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HIDATIDOSIS HUMANA: OBSERVACIONES EN LA DETECCION DE
ANTICUERPOS IgG anti Echinococcus granulosus
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“The thing that makes science a distressing occupation is the
work of others”
André Lwoff, Premio Nobel de Fisiología o Medicina del año 1965
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FRANCOIS JACOB
Genetics of the bacterial cell Nobel Lecture, December ll, 1965 If I find myself here today, sharing with Andre Lwoff and Jacques Monod this
very great honor which is being bestowed upon us, it is undoubtedly because,
when I entered research in 1950, I was fortunate enough to arrive at the right
place at the right time. At the right place, because there, in the attics of the
Pasteur Institute, a new discipline was emerging in an atmosphere of
enthusiasm, lucid criticism, nonconformism, and friendship. At the right time,
because then biology was bubbling with activity, changing its ways of
thinking, discovering in microorganisms a new and simple material, and
drawing closer to physics and chemistry. A rare moment, in which
ignorance could become a virtue.
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Según V.C.W. Tsang (1981) el clásico aumento de la
actividad específica observado en la purificación
secuencial de una única actividad bioquímica no es
observado en el fraccionamiento secuencial de material
parasitario debido a la multiplicidad de actividades
antigénicas y a la pérdida de actividades antigénicas
durante el proceso de purificación.
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…may be the inclusion of host and parasite molecules in
stable molecular complexes …….All the former authors
separated host components completely before isolating
parasite antigens, and immunological reactions with these
resulting antigens were often less effective than those
performed with total hydatid fluid. Our data indicate that
the parasite antigens of hydatid fluid may be similar to host
antigens; thus, the elimination of host componentes could
lead to the loss of immunoreactive parasite substances...
Mario Pezzella,1984
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….in the present study, an ELISA was used that incorporated
crude E. granulosus hydatid cyst fluid rather than purified
antigen (antigen B or antigen 5) as used in previous studies.
Our rationale was that the broad diversity of antigens present in
crude hydatid cyst fluid might enhance detection of subclass
antibodies with different antigen specificities….
Lawn and others, 2004
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OBTENCIÓN DEL RECURSO BIOLÓGICO PARA LA
PRODUCCIÓN DE ANTÍGENOS
(a) (b)
Figura 1. Quistes hidatídicos en un pulmón ovino (a) y en un hígado ovino (b) que provienen de un animal recién faenado.
(a) (b)
Figura 2. Extracción de líquido hidatídico (a) y de membrana (b) de un quiste hidatídico localizado en pulmón ovino.
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Figura 3. Cosecha de protoescólices seleccionados por velocidad de sedimentación. La aspiración de líquido desde la superficie
comenzó dos minutos después de adicionar cuidadosamente a la parte superior el sedimento conteniendo los protoescólices no
seleccionados.
(a) (b)
Figura 4. Protoescólices seleccionados. Protoescólex evaginado (). Amplificación x 100 (a). Con mayor aumento (x 400) (b).
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CARACTERIZACIÓN DE FRACCIONES OBTENIDAS DE LÍQUIDO
HIDATÍDICO DE HUÉSPED OVINO POR ELECTROFORESIS EN GEL DE
POLIACRILAMIDA CON DODECIL SULFATO DE SODIO (SDS-PAGE)
A B C D E F G
kDa
46.9
103
34.1
28.5
20.2
81
kDa
103
81
34.1
28.5
20.2
46.9
.Análisis por SDS-PAGE 15% (A, B, C, y D) y SDS-PAGE 12% (E,
F y G).
Líneas A y E: marcadores de pesos moleculares. Línea B: LPLHB;
Línea C y F: LP y Líneas D y G: fracción enriquecida en antígeno B
obtenida a partir de LP. LPLHB: Antígeno LP obtenido a partir de
líquido hidatídico bovino (Pdo 0.05 M pH 5). LP: Antígeno obtenido
a partir de líquido hidatídico ovino (Pdo 0.05 M pH 5).
