Har hSERT et S2-bindings-site?chem.au.dk/fileadmin/_migrated/content_uploads/Bachelor_Louise... ·...

Har hSERT et S2-bindings-site?

BachelorprojektVejleder: Henrik Helligsø Jensen

Louise Morck BesenbacherÅrskortnummer: 20084163

Kemisk Institut, Aarhus UniversitetAugust 2011

iii

Indholdsfortegnelse

Indholdsfortegnelse iii

Forord v

Forkortelser vii

Abstract ix

Resumé xi

1 Introduktion 11.1 Depression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.2 Serotonin - en monoaminerg neurotransmitter . . . . . . . . . . . . . . . . 21.3 Serotonin-transportprotein (SERT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51.4 Antidepressiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61.5 Bachelorprojekt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2 Resultater og diskussion 132.1 Sonogashira-koblingsreaktioner . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132.2 Syntese af THP-beskyttet propargylalkohol (3) . . . . . . . . . . . . . . . . 182.3 Syntese af 3-(THP-beskyttet propargylalkohol)imipramin (4): Forsøg 1 . . . 192.4 Syntese af 3-(THP-beskyttet propargylalkohol)imipramin (4): Forsøg 2 . . . 202.5 Syntese af 3-(propargylalkohol)imipramin (6): Forsøg 3 . . . . . . . . . . . . 212.6 Syntese af 3-(THP-beskyttet propargylalkohol)imipramin (4): Forsøg 4 . . . 222.7 Syntese af 3-(THP-beskyttet propargylalkohol)imipramin (4): Forsøg 5 . . . 232.8 Afbeskytning af 3-(THP-beskyttet propargylalkhohol)imipramin (6a) . . . . 232.9 Syntese af 3-((triisopropylsilyl)acetylen)imipramin (7) . . . . . . . . . . . 242.10 Syntese af linker med 2-(2-chloroethoxy)ethanol og naphthol (9) . . . . . . 262.11 Mesylering af 3-(propargylalkohol)imipramin (10) . . . . . . . . . . . . . . . 27

3 Fremtidigt arbejde 29

4 Konklusion 31

5 Experimental 335.1 General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 335.2 Apparatus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 335.3 Synthesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

Litteratur 43

Appendiks 45

v

Forord

Dette bachelorprojekt bygger på eksperimentelt arbejde udført på Kemisk Institut, AarhusUniversitet i perioden januar 2011 til maj 2011 under vejledning af adjunkt Henrik HelligsøJensen, afdeling Bioorganisk Kemi, gruppe 103. Projektet svarer til 10 ECTS point. Bachel-orprojektet er skrevet på dansk, og danske fagudtryk er anvendt i det omfang det er fundetdækkende. Det eksperimentielle afsnit er skrevet på engelsk med henblik på eventuel fremtidigpublicering af de eksperimentelle data. I forbindelse med dette bachelorprojekt vil jeg gernetakke alle i gruppe 103 for altid at være behjælpelige under mit arbejde i laboratoriet. Tak tilKlaus Meier Bjerglund fra gruppe 107 for at hjælpe mig i deres laboratorium. En stor tak tilmin vejleder, adjunkt Henrik Helligsø Jensen, for tålmodighed, rådgivning og vejledning iforbindelse med både laboratoriearbejdet og i skriveprocessen. En særlig tak gives til AgneteViuff og hele min familie for at have læst korrektur på opgaven.

Aarhus Universitet, 5. oktober 2011

Louise Morck Besenbacher

vii

Forkortelser

atm. atmosfæred DubletDA DopaminDAT Dopamin transporterDHP DihydropyranDMF DimethylformamidES Electrospray [En] /

Elektrospray [Da]Eq equivalent [En]

ækvivalent [Da]5-HIAA 5-Hydroxyindoleacetic acid[En]/

5-hydroxyindol eddikesyre [Da]5-HT 5-hydroxytryptamin, serotonin5-HTP 5-hydroxytryptophan, serotoninhSERT human serotonin transport protein [En]/

menneskelige serotonin-transportprotein [Da]LeuT Bakteriel Leucin transporterMAO Monoamin oxidaseMS MassespektroskopiNA NoradrenalinNAT Noradrenalin transporterNMR Nuclear magnetic resonance [En] /

kernemagnetisk resonans [Da]NSS Neurotransmitter: sodium symporter [En] /

Neurotransmitter: Natrium symporter [Da]Phe PhenylalaninR f Retentions-faktors Singletsat. saturated [En] /

mættet [Da]

viii FORKORTELSER

SERT Serotonin-transportproteinSSRI Selective serotonin reuptake inhibitor [En] /

