IDENTIFIKASI GENOTIPE GEN SITOKROM P450 2A6*1/*4 PADA ...
Transcript of IDENTIFIKASI GENOTIPE GEN SITOKROM P450 2A6*1/*4 PADA ...
IDENTIFIKASI GENOTIPE GEN SITOKROM P450 2A6*1/*4 PADA
SUBJEK UJI NONPEROKOK SUKU PAPUA INDONESIA DENGAN
METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Ferawati
NIM : 178114032
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2021
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
IDENTIFIKASI GENOTIPE GEN SITOKROM P450 2A6*1/*4 PADA
SUBJEK UJI NONPEROKOK SUKU PAPUA INDONESIA DENGAN
METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Ferawati
NIM : 178114032
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2021
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
Persetujuan Pembimbing
IDENTIFIKASI GENOTIPE GEN SITOKROM P450 2A6*1/*4 PADA
SUBJEK UJI NONPEROKOK SUKU PAPUA INDONESIA DENGAN
METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Skripsi yang diajukan oleh:
Ferawati
NIM: 178114032
telah disetujui oleh
Pembimbing Utama
Dr. apt. Christine Patramurti
tanggal
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
HALAMAN PENGESAHAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis
tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan
dalam kutipan dan daftar pustaka, dengan mengikuti ketentuan sebagaimana
layaknya karya ilmiah. Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme
dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan
perundang-undangan yang berlaku.
Yogyakarta, 10 Juni 2021
Penulis,
Ferawati
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN
PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :
Nama : Ferawati
Nomor Mahasiswa : 178114032
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan
Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :
Identifikasi Genotipe Gen Sitokrom P450 2A6*1/*4 Pada Subjek Uji
Nonperokok Suku Papua Indonesia Dengan Metode Polymerase Chain
Reaction (PCR)
Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan
kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-
ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data,
mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media
lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun
memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai
penulis.
Atas kemajuan teknologi informasi, saya tidak berkeberatan jika nama, tanda
tangan, gambar atau image yang ada di dalam karya ilmiah saya terindeks oleh
mesin pencari (search engine), misalnya google.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal : 22 Juli 2021
Yang menyatakan
Ferawati
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
HALAMAN PERSEMBAHAN
Karya ini saya persembahkan kepada:
Tuhan Yesus
Kedua orang tua saya Bapak dan Mama
Adik-adik saya Rini, Ryo dan Raffael
Keluarga besar dan sahabat
serta
Almamater tercinta Universitas Sanata Dharma
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Yang Maha Esa
atas berkat dan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyusun dan menyelesaikan
skripsi yang berjudul “Identifikasi Genotipe Gen Sitokrom P450 2A6*1/*4 Pada
Subjek Uji Nonperokok Suku Papua Indonesia Dengan Metode Polymerase Chain
Reaction (PCR)” untuk memenuhi persyaratan dalam memperoleh gelar Sarjana
Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Proses penyusunan skripsi ini tidak lepas dari dukungan, peran, dan bantuan dari
berbagai pihak. Maka dari itu, melalui kesempatan ini penulis ingin mengucapkan
banyak terima kasih kepada:
1. Ibu Dr. apt. Yustina Sri Hartini selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Ibu Dr. apt. Christine Patramurti selaku Kepala Program Studi Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, serta selaku Dosen
Pembimbing Skripsi yang selalu memberikan masukan, arahan, ilmu dan
mendampingi dengan penuh sabar selama proses penyusunan naskah skripsi
dari awal hingga akhir sehingga menjadi lebih baik.
3. Bapak Dr.Jeffry Julianus, M.Si. dan Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si,
M.Sc. selaku Dosen Penguji yang telah memberikan kritik, saran dan ilmu
yang bermanfaat serta membangun dalam penelitian ini.
4. Ibu Dr. apt. Erna Tri Wulandari selaku Dosen Pembimbing Akademik yang
telah mendampingi selama proses perkuliahan di kelas FSMA 2017.
5. Bapak Kayatno selaku Laboran Laboratorium Biokimia dan Bapak Yohanes
Wagiran selaku Laboran Laboratorium Kultur Jaringan yang telah sabar
dalam membantu proses penelitian ini.
6. Seluruh Dosen yang dengan sabar memberikan ilmu pengetahuan dan Staff
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas bantuannya selama proses
perkuliahan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
7. Bapak Yohanis dan Ibu Elisabeth selaku orang tua serta adik-adikku Rini,
Ryo dan Raffael yang sangat aku cintai. Terima kasih telah banyak
memberikan dukungan, semangat, doa dan kasih sayang yang begitu besar
selama proses perkuliahan serta penyelesaian skripsi.
8. Keluarga besarku yang selalu memberikan semangat, doa dan kasih sayang
selama proses perkuliahan serta penyelesaian skripsi.
9. Teman-teman seperjuangan penelitian skripsi yaitu Albertha, Vivian, Yosin
dan Epifania yang telah saling mendukung dan melengkapi satu sama lain.
Terima kasih atas kerjasamanya dan suka duka yang telah kita lewati
bersama.
10. Sahabat-sahabatku tersayang dan seperjuangan selama perkuliahan di
Farmasi yaitu Shannia, Veren, Vivian, Desmar, Janise, Bergita dan Carolin
yang telah menemani selama proses perkuliahan. Terima kasih atas kasih
sayang, dukungan dan bimbingan yang telah kalian berikan selama
berkuliah sehingga membuatku menjadi pribadi yang lebih baik.
11. Sahabat-sahabatku dan saudaraku yang telah berjuang merantau bersama di
Yogyakarta yaitu Bergita, Meydistra, Yezika, Ica, Nelly, Welly dan
Dayanara. Terima kasih telah berjuang bersama dan saling memberikan
dukungan selama berada di Yogyakarta.
12. Kakak Marni dan Tina yang berjuang merantau bersama di Yogyakarta.
Terima kasih telah memberikan semangat, kasih sayang dan dukungan serta
sudah menjagaku selama merantau di Yogyakarta.
13. Teman-temanku yang jauh disana yaitu Januar, Malik, Jaka, Yosi, Iyo,
Bambang dan Yoga. Terima kasih atas kasih sayang, semangat dan motivasi
selama proses perkuliahan serta penelitian ini.
14. Teman-teman seperjuangan FSMA 2017 dan golongan A2 yang sudah
berjuang bersama selama proses perkuliahan. Terima kasih atas dinamika
dan kerjasamanya selama proses pembelajaran di kelas serta selama
praktikum.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
15. Semua pihak yang belum disebutkan dan turut membantu selama proses
penelitian serta penyusunan skripsi.
Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penulisan
skripsi ini, sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari
semua pihak. Penulis berharap semoga penulisan skripsi ini dapat bermanfaat bagi
pembaca dan perkembangan ilmu farmasi.
