icaR - sjku.muk.ac.irsjku.muk.ac.ir/article-1-3915-fa.pdf · Sciences, Hamadan, Iran (Corresponding...

8

Scientific Journal of Kurdistan University of Medical Sciences No.93/Mar-Apr 2018

Expression of aap and icaR genes involved in biofilm production in clinical

strains of Staphylococcus aureus resistant to methicillin and gentamicin

Heydari N., MSc1, Tahmasebi H., MSc

2, Zeini B. , MSc

1, Dehbashi S., PhD Student

3,

Arabestani M.R., PhD4 , 5

1. MSc, Department of Microbiology,Hamadan Universi ty of Medical Sciences, Hamadan,

I ran.

2 . MSc, Department of Microbiology,Zahedan Universi ty of Medical Sciences, Zahedan,

I ran.

3 . PhD student, Department of Microbiology,Hamadan University of Medical Sciences,

Hamadan, I ran.

4 . Associate professor, Department of Microbiology,Hamadan Universi ty of Medical Sciences,

Hamadan, Iran .

5 . Associate professor, Nutri t ion Health Research Center, Hamadan Universi ty of Medical

Sciences, Hamadan, Iran (Corresponding Author ),Tel:+98-81-238380755,

[email protected]

ABSTRACT

Backgrounds and Aim: Staphylococcus aureus biofilms are involved in a multitude of

serious chronic infections. Production of biofilms is a defensive-invasive process controlled

and regulated by the aap and icaR genes. The expression levels of these genes play an

important role in the formation of biofilm. The aim of this study was to investigate the

expression of icaR and aap regulatory genes in clinical isolates of S. aureus resistant to

methicillin and gentamicin. Materials and Methods: In this analytical study, among 285 samples, we detected 100

isolates of methicillin resistant and 82 isolates of gentamicin resistant S. aureus. Resistant

strains were evaluated for the presence of biofilm regulatory genes. The expression levels of

regulatory genes were measured by real-time PCR method. We used SPSS software 16 for

statistical analysis and also REST 2008 V3 software for analysis of quantitative results.

Results: Among 100 methicillin resistant and 82 gentamicin resistant isolates of S. aureus the

highest expression levels of icaR and aap genes were detected in the smears obtained from the

wounds and catheters. Moreover, a different pattern of gene expression was observed in

multidrug resistant strains in comparison to the strains with lower rate of resistance. Also,

there was a significant relationship between the presence and activity of regulatory genes and

biofilm formation in different samples (p≤0 / 05).

Conclusion: Considering the frequency of biofilm producing strains of S. aureus in the

smears from the catheters and wounds and also increased gene expression, appropriate

therapeutic measures should be considered for methicillin and gentamicin resistant of S.

aureus.

Keywords: Drug resistance, S. aureus, Virulence factors, Methicillin, Gentamicin, Gene

expression.

Received: Aug 2, 2017 Accepted: Nov 6, 2017

46-7931/17فروردین و اردیبهشت /دوره بیست و سوم /مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی کردستان

بالینی سویه هایدر دخیل در بیوفیلم icaR و aapبیان ژن های میزانبررسی

جنتامایسین و مقاوم به متی سیلین استافیلوکوکوس اورئوس 5و4محمد رضا عربستانی 3ساناز ده باشی ، 1، بهروز زینی2، حامد طهماسبی1 نرگس حیدری

.انشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایرانگروه میکروب شناسی، دانشکده پزشکی، دکارشناس ارشد، .1

.گروه میکروب شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی زاهدان، زاهدان، ایران، کارشناس ارشد.2

.، گروه میکروب شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایراندانشجوی دکتری تخصصی.3

.دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایران، گروه میکروب شناسی، دانشیار .4

،381-238383855:تلفن ثابت ،(مولف مسوول) مرکز تحقیقات سالمت تغذیه، دانشگاه علوم پزشکی همدان، همدان، ایراندانشیار، .5

[email protected]

:چکیده

-یند دفاعیآبیوفیلم یک فرتولید.ونت های مختلفی می باشدمسئول بروز عف استافیلوکوکوس اورئوسبیوفیلم :زمینه و هدف

تشکیل ها نقش بسیار مهمی در قدرت این ژنمیزان بیان .تنظیم می شودکنترل و icaRو aapهای که توسط ژن استتهاجمی

استافیلوکوکوس ینیبال یها جدایهدر aapو icaR یمیتنظ یهاژن انیب زانیم هدف از این مطالعه بررسیبیوفیلم دارند،از این رو .گرفتقرار نیسیو جنتاما نیلیس یمقاوم به مت اورئوس

285از مجموع و جنتامایسین نیلیس یمقاوم به مت استافیلوکوکوس اورئوس جدایه 133تحلیلی، مطالعه نیادر :بررسیروش

جهت. گرفتندرقرا یمولکول-یمک یابیمورد ارز لمیوفیب تنظیمی یمقاوم جهت حضور اپرون ها یها هیسو. شد ینمونه جمع آور

از ( یلیتحل-یفیتوص)یآمار یزهایآنالبه منظور. دیاستفاده گرد Real-Time PCRاز روش تنظیمی یهاژن انیب زانیسنجش م

.استفاده شد REST 2008 V3بدست آمده از نرم افزار یکم جینتا زیاستفاده شد و جهت آنال 11نسخه SPSSنرم افزار

جنتامایسن بدست آمده، جدایه مقاوم به 82مقاوم به متی سیلین و استافیلوکوکوس اورئوسبالینی جدایه 133موعاز مج :یافته ها

عالوه براین، میزان بیان ژن در سویه . در نمونه های زخم وکاتاتر مشاهده شد icaRو aapبیشترین میزان بیان ژن های تنظیمی