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UNIDADES DE ACTIVIDAD
ANTIGÉNICA CON LOS SIGUIENTES
SUEROS
RELACIÓN DE
REACTIVIDAD
CRUZADA
(T-N)/(E-N)
Fracción
Fase Sólida
E.g
(E)
Toxocara (T)
Normal
(N)
LP
Polysorp
421
11
1
0.024
B
Maxysorp
370
61
0.9
0.163
Pr
Maxysorp
246
1.8
0.9
0.004
LP: fracción enriquecida en antígeno 5 y en antígeno B. B: fracción enriquecida en antígeno B
obtenida a partir de la fracción LP. Pr: fracción derivada de protoescólices. E: suero humano
hidatídico (HAI Reactivo título 16384, WB Positivo, Arco 5 Positivo) próximo al límite superior del
rango dinámico. T: suero heterólogo de un paciente con prueba serológica anti antígeno purificado
de Toxocara reactivo. N: suero de una persona considerada sana. Unidades de actividad
antigénica: miliunidades Abs 630 nm/min.
Cuantificación de las reactividades antigénicas y reactividades
cruzadas de las fracciones LP, B y Pr mediante un ensayo Peroxidasa
IgG K-ELISA.
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(-) (+) LP
B 5
SCI
SC
Análisis antigénico de la fracción LP por inmunoelectroforesis frente a suero de
conejo inmunizado con la preparación LP. Canaleta SCI: suero de conejo
inmunizado con la fracción LP obtenido 21 días luego de la segunda dosis.
Canaleta SC: suero de conejo obtenido antes de la inmunización con la primer
dosis de LP. B y 5 indican los sistemas precipitantes considerados como
antígeno 5 – anti antígeno 5 y antígeno B –anti antígeno B. El arco más
catódico no esta identificado. (+) ánodo ó polo positivo. (-) cátodo ó polo
negativo.
Caracterización de la fracción LP por Inmunoelectroforesis
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0
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30
40
50
60
70
80
0 5 10 15 20 25
Antígeno LP. Concentración de Proteínas (ug/mL)
miliunid
ades A
bs 6
30 n
m/m
in
Lote 402
Lote 703
Lote 402
Lote 703
Ensayo Peroxidasa IgG K-ELISA: cuantificación de actividades antigénicas y comparación de
dos lotes de antígeno LP. Concentración suero humano hidatídico: 10 L/mL. Las magnitudes
(miliunidades Abs 630nm/min) se indican en la ordenada y las concentraciones de antígeno LP
(proteína) en g/mL en la abscisa. Nivel de reactividad cruzada (lote 703 y lote 402 ▲):
unidades de actividad antigénica determinada frente a un suero heterólogo (anti Toxocara
Reactivo) a una concentración de 10 L/mL.
ENSAYO PEROXIDASA IgG K-ELISA: RELACIÓN ENTRE LA VELOCIDAD
DE LA REACCIÓN Y LA CONCENTRACIÓN DE ANTÍGENO LP.
REPRODUCIBILIDAD LOTE A LOTE
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0
20
40
60
80
100
120
140
0 10 20 30 40 50
Antígeno B. Concentración de Proteínas (ug/mL)
miliu
nid
ade
s A
bs
63
0 n
m/m
in Suero JG
Suero MJ
Suero LV
Suero O
Ensayo Peroxidasa IgG K-ELISA. Relación entre las unidades de actividad
enzimática (miliunidades Abs 630 nm/min) indicadas en la ordenada y las
concentraciones de antígeno B (µg/mL) colocadas en la abscisa. Suero
hidatídico MJ. Suero hidatídico LV. Suero hidatídico JG y Suero no
hidatídico O.
ENSAYO PEROXIDASA IgG K-ELISA: RELACIÓN
ENTRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN Y LA
CONCENTRACIÓN DE ANTÍGENO B
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R2 = 0,997
R2 = 0,9996
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12
uL de suero / mL
miliu
nid
ade
s A
bs
63
0 n
m/m
in
Suero BR
Suero CE
Suero TC
Ensayo Peroxidasa IgG K-ELISA para actividad anticuerpo anti antígeno LP.
Antígeno LP en el nivel de saturación. Relación entre las unidades de actividad
enzimática (miliunidades Abs 630nm/min) indicadas en la ordenada y las
actividades anticuerpo (diluciones de los sueros en µL/mL) colocadas en la
abscisa. Suero hidatídico BR (WB Positivo, arco 5 Positivo, HAI título Reactivo
2048). Suero hidatídico CE (WB Positivo, arco 5 Negativo, HAI título Reactivo
256). Suero no hidatídico TC con actividad anti cardiolipina.