Yogyakarta, 10 Juni 2021
Penulis,
Ferawati
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR ISI
HALAMAN SAMPUL ............................................................................................ i HALAMAN JUDUL ............................................................................................... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................... iii
HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................. v LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN ...................................................... vi LEMBAR PERNYATAAN PUBLIKASI ............................................................. vi HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................... vii
PRAKATA ........................................................................................................... viii
DAFTAR ISI .......................................................................................................... xi
DAFTAR TABEL ................................................................................................. xii DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xiii DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xiv ABSTRAK ............................................................................................................ xv
ABSTRACT ........................................................................................................... xvi PENDAHULUAN ................................................................................................ 17
METODOLOGI PENELITIAN ............................................................................ 19 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................. 23 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 33
LAMPIRAN .......................................................................................................... 36 BIOGRAFI PENULIS .......................................................................................... 45
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Frekuensi alel dan genotipe CYP2A6 .................................................... 28
Tabel 2. Efek Genotipe*1/*4 pada beberapa obat ................................................ 30
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA ................................................... 24
Gambar 2. Urutan basa nukleotida dan primer CYP2A6*1 dan CYP2A6*4 ..... 27
Gambar 3. Hasil elektroforesis produk PCR CYP2A6*4 ................................... 28
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat Keterangan Layak Etik .......................................................... 36
Lampiran 2. Sertifikat analisis Go Taq Green Master Mix ................................. 37
Lampiran 3. Informasi Pemakaian Go Taq Green Master Mix ........................... 38
Lampiran 4. Lembar Infromasi Nucleic Acid Gel Stain ...................................... 39
Lampiran 5. Lembar Infromasi DNA Ladder ..................................................... 40
Lampiran 6. Elektroforesis Hasil PCR ................................................................ 41
Lampiran 7. Hasil Penelitian ............................................................................... 42
Lampiran 8. Lembar Primer PCR alel CYP2A6*4 ............................................. 44
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
ABSTRAK
Enzim sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) adalah enzim yang bertanggung
jawab dalam metabolisme beberapa substrat obat dan racun seperti nikotin,
fadrozole, asam valproat dan N-nitrosamin. Gen CYP2A6 adalah gen yang
menyandi enzim CYP2A6 yang memiliki bentuk polimorfisme yang tinggi
sehingga dapat berpengaruh terhadap kecepatan metabolisme substrat enzim
CYP2A6. CYP2A6*1 merupakan bentuk wild type dari CYP2A6, sedangkan
CYP2A6*4 merupakan salah satu bentuk polimorfisme yang tidak memiliki
aktivitas CYP2A6. Seorang individu yang memiliki CYP2A6*1 dan CYP2A6*4
dapat membentuk genotipe CYP2A6*1/*4. Genotipe CYP2A6*1/*4 merupakan
salah satu bentuk genotipe yang dikategorikan sebagai slow metabolizers yang
menyebabkan penurunan 50% aktivitas dalam memetabolisme substrat CYP2A6
dari keadaan normal. Penelitian ini dilakukan dengan cara deskriptif observasional.
Sebanyak 30 sampel isolat DNA akan dianalisis yang berasal dari penelitian
sebelumnya. Hasil isolat DNA dianalisis dengan amplifikasi menggunakan metode
Polymerase Chain Reaction (PCR). Hasil penelitian ditemukan dua macam
genotipe, yaitu 20 subjek uji ditemukan genotipe gen CYP2A6*1/*4 (66,67%) yang
merupakan Slow metabolizers dan 10 subjek uji ditemukan genotipe CYP2A6*4/*4
(33,33%) yang merupakan Poor metabolizers.
Kata kunci: CYP2A6*4, Polimorfisme, Suku Papua di Indonesia, Polymerase
Chain Reaction (PCR).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvi
ABSTRACT
Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6) enzymes are enzymes that are
responsible for the metabolism of several drug and toxic substrates such as
nicotine, fadrozole, valproic acid and N-nitrosamines. The CYP2A6 gene is a gene
that codes for the CYP2A6 enzyme which has a high polymorphism form so that it
can affect the metabolic rate of the CYP2A6 enzyme substrate. CYP2A6*1 is a wild
type of CYP2A6, while CYP2A6*4 is a polymorphism that does not have CYP2A6
activity. An individual who has CYP2A6*1 and CYP2A6*4 can form the CYP2A6
*1/*4 genotype. CYP2A6 *1/*4 genotype is one of the genotypes categorized as
slow metabolism which causes a 50% decrease in activity in metabolizing CYP2A6
substrates from the state. normal. This research was conducted in a descriptive
observational manner. A total of 30 DNA isolate samples will be analyzed from
previous studies. The results of the DNA isolates were analyzed by amplification
using the Polymerase Chain Reaction (PCR) method. The results of the study found
two types of genotypes, namely 20 test subjects found the genotype of the
CYP2A6*1/*4 gene (66.67%) which was Slow metabolizers and 10 test subjects
found the genotype of CYP2A6*4/*4 (33.33%) which was Poor metabolizers.
Keywords: CYP2A6*4, Polymorphism, Papuan Black Race in Indonesia,
Polymerase Chain Reaction (PCR).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
PENDAHULUAN
Variabilitas respon dan klirens obat antar individu merupakan masalah
yang umum terjadi dalam praktek klinis (Preissner dkk., 2013). Faktor utama yang
menyebabkan masalah tersebut adalah ekspresi dan fungsi enzim pemetabolisme
obat yang bervariasi. Ekpresi dan fungsi enzim yang bervariasi ini dapat
dipengaruhi oleh polimorfisme genetik (Zanger dkk., 2005). Polimorfisme
merupakan perubahan informasi genetik yang menyebabkan terjadinya variasi
bentuk dari gen, baik dua atau lebih dalam satu spesies (Patramurti dkk., 2019).
Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) merupakan salah satu gen yang memiliki bentuk
polimorfisme yang tinggi.
Gen CYP2A6 adalah gen yang menyandi enzim sitokrom P450 2A6
(CYP2A6) yang bertanggung jawab dalam metabolisme beberapa substrat obat dan
senyawa racun, seperti kumarin, nikotin, 3,5-dimetil-2-(3-piridil)thiazolidin-4-one
hidroklorida (SM-12502), tegafur, fadrozole, metoxyflurance, asam valproat,
aflatoksin B1, N-nitrodiethylamine, 1,3-butadine dan N-nitrosamin (Tanner dan
Tyndale, 2017; Fujieda dkk., 2004). Gen CYP2A6 memiliki bentuk polimorfisme
yang tinggi akibat adanya variasi lokus, seperti single nucleotide polymorphisms
(SNPs), gene deletions, duplikasi gen, hibrid gen dengan CYP2A7 dan konversi
gen (McDonagh dkk., 2012). Alel CYP2A6*4 merupakan salah satu bentuk
polimorfisme gen yang tidak aktif, sedangkan CYP2A6*1 (Wild type) merupakan
bentuk aktif yang memiliki aktivitas normal (Zdanowicz dan Adams, 2014).
CYP2A6*4 berperan sebagai gen deletion sehingga termasuk dalam bentuk gen
tidak aktif (Zdanowicz dan Adams, 2014; Patramurti dkk., 2019). Seorang Individu
yang memiliki alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*4 dapat membentuk genotipe
CYP2A6*1/*4. Genotipe CYP2A6*1/*4 merupakan salah satu bentuk genotipe
dikategorikan sebagai slow metabolizers (Liu dkk., 2011; Patramurti dkk., 2019).
Frekuensi polimorfisme genotipe CYP2A6*1/*4 pada populasi di
Indonesia belum diketahui secara pasti, karena perbedaan etnis berpengaruh secara
signifikan terhadap frekuensi polimorfisme gen CYP2A6 tertentu (Tsukino dkk.,
2002; Muliaty dkk., 2010). Berdasarkan beberapa penelitian, genotipe gen
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
CYP2A6*1/*4 dapat ditemukan pada beberapa suku di Indonesia seperti suku Jawa
sebesar 63,9% dan Batak sebesar 2,9% (Patramurti dan Fenty., 2017; Soeroso dkk.,
2018). Selain itu, frekuensi bentuk polimorfisme CYP2A6 yang menurunkan dan
tidak memiliki aktivitas enzim CYP2A6 ditemukan lebih tinggi pada populasi di
Afrika dibandingkan populasi berkulit putih. Populasi Afrika merupakan ras
negroid yang memiliki warna kulit yang cenderung lebih hitam. Pada penelitian
yang dilakukan oleh Tanner dan Tyndale (2017), ditemukan bahwa frekuensi
bentuk polimorfisme genotipe loss of function seperti CYP2A6*1/*4 pada
populasi ras kulit hitam sebesar 38%. Ras kulit hitam juga terdapat di Indonesia
khususnya di daerah Papua. Selain itu, frekuensi genotipe gen CYP2A6*1/*4
ditemukan cukup tinggi pada seorang nonperokok yaitu sebesar 13,8% sehingga
subjek uji yang digunakan adalah seorang nonperokok (Tan dkk., 2001).