همچنین، بین حضور وفعالیت . دارای مقاومت کمتر، دارای الگوی متفاوتی بود های داری مقاومت چندگانه نسبت به سویه های

(.>p 35/3)ژنهای تنظیمی و تولید بیوفیلم در نمونه های مختلف ارتباط معنی داری مشاهده شد

زایش بیان ژنی های بدست آمده ازکاتاتر وزخم، و اف جدایهبا توجه به فراوانی سویه های تولید کننده بیوفیلم در :یریگ جهینت

.دراین نمونه ها،باید الگوی دارویی مناسبی را درسویه های مقاوم به متی سیلین و جنتامایسین اتخاذ نمود

، بیان ژن، متی سیلین، جنتامایسین، عوامل بیماری زااستافیلوکوکوس اورئوسمقاومت دارویی، :واژه های کلیدی

15/8/61:یرشپذ 3/8/61:اصالحیه نهایی 11/5/61:وصول مقاله

47محمد رضا عربستانی

7931یبهشت فروردین و ارد/دوره بیست و سوم /مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی کردستان

مقدمه

که می باشد ها مسیکروارگانیاز م یشامل مجموعه ا لمیوفیب

موجود کی ایزنده و ریجسم غ کی کسیدر سطح و ماتر

متصل شده و سبب ایجاد یک سطج ژله ایی می زنده بهم

و همکاران Heukelekianبیوفیلم اولین بار توسط . شوند

ده قرار گرفت و بصورت یک الیه ناشناس مورد مشاه

تئوری 1688و همکاران در سال Costerton سرانجام

این الیه . (1)حضور بیوفیلم در باکتری ها را ارائه دادند

برای باکتری فراهم می کند، یعالوه بر اینکه محیطی مناسب

شرایط ایده آلی را برای رشد و تکثیر با آن در محیط های

ترین ویژگی های بیوفیلم از مهم. (2)ناپایدار بوجود می آورد

، کمک به بقاء باکتری در شرایط سخت محیطیمی توان به

اثر گذاری ، مزمنایجاد بیماری های نقش در بیماری زایی و

مقاومت دارویی از طریق نفوذ و تقویت ایجادآن در

تسهیل در ، ناپذیری آنتی بیوتیک در ماتریکس پلیمری

زایش جهش های و اف انتقال ژن از طریق کانژوگاسیون

بوجود آمدن سویه ژنتیکی بواسطه این اتصاالت باکتریایی،

های ژنوتیپی جدید در اثر موتاسیون یا جهش در داخل

فعال شدن ژن های مسئول ویروالنس باکتری در و بیوفیلم

. (2و3)، اشاره کردشکل بیوفیلم

در باکتری نقش بیماری زا بودن این الیه پلی ساکاریدی

بطوریکه در ،بسیار مهم می باشد کوس اورئوساستافیلوکو

و یا وابسته به سازمان کمیته کنترل کننده سالمت 2338سال

Healthcare (HICPAC)یا بهداشت جهانی

Infection Control Practices Advisory

Committee خاص، روش های دستورالعملطی یک

را ارئه از جمله بیوفیلم ،مقابله با این عوامل بیماری زا

حضور این الیه توسط گروه خاصی از اوپرون های . (4)داد

ساختاری به نام اوپرون های داخل سلولی یا

Intracellular Adhesin (ICA ) کد می شود که

، icaR ،icaDدارای لوکوس های ژنی مختلف شامل

icaB وicaD ین لوکوس ژنی ارتباط ا. (4و5)می باشد

و یا ساکاریدی داخل سلولی تنگاتنگی با ادهزین های پلیPolysaccharide Intercellular Adhesin

(PIA )(1)دارد .icaR محصول یک پروتئین عبوری از

-N-acetylسطح الیه های غشایی می باشد که با

glucosaminyltransferases دارای همولوژی می

این ژن که یک القا گر اولیه برای شروع ساخت . باشد

می باشد، با دریافت افیلوکوکوس اورئوساستبیوفیلم در

ها باعث بیان آبشاری PIAسیگنال های محیطی بواسطه

این ژن با حضور . (8)می شود icaسایر ژن های لوکوس

UDP-Nacetylglucosamine فعالیت خود را آغاز

می باشد که خاصیت ترانسفرازی icaمی کند و تنها ژن

به سایر ژن ( چاپرون)یک انتقال دهنده پیام icaD. دارد

سبب فعال icaRهای این لوکوس می باشد که با کمک

شدن آنزیم های خاصی جهت ایجاد ارتباط و بیان شدن

icaC باicaR وicaD می شود، بطوریکه وقتی همکاری

icaR وicaD برابر 23شروع می شود، میزان بیان بیوفیلم

که حتی با این امر گاهی سبب می شود. (8)افزایش می باشد

در برخی سویه ها تولید بیوفیلم را شاهد icaRDحضور

که ارتباط بین فضای داخلی و خارجی غشای icaC. باشیم

سیتوپالسمی باکتری را بر عهده دارد، یکی از طوالنی ترین

این بخش سبب ارتباط . توالی های بین غشایی را داراست

icaD ارتباط با قسمت خارجی غشاسیتوپالسمی می شود و

تنها لوکوسی می باشد icaB. (8) می شود icaBآن

بصورت خارج سیتوپالسمی قرار گرفته است و ارتباط

. ها را حفظ می کند PAIسطحی باکتری با

Accumulation-Associated Protein

(AAP) یکی از مهم ترین پروتئین های تنظیمی در تجمع و

پروتئین تحت فعال شدن این. شکل گیری بیوفیلم می باشد

شرایط محیطی و برخی عوامل نامساعد شکل می گیرد که

در نهایت تشکیل بیوفیلم را تشدید می کند، این پروتئین

(.6)کد می شود aapتوسط

...بررسی میزان بیان ژن های 44

7931فروردین و اردیبهشت /دوره بیست و سوم /مجله علمی دانشگاه علوم پزشکی کردستان

استافیلوکوکوس ی، گونه ها1685بار در سال نیاول یبرااین .گزارش شد نیلیس یو مت نیسیمقاوم به جنتاما اورئوس