ENSAYO PEROXIDASA IgG K-ELISA: RELACIÓN
ENTRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN Y LA
ACTIVIDAD ANTICUERPO ANTI ANTÍGENO LP
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1 2 3 4 5 6 7 8
Ensayo Peroxidasa IgG K-ELISA: detección de actividad anticuerpo anti
antígeno LP. Antígeno LP en el nivel de saturación. Solución sustrato TMB-
H202. Pocillo 8: suero humano hidatídico Reactivo bajo; Pocillo 7: suero
humano hidatídico Reactivo alto; Pocillo 3: suero humano clasificado como
Reactivo; Pocillos 1, 2, 4, 5 y 6: sueros humanos clasificados como No
Reactivos.
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Ensayo Peroxidasa IgG K-ELISA: detección de actividad anticuerpo anti antígeno
Pr. Antígeno derivado de protoescólices (Pr) en el nivel de saturación. Solución
sustrato TMB-H202. Pocillo 1: suero humano hidatídico Reactivo bajo; Pocillo 2:
suero humano hidatídico Reactivo alto; Pocillo 6: suero humano clasificado como
Reactivo; Pocillos 3, 4, 5, 7 y 8: sueros humanos clasificados como No Reactivos.
ENSAYO PEROXIDASA IgG K-ELISA: RELACIÓN ENTRE
LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN Y LA ACTIVIDAD
ANTICUERPO ANTI ANTÍGENO Pr
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Ensayo Peroxidasa IgG K-ELISA: detección de actividad anticuerpo anti antígeno
B. Preparación enriquecida en antígeno B en el nivel de saturación. Solución
sustrato TMB-H202. Pocillo 8: suero humano hidatídico Reactivo bajo; Pocillo 7:
suero humano hidatídico Reactivo alto; Pocillos 1, 2, 3, 4, 5 y 6: sueros humanos
clasificados como No Reactivos.
ENSAYO PEROXIDASA IgG K-ELISA: RELACIÓN
ENTRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN Y LA
ACTIVIDAD ANTICUERPO ANTI ANTÍGENO B
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REPRODUCIBILIDAD INTRA ENSAYO DE LA
TÉCNICA PEROXIDASA IgG ELISA APLICADA A LA
DETECCIÓN DE ACTIVIDAD ANTICUERPO ANTI
ANTÍGENO B, LP ó Pr
Unidades de Actividad
Suero Homólogo Suero Heterólogo Suero Sano
Ensayo Antígeno
miliu/min
Abs (X)
miliu
Abs (X) CV
miliu/min
Abs
miliu
Abs
miliu/min
Abs
miliu
Abs
K-ELISA B 4.35 7.0% 0.75 0.6 ELISA CPF B 168 2.7% 69 65
K-ELISA LP 104.9 2.1% 2 0.6
ELISA CPF LP 492 3.0% 63 58
K-ELISA Pr 81.7 4.0% 1.5 ND
ELISA CPF Pr 583 3.9% 63 ND
Valores de actividad obtenidos al aplicar el ensayo Peroxidasa IgG ELISA
a la detección de actividad anticuerpo en réplicas de un suero homólogo.
Unidades de actividad expresadas como miliuAbs/min ó miliuAbs. miliuAbs/min: miliunidades absorbancia a
630nm/min. miliuAbs: miliunidades absorbancia a 630 nm (lecturas de absorbancia a 630 nm x 1000). X: media
aritmética. CV: coeficiente de variación expresado en %. Suero homólogo: suero humano hidatídico.
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REPRODUCIBILIDAD INTER ENSAYO AL APLICAR LA
TÉCNICA PEROXIDASA IgG ELISA A LA DETECCIÓN DE
ACTIVIDAD ANTICUERPO ANTI ANTÍGENO LP
Ensayo Peroxidasa IgG K-ELISA. Reproducibilidad inter ensayo. Valores de actividad
(miliunidades Abs/min) corregidos y llevadas a la misma escala relativa.