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi genotipe gen
CYP2A6*1/*4 pada subjek nonperokok suku Papua Indonesia mengunakan metode
Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR adalah teknik biologi molekuler yang
digunakan untuk amplifikasi sekuen DNA spesifik menjadi jutaan salinan sekuen
DNA melalui reaksi enzimatis yang diperantarai oleh primer (Hewajuli dan NLPI.,
2014). Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan yang telah dilakukan oleh
Handani, (2019) dengan judul “Identifikasi Alel Gen Sitokrom P450 2A6*4 pada
Subjek Uji Nonperokok Ras Kulit Hitam Papua Indonesia Dengan Metode
Polymerase Chain Reaction (PCR)”. Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan,
karena pada penelitian sebelumnya hanya dilakukan identifikasi keberadaan dan
frekuensi alel CYP2A6*1, sedangkan pada penelitian ini akan dilanjutkan untuk
mengidentifikasi keberadaan dan frekuensi alel CYP2A6*4 sehingga dapat
diperoleh keberadaan dan frekuensi genotipe CYP2A6*1/*4. Genotipe merupakan
kombinasi antara dua alel pada kromosom yang berbeda dan menghasilkan sifat
fisik yang disebut fenotipe (Styn dkk., 2013; McDonagh dkk., 2012). Tujuan
dilakukan identifikasi genotipe adalah untuk mengetahui fenotipe seperti kecepatan
metabolisme CYP2A6 pada individu tertentu, sedangkan pada penelitian
sebelumnya dilakukan identifikasi alel yang merupakan bentuk variasi gen yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
berada pada suatu lokus. Identifikasi alel dilakukan untuk melihat aktivitas enzim
CYP2A6, sedangkan dengan mengetahui genotipe maka dapat ditentukan fenotipe
pada suatu individu tertentu (McDonagh dkk., 2012; Raunio dan Rahnasto-rilla,
2012).
Pada penelitian sebelumnya dilakukan identifikasi keberadaan dan
frekuensi alel CYP2A6*1 menggunakan primer forward (5’- CCT CAT CAC ACA
CAA CTT CCT C - 3’) dan primer reverse (5’ - CGC AGG TAC TGG GTG CTT
GGT AG - 3’), sedangkan pada penelitian ini dilakukan identifikasi keberadaan dan
frekuensi alel CYP2A6*4 mengunakan primer forward (5’ - CCT CAT CAC ACA
CAA CTT CCT C - 3’) dan primer reverse (5’ - TGC AGG TAC TGG GTG CTT
GGT AG - 3’). Data hasil penelitian yang telah didapatkan oleh Handani, (2019)
akan digabungkan dengan hasil data pada penelitian ini. Hasil penelitian ini
diharapkan dapat memberikan informasi mengenai keberadaan genotipe
CYP2A6*1/*4 pada subjek uji nonperokok suku Papua Indonesia.
METODOLOGI PENELITIAN
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan adalah isolat DNA dari sampel darah non perokok
suku Papua yang berasal dari penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Handani,
(2019). Isolat DNA yang digunakan dari penelitian terdahulu telah mendapatkan
keterangan layak etik untuk digunakan pada penelitian ini. Primer forward: 5’ CCT
CAT CAC ACA CAA CTT CCT C 3’dan primer reverse: 5’ TGC AGG TAC TGG
GTG CTT GGT AG 3’. Water For Injection (WFI), 1 KB DNA Ladder (Geneaid),
alkohol 70%, aquadest, loading dye, gel agarose (Vivantis), Tris-Brorat-EDTA
(TBE) Buffer 10x (Vivants), nuclease free water dan Promega Go Taq Green
Master Mix (mengandung taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl2 dan Buffer).
Alat Penelitian
Alat yang digunakan adalah satu set elektroforesis (Biorad), UV
Transilluminator (Fisher Scientific), microtube 1,5 ml (Biologix), vorteks (Fisher
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
Scientific), mikropipet 1-10 µL (Soccorex Acura 825), mikropipet 2-20 µL
(Soccorex Acura 825), mikropipet 1-10 µL (GilsonTM), PCR Tubes (Axygen),
dispossable gloves, blue tip, yellow tip, white tipe, ice tip, gelas beaker (Pyrex), hot
plate, kamera polaroid, microwave, erlenmeyer (Pyrex), gelas ukur (Pyrex),
magnetic stirrer, Thermal cycler (Biorad T100TM) dan alat-alat gelas.
Tata Cara Penelitian
Analisis Kualitatif Isolat DNA
Analisis kualitatif isolat DNA dilakukan dengan teknik elektroforesis
menggunakan gel agarose 1,0%. Pembuatan gel agarose dengan cara melarutkan
0,25 g agarose dalam larutan 1x TBE buffer sebanyak 25 mL. Campuran tersebut
kemudian dipanaskan menggunakan microwave selama sekitar lima menit hingga
semua agarose larut. Larutan gel agarose yang telah jernih di ambil dari microwave,
lalu ditambahkan 2,5 µL GelRed dan dicampur hingga homogen. Larutan gel
agarose dituangkan ke dalam cetakan gel yang telah dipasang sisiran ditepi gel dan
gel dibiarkan mengeras. Setelah gel agarose mengeras sisiran ditepi gel dicabut
sehingga terbentuk sumur-sumur. Selanjutnya isolat DNA sebanyak 4,0 µL
diletakkan ke atas plat tetes, kemudian ditambahkan aqubidest sebanyak 1,0 µL dan
loading dye sebanyak 1,0 µL. Campuran isolat DNA diambil sebanyak 6,0 µL dan
dimasukkan ke dalam sumuran-sumuran gel agarose dan salah satu sumuran gel
agarose diisi dengan DNA leadder sebanyak 3,0 µL. Gel agarose diletakkan ke
dalam gel tray yang berisi larutan buffer TBE 1x. Elektroforesis dilakukan pada
tegangan 100 Volt dan running selama 30 menit. Molekul DNA pada gel tray akan
bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif pada pH netral. Gel agarose yang
telah elektroforesis kemudian diambil untuk melihat panjang pita DNA dengan
menggunakan sinar ultraviolet dalam trans ulliminator dan didokumentasikan
menggunakan kamera mirrorless Fujifil XA3.
Amplifikasi genotipe gen CYP2A6*1/*4
Fragmen genotipe gen CYP2A6*1/*4 diamplifikasi menggunakan primer
forward: 5’ CCT CAT CAC ACA CAA CTT CCT C 3’dan primer reverse: 5’ TGC
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
AGG TAC TGG GTG CTT GGT AG 3’. Amplifikasi genotipe gen CYP2A6*1/*4
dilakukan dengan menggunakan PCR, dengan bahan yang terdiri atas Promega Go
Taq Green Master Mix 12, 5 µl, forward primer 1,25 µL, reverse primer 1,25 µL,
isolat DNA 5,0 µL dan nuclease free water 5,0 µL yang dicampur dengan volume
akhir 25,0 µL. Amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR (Thermal cycler parkin
elmer 2400). Kondisi PCR diatur dengan initial denaturasi pada suhu 95°C selama
5 menit, dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 98°C selama 20 detik, annealing
pada suhu 62,6°C selama 15 detik, dan ekstensi pada suhu 72°C selama 30 detik.
Amplifikasi dilakukan dengan siklus sebanyak 35 kali dan diakhiri dengan final
ekstensi pada suhu 72°C selama 5 menit.