مقاومت به آنتی بیوتیک های جدید نیز در حالی است که،

عالوه بر این، (. 13)در این جنس در حال گسترش می باشد

برخی عوامل مقاومتی می توانند بین گونه های یک جنس و

یا حتی جنس های مختلف باکتریایی گردش داشته باشند و

سبب انتقال مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی بین باکتری

این انتقال ژنی گاهی بین باکتری .(11)های مختلف شود

لوده کننده مواد غذایی و باکتری های جدا شده از آهای

خصوصا در مورد باکتری . بالین نیز مشکل ساز می شود

(.12)هایی که توانایی تولید بیوفیلم را دارا می باشند

تولید بیوفیلم در در تعیین بیان ژن های دخیل در زمینه ی

و ارتباط آن با مقاومت وکوکوس اورئوساستافیلباکتری

. مطالعات مختلفی صورت گرفته استهای آنتی بیوتیکی

Bintao Cui و همکاران وClaire Marquès و

با مطالعه بر گونه های 2315همکاران هر دو در سال

استافیلوکوکوس، میزان بیان ژن های دخیل در تولید بیوفیلم

مورد بررسی قرار یوتیک هاآنتی ب در سویه های مقاوم به

در این پژوهش ها نشان داده شد که برخی آنتی . دادند

از تولید icaDو icaAبیوتیک ها بطور غیر مستقیم با مهار

(.13و14)بیوفیلم در این باکتری ها جلوگیری کردند

با مطالعه بر 2312و همکاران در سال Atshanهمچنین

یلوکوکوس اورئوساستافروی سویه های حساس و مقاوم

نشاند دادند که بیان برخی ژن های دخیل در بیوفیلم در

با .(15)سویه های مقاوم از میزان بیشتری برخوردار می باشند

توجه به اهمیت نقش برخی مهار کننده ها در بیان ژن های

نقش و جایگاه مهم سویه دخیل در تولید بیوفیلم و همچنین

در افیلوکوکوس اورئوساستهای تولید کننده بیوفیلم

عفونت های بالینی و حتی آلودگی های غذایی، شناسایی

و icaتعیین میزان بیان ژن های لوکوس ژنی این سویه ها و

د نقش موثری اصلی تولید بیوفیلم، می توان کننده هایتنظیم

در مقابله و درمان عفونت های ایجاد شده توسط این باکتری

با تجزیه و تحلیل مقادیر ،طالعهعالوه بر م .داشته باشد

حاصل از بیان ژن های دخیل در تولید بیوفیلم در ایزوله های

می توان بر اساس نوع ،جدا شده از نمونه های بالینی مختلف

نمونه بالینی، دستورالعمل درمانی خاصی را جهت کنترل

تولید کننده بیوفیلم اتخاذ کرد، استافیلوکوکوس اورئوس

یمیتنظ یژن ها انیارتباط ب تعیین مطالعه،ین لذا هدف از ا

aap وicaR استافیلوکوکوس ینیبال یها هیدر سو یها هیو سو نیسیو جنتاما نیلیس یمقاوم به مت اورئوس

.بود حساس

روش بررسی

تحلیلی،که با استفاده از روش نمونه -توصیفی مطالعه دراین

6 دوره یک گیری آسان و دردسترس صورت گرفت، طی

بیماران بستری در بخشهای مختلف نمونه بالینی از 285 ماهه

همدان در سال شهر پزشکی علوم مراکز درمانی دانشگاه

فواصل زمانی نمونه گیری در فصول . جمع آوری شد 1365

نمونه های خرداد تا دیمختلف سال تعیین گردید و از

استافیلوکوکوس اورئوسمختلف بالینی جهت جداسازی

نیز بر اساس معیار ورود وخروج .ری گردیدجمع آو

باکتریایی بودن عفونت های گزارش شده و همچنین طوالنی

در نهایت . در بیمارستان تعیین شدبودن مدت بستری بیماران

مقاوم به متی اورئوس وساستافلوکوکبالینی های جدایه

جهت جداسازی باکتری های مورد . سیلین جدا سازی شد

بیوشیمیایی مختلف نظیر کواگوالز، نظر از تست های

آز استفاده DNAکاتاالز، تخمیر مانیتول و همچنین تست

به منظور جداسازی گونه های استافیلوکوکوس و . گردید

نیز تست اکسیداز مورد استفاده قرار گرفت وسمیکروکوک

.(11و18)

استفاده از باو متی سیلین جنتامایسینسویه های مقاوم به

33و سفوکسیتین میکروگرمی13تامایسین جندیسکهای

انتشار از دیسک با روش( انگلستان ،Mast)میکروگرمی



برای کنترل کیفی و ارزیابی نتایج، از .تعیین گردید

و کنترل منفی ATCC25923 استافیلوکوکوس اورئوسنترل کبعنوان ATCC43300 استافیلوکوکوس اورئوس