UNIDADES DE ACTIVIDAD
E1 E2 E3 E4
Suero
miliu/min
Abs
miliu/min
Abs
miliu/min
Abs
miliu/min
Abs
Hid1 7.1 5.6 8.5 9.2
Hid2 13 12.6 14 16.5
Hid3 28 28.9 26 22
Hid4 212 224 189 208
N 0.6 0.9 1.6 2.2
Het 1.8 1.8 ND ND
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APLICACIÓN DE LA TÉCNICA DE INMUNOTRANSFERENCIA
(Western blot) AL ANÁLISIS DE LA RESPUESTA
ANTICUERPO BASADA EN LOS ANTÍGENOS RECONOCIDOS
Tiras 1, 2, 3, 4 y 5: sueros humanos hidatídicos provenientes de la consulta espontánea. Tiras 6, 7,
8, 9, 10 y 11: sueros humanos hidatídicos provenientes de estudios seroepidemiológicos. Tiras 12,
13 y 14: sueros humanos no hidatídicos con reactividad anti Toxocara. Las flechas señalan las
bandas de mayor especificidad (9, 16 y 26 kDa) y una no específica (60 kDa).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
14
60
26
16
9
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Técnica Positivos/Total Sensibilidad %
HAI 91/105 87
IgG K-ELISA Ag LP 103/106 97
IgG K-ELISA Ag B 94/106 89
IgG K-ELISA Ag Pr 98/106 92
IB 87/102 85
arco 5 39/102 38
Sensibilidades. Reacciones positivas obtenidas en sueros de
pacientes hidatídicos de la consulta espontánea con las
pruebas HAI, arco 5, IB y Peroxidasa IgG K-ELISA con el
antígeno LP (Ag LP) ó el antígeno Pr (Ag Pr) ó el antígeno B
(Ag B).
Sensibilidad: PVx100/(PV+FN). PV: positivo verdadero. FN: falso negativo
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(A) Imagen quística localizada en cerebro (QH) revelada por tomografía axial computada en el
niño QM de 8 años sintomático procedente de la localidad de Dolavon, Provincia de Chubut, con
pruebas serológicas negativas para detección de anticuerpos anti antígenos de Echinococcus
granulosus. (B) Quiste obtenido mediante procedimiento quirúrgico de aproximadamente 8 cm en
sentido horizontal y derivado al laboratorio donde se extrajo líquido y membrana. No se
observaron protoescólices.
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Quiste hidatídico localizado en el canal medular del paciente CC de 42 años sintomático con
residencia previa en los Departamentos Tehuelches y Gaiman de la Provincia de Chubut y con
prueba de inmunotransferencia positiva para la detección de anticuerpos anti antígenos de
Echinoccocus granulosus de 9, 16 y 26 kDa. Quiste obtenido mediante procedimiento quirúrgico y
derivado al laboratorio. Medida aproximada del quiste en sentido horizontal: 2.2 cm. Volumen de
líquido extraído: 1.8 ml. Se observaron protoescólices.
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Paciente masculino PT de 70 años procedente de la localidad de Paso de Indios. Quiste hidatídico
localizado en bazo de 5.5 cm obtenido mediante procedimiento quirúrgico (A) y derivado al
laboratorio donde luego de seccionarlo se constata la calcificación () y la ausencia de líquido
hidatídico (B).
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Ensayo IgG K-ELISA
Número de sueros con reacción positiva
Grupo no hidatídico Total Ag LP Ag Pr Ag B
Lupus Eritematoso 4 0 0 0
Filariasis 14 2 0 6
Toxoplasmosis 18 1 0 2
Sífilis 13 1 1 2
Artritis reumatoidea 1 0 0 0
Triquinosis 10 0 0 2
Toxocarosis 12 2 1 4
Chagas 23 2 0* 5*
Especificidad % 92 98 77
Especificidades. Número de reacciones positivas al aplicar la
técnica Peroxidasa IgG K-ELISA (Ensayo IgG K-ELISA) con el
antígeno LP (Ag LP) ó el antígeno Pr (Ag Pr) ó el antígeno B
(Ag B) a la detección de anticuerpos en un grupo de
personas no hidatídicas con otras infecciones o
enfermedades.
* Se analizaron 19 de los 23 sueros. Especificidad: VNx100 /(VN+FP). VN: Negativo Verdadero;
FP: Falso Positivo.