Analisis produk PCR menggunakan teknik elektroforesis
Hasil produk PCR dianalisis menggunakan teknik elektroforesis, dengan
gel agarose 1,5% sebagai fase diam dan TBE 1x sebagai fase gerak. Timbang gel
agarose dan dilarutkan dalam larutan TBE 1x sebanyak 25 mL. Panaskan campuran
gel agarose menggunakan microwave hingga semua gel agarose larut, kemudian
tambahkan 2,5 µL Gelred dan dicampur hingga homogen. Larutan gel agarose
dituangkan kedalam cetakan gel yang telah dipasang sisiran ditepi gel dan gel
dibiarkan mengeras. Setelah gel agarose mengeras sisiran ditepi gel dicabut
sehingga terbentuk sumur-sumur. Gel agarose yang telah mengeras diletakkan ke
dalam bejana elektroforesis yang berisi fase gerak TBE 1x hingga permukaan
permukaan gel agarose terendam. Campurkan produk PCR sebanyak 5 µL dengan
loading dye sebanyak 1 µL. Ambil campuran produk PCR sebanyak 6 µL
menggunakan mikropipet dan dimasukkan kedalam sumuran gel agarose. DNA
ladder dimasukkan ke dalam salah satu sumuran gel agarose. Elektroforesis
dilakukan pada tegangan 100 Volt dan running selama 30 menit. Gel agarose yang
telah elektroforesis kemudian diambil untuk melihat panjang pita DNA dengan
menggunakan sinar ultraviolet dalam trans ulliminator dan didokumentasikan
menggunakan kamera polaroid (Patramurti dan Fenty, 2015).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
Analisis Hasil
1. Hasil produk PCR dideteksi menggunakan metode elektroforesis. Terbentuknya
hasil produk berupa pita dengan panjang 350 bp menunjukan bahwa isolat DNA
yang dianalisis memiliki alel CYP2A6*4, sedangkan jika tidak terbentuk pita
maka menunjukkan adanya alel CYP2A6*1.
2. Perhitungan frekuensi genotipe gen CYP2A6*1/*4 pada subjek uji suku Papua
non perokok di Indonesia diawali dengan perhitungan frekuensi alel dengan
menggunakan rumus:
Frekuensi CYP2A6*1 =jumlah alel CYP2A6∗1 yang diperoleh
jumlah seluruh (30) x 100%
Frekuensi CYP2A6*4 =jumlah alel CYP2A6∗4 yang diperoleh
jumlah seluruh (30) x 100%
Setelah keberadaan dan frekuensi alel telah diketahui maka dilakukan
perhitungan frekuensi genotipe CYP2A6*1/*4. Perhitungan genotipe
CYP2A6*1/*4 didasarkan pada penelitian yang telah dilakukan oleh Patramurti
dkk., (2015). Untuk mengetahui frekuensi genotipe CYP2A6*1/*4, maka
dilakukan dengan mengidentifikasi keberadaan alel CYP2A6*1 yang ditemukan
pada penelitian sebelumnya dan alel CYP2A6*4 pada penelitian ini. Individu
yang memiliki CYP2A6*1 dan CYP2A6*4 dikategorikan sebagai individu yang
memiliki genotipe CYP2A6*1/*4. Selain dapat mengetahui genotipe
CYP2A6*1/*4, penelitian ini juga dapat mengetahui bentuk genotipe lain seperti
genotipe CYP2A6*1/*1 dan CYP2A6*4/*4. Setelah dilakukan perthitungan
manual, jumlah frekuensi setiap genotipe akan dilakukan perhitungan persen
frekuensi menggunakan rumus:
Frekuensi genotipe CYP2A6*1/*4 =jumlah genotipe CYP2A6∗1/∗4
jumlah seluruh (30) x 100%
Frekuensi genotipe CYP2A6*4/*4 =jumlah genotipe CYP2A6∗1/∗4
jumlah seluruh (30) x 100%
Frekuensi genotipe CYP2A6*1/*1 =jumlah genotipe CYP2A6∗1/∗4
jumlah seluruh (30) x 100%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
HASIL DAN PEMBAHASAN
Gen CYP2A6 merupakan gen yang memiliki bentuk polimorfisme yang
tinggi. Polimorfisme gen CYP2A6 dapat mempengaruhi kecepatan CYP2A6 dalam
metabolisme substrat obat. Identifikasi genotipe CYP2A6 dapat dilakukan untuk
mengetahui kecepatan metabolisme pada suatu individu teretntu. Penelitian ini
dilakukan dengan tujuan untuk mengidentifikasi genotipe gen CYP2A6*1/*4 pada
subjek uji nonperokok suku Papua Indonesia sebanyak 30 orang. Perhitungan
subjek uji telah dilakukan oleh Handani (2019) yang mengacu pada B-Rao (2001).
Subjek uji yang digunakan adalah orang dewasa keturunan suku Papua asli minimal
sampai third degree relativies yang bertempat tinggal di Yogyakarta dan seorang
nonperokok. Subjek uji yang dieliminasi pada penelitian ini adalah seseorang
dengan riwayat merokok kurang dari 5 tahun dan sedang terinfeksi bakteri atau
virus. Subjek uji yang terinfeksi bakteri dapat membiaskan hasil penelitian. Hal ini
dapat disebabkan akibat terisolasinya DNA virus atau bakteri tersebut (Handani,
2019).
Identifikasi genotipe gen CYP2A6*1/*4 dilakukan dengan tiga tahapan
utama, yaitu analisis kualitatif kualitatif isolat DNA, amplifikasi genotipe gen
CYP2A6*1/*4 dan analisis produk PCR menggunakan teknik eletroforesis.
Identifikasi genotipe gen CYP2A6*1/*4 dilakukan dengan meggunakan metode
Polymerase Chain Reaction (PCR). Subjek uji yang digunakan adalah suku Papua
yang merupakan ras kulit hitam. Frekuensi bentuk polimorfisme CYP2A6 yang
menurunkan dan tidak memiliki aktivitas enzim CYP2A6 ditemukan lebih tinggi
pada populasi ras kulit hitam di Afrika dibandingkan populasi berkulit putih.
Populasi Afrika dan suku Papua merupakan ras negroid yang memiliki warna kulit
yang cenderung lebih hitam.
Analisis kualitatif isolat DNA
Isolat DNA yang digunakan didapatkan dari penelitian terdahulu oleh
Handani (2019). Isolat DNA dari penelitian terdahulu disimpan pada lemari
pendingin dengan suhu -70°C. Penyimpanan isolat DNA dengan dengan temperatur
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
yang lebih rendah dapat digunakan dalam jangka waktu yang lama (Marwayana,
2015). Isolat DNA berasal dari subjek uji nonperokok ras suku Papua Indonesia
akan dilakukan analisis kemurnian isolat. Tujuan dilakukan analisis kemurnian
isolat DNA adalah untuk memastikan bahwa sampel isolat DNA masih dalam
kedaan murni sehingga dapat digunakan sebagai sampel identifikasi genotipe gen
CYP2A6*1/*4 (Patramurti dan Fenty., 2017). Analisis kualitatif isolat DNA
dilakukan dengan menggunakan teknik elektroforesis yang selanjutnya dideteksi
menggunakan UV transiluminator. Isolat DNA ditambahkan loading dye yang
berfungsi sebagai pemberat DNA sehingga DNA berada di dalam sumuran dan
sebagai penanda posisi pita DNA pada saat migrasi (Yohana dkk., 2018; Novitasari
dkk., 2014). Isolat DNA yang murni dan tidak terkontaminasi, akan menunjukan
hasil analisis dengan terbentuknya pita tunggal tebal di atas marker atau dengan
ukuran lebih dari 3.000 bp. Pita yang tebal menunjukkan secara kualitatif bahwa
konsentrasi isolat DNA yang tinggi (Patramurti dan Fenty., 2017; Hidayanti dkk.,
2016). Isolat yang digunakan pada penelitian ini masih dalam keadaan murni dan
tidak terkontaminasi sehingga dapat digunakan untuk analisis pada penelitian ini
(Gambar 1).
Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA
Keterangan:
M : DNA ladder sebagai marker
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 : Isolat DNA dengan pita tunggal dan tebal
Kondisi elektroforesis : fase diam gel agarose 1%; dan fase gerak TBE 1x; tegangan
100 Volt; running selama 30 menit
M 7 6 5 4 3 2 1
3000 bp
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Amplifikasi genotipe gen CYP2A6*1/*4
Penelitian ini dilakukan bertujuan untuk mengidentifikasi dan mengetahui
frekuensi genotipe gen CYP2A6*1/*4. Untuk mengidentifikasi genotipe gen
CYP2A6*1/*4, maka perlu dilakukan amplifikasi alel CYP2A6*1 dan alel
CYP2A6*4. Pada penelitian ini dilakukan amplifikasi alel CYP2A6*4 sedangkan
hasil amplifikasi alel CYP2A6*1 didapatkan dari hasil penelitian Handani (2019).
Amplifikasi isolat DNA pada penelitian ini dan Handani (2019) dilakukan dengan
menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Bahan yang diperlukan
dalam berlangsungnya PCR adalah template DNA, Taq polimerase, sepasang
primer, dNTPS (deoksiribonukleosida trifosfat), magnesium klorida, dan larutan
buffer PCR (Hernandez-Rodriguez., 2012). Enzim Taq polimerase berfungsi
sebagai katalis pada saat polimerisasi DNA (Handoyo dan Rudiretna., 2001).
Deoksiribonukleosida trifosfat (dNTPS) berfungsi sebagai penyedia basa
nukleotida pada saat sintesis DNA baru. MgCl2 berfungsi sebagai kofaktor enzim
DNA polimerase dan terdapat ion Mg2+ yang akan berikatan dengan ion α-fosfat
pada dNTP sehingga membantu dalam penambahan molukel dNTP. Larutan buffer
PCR berfungsi dalam mempertahankan pH dalam keadaan optimal. Primer
berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan
menyediakan gugus hidroksi pada ujung 3’ yang diperlukan untuk eksistensi DNA
(Handoyo dan Rudiretna., 2001; Faried dkk., 2019).
Mekanisme kerja metode PCR memiliki prinsip yang sama dengan proses
replikasi rantai DNA. Proses PCR terjadi dengan melalui beberapa tahap yaitu,
danaturasi, annealing dan extension. Tahap denaturasi dikenai suhu setinggi 95°C
berfungsi untuk memutusakan ikatan hidrogen yang menghubungkan kedua rantai
ganda DNA. Pada tahap annealing suhu diturunkan menjadi 62,6°C sehingga
primer dapat berikatan dengan DNA tamplate. Melekatnya primer pada sekuen
awal DNA template akan merangsang DNA polimerase mensintesis rantai DNA
baru dengan menambahkan basa nukleotida yang sesuai pada rantai DNA template
(Faried dkk., 2019; Nurhayati dan Darmawati., 2017). Pada tahap extension suhu
reaksi PCR dinaikan kembali menjadi 72°C. Tahapan aplikasi tersebut dilakukan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
sebanyak 35 siklus dan diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72°C. Kondisi PCR
yang digunakan pada penelitian ini disesuaikan dengan penelitian Handani (2019).
Pada penelitian Handani (2019) telah dilakukan optimasi suhu dan waktu PCR,
sehingga didapatkan hasil yang optimum. Kondisi PCR dari penelitian Handani
(2019) dapat digunakan pada penelitian ini karena hanya terdapat satu perbedaan
basa nukleotida primer reverse yang digunakan pada penelitian.
Primer yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari satu pasang yaitu
primer forward yang berikatan dengan segmen awal sekuen DNA template dan
primer reverse yang berikatan dengan segmen akhir DNA template. Primer yang
digunakan pada penelitian ini adalah primer yang spesifik untuk mengamplifikasi
CYP2A6*4 yaitu primer forward: 5’ CCT CAT CAC ACA CAA CTT CCT C
3’dan primer reverse: 5’ TGC AGG TAC TGG GTG CTT GGT AG 3’. Primer
yang digunakan pada penelitian Handani (2019) adalah primer yang spesifik untuk
mengamplifikasi CYP2A6*1 yaitu primer forward: 5’ CCT CAT CAC ACA CAA
CTT CCT C 3’dan primer reverse: 5’ CGC AGG TAC TGG GTG CTT GGT AG
3’. Primer yang digunakan pada penelitian ini dan Handani (2019) akan spesifik
mengamplifikasi pada urutan basa nukleotida urutan ke-10643 hingga urutan ke-
10993. Perbedaan dari kedua pasang primer tersebut yaitu pada urutan basa
nukleotida primer reverse. Perbedaan urutan basa nukleotida tersebut terdapat pada
urutan ke-10993 yaitu alel CYP2A6*1 mengkode basa nukeleotida G sedangkan
CYP2A6*4 mengkode basa nukleotida A (Gambar 2). Adanya perbedaan urutan
basa nukelotida pada primer reverse, dapat menjadi spesifikasi primer pada saat
penempelan dengan DNA tamplate. Selain perbedaan urutan basa pada primer
reverse, terdapat juga lima perbedaan urutan basa nukleotida anatar alel CYP2A6*1
dan CYP2A6*4 seperti yang terdapat pada gambar 2. Alel CYP2A6*4 mengalami
gen deletion akibat adanya homologous unequal crossover antara CYP2A6 dan
CYP2A7 (Zdanowicz dan Adams, 2014; Lopez-Flores dkk., 2016). Hal ini
menyebabkan tidak terekspresinya mRNA yang mengkode CYP2A6, namun
mengkode mRNA yang menyebabkan terbentuknya protein berbeda sehingga tidak
memiliki aktivitas CYP2A6 (Handani, 2019).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Gambar 2. Urutan basa nukleotida dan primer CYP2A6*1 dan CYP2A6*4
Analisis produk PCR
Hasil amplifikasi produk PCR alel CYP2A6*4 dianalisis menggunakan
teknik eletroforesis. Teknik eletroforesis dilakukan dengan menggunakan gel
agarose 1,5% sebagai fase diam dan TBE 1x sebagai fase gerak. Elektroforesis
dilakukan pada tegangan 100 Volt dan running selama 30 menit. Produk PCR yang
telah diamplifikasi dimasukkan kedalam sumuran gel agarose dan salah satu
sumuran digunakan sebagai marker. Marker pada bagian pinggir sumuran berfungsi
sebagai petujuk ukuran segmen DNA atau amplikon (Faried dkk., 2019). Hasil
elektroforesis kemudian diambil untuk melihat ukuran pita DNA dengan
menggunakan sinar ultraviolet dalam UV transulliminator dan didokumentasikan
menggunakan kamera sehingga didapatkan hasil seperti pada gambar 3.