(.18و18)مثبت استفاده شد

سایی سویه های تولید کننده بیوفیلم به روش جهت شنا

به این .خانه ای استفاده شد 61فنوتیپی از روش میکرو پلیت

یسو پتویترصورت که بعد از تلقیح باکتری در محیط

ساعته در 24 گرمخانه گذاریو (، آلمانMerck) براث

خانه ای 61درجه، نمونه ها داخل پلیت های 38دمای

تفاده از رنگ کریستال ویوله رنگ آمیزی ریخته شد و با اس

583در نهایت با قرائت جذب نوری در طول موج . شدند

(.16)نانومتر نتایج مورد بررسی قرار گرفت

REboEx با استفاده از کیت RNA Totalاستخراج

صورت گرفت و جهت سنتز (، ایرانپیشگامشرکت )

cDNA نیز از( کیت سنتز شرکتEurxمریکا،آ )اده استف

RNAمراحل نهایی کار از جمله خلوص سنجی . گردید

Total وcDNA از نظر کیفی بر اساس های سنتز شده

نتایج حاصل از الکتروفورز محصوالت بدست آمده بر روی

و همچنین از نظرکمی بر اساس تعیین درصد 5/2ژل آگارز

صورت گرفت و Ares Mمطالعات جذب نوری مطابق با

-83جهت ازمایش نهایی در دمای محصوالت سنتز شده

(.23)درجه سانتیگراد نگهداری شدند

استفاده از روش کمیت بـا مطالعهژنهای مورد میزان بیان

و با استفاده از برای این منظور. سنجی نسبی تعیین شدند

رنگ و Real Time PCRروش

.ارزیابی گردید (، دانمارکAmplicon)1سایبرگرین

23هت انجام واکنش در حجم مخلوط تهیه شده ج

بدین صورت بود که از مستر . میکرولیتر تهیه گردید

میکرولیتر، از 13به میزان ( ، دانمارکAmplicon)میکس

میکرولیتر 1رفت و برگشت ( ، کرهMacrogen)هر پرایمر

حجم . سنتز شده استفاده گردید cDNAمیکرولیتر از 1و

Sigma-شرکت)DEPCباقی مانده با استفاده از محلول

Aldrichفاقد ( ، آمریکاRNA 23به حجم نهای

جهت تکثیر ژن چرخه های دمایی .میکرولیتر رسانده شد

دقیقه مرحله واسرشت سازی 13بصورت های مورد نظر

سیکل برای مراحل 43درجه سانتیگراد و 65اولیه در دمای

درجه 65ثانیه در 33واسرشت سازی ثانویه بمدت

درجه 58ثانیه در دمای 63ال پرایمر به مدت سانتیگرادو اتص

82مرحله طویل سازی نیز در دمای. سانتیگراد لحاظ گردید

تمامی .(1جدول)ثانیه تعیین شد 15درجه سانتیگراد بمدت

Real Time PCRمراحل فوق با استفاده از دستگاه

Step One Plus (ABIآمریکا ، )(. 21)تنظیم گردید

Real Time PCRایمرهای مورد استفاده در واکنش پرمشخصات . 1جدول

ژن های مورد

مطالعه

منبع طول محصوالت توالی نوکلئوتیدی

gmk ATCGTTTTATCGGGACCATC

TCATTAACTACAACGTAATCGTA 318 21

icaR TAA TCC CGA ATT TTT GTG AA

AAC GCA ATA ACC TTA TTT TCC 416 21

aap AGAACCTACAACTTCAGAACCTGTG

AA ACCTTTAACCGTAGTTGGCGGTAT 133 22



Efficiency = 10با استفاده از فرمول (-1/slope)

– 1

بدین . ارزیابی گردید PCR time-Real بازدهی واکنش

های مختلـف از محـصول بـرای این کار رقتصورت که

PCR ل را تهیـه کرده و سپس برای آنها تـستحاص

PCR time-Real انجـام و ازCTاصـل و هـای ح

غلظـت موجـود جهـت ترسـیم نمـودار استاندارد استفاده

Efficiency+1 ها بـر اساس فرمـول محاسـبه بیان ژن. شد

(-ΔCT) و مطالعاتPfaffl method پذیرفت انجام

رانس و یـک یـا چند ژن که در این بررسی یک ژن رف

gmkدر این بررسی از ژن . هدف وجود دارد

بعنوان ژن رفرانس برای ، Guanylate kinaseعامل

.(23)تعیین میزان بیان ژن های مورد مطالعه استفاده شد

بر اساس قطر هاله، با استفاده از تمامی تعیین مقاومت ها

Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI) (.18)صورت گرفت 2311نسخه

Relativeاز تجزیه و تحلیل نتایج حاصل برای

Quantitation و ΔΔtc افـزار رماز ن RG-

REST کایآزمون آماری از . استفاده گردید 2338نسخه-

برای مقایسه یافته های کیفی و تست مثبت مستقل برای دو

در این ) مقایسه یافته های کمی مورد استفاده قرار گرفتند

.(معنی دار در نظرگرفته شد p ≥3/ 35مطالعه مقدار

هایافته

استافیلوکوکوس اورئوسهای بالینی جدایهاز میان تمام

دارای قطر هاله ( درصد 81/35)جدایه133مورد مطالعه،

به متی سیلین میلیمتر بودند که بعنوان مقاوم21یا کمتر از 21

دارای قطر هاله بیشتر از ( درصد 28/14)جدایه 183و

نظر در به متی سیلین میلیمتر بودند که بعنوان حساس21

های بالینی جدایههمچنین از میان تمام . گرفته شدند

مقاوم به متی سلین مورد مطالعه، استافیلوکوکوس اورئوس

یا کمتر از 12دارای قطر هاله ( درصد82)جدایه 82

18میلیمتر بودند که بعنوان مقاوم و 12

میلیمتر بودند 14دارای قطر هاله بیشتر از (درصد18)جدایه

هیچ سویه (. 2جدول)ر نظر گرفته شدندکه بعنوان حساس د

سویه مقاوم به 82از . مقاوم به ونکومایسین دیده نشد

بعد از انجام غربالگری اولیه جهت جنتامایسین و متی سیلین

تعیین سویه های تولید کننده بیوفیلم توسط روش کریستال

. داری تظاهرات فنوتیپی تولید بیوفیلم بودند جدایه 15ویوله،

4از سویه های حساس به متی سیلین و جنتامایسین، همچنین

(.1شکل)بودنددارای دقت باالی تشکیل بیوفیلم جدایه

این مطالعه با محوریت مطالعه بر روی سویه های

دارای مقاومت همزمان به استافیلوکوکوس اورئوس

میزان بیان ژن . جنتامایسین و متی سیلین، صورت پذیرفت

های مقاوم و حساس به متی در سویه icaRو aapهای

ایزوله بالینی 5سیلین و جنتامایسین بدین صورت بود که، در

دارای مقاومت های هم زمان به متی سیلین و جنتامایسین، با

استافیلوکوکوس سویه استاندارد )توجه به سویه کنترل، همه ایزوله ها با افزایش بیان (ATCC25923 اورئوس