Selektiv serotonin-genoptagelseshæmmer [Da]SNRI Serotonin and noradrenalin reuptake inhibitor [En] /

serotonin- og noradrenalingenoptagelseshæmmere [Da]SN2 Nukleofil substitution, bimolekylærStuetemp. Stuetemperaturt tripletTBAF Tetra-n-butylammonium fluoridTCA Tricycliske antidepressivaTHF TetrahydrofuranTHP TetrahydropyranTLC Thin layer chromatography [En] /

Tyndtlagskromatografi [Da]Tyr TyrosinICD International Classification of Diseases

ix

Abstract

Mental diseases like depression cause major problems worldwide with high economic costs tothe society and huge personal cost to the patients and their families. Depression can be treatedwith antidepressant drugs, which often are medicinal agent that relieves depression symptomsby binding to the serotonin transport protein (SERT). The binding of antidepressants toSERT inhibits the transporter, and lead to an increased concentration of serotonin (5-HT) inthe synaptic cleft between the presynaptic neuron and the postsynaptic neuron. There areproblems related to use of antidepressants, e.g. slow effects as well as several sideeffects.There are several classes of antidepressants, which can inhibit SERT, but the two mostimportant are tricyclic antidepressants (TCA), such as imipramine and selective serotoninreuptake inhibitors (SSRI) such as escitalopram.1,2

N

N

Imirapmine

ONC

N

F

Escitalopram

Figure 1. Antidepressants that inhibit SERT.

The function of SERT is not yet fully understood, but a major breakthrough was the firstcrystallographic three-dimensional reconstruction of the bacterial transporter protein (LeuT),which is a homologue of the human SERT. Based on results from LeuT, it has been speculatedwhether an extra regulatory binding site (S2-site) exist, i.e. different from the human SERTprimary binding site. The primary aim of this project is to synthesize a range of dimericcompounds, which in this project will be heterodimers consisting of imipramine and a linkerin the 3-position. The linker contains a naphthol-group.∗ Previously, it has been demonstratedthat nitrogen-interlinked imipramines do not bind to a S2-site in SERT. Therefore, we willtest if an imipramine with a linker in 3-position is able to bind to a possible S2-site in SERT.If the S2-site exists, the dimer can futhermore be used to determine the distance between theS1-site and the possible S2-site.

Until now, nobody has synthesized imipramine coupled with a linker in the 3-position.Thus the primary challenge has been to identify optimal reaction conditions for the Sono-gashira coupling reaction with the poorly reactive chloride of clomipramine.

∗Based on previous studies within our group, we have a presumption that a naphthol-group could possiblybind to a S2-site. This is based on unpublished results in the process of patenting.

x ABSTRACT

N

N

Cl

Clomipramine

Sonogashira coupling

N

N

OTHP

3

1

2

4

5

67

89 10 11

N

N

OO

On

n = 1, 2, 3....

Deprotection

Coupling of linker

OTHP

Figure 2. Reaction scheme for the dimerization reaction with clomipramine.

Here, we report the first successful Sonogashira coupling reaction with the poorly reactivechloride of clomipramine. In addition, similar reaction conditions were successfully used toproduce a control compound which will be used to check whether an imipramine with analkyne in the 3-position can bind to the S1-site. These results are promising in respect tothe upcoming experiments which is the synthesis of the linkage between imipramine and thelinker. This final step will make it possible to perform biological tests of these molecules.

xi

Resumé

Psykiske sygdomme som for eksempel depression forårsager i dag store problemer overhele verden med både store økonomiske omkostninger for samfundet og store personligeomkostninger for patienterne og deres pårørende. Depression kan behandles med lægemidlerkaldet antidepressiva, der oftest fungerer ved at disse lindrer depressionssymptomerne ved atbinde til serotonintransport proteinet (SERT). Bindingen af antidepressiva til SERT inhiberertransporteren, hvilket fører til en forøget koncentration af serotonin (5-HT) i den synaptiskekløft imellem den præsynaptisk neuron og den postsynaptisk neuron. Der er flere problemerved at bruge antidepressiva. Blandt andet tager det lang tid inden indvirkningen indtræffer, ogder er forholdsvis mange bivirkninger. Der er flere forskellige typer af antidepressiva, der kaninhibere SERT, men de to vigtigste er tricykliske antidepressiva (TCA) såsom imipramin, ogselektive serotonin-genoptagelseshæmmere (SSRI) såsom escitalopram.1,2

N

N

Imirapmin

ONC

N

F

Escitalopram

Figur 3. Eksempler på to antidepressiva, der inhiberer SERT.