Terbentuknya pita berukuran 350 bp pada hasil elektroforesis produk PCR
menunjukkan bahwa subjek uji memiliki alel CYP2A6*4, sedangkan jika tidak
terbentuk pita menunjukkan bahwa subjek uji memiliki alel CYP2A6*1.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Gambar 3. Hasil elektroforesis produk PCR CYP2A6*4
Keterangan:
1-7 : Produk PCR yang terbentuk 350 bp (CYP2A6*4)
M : DNA Ladder
Kondisi elektroforesis : fase diam gel agarose 1,5%; dan fase gerak TBE 1x; tegangan
100 Volt; running selama 30 menit
Tabel 1. Frekuensi alel dan genotipe CYP2A6 Alel Jumlah Frekuensi
CYP2A6*1 (Handani, 2019) 20 66,67%
CYP2A6*4 30 100%
Genotipe Jumlah Frekuensi
Genotipe*1/*4 20 66,67%
Genotipe*4/*4 10 33,33%
Berdasarkan hasil elektroforesis 30 produk PCR yang telah dideteksi
menggunakan UV transulliminator, didapatkan sebanyak 30 produk PCR
menghasilkan pita dengan ukuran 350 bp. Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa,
30 isolat DNA subjek suku Papua memiliki frekuensi alel CYP2A6*4 sebesar 100%
(Tabel 1). Penentukan gentotipe gen CYP2A6 pada suku Papua dilakukan dengan
menggabungkan data penelitian ini dengan penelitian Handani (2019). Pada
penelitian Handani (2019), dilakukan amplifikasi alel CYP2A6*1 yang ditandai
dengan terbentuknya pita berukuran 350 bp, sedangkan jika tidak terbentuk pita
menunjukkan bahwa subjek uji memiliki CYP2A6*4. Berdasarkan hasil penelitian
M 1 2 3 4 5 6 7
350 bp
3000 bp
100 bp
300 bp 200 bp
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
yang dilakukan Handani (2019), didapatkan subjek uji yang memiliki CYP2A6*1
sebanyak 20 isolat DNA dengan frekuensi 66,67%. Berdasarkan kedua hasil
penelitian tersebut, subjek uji yang memiliki genotipe CYP2A6*1/*4 sebanyak 20
isolat DNA dengan frekuensi 66,67%. Sebanyak 10 subjek uji memiliki genotipe
CYP2A6*4/*4 dengan frekuensi 33,33% (Tabel 1).
Hasil genotipe CYP2A6*1/*4 yang didapatkan pada subjek uji
nonperokok suku Papua Indonesia sangat tinggi. Menurut Tanner dan Tyndale
(2017), frekuensi bentuk polimorfisme CYP2A6 yang menurunkan dan tidak
memiliki aktivitas enzim CYP2A6 ditemukan lebih tinggi pada populasi di Afrika
dibandingkan populasi berkulit putih. Populasi Afrika merupakan ras negroid yang
memiliki warna kulit yang cenderung lebih hitam. Pada penelitian yang dilakukan
oleh Tanner dan Tyndale (2017), ditemukan bahwa frekuensi bentuk polimorfisme
genotipe loss of function seperti CYP2A6*1/*4 pada populasi ras kulit hitam
sebesar 38%.
Patramurti dkk., (2019) dan Liu dkk., (2011) mengatakan bahwa seorang
individu yang memiliki bentuk heterozigot alel tidak aktif CYP2A6*4
dikategorikan sebagai slow metabolizers, sedangkan bentuk homozigot CYP2A6*4
dikategorikan sebagai poor metabolizers. Genotipe CYP2A6*1/*4 merupakan
salah satu bentuk heterozigot alel gen tidak aktif yang dikategorikan sebagai slow
metabolizers, sedangkan genotipe CYP2A6*4/*4 merupakan salah satu bentuk
homozigot alel gen tidak aktif yang dikategorikan sebagai poor metabolizers.
Individu yang dikategorikan sebagai slow metabolizers dikaitkan dengan
penurunan 50% aktivitas dalam memetabolisme substrat CYP2A6 dari keadaan
normal (Liu dkk., 2011). Penurunan metabolisme dari keadaan normal dapat
mempengaruhi konsentrasi substrat obat di dalam darah dan respon klinis beberapa
terapi obat (Tanner dan Tyndale, 2017). Tanner dkk., (2017) melaporkan bahwa
terjadi penurunan metabolisme senyawa obat letrozole pada seorang individu yang
memiliki genotipe CYP2A6*1/*4. Hal ini ditunjukkan meningkatkan konsentrasi
letrozole pada individu yang memiliki genotipe CYP2A6*1/*4. Selain letrozole,
terdapat beberapa obat yang mengalami penurunan metabolisme pada individu
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
dengan genotipe CYP2A6*1/*4 (Tabel 2). Penurunan metabolisme ini, secara
signifikan berpengaruh terhadap tingkat respon pengobatan menjadi lebih rendah
dan dapat meningkatkan risiko perkembangan penyakit (Tanner dkk., 2017). Oleh
karena itu, polimorfisme CYP2A6 dapat menjadi salah satu pertimbangan dalam
penyesuaian dosis pasien, sehingga dapat mencapai target yang diharapkan.
Tabel 2. Efek Genotipe*1/*4 pada beberapa obat Nama substrak /
obat
Efek
Tegafur Menurunkan metabolisme tegafur menjadi metabolit aktif
5-fluorourasil
Letrozole Menurunkan metabolisme oksidatif letrozole menjadi
bentuk tidak aktif (karbinol)
Asam Valproat Menurunkan metabolisme asam valproat menjadi asam 4-
ene-valproik, asam 3-hidroksi-valproik, asam 4-hidroksi-
valproik dan 5-hidroksi-valproik asam, sehingga
meningkatkan konsentrasi asam valproat
Artesunat (turunan
artemisin)
Menurunkan metabolisme artesunat menjadi metabolit
aktif dihydro-artemisinin
(Tanner dkk., 2017; McDonagh dkk., 2012).
Hasil penelitian ini juga dapat digunakan untuk memprediksikan risiko
terjadinya suatu penyakit, seperti diabetes melitus, kardiovaskular dan kanker. Pada
penelitian ini, subjek uji yang digunakan adalah seorang perokok pasif yang jarang
maupun sering menghirup asap rokok. Asap rokok mengandung beberapa senyawa
berbahaya seperti nikotin dan TSNA (tobacco specific-nitrosamine). Nikotin
dimetabolisme oleh CYP2A6 menjadi metabolit inaktivasi yaitu kotinin yang
selanjutnya dimetabolisme menjadi trans-3’hydroxycotinine (3HC) (Muliaty dkk.,
2010; Tanner and Tyndale, 2017). Keberadaan genotipe CYP2A6*1/*4 pada suku
Papua yang dikategorikan sebalagi slow metabolizers, dapat menurunkan laju
metabolisme nikotin. Hal ini dapat menjadi salah satu faktor risiko terjadinya
penyakit diabetes melitus dan kardiovaskular meningkat. Dampak dari slow
metabolizers dapat meningkatkan kadar nikotin dalam plasma dan dapat
menyebabkan toksisitas nikotin (Muliaty dkk., 2010). Pada penderita diabetes
melitus, penggunaan nikotin dapat menyebabkan resistensi insulin, terjadi
perubahan sekresi insulin dan disfungsi sel β (Sliwinska-Mosson and Milnerowicz,
2017; Ario, 2014). Resistensi insulin terjadi akibat meningkatnya kadar hormon
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
insulin antagonistik yaitu katekolamin sehingga dapat menyebabkan peningkatan
mobilisasi dari gula darah (Benowitz and Burbank., 2017; Ario, 2014).
Penurunan laju metabolisme nikotin akan meningkatkan kadar nikotin di
dalam plasma. Hal ini menjadi salah satu faktor risiko terjadinya penyakit
kardiovaskular melalui peningkatan denyut jantung, tekanan darah dan kerusakan
endotel pembuluh darah koroner (Ljungberg dkk., 2013; Kementerian Kesehatan
Republik Indonesia, 2009). Nikotin dapat meningkatkan lipolisis dan konsentrasi
asam lemak bebas yaitu trigliserida. Penumpukan trigliserida dapat menyebabkan
disfungsi endotel yang memicu terjadinya aterosklerosis. Aterosklerosis dapat
menyebabkan penyempitan saluran pembuluh darah menuju jantung yang
mengakibatkan kurangnya asupan darah untuk otot jantung, sehingga menyebabkan
terjadinya penyakit kardiovaskular (Wowor dkk., 2013; Saesarwati dan Satyabakti.,
2016).