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Técnica Positivos/Total Sensibilidad %
HAI 52/69 75
K-ELISA Ag LP 59/70 84
K-ELISA Ag B 51/70 73
K-ELISA Ag Pr 55/70 79
IB 46/70 66
arco 5 15/70 21
Sensibilidades. Reacciones positivas obtenidas en los
sueros de 70 pacientes hidatídicos asintomáticos con las
pruebas HAI, arco 5, IB y Peroxidasa IgG K-ELISA con el
antígeno LP (K-ELISA LP) ó el antígeno Pr (K-ELISA Pr) ó el
antígeno B (K-ELISA B).
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Actividad IgG4 en sueros de pacientes hidatídicos de la
consulta frente a las preparaciones antigénicas LP, B y
Pr.
LP: preparación obtenida de líquido hidatídico de huésped intermediario
ovino enriquecida en antígeno 5 y en antígeno B.
B: preparación obtenida de líquido hidatídico de huésped intermediario
ovino enriquecida en antígeno B.
Pr: preparación obtenida de protoescólices de E. granulosus de huésped
intermediario ovino.
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Información previa considerada y objetivos:
......Phosphocoline (PC), an immunodominant molecule present on a
wide range of organisms, evoke antibody responses that lead to false-
positive reactions in routine serological assays. Human essentially do no
response to PC in the IgG4 subclass...(LaL R.B. and E.A. Ottensen, J.
Infect. Dis. 1988:1034-1037)
Objetivo: aumento de la especificidad por detección de actividad IgG4
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.....because it has previously been hyphothesized that all antibody responses of
the IgG4 subclass reflect chronic antigenic stimulation...(Lal R.B. and E.A.
Ottensen, J. Infect. Dis. 1988:1034-1037)
.... IgG4 is an important diagnostic parameter for clinically expressed cystic
echinococcosis in human...(Shambesh M.K. et al. Acta Tropica 64–1997-,53-63)
Objetivo: mediante la detección de actividad anticuerpo IgG4, respecto a la
actividad anticuerpo IgG, sortear la limitante relacionada con actividad anticuerpo
residual.
...Wen and Craig (1994) using immunoblot showed that antigen B
subunits bound predominantly IgG4 antibodies...(Craig P.S.
Compendium on Cystic Echinococcosis, 1997:85-118)
Objetivo: comparar los reactividades IgG4 detectadas con los ensayos
IgG4 K-ELISA Ag LP, IgG4 K-ELISA Ag B e IgG4 K-ELISA Ag Pr y
analizar la correspondencia entre los resultados de cada IgG4 K-ELISA
con los patrones de reactividad obtenidos con la técnica de
inmunotransferencia IgG-IB.
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Reacciones positivas (reactivas) obtenidas en sueros de
pacientes hidatídicos de la consulta con las pruebas IgG
K-ELISA Ag LP, IgG4 K-ELISA Ag Pr, IgG4 K-ELISA Ag B
e IB.
Técnica Positivos/Total
IgG K-ELISA Ag LP 25/25
IgG4 K-ELISA Ag LP 18/24
IgG4 K-ELISA Ag B 17/25
IgG4 K-ELISA Ag Pr 19/25
IB 18/22
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Técnica de Inmunotransferencia IB aplicada al análisis
de sueros de pacientes hidatídicos de la consulta
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Ejemplos de resultados obtenidos:
Tiras que satisfacen el criterio de positividad: 1, 3, 5 y 6?: La flecha señala la banda de mayor especificidad (aprox. 9 kDa).
Tiras que no satisfacen el criterio de positividad: 2 y 4. Línea PM: estándares de pesos moleculares aproximados (kDa).
Tiras IgG4 K-ELISA Ag LP IgG4 K-ELISA Ag B IgG4 K-ELISA Ag Pr
1 + + +
2 - - -
3 + + +
4 + + +
5 - - -
6 + - -
61.0
47.8
35.9
24.5
18.7
13.9
5.9
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Quistes Hidatídicos en Hígado y
Pulmón Bovino de un animal
faenado en un frigorífico del Valle
Inferior del Río Chubut con
verificación de la presencia de
protoescólices.
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Hígado Bovino
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Pulmón Bovino
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Cosecha de Protoescólices
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“arenilla hidatídica”
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Verificación de la presencia de protoescólices mediante
observación microscópica (200x).
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Williams, Pérez Esandi, and Oriol, 1971
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