Funktionen af SERT er stadig delvist ukendt, men et stort gennembrud i forståelsen afhSERT kom, med den første krystallografiske rekonstruktion af det bakterielle transportprotein(LeuT), hvilket er en homolog til den menneskelige SERT. Baseret på resultater fra LeuT, harder været spekuleret i, om der kan eksistere et ekstra regulerende bindings site (S2-site), dervil være forskellig fra det primære bindings-site (S1-site) i det menneskelige SERT.

Det primære formål med dette projekt er, at syntetisere en række dimeriske forbindelser,som for dette projekt vil være heterodimerer bestående af en imipramin og en linker i 3-positionen med en naphthol-gruppe.† I tidligere undersøgelser er det blevet vist, at nitrogeninterlinked imipramin ikke binder til et muligt S2-site i SERT. Derfor tester vi i stedet for omen imipramin med en linker i 3-positionen kan binde i et S2-site i SERT. Hvis et sådan S2bindings-site eksisterer, kan dimerne desuden benyttes til at bestemme afstanden imellemS1-sitet og det mulige S2-site. Indtil nu har ingen syntetiseret imipramin koblet med en linkeri 3-positionen, og, derfor har den primære udfordring først og fremmest været at finde deoptimale reaktionsbetingelser, der vil tillade en Sonogashira-koblingsreaktion med det megetlidt reaktive chlorid på clomipramin. I projektet er det lykkes at finde reaktionsbetingelser, der

†Baseret på tidligere studier har vi i gruppen en formodning om, at en naphthol-gruppe vil kunne binde til etmuligt S2-site. Dette er baseret på endnu ikke offentliggjorte resultater, der er under patentbehandling.

xii RESUMÉ

N

N

Cl

Clomipramin

Sonogashira kobling

N

N

OTHP

3

1

2

4

5

67

89 10 11

N

N

OO

On

n = 1, 2, 3....

Afbeskyttelse

Kobling af linker

OTHP

Figur 4. Reaktionsskema for dimeriseringsreaktionen med clomipramin.

tillader en Sonogashira-koblingsreaktion med det meget lidt reaktive chlorid på clomipramin.Herudover er det med de samme reaktionsbetingelser lykkes at fremstille et kontrolstof, derkan benyttes til at teste om imipramin med en alkyn i 3-positionen kan binde til S1-sitet. Disseresultater er lovende i forhold til de kommende eksperimenter, som er en kobling imellemimipramin og linkeren. Dette sidste reaktionstrin vil gøre det muligt at udføre biologiske testpå dimerne og dermed, afgøre om det mulige S2-site eksisterer.

1

KAPITEL 1

Introduktion

1.1 DepressionPsykiske lidelser er en af de otte sygdomme, der i dag kategoriseres som en folkesygdomi Danmark.3 Kendetegnende for folkesygdomme er, at de er i stor udbredelse, og både demenneskelige omkostninger og udgifterne for det danske social- og sundhedsvæsen er store.4

En psykisk lidelse er ikke en konkret sygdom, men det er et begreb, der omfatter fleresygdomme og tilstande, som for eksempel stress, spiseforstyrrelser, demens, kronisk angst ogdepression.

Depression er altså en psykisk tilstand, hvis dominerende symptom oftest er, at patientensstemningsleje er nedsat, hvilket resulterer i øget tristhed og nedsat lyst og interesse for gængsedaglige aktiviteter. Dette fører ofte til generel træthed, skyldsfølelse, manglende selvtillid, ogstærkt reduceret aktivitets- og energiniveau. I de værste tilfælde kan symptomerne være såuudholdelige, at en patient vælger at begå selvmord. En depression udvikles oftest gradvistog varigheden kan derfor variere fra få uger til måneder, og i nogle tilfælde kan den enddavare i flere år. Det menes, at omkring 20% af den danske befolkning på et tidspunkt i løbet aflivet vil udvikle symptomer på en depression.5 Derudover er depression ofte en tilbageven-dende sygdom, idet flere end 66% af de personer der har haft en depression vil udvikle nyedepressionssymptomer på et senere tidspunkt.5 Med lægemidler kaldet antidepressiva kanvarigheden forkortes, men med den nuværende medicin medvirker dette som regel en rækkebivirkninger.