CYP2A6 bertanggung jawab dalam memetabolisme TSNA menjadi
metabolit aktif. Terdapat beberapa jenis TSNA yang memicu terjadinya kanker dari
asap rokok yaitu 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) dan N-
nitrosonornicotine (NNN). NNK dan NNN akan diaktivasi secara metabolik
melalui reaksi α-hidroksilasi menjadi zat perantara yang reaktif seperti methyl
diazonium ion, pyridyloxobutyl diazonium ion dan pyridylhydroxylbutyl diazonium
ion. Perantara reaktif ini dapat terikat dengan DNA sehingga membentuk DNA
adduct yang memicu terjadinya pembentukan kanker pada jaringan yang terpapar
asap rokok, terutama laring dan paru-paru (Chiang dkk., 2011; Raunio and
Rahnasto-Rilla, 2012). Pada individu dengan slow metabolizers dapat menurunkan
laju metabolisme NNK dan NNN, sehingga risiko terjadinya kanker paru-paru
menjadi lebih rendah. Pada penelitian yang dilakukan oleh Tan dkk., (2001),
didapatkan bahwa frekuensi risiko terjadinya kaner paru-paru lebih tinggi pada
individu dengan genotipe CYP2A6*1/*1 dibandingkan dengan individu dengan
genotipe CYP2A6*1/*4. Berdasarkan hasil penelitian ini, maka suku Papua dengan
genotipe CYP2A6*1/*4 memiliki risiko terjadinya kanker paru-paru lebih rendah.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
Namun perokok pasif tetap disarankan untuk menghindari asap rokok, karena
polimorfisme CYP2A6 ini hanya menjadi salah satu faktor prediksi risiko kanker.
KESIMPULAN
1. Subjek uji nonperokok suku Papua Indonesia ditemukan dua macam genotipe
yaitu genotipe gen CYP2A6*1/*4 dan CYP2A6*4/*4.
2. Frekuensi genotipe gen CYP2A6*1/*4 ditemukan pada subjek uji nonperokok
Indonesia sebanyak 66,67% dan CYP2A6*4/*4 sebanyak 33,33%.
SARAN
Pada penelitian selanjutnya, perlu dilakukan identifikasi genotipe gen
CYP2A6*1/*4 pada suku yang berbeda dengan dikaitkan secara langsung pengaruh
konsentrasi subtrat obat pada individu tersebut.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
DAFTAR PUSTAKA
Ario, M. D., 2014. Effect Of Nicotine In Cigarette For Type 2 Diabetes Melitus. J
MAJORITY, 3(7), 75-80.
Benowitz, N, L., dan Burbank, A, D., 2017. Cardiovascular Toxicity of Nicotine:
Implications for Electronic Cigarette Use. Trends Cardiovasc Med, 26(6),
515-523.
B-Rao, C., 2001. Sample size considerations in genetic polymorphism studies.
Chiang, H. C., Wang, C. Y., Lee, H. L., dan Tsou, T. C., 2011. Metabolic effects of
CYP2A6 and CYP2A13 on 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-
butanone (NNK)-induced gene mutation-A mammalian cell-based
mutagenesis approach. Toxicology and Applied Pharmacology, 253, 145-
152.
Faried, Ahmad., Halim, Danny., dan Achmad, T. H., 2019. Biologi Molekuler
Dasar. Penerbit Erlangga, Jakarta. Hal. 146-150.
Fujieda, M., Yamazaki, H., Saito, T., Kiyotani, K., Gyamfi, M. A., Sakurai, M.,
Akita, H. D., Sawamura, Y., Yokota, J., Kunitoh, H., dan Kamataki, T.,
2004. Evaluation of CYP2A6 genetic polymorphisms as determinants of
smoking behavior and tobacco-related lung cancer risk in male Japanese
smokers. Carcinogenesis, 25(12), 2451-2458.
Handani, Dewa, Ayu, Sri., 2019. Identifikasi Alel Gen Sitokrom P450 2a6*4 Pada
Subjek Uji Nonperokok Ras Kulit Hitam Papua Indonesia Dengan Metode
Polymerase Chain Reaction (PCR).
Handoyo, Darmo., dan Rudiretna, Ari., 2001. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan
Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas, 9(1), 17-29.
Hewajuli, Dyah, Ayu., dan NLPI, Dharmayanti., 2014. Perkembangan Teknologi
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam
Mengidentifikasi Genom Avian Influenza dan Newcastle Diseases.
Wartazoa, 24(1), 16-29.
Hidayati., Saleh, E., dan Aulawi, T., 2016. Identifikasi Keragaman Gen BMPR-1B
(Bone Morphogenetic Protein Receptor Ib) Pada Ayam Arab,Ayam
Kampung Dan Ayam Ras Petelur Menggunakan PCR-RFLP. Jurnal
Peternakan, 13(1), 1-12.
Kemenkes RI, 2009. Pedoman Pengendalian Penyakit Jantung dan Pembuluh
Darah.
Liu, T., David, S. P., Tyndale, R. F., Wang, H., Zhou, Q., Ding, P., He, Y. H., Yu,
X. Q., Chen, W., Crump, C., Wen, X. Z., dan Chen, W. Q., 2011.
Associations of CYP2A6 genotype with smoking behaviors in southern
China. National Institutes of Health, 5(106), 984-994.
Ljungberg, L. U., Persson, L., Eriksson, A. C., Green, H., dan Whiss, P. A., 2017.
Effects of nicotine, its metabolites and tobacco extracts on human platelet
function in vitro. Toxicology in Vitro, 27, 932-938.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
López-Flores, L. A., Pérez-Rubio, G., dan Falfán-Valencia, R., 2016. Distribution
Of Polymorphic Variants Of CYP2A6 And Their Involvement In Nicotine
Addiction. EXCLI Journal, 16, 174-196.
Marwayana, O. N., 2015. Ekstraksi Asam Deoksiribonukleat (DNA) Dari Sampel
Jaringan Otot. Oseana, 40(2), 1-9.
McDonagh, E. M., dkk., 2012. PharmGKB summary: Very important
pharmacogene information for cytochrome P-450, family 2, subfamily A,
polypeptide 6. Pharmacogenetics and Genomics, 22(9), 695–708.
Muliaty, D., Yusuf, I., Satiabudy, R., dan Wanandi, S. I., 2010. CYP2A6 Gene
Polymorphisms Impact To Nicotine Metabolism. Med J Indones. 19(1),
46-51.
Novitasari, D. A., Elvyra, R., Roslim, D.I., 2014. Teknik Isolasi dan Elektroforesis
DNA Total pada Kryptopterus Apogon (Bleeker 1851) dari Sungai
Kampar Kiri dan Tapung Hilir Kabupaten Kampar Provinsi Riau. JOM
FMIPA, 1(2), 259- 260.
Patramurti, C., Candaya, E. J., Kiatarto, S. F., dan Karut, A. K., 2019. Polimorfisme
Gen Sitokrom P450 2A6 Alel *1, *4, *7, dan *9 pada Subjek Uji Perokok
Suku Tionghoa Indonesia. Jurnal Farmasi Indonesia, 11(1), 437-445.
Patramurti, C., dan Fenty., 2017. Studi Genotipe Sitokrom P450 2A6 Alel
CYP2A6*4 dan CYP2A6*9 pada Subyek Uji Perokok Suku Jawa
Indonesia. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 15(1), 50-56.