(. 1نمودار()3جدول)ودندژن های مورد بررسی همراه ب

حساس به استافیلوکوکوس اورئوسهمچنین در سویه های

سویه )متی سیلین و جنتامایسین نیز با توجه به سویه کنترل

، (ATCC25923 استافیلوکوکوس اورئوساستاندارد

، A1.Sدر سویه های icaRو aapافزایش بیان ژن های

A2.S ،A4.S وA5.S مشاهده شد و سویهA1.S دارای

این (. 2نمودار()4جدول)کاهش بیان ژن های ذکر شده بود

در حالی بود که، مقادیر بیان بدست آمده از میزان بیان ژن

های مورد بررسی در سویه های مقاوم به متی سیلین و

. جنتامایسین بیشتر از سویه های حساس بودند

بر: و نوع نمونه بالینی aapارتباط حضور و میزان بیان ژن

اساس بررسی های کیفی صورت گرفته مبتنی بر آمار

توصیفی، ارتباط معنی داری بین حضور و فعالیت این ژن و

P.valueبطوریکه مقادیر . نوع نمونه بالینی مشاهده شد

بر اساس نوع نمونه و با aapبدست آمده از فعالیت ژن



دو برای نمونه های خون، ادرار، -استفاده از آزمون کای

، 344/3ر، زخم و سواپ بینی به ترتیب کمتر از کاتات

این در حالی بود که میانگین . بود 335/3و 346/3، 331/3

P.value محاسبه شده برای نوع نمونه بالینی و میزان بیان

.بدست آمد 336/3مقدار aapژن

بر : و نوع نمونه بالینی icaRارتباط حضور و میزان بیان ژن

ورت گرفته مبتنی بر آمار اساس بررسی های کیفی ص

توصیفی، ارتباط معنی داری بین حضور و فعالیت این ژن و

P.valueبطوریکه مقادیر . نوع نمونه بالینی مشاهده شد

بر اساس نوع نمونه و با icaRبدست آمده از فعالیت ژن

دو برای نمونه های خون، ادرار، -استفاده از آزمون کای

، 328/3ترتیب کمتر از کاتاتر، زخم و سواپ بینی به

این در حالی بود که میانگین . بود 315/3و 321/3، 333/3

P.value محاسبه شده برای نوع نمونه بالینی و میزان بیان

.بدست آمد 322/3مقدار icaRژن

ه متی سیلینمقاوم ب استافیلوکوکوس اورئوسفراوانی آنتی بیوتیک های مورد مطالعه در سویه های بالینی . 2جدول

حساس آنتی بیوتیک

(درصد)تعداد

نیمه حساس


مقاوم


3 سفوکسیتین

3

133 ـــــــــــ

درصد 133

133 ونکومایسین

درصد133

3 ـــــــــــــ

درصد 3

13 جنتامایسین

درصد 13

5

درصد5

82

درصد 82



بیان با توجه میزان .مقاوماستافیلوکوکوس اورئوس در جدایه های بالینی gmkو icaR و aapبدست آمده از ژن های ( CT) مقادیر چرخه دمایی -3جدول

. در جدول لحاظ شده است ΔΔCT 2-به فرومول

بیان با میزان .حساس فیلوکوکوس اورئوساستاهای بالینی جدایهدر gmkو icaR و aapبدست آمده از ژن های (CT)چرخه دماییمقادیر -4جدول

. در جدول لحاظ شده استΔΔCT 2-توجه به فرومول

ژن رفرانس ژن icaR aap ژن حساسیت واکنش

-ΔΔCT2 3313/1 1443/1 3633/1

چرخه دمایی ژن مقادیر چرخه دمایی

icaR

چرخه دمایی ژن

aap


gmk

aap بیان ژننتیجه icaRنتیجه بیان ژن

18/28 68/28 کنترل 34/25 1 1

A1.S 66/23با کد ایزوله 11/22 61/33 185413113/1 843133831/3

A2.S 44/25 ایزوله با کد 16/23 38/26 582841862/3 141223128/4

A3.S 11/26ایزوله با کد 14/32 88/33 583121515/1 612133155/3

A4.S 11/23ایزوله با کد 22 11/21 113441233/2 131811384/1

A5.S 51/28ایزوله با کد 88/24 36/34 411636423/2 433288888/3

ژن رفرانس ژن icaR aap ژن حساسیت واکنش

-ΔΔCT2 3313/1 1443/1 3633/1

چرخه دمایی ژن مقادیر چرخه دمایی

icaR


aap


gmk

aap نتیجه بیان ژن icaRنتیجه بیان ژن

18/28 68/28 کنترل 34/25 1 1

A1 82/21 11/14ایزوله با کد 61/33 22212626/11 33828381/13

A2 52/25 45/18له با کد ایزو 38/26 538236312/3 236861484/5

A3 28/24 16/26ایزوله با کد 88/33 148488355/5 431588288/1

A4 34/23 25 11/21 481536623/8 363222146/1ایزوله با کد

A5 45/25 68/18ایزوله با کد 36/34 538144383/5 533321331/8



مقاوم به متی سیلین و جنتامایسین بر اورئوس وساستافیلوکوکدر ایزوله های بالینی ( سمت چپ)aapو ( سمت راست)icaRتکثیر ژن های نمودار. 1نمودار

.در نظر گرفته شده است 3331/3میزان ترشولدر . ΔΔCTاساس

حساس به متی سیلین و جنتامایسین بر استافیلوکوکوس اورئوسدر ایزوله های بالینی ( سمت چپ)aapو ( سمت راست)icaRنمودار تکثیر ژن های . 2نمودار

.در نظر گرفته شده است 3331/3میزان ترشولدر . ΔΔCTاساس

کنترل مثبت Aدر ردیف 2کنترل منفی و چاهک Aدر ردیف 1چاهک شماره . تشخصی سویه های حامل بیوفیلمنتیجه حاصل از تست فنوتیپی -1 شکل



بحث

به منظور حفظ بقای خود کوس اورئوسکواستافیلوباکتری

در شرایط ناپایدار محیطی، در گذر زمان، دچار تغییرات

یکی از مهم ترین مواردی که می توان به. زیادی شده است

آن اشاره کرد، توانایی این باکتری در تولید الیه های

خارجی جهت اتصال قوی تر و مقاومت بیشتر در برابر

بیوفیلم یکی از این عوامل . عوامل از بین برنده می باشد

خارجی می باشد که می تواند عالوه بر ایفای نقش خود در

بیماری زایی، نقش موثری در بروز مقاومت های آنتی

مقاومت به متی سیلین و جنتامایسین . کی نیز داشته استبیوتی

، یکی از مهم ترین موارد استافیلوکوکوس اورئوسدر

مقاومت آنتی بیوتیکی است که درمان عفونت های وابسته به

دخالت . (23)این باکتری را با مشکالتی مواجه کرده است

ژن های مختلف در تولید بیوفیلم و نقش آنها در کنترل

، می استافیلوکوکوس اورئوسد این عامل بیماری زا در تولی

تواند این باکتری را در برابر نفوذ برخی آنتی بیوتیک های

. موثر بر دیواره سلولی و یا قسمت های داخلی، مقاوم کند

به خوبی مشخص شده icaدر این بین نقش لوکوس

و همکاران در مطالعه خود گزارش Cramiton .(24)است

استافیلوکوکوس اورئوسعدم تشکیل بیوفیلم در کردند که

بر طبق یافته .باشد ica ممکن است در نتیجه حذف اپرون

حتی در آمریکا 2312در سال و همکاران suzuki های

محل آناتومیک و محیط فیزیولوژیکی که از آن نمونه ها

جدا شده است ممکن است در تشکیل بیوفیلم تاثیرگذار

های جدا شده جدایهدر ica وانی اپرونباشد به طوریکه فرا

از شده جدا های جدایه در ودرصد 13از کیسه ملتحمه

ین در حالی ا. (25و21)است شده گزارشدرصد 15پوست

مده از نمونه آهای بدست جدایهدر مطالعه حاضر است که

های خون و ادرار و کاتاتر دارای بیشترین فعالیت تولید بیان

و A1بطوریکه نمونه های . بودند icaRو aapژن های

A4 که از کاتاتر و خون جدا شدند دارای باالترین میزان

اطالعات بدست . بیان ژنی با توجه به نمونه کنترلی بودند

آمده از این تحقیق با نتایج بدست آمده از مطالعات ذکر

یکی از مهم ترین فعالیت . شده همخوانی نزدیکی داشت

باکتری به سطوح و همچنین های بیوفیلم در اتصال

این ابزارآالت که در مواردی . ابزارآالت پزشکی می باشد

همچون تزریق و یا خونگیری استفاده می شود، می تواند با

منتشر کردن باکتری، سبب ایجاد عفونت های منتشر

از این رو، سویه هایی که از نمونه . استافیلوکوکوسی شود

دا شده اند، این احتمال را های کاتاتر و یا زخم و ادرار ج

می توان داد که از نظر فعالیت ژن های دخیل در تولید و

این در حالی بود که، با (. 25)تنظیم بیوفیلم، بیشتر باشد

دو بین نوع نمونه های بالینی -یاستفاده از آزمون آماری کا

ارتباط معنی داری icaRو aapو میزان بیان ژن های

برای هر یک به ترتیب P.valueمشاهده شد که مقادیر

. بدست آمد 322/3و 336/3

در میزان بالینی عالوه بر اینکه برخی عوامل مانند نوع نمونه

در باکتری مبیان ژن های کنترلی مهم در تولید بیوفیل

، نقش موثری دارند، برخی عوامل استافیلوکوکوس اورئوس

ی دیگر، مانند حضور آنتی بیوتیک ها و ظهور سویه ها

مقاوم نیز می تواند بیان این ژن ها را تحت اثر خود قرار

در اسپانیا، با 2315و همکاران در سال Saising. (8)دهد

مطالعه بر روی اثر مهاری برخی از آنتی بیوتیک ها بر تولید

ها، نشان دادند که استافیلوکوکوسبیوفیلم در

rhodomyrtone نتی بیوتیک طبیعی می آبعنوان یک

د عالوه بر مهار ستنر بیوفیلم، باکتری های مقاوم در این توان

نتایج تایید کنندهاین امر . (28) جنس را نیز از بین ببرد

بدست آمده در این پژوهش می باشد، بطوریکه با بیان

سنجی سویه های حساس و مقاوم به آنتی بیوتیک ها متی

ا در سیلین و جنتامایسین، دیده شد که میزان بیان این ژن ه

. سویه های حساس به میزان قابل توجهی با کاهش روبرو بود

در مطالعات مختلف نیز می توان دخالت حضور و اثر آنتی

بیوتیک ها بر بیان ژن های دخیل در تولید بیوفیلم را مشاهده



و Bintao Cuiکرد، بطوریکه در بررسی هایی که توسط

در 2315در سال استافیلوکوکوسهمکاران بر گونه های

استرالیا صورت گرفت مشخص شد، اثر بخشی آنتی بیوتیک

در . اریترومایسین بر تولید بیوفیلم را مورد بررسی قرار دادند

این پژوهش نشان داده شد که برخی آنتی بیوتیک ها بطور

از تولید بیوفیلم در این icaDو icaRغیر مستقیم با مهار

و Claire Marquès .(28)باکتری ها جلوگیری کردند

با مطالعه بر روی در فرانسه 2315در سال همکاران

و اثر بخشی آنتی بیوتیک های استافیلوکوکوس اورئوس

، عملکرد جنتامایسین، فیلممختلف بر مهار تولید بیو

سفتارولین، سفازولین، اوفلوکساسین و گروهی دیگر از آنتی

گزارش داده icaRو icaبیوتیک ها بر گروه ژنی

با نتایج مطالعه حاضر مشابهنتایج این مطالعات که .(26)شد

است، این امر را بیان می کند که بین سویه های حساس به

آنتی بیوتیک و مقاوم به آنتی بیوتیک می تواند اختالفات

زیادی از نظر کد شدن برخی ژن های پایه ای موثر بر تولید

ژن های این در حالی است که، برخی. بیوفیلم داشته باشند

که تولید عوامل بیماری زای agrکنترلی مانند

از جمله بیوفیلم را کنترل می استافیلوکوکوس اورئوس

کنند، هم در برخی سویه های مقاوم می تواند حالت

افزایشی به خود بگیرد که در نهایت افزایش بیان ژن های

را به دنبال خواهد icaR aapپایین دستی از جمله

رنهایت با اطالعات بدست آمده از این تحقیق د. (33)داشت

که نشان دهنده حجم گسترده ای از مقاومت های چندگانه

نیز می باشد، فعالیت این سویه ها که قدرت بیماری زایی

محیطی نیز حفظ می کنند، با نامساعد خود را در شرایط

حذف برخی اوپرون های واسط و باال بردن تولید بیوفیلم

کاهش آسیب پذیری خود، مقاومت آنتی خود، در کنار

.(33)بیوتیکی خود را نیز افزایش می دهند

نتیجه گیری

بیوفیلم می تواند در سویه دمیزان بیان ژن های دخیل در تولی

دارای مقاومت و حساسیت استافیلوکوکوس اورئوسهای

این در حالی است که، برخی . به آنتی بیوتیک متفاوت باشد

ی پرکاربرد که سبب ظهور سویه های مقاوم آنتی بیوتیک ها

می شوند، می توانند تحت تاثر حضور برخی عوامل پوششی

مانند بیوفیلم دچار کاهش قدرت اثر بخشی و یا حتی از

نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد . دست دادن آن شوند

می تواند در سویه های icaRو aapکه بیان ژن های

مقاوم و حساس به متی سیلین و ساستافیلوکوکوس اورئو

از این رو، می توان این . جنتامایسین کامال متفاوت باشد

نتیجه را گرفت که عوامل بیماری زا مانند بیوفیلم، در کنار

تحریک بیش از حد سیستم ایمنی و بروز فعالیت های

ایمونولوژیکی حاد، می توانند در نحوه و توع مقاومت های

. وثر باشندآنتی بیوتیکی نیز م

ینتشکر و قدردا

با شماره 1365این مقاله حاصل طرح دانشجویی در سال

و کد اخالقی 658134233

R.UMSHA.REC.1395.326 که با حمایت مالی

معاونت پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی همدان به انجام

نویسندگان مراتب تشکر و قدردانی خود را از . رسیده است

.ابراز می دارداین معاونت محترم

References

1. Foster TJ, O'Reilly M, Patel AH, Bramley AJ. Genetic studies of Staphylococcus aureus

virulence factors. Antonie Van Leeuwenhoek 1988; 54:475-82.

2. Oyama T, Miyazaki M, Yoshimura M, Takata T, Ohjimi H, Jimi S. Biofilm-Forming

Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Survive in Kupffer Cells and Exhibit High

Virulence in Mice. Toxins (Basel) 2016; 8: 223-39.



3. Rahimi F, Katouli M, Karimi S. Biofilm production among methicillin resistant

Staphylococcus aureus strains isolated from catheterized patients with urinary tract infection.

Microb Pathog 2016; 9: 69-76.

4. Thilakavathy P, Priyan RM, Jagatheeswari PA, Charles J, Dhanalakshmi V, Lallitha S, et

al. Evaluation of Ica Gene in Comparison with Phenotypic Methods for Detection of Biofilm

Production by Coagulase Negative Staphylococci in a Tertiary Care Hospital. J Clin Diagn

Res 2015; 9: 16-9.

5. Tyner H, Patel R. Propionibacterium acnes biofilm - A sanctuary for Staphylococcus

aureus Anaerobe 2016; 409: 63-7.

6. Namvar AE, Asghari B, Ezzatifar F, Azizi G, Lari AR. Detection of the intercellular

adhesion gene cluster (ica) in clinical Staphylococcus aureus isolates. GMS Hyg Infect

Control 2013; 8: 3-15.

7. O'Gara JP. Ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus

epidermidis and Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett 2007; 270: 179-88.

8. Costa MO, Beltrame CO, Ferreira FA, Botelho AM, Lima NC, Souza RC, et al. Complete

Genome Sequence of a Variant of the Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus ST239

Lineage, Strain BMB9393, Displaying Superior Ability To Accumulate ica-Independent

Biofilm. Genome Announc 2013; 1: 119-29.

9. Ulrich M, Bastian M, Cramton SE, Ziegler K, Pragman AA, Bragonzi A, et al. The

staphylococcal respiratory response regulator SrrAB induces ica gene transcription and

polysaccharide intercellular adhesin expression, protecting Staphylococcus aureus from

neutrophil killing under anaerobic growth conditions. Mol Microbiol 2007; 65 :1276-87.

10. Heydari N, Alikhani M Y, Azizi Jalilian F, Tahmasebi H, Arabestani M R. Evaluation of

real time PCR for detection of clinical isolates of Staphylococcus aureus and methicillin-

resistance strains based on melting curve analysis method. Koomesh 2017; 19 :877-86. [In

Persian]

11. Arabestani M R, Tahmasebi H, Zeyni B. Diagnostic Value of Melting Curve Analysis

Based on Multiplex-Real Time PCR in Identification of Enterococci Species . Mazandaran

Univ Med J 2017; 26 :234-47.[In Persian]

12. Zeyni B, Arabestani M, YuosefiMashof R, Tahmasebi H. Evaluation of Real-time PCR-

based DNA melting method for detection of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium

in clinical isolates. BUMJ 2017; 19 :26-33.[In Persian]

13. Kyoui D, Hirokawa E, Takahashi H, Kuda T, Kimura B. Effect of glucose on Listeria

monocytogenes biofilm formation, and assessment of the biofilm’s sanitation tolerance.

Biofouling 2016; 32: 815-26.

14. Khangholi M, Jamalli A. The Effects of Sugars on the Biofilm Formation of Escherichia

coli 185p on Stainless Steel and Polyethylene Terephthalate Surfaces in a Laboratory Model.

Jundishapur J Microbiol 2016; 9: e40137.

15. Jahid IK, Lee NY, Kim A, Ha SD. Influence of glucose concentrations on biofilm

formation, motility, exoprotease production, and quorum sensing in Aeromonas hydrophila. J

Food Prot 2013;76:239-47.

16. Bokaeian M, Tahmasebi H. Molecular Identification of Genes Responsible for Resistance

to Aminoglycosides and Methicillin in Clinical Samples of Staphylococcus Aureus. BUMJ

2017; 19:38-46.[In Persian]

17. CLSI. M100-S25 performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Twenty-

fifth informational supplement; 2015.



18. Arabestani MR, Rastiany S, Mousavi SF, Ghafel S, Alikhani MY. Identification of toxic

shock syndrom and exfoliative toxin genes of Staphylococcus aureus in carrier persons,

resistant and susceptible methicillin. Tehran Univ Med J 2015; 73: 554-60.[In Persian]

19. Jain A, Agarwal A. Biofilm production, a marker of pathogenic potential of colonizing

and commensal staphylococci. J Med Microbiol 2009;76:88-92.

20. Ares M. Bacterial RNA isolation. Cold spring harbor protocols 2012; 12:1024-7.

21. Chan WS, Chan TM, Lai TW, Chan JFW, Lai RWM, Lai CKC, et al. Complementary use

of MALDI-TOF MS and real-time PCR–melt curve analysis for rapid identification of

methicillin-resistant staphylococci and VRE. J Antimicrob Chemother 2015;70: 441-7.

22. Arciola CR, Gamberini S, Campoccia D, Visai L, Speziale P, Baldassarri L, et al. A

multiplex PCR method for the detection of all five individual genes of ica locus in

Staphylococcus epidermidis. A survey on 400 clinical isolates from prosthesis-associated

infections. J Biomed Mater Res A 2005;75:408-13.

23. Pfaffl WM. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR.

Nucleic Acids Res 2001;29:45.

24. Zmantar T, Kouidhi B, Miladi H, Mahdouani K, Bakhrouf A. A microtiter plate assay for

Staphylococcus aureus biofilm quantification at various pH levels and hydrogen peroxide

supplementation. New Microbiol 2010; 33: 137-45.

25. Cramiton SE, Gerke C, Gotz F. In vitro methods to study staphylococcal biofilm

formation. Methods Enzymol 2001; 336: 239-55.

26. Suzuki T, Kawamura Y, Uno T, Ohashi Y, Ezaki T. Prevalence of Staphylococcus

epidermidis strains with biofilm-forming ability in isolates from conjunctiva and facial skin.

Am J Ophthalmol 2005; 140: 844-50.

27. Saising J, Götz F, Dube L, Ziebandt AK, Voravuthikunchai SP. Inhibition of

staphylococcal biofilm-related gene transcription by rhodomyrtone, a new antibacterial agent.

Ann Microbiol 2015; 65: 659-65.

28. Cui B, Smooker PM, Rouch DA, Deighton MA. Effects of erythromycin on the

phenotypic and genotypic biofilm expression in two clinical Staphylococcus capitis

subspecies and a functional analysis of Ica proteins in S. capitis. J Med Microbiol 2015; 64:

591-604.

29. Marques C, Tasse J, Pracros A, Collin V, Franceschi C, Laurent F, et al. Effects of

antibiotics on biofilm and unattached cells of a clinical Staphylococcus aureus isolate from

bone and joint infection. J Med Microbiol 2015; 64:1021-6.

30. Dai Y, Chang W, Zhao C, Peng J, Xu L, Lu H, et al. VraR Binding to the Promoter

Region of agr Inhibits Its Function in Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus

(VISA) and Heterogeneous VISA. Antimicrob. Agents Chemother 2017; 61: e02740-16.

icaR - sjku.muk.ac.irsjku.muk.ac.ir/article-1-3915-fa.pdf · Sciences, Hamadan, Iran (Corresponding...

Documents

Transcript of icaR - sjku.muk.ac.irsjku.muk.ac.ir/article-1-3915-fa.pdf · Sciences, Hamadan, Iran (Corresponding...