Depression inddeles i tre hovedgrupper, henholdsvis depressiv enkelt episode og periodiskdepression (tilbagevendende). Samlet benævnes de to grupper som unipolar depression, hvorpatienten kun lider af depression. Den sidste gruppe kaldes bipolar affektiv sindslidelseogså kendt som bipolar depression, og her veksler patienten imellem depression og mani.I Danmark stilles diagnosen oftest ved hjælp af det internationale diagnosesystem ICD-10lavet af WHO (World Health Organization), hvor der skelnes imellem tre grader af unipolardepression: let, moderat og svær.6 Hver sværhedsgrad har sine veldefinerede diagnostiskekriterier, som blandt andet omfatter antallet af symptomer. I ICD-10 opdeles symptomernei to kategorier, henholdsvis depressive kernesymptomer og depressive ledsagesymptomer.Kernesymptomer inkluderer nedtrykthed, nedsat lyst og interesse, nedsat energi og øgettræthed. Ledsage symptomer inkluderer nedsat selvtillid, selvbebrejdelser og skyldfølelse,

2 KAPITEL 1 – INTRODUKTION

tanker om død og selvmord med flere.7

Årsagen til, at patienter rammes af en depression er ikke klarlagt præcist, men mangeforskningsresultater indikerer at det biokemisk set er en forstyrrelse i hjernens signalstof-fer/neurotransmittere. Allerede tilbage i 1965 blev denne teori beskrevet første gang, daden amerikanske psykiater Joseph Jacob Schildkraut publicerede Monoamin Hypotesen.8

Hypotesen var at en depression forårsages af et underskud af de monoaminerge neurotrans-mittere i hjernen, mens mani forårsages af et overskud af disse. Eksempler på monoaminergeneurotransmittere i hjernen, der nævnes i forbindelse med depression, er serotonin (5-HT),dopamin (DA) og noradrenalin (NA). der har meget identiske molekylære strukturformler.

NH

HO

NH2

HOOH

NH2

OH

HO

HO

NH2

Serotonin NoradrenalinDopamin

Figur 1.1. Molekylære strukturformler for de tre monoaminerge neurotransmitter, henholds-vis serotonin, dopamin og noradrenalin

1.2 Serotonin - en monoaminerg neurotransmitterSerotonin har den kemiske betegnelse 5-hydroxytryptamin, som oftest forkortes 5-HT. Bio-kemisk dannes 5-HT ud fra aminosyren L-tryptofan og kan nedbrydes af monoaminoxidaseog aldehyd-dehydrogenase til 5-hydroxyindol-eddikesyre (5-HIAA). 5-HIAA udskilles viaurinen og kan derfor benyttes til at bestemme kroppens serotoninniveau.

NH2

OHO

NH

NH2

OHO

NH

HOTryptophanhydroxylase

L-Tryptophan 5-hydroxytryptophan(5-HTP)

NH

HO

Serotonin5-hydroxytryptamin

(5-HT)

NH2

Monoamin oxidaseAldehyd dehydrogenase

NH

HO

5-hydroxyidol eddikesyre(5-HIAA)

O

OH

L-aromatisk syredecarboxylase

Figur 1.2. Serotoninmetabolismen.

1.2. SEROTONIN - EN MONOAMINERG NEUROTRANSMITTER 3

Dannelsen af serotonin i dyr og mennesker er en kort metabolisk proces katalyseretaf to enzymer, nemlig en hydroxylase, der er det hastighedsbegrænsende enzym og endecarboxylase som vist i Fig. 1.2.8

Serotonin findes flere steder i kroppen, de højeste koncentrationer af serotonin er i hen-holdsvis mave-tarm kanalen, i blodet (blodpladerne) og i centralnervesystemet. Over 90 %af den totale mængde af serotonin i kroppen produceres og opbevares i de enterokromaffineceller der er specialiserede enteroendokrine celler i mave-tarm kanalen. De enterokromaffineceller forekommer i epitelvævet på overfladen af tarmlumen, og herfra frigives serotonin ogregulerer tarmens bevægelser og sekretion.9,8

En del af serotoninen fra de enterokromaffine celler trænger igennem tarmvævet og udi blodet, hvor det aktivt optages af blodpladerne og opbevares deri. I blodpladerne hjælperserotonin med at regulere blodets evne til at størkne (hæmostasen). Den resterende mængdeserotonin syntetiseres i centralnervesystemet i de såkaldte serotonerge neuroner.8 Disseneuroner er primært forekommende i de såkaldte Raphe kerner, som ligger i midten afhjernestammen, og herfra regulerer serotonin blandt andet humør, appetit og søvn.10 I Raphekernerne er de serotonerge neuroner samlet i cirka ni klynger eller grupper af neuronceller.Herfra sender neuronerne deres aksoner ud af Raphe kerner, og forsyner en stor del afcentralnervesystemet med nerver, som vist i Fig. 1.3

Raphe kerner

Figur 1.3. Illustration af hjernens serotoninsystem. Raphe kernerne (markeret med sortepile) er de serotonerge neuroners oprindelsessted, hvorfra disse neuroner forsyner resten afhjernen med nerver (indikeret med røde pile).

Inden i og imellem neuronerne foregår neurotransmissionen, der er en del af hjernensaktivitet. Dette er en kommunikation imellem neuronerne, der foregår ved, at et kemikalieeller et elektrisk signal overføres fra en neuron til en anden, og dermed starter en kaskade,som sender et signal eller en impuls fra for eksempel centralnervesystemet og ud til etorgan.11 I de serotonerge neuroner er formålet at frigive serotonin og opretholde et stabiltserotoninniveau i hjernen for at undgå eksempelvis depression. At indtage serotonin oraltkan ikke øge serotoninkoncentrationen i hjernen, da det ikke kan diffundere igennem blod-hjerne-barrieren12 og kan derfor ikke optages i de serotonerge neuroner. Udgangsstoffet forserotonindannelsen, nemlig aminosyren tryptophan, kan derimod passere denne barriere.13

Når tryptophan passerer blod-hjerne-barrieren, optages det i den præsynaptiske seroto-nerge nerve, hvor det omdannes til serotonin via serotoninmetabolismen (Fig. 1.2). Herefteropbevares serotonin i veksikler for at beskyttes mod nedbrydning, som vist i Fig. 1.4. I


neuronen bevæger vesiklerne sig mod aksonets nerveende af en nerveimpuls, der er et elek-trisk signal igennem neuronen. Dette elektriske signal kaldes også, for aktionspotentialet.Når det elektriske signal løber igennem neuronen, sker der en såkaldt depolarisering, hvoren ændring i potentialet over neuronens cellemembran, får membranens Ca2+-kanaler til atåbne sig således, tilstrømning af Ca2+ øges. Den høje koncentration af Ca2+ i neuronen, iforhold til koncentrationen ekstracellulært, vil påvirke vesiklerne på en sådan måde, at deintegreres med cellemembranen og dermed frigiver serotonin ud i den synaptiske kløft, detvil sige området imellem de to neuroner. Serotonin diffunderer herefter den korte vej overkløften til den såkaldte postsynaptiske neuron og binder sig til serotoninreceptorerne, hvilketinducerer et aktionspotentiale i den postsynaptiske neuron. Således foregår initieringen afneurotransmissionen. Neurotransmissionen slutter ved, at serotonin diffunderer fra receptorenog tilbage til den præsynaptiske neuron, hvor det genoptages via et serotonin-transportprotein(SERT). Når serotonin er blevet genoptaget, opbevares det igen i vesikler i den præsynpatiskeneuron, indtil det skal benyttes næste gang. Det serotonin der ikke genlagres vil blive nedbrudtaf enzymet monoaminoxidase til 5-HIAA.14,15

Præsynaptisk

nerve

Serotonin

receptor

Postsynaptisk

nerve

Synapse

Tryptofan 5-HTP

Serotonin

SERT

Nerveimpuls

Nerveimpuls

Figur 1.4. Neurotransmission fra en præsynaptisk neuron til en postsynaptisk neuron. I denpræsynaptiske neuron sker omdannelsen af tryptophan til serotonin. En nerveimpuls senderserotonin i vesikler ned mod nerveenden af neuronen, hvor vesiklerne integreres og senderserotonin ud i den synaptiskekløft. I den postsynaptiske neuron optages serotonin i receptorerog videregiver deres signaler, hvorefter serotonin diffunderer tilbage og genoptages af SERT iden præsynaptiske neuron.

1.3. SEROTONIN-TRANSPORTPROTEIN (SERT) 5

1.3 Serotonin-transportprotein (SERT)SERT er som tidligere nævnt et monoamin-transportprotein, der er et integreret membranpro-tein i de serotonerge neuroner. Proteinet transporterer altså neurotransmitteren serotonin vedaktiv transport fra den synaptiske kløft og ind i den præsynaptiske neuron, hvormed neuro-transmissionen afsluttes. SERT har således en afgørende betydning for reguleringen af denekstracellulære koncentration af serotonin i hjernen, som det ses i Fig. 1.4. SERT tilhører neu-rotransmitter/natrium symporter-familien (NSS), der er en gren af monoamin-transporterne,som har en væsentlig rolle i afslutningen af neurotransmissionen ved natrium-drevet genoptag.

Transportproteinet har en dynamisk struktur, der gennemgår en række konformationelleændringer under transporten af monoaminer. Den mest accepterede model for transport-mekanismen er ’alternating access’-modellen, der blev præsenteret første gang i 1966 afJardetzky.16,1 Mekanismen omfatter alle de tre monoamine-transportere både SERT, dopamin-transporter (DAT) og noradrenalin transporter (NAT), men med små forskelle for de enkeltetransportere.1. I Fig. 1.5 gennemgås SERT mekanismen.

Serotonin

Figur 1.5. Den monoamine-transportmekanisme for SERT. Transporteren ses i sin indad-vendte og uddadvendte konformation. Ionerne Cl– (gul trekant), Na+ (lilla diamant) og K+

(grøn hexagon) har hver sin funktion under transportmekanismen. Serotonin (rød oval) er denenhed der transporteres.

Modellen beskriver sekvensen af konformationsændringer med de to primære forandringermellem en såkaldt udadvendt konformation og en indadvendt konformation.1 I den udadvendtekonformation er serotonin og ionbindingsstedet åbent ud mod det ekstracellulære medium,og i den indadvendte konformation er proteinet åbnet ind mod det intracellulære medium.Når proteinet er åbnet ud mod det ekstracellulære medium, vil serotoninen og ioner bindes tilproteinet, og når det efterfølgende er åbnet ind imod det intracellulære medium, dissocieresserotonin og ioner fra bindingsstedet og diffunderer ind i den præsynaptiske neuron. SERTaktiveres ved binding af Na+-ioner fra det ekstracellulære medium. Det menes, at en Na+-iontransporteres sammen med hvert serotonin molekyle.

SERT kobler med natrium, som et co-substrat og fungerer, som energikilden for SERTstransport af serotonin mod serotonins kemiske gradient. SERT binder udover Na+-ionen ogsåen cytoplasmatisk K+-ion. Dette menes, at være nødvendigt for at SERT kan skifte konfor-mation fra den indadvendte til den udadvendte konformation, hvorved transportencyklussenstartes forfra. Både intracellulært og ekstracellulært har det desuden vist sig, at Cl–-ionerne


fremmer transporterens omsætning, og fungerer således som co-faktorer. Cl– undersøgelserneer foretaget på DAT, men det samme gælder antageligvis for NAT og SERT.1

1.4 AntidepressivaDepression kan behandles med antidepressiva, hvis primære mål er at inhibere SERT. Denfarmakologiske virkning herved, er en normalisering af serotoninniveauet i hjernen. Anti-depressiva benyttes oftest kun ved depressionsgraderne moderat og svær (se afsnit 1.1), pågrund af de problemer som medicineringen medfører. Der forekommer ofte bivirkninger ogvirkningen er så langsom, at der generelt først mærkes bedring efter 3-6 uger.17 Schildkrautshypotese omkring depression er, at depressioner forårsages af et underskud af monoaminergeneurotransmitter, hvilket understøttes af antidepressivas mekanistiske virkning.

En revolution inden for psykofarmakologi og psykiatrien kom i midten af 1950’erne,hvor man opdagede stofferne imipramin (1) og iproniazids antidepressive effekter.18. Imi-pramin er et tricyklisk antidepressiv, der inhiberer SERT, hvorimod iproniazid inhiberermonoaminoxidase.

N

N

Imipramin 1

N

NH

OHN

Iproniazid

Figur 1.6. Molekylære strukturer af imipramin og iproniazid.

Antidepressiva blokerer således den monoaminerge neurotransmission på forskelligvis,derfor kan det inddeles i tre klasser, henholdsvis monoaminoxidase-inhibitor (MAOI), mo-noaminreceptor-antagonist og monoamintransporter-inhibitor.1 I metabolismen for sero-tonin, som ses i Fig. 1.2, er monoaminoxidase det enzym, der nedbryder serotonin. Enmonoaminoxidase-inhibitor, vil derfor forhindre en nedbrydning af serotonin ved at inhiberemonoaminoxidase og forøger således serotoninkoncentrationen i de serotonerge neuroner.Monoaminoxidase-inhibitorer benyttes sjældent som antidepressiva på grund af dets man-ge bivirkninger, og benyttes kun når andre antidepressiva ikke tåles af patienten eller ikkevirker. En monoaminreceptor-antagonist virker på en receptor i den præsynaptiske neuron.En monoaminreceptor-antagonist binder til en receptor, som den blokerer og dermed for-hindrer i at stimuleres. Når receptoren ikke stimuleres, så udsendes der ikke signal til denpostsynaptiske neuron, hvorfor der ikke dannes et nyt aktionspotentiale. Dermed standsesneurotransmission og serotoninkoncentrationen øges. I dag er den mest anvendte type afantidepressiva, monoamintransport-inhibitorer. Denne gruppe omfatter blandt andet tricykliskantidepressiva (TCA), selektiv serotonin genoptagelseshæmmere (SSRI) og serotonin- ognoradrenalin genoptagelseshæmmere (SNRI). Inden for disse antidepressiva skelner man mel-

1.4. ANTIDEPRESSIVA 7

lem de gamle antidepressiva, som er TCA, og de nye antidepressiva, som er henholdsvis SSRIog SNRI. De gamle antidepressiva (TCA) såsom imipramin (1), desipramin og clomipramin(2) anvendes i dag i meget mindre grad end de nyere. Dog benyttes TCA stadigt ved sværedepressioner, da de nye ikke har vist tilstrækkelig virkning. Den primære årsag til at manhar udviklet nye antidepressiva er TCA’s mange bivirkninger som for eksempel svimmelhed,søvnforstyrrelse, samt stor hjertepåvirkning. Bivirkningerne skyldes, at TCA også utilsigtetblokerer de forskellige receptorer i det serotonerge system.15 I Fig. 1.7 nedenfor ses eksemplerpå nogle af de gamle tricykliske antidepressiva.

N

N

Imipramin 1

N

NH

Desipramin

N

N

Clomipramin 2

Cl

Figur 1.7. Eksempler på tre forskellige strukturer for gamle tricykliske antidepressiva, hen-holdsvis imipramin (1), desipramin og clomipramin (2).

De nye antidepressiva, såsom citalopram (SSRI) og venlafaxin (SNRI), har de seneste årfået stor udbredelse, da de har langt færre bivirkninger end de gamle, idet de ikke blokererreceptorerne i det serotonerge system. De er derimod selektive for henholdsvis SERT ogNAT. SSRI regulerer kun serotonin transporten, mens SNRI påvirker både serotonin ognoradrenalin.15

ONC

N

F

Escitalopram

MeO

NHO

Venlafaxin

Figur 1.8. Eksempler på strukturer for nye antidepressiva, henholdsvis citalopram (SSRI) ogvenlafaxin (SNRI).

Antidepressivas selektivitet for SERT og NAT har vist sig at afhænge af antallet met-hylgrupper på aminen, som enten er en sekundær eller tertiær amin. Antidepressiva med ensekundær amin har større selektivitet for NAT, mens antidepressiva med en tertiær amin, somfor eksempel imipramin (1) og clomipramin (2) har større selektivitet for SERT.1


1.4.1 Inhibering

Som tidligere nævnt er den farmakologiske årsag til en depression, at der er en ubalance i detserotonerge system, der medfører en nedsat koncentration af serotonin. Serotoninkoncentratio-nen styres direkte af den præsynaptiske neurons genoptag af SERT, og en inhibering af SERTvil således hæmme neuronens genoptagelse af serotonin, hvorved serotoninkoncentrationenforøges i den synaptiske kløft. Dette medvirker en opblødning eller helt fjernelse af depres-sionssymptomerne. Der er stadigvæk mange uklarheder omkring SERTs funktioner, meninden for de seneste år har man fundet ud af at TCA blokerer SERT ved såkaldt kompetitivinhibering.2 Det vil sige, at serotonin (substrat) og TCA (inhibitor) konkurrerer om SERT’s(enzymets) aktive site, hvilket er muligt, fordi den kompetitive inhibitor ligner substratet. NårTCA binder til det aktive site i SERT forhindres serotonin i at binde, da de ikke kan binde påsamme tid. Dog kan øget koncentration af serotonin udkonkurrere inhibitoren TCA. Som visti Fig. 1.9, er strukturerne for serotonin og TCA meget forskellige, men når de alligevel beggekan binde til SERT i det samme bindings-site, så må de have dele der er identiske.

N

N

NH

HO

NH2

Imipramin 1 Serotonin

Figur 1.9. Molekylære strukturer af henholdsvis det tricykliske antidepressiv (TCA), imipra-min og aminosyren serotonin.

Det er blevet påvist, at selvom serotonin er meget mindre end TCA, så er serotoninsindolring placeret i samme position som TCA’s ene aromatiske ring og azepinring i SERT’saktive site. Dette gør, at positionen af serotonins 5-hydroxylgruppe placeres i samme po-sition som TCA’s 3-position.2 I Fig. 1.10 er det vist, hvordan TCA og serotonin hver isærbinder til SERT.2 TCA forhindrer serotonin i at binde blandt andet på grund af deres storestørrelsesforskel.

Serotonin genoptages i den præsynaptiske neuron ved en række konformationsændringer,som beskrevet i afsnit 1.3. Når serotonin er bundet i det aktive site i SERT lukker sidekædernefra Tyr176 og Phe335 serotonin inde ved sammen at danne et aromatisk ’låg’, hvormed serotoninforhindres i at være i det ekstracellulære medium. Når det i stedet er TCA, der binder i detaktive site, er det et meget større molekyle, hvilket vil få sidekæderne på Tyr176 og isærPhe335 til at rotere og dermed forårsage, at det aromatiske ’låg’, der normalt lukker serotonininde, forbliver åbnet. Den anden aromatiske ring af TCA (den der ikke binder i det aktivesite) forhindrer ’låget’ i at lukke. TCA medvirker således til, at SERT ikke kan udføredets konformationsændringer, da sidekæderne ikke kan lukke ’låget’. SERT låses fast idens udadvendte konformation og forhindrer derved SERT i at genoptage serotonin fra densynaptiske kløft. TCA inhiberer SERT og stabiliserer derved serotoninkoncentrationen i densynaptiske kløft.

1.5. BACHELORPROJEKT 9

Tyr176

Phe335

5-HT

Imipramin

Figur 1.10. Imipramin og serotonins binding i SERT.

1.5 Bachelorprojekt

1.5.1 Tidligere forskningI 2010 blev det vist, at bindings-sitet for TCA i den ekstracellulære vestibule i LeuT ikke liggerdet samme sted, som det centrale bindings-site for SERT, også kendt som S1-site.2 LeuT er enbakteriel homolog af neurotransmitteren natrium symporter. Derfor er der blevet spekulereti, om der eksisterer et ekstra bindings-site i SERT, der ligeledes kan binde antidepressiva.Dette indtil videre hypotetiske bindings-site kaldes for S2-sitet. Et ekstra bindings-site iSERT kunne tænkes at hjælpe med udviklingen af TCA’ere med forbedrede egenskaber. Hvisder for eksempel er to bindings-sites, vil man muligvis kunne udvikle ny medicin med enhurtigere virkning og højere serotoninkoncentration end S1-bindings-sitet kan producere pånuværende tidspunkt. Dette kan for eksempel medføre, at man kan benytte mindre mængderantidepressiva og få færre bivirkninger. I vores gruppe er det tidligere blevet undersøgt, omdet hypotetiske S2-bindings-site eksisterer ved at syntetisere nitrogen-koblede tricykliskeantidepressive dimere.19

N

N O N

N

n

n = 1, 2, 3 ...