Patramurti, C., Sugiyanto., Nurrochmad, A., dan Martomo, S., 2015. Polymorphism
Of Cytochrome P450 (CYP2A6*1 And CYP2A6*4) Among Javanese
Indonesian Smoker And Non Smoker. Indonesian Journals Pharm, 26(1),
11-19.
Preissner, S. C., Hoffmann, H. F., Preissner, R., Dunkel, M., Gewiess, A., dan
Preissner, S., 2013. Polymorphic Cytochrome P450 Enzymes (CYPs) and
Their Role in Personalized Therapy. PLOS ONE, 8(12).
Raunio, Hannu., dan Rahnasto-Rilla, Minna., 2012. CYP2A6: genetics, structure,
regulation, and function. Drug Metab Drug Interact, 27(2), 73-88.
Saesarwati, Desta., dan Satyabakti, Prijono., 2016. Analisis Faktor Risiko Yang
Dapat Dikendalikan Pada Kejadian PJK Usia Produktif. Jurnal Promkes,
4(1), 22-33.
Styn, M. A., Nukui, T., Romkes, M., Perkins, K. A., Land, S. R., dan Weissfeld, J.
L., 2013. CYP2A6 Genotype and Smoking Behavior in Current Smokers
Screened for Lung Cancer. Subst Use Misuse, 48(7), 490-494.
Tan, W., Chen, G. F., Xing, D. Y., Song, C. Y., Kadlubar, F. F., dan Lin, D. X.,
2001. Frequency Of Cyp2a6 Gene Deletion And Its Relation To Risk Of
Lung And Esophageal Cancer In The Chinese Population. International
Union Against Cancer, 95, 96-101.
Tanner, J. A., dan Tyndale, R. F., 2017. Variation in CYP2A6 Activity and
Personalized Medicine. Journal of Personalized Medicine, 7(18), 1-29.
Tanner, J. A., Henderson, J. A., Buchwald, D., Howard, B. V., Henderson, P. N.,
dan Tyndale, R. F., 2017. Variation in CYP2A6 and nicotine metabolism
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
among two American Indian tribal groups differing in smoking patterns
and risk for tobacco-related cancer. Pharmacogenet Genomics, 27(5), 169-
178.
Tsukino, H., Kuroda, Y., Qiu, D., Nakao, H., Imai, H., dan Katoh, T., 2002. Effects
Of Cytochrome P450 (Cyp) 2a6 Gene Deletion And Cyp2e1 Genotypes
On Gastric Adenocarcinoma. International Union Againts Cancer, 100,
425-428.
Yohana, Kesia., Adisyahputra., dan Trijatmiko, K. R., 2018. Validasi Qtl Dan
Aplikasinya Untuk Perbaikan Sifat Toleran Keracunan Al Pada Padi
(Oryza Sativa L.). BIOMA, 14(1), 37-48.
Zanger, Ulrich, M., Klein, Kathrin., Richter, Tanja., Toscano, Claudia., dan
Zukunft, Jorg., 2005. Impact of Genetic Polymorphism in Relation to
Other Factors on Expression and Function of Human Drug-Metabolizing
P450s. Taylor & Francis Inc, 15, 121-124.
Zdanowicz, Marti, M., dan Adams, Patti, W., 2014. The Pharmacogenetics of
Nicotine Dependence and Smoking Cessation Therapies. Journal
Pharmacogenomics Pharmacoproteimics, 5(4), 1-20.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat Keterangan Layak Etik
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
Lampiran 2. Sertifikat analisis Go Taq Green Master Mix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
Lampiran 3. Informasi Pemakaian Go Taq Green Master Mix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
Lampiran 4. Lembar Infromasi Nucleic Acid Gel Stain
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
Lampiran 5. Lembar Infromasi DNA Ladder
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
Lampiran 6. Elektroforesis Hasil PCR
M 1 2 3 4 5 6 7 M
: 8 9 10 11 12 13 14
M 15 16 17 18 19 20 21 M 22 23 24 25 26 27 28
M 29 30
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
Lampiran 7. Hasil Penelitian
No
Subjek
CYP2A6 Genotipe CYP2A6
*1
(Handani, 2019)
*4 *1/*4 *4/*4
1 - ✓ - ✓
2 - ✓ - ✓
3 - ✓ - ✓
4 - ✓ - ✓
5 ✓ ✓ ✓ -
6 ✓ ✓ ✓ -
7 - ✓ - ✓
8 ✓ ✓ ✓ -
9 ✓ ✓ ✓ -
10 ✓ ✓ ✓ -
11 ✓ ✓ ✓ -
12 ✓ ✓ ✓ -
13 - ✓ - ✓
14 - ✓ - ✓
15 ✓ ✓ ✓ -
16 ✓ ✓ ✓ -
17 ✓ ✓ ✓ -
18 ✓ ✓ ✓ -
19 ✓ ✓ ✓ -
20 ✓ ✓ ✓ -
21 ✓ ✓ ✓ -
22 ✓ ✓ ✓ -
23 - ✓ - ✓
24 ✓ ✓ ✓ -
25 ✓ ✓ ✓ -
26 ✓ ✓ ✓ -
27 ✓ ✓ ✓ -
28 - ✓ - ✓
29 ✓ ✓ ✓ -
30 - ✓ - ✓
Total 20 30 20 10
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
Analisis Hasil Alel:
1. Frekuensi alel CYP2A6*1 yang didapatkan dari penelitian Handani (2019)
dengan menggunakan sepasang primer yang spesifik alel CYP2A6*1
Frekuensi CYP2A6*1 = jumlah alel CYP2A6∗1 yang diperoleh
jumlah seluruh (30) x 100%
= 20
30 x 100% = 66,67%
2. Frekuensi alel CYP2A6*4 yang didapatkan dari penelitian ini dengan
menggunakan sepasang primer yang spesifik alel CYP2A6*4
Frekuensi CYP2A6*4 = jumlah alel CYP2A6∗4 yang diperoleh
jumlah seluruh (30) x 100%
= 30
30 x 100% = 100%
Analisis Hasil Genotipe:
1. Frekuensi genotipe CYP2A6*1/*1 =jumlah genotipe CYP2A6∗1/∗1
jumlah seluruh (30) x 100%
= 20
30 x 100% = 66,67%
2. Frekuensi genotipe CYP2A6*1/*4 =jumlah genotipe CYP2A6∗1/∗4
jumlah seluruh (30) x 100%
= 10
30 x 100% = 33,33%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
Lampiran 8. Lembar Primer PCR alel CYP2A6*4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi yang berjudul “Identifikasi Genotipe Gen
Sitokrom P450 2A6*1/*4 Pada Subjek Uji Nonperokok
Suku Papua Indonesia Dengan Metode Polymerase
Chain Reaction (PCR)” memiliki nama lengkap Ferawati.
Penulis lahir di Bontang pada tanggal 11 November 1998.
Penulis merupakan anak pertama dari empat bersaudara
pasangan Yohanis dan Elisabeth. Penulis telah
menempuh pendidikan formal di TK YPPSB Sangatta
(2003-2005), SD YPPSB sangatta (2005-2011), SMP
YPPSB Sangatta (2011-2014), dan SMA Santo Fransiskus Assisi Samarinda (2014-
2017). Penulis melanjutkan pendidikan sarjana di Fakultas Farmasi, Universitas
Sanata Dharma, Yogyakarta. Semasa menempuh kuliah, penulis aktif berpartisipasi
dalam kegiatan kepanitian seperti anggota sie Konsumsi KPU Fakultas Farmasi
(2018) dan Bendahara Pelepasan Wisuda II (2019). Penulis juga aktif mengikuti
organisasi yaitu DPMF Farmasi periode 2018/2019 sebagai anggota divisi
Advokasi. Selain itu, penulis juga pernah menjadi asisten dosen praktikum yaitu
Kimia Dasar (2018).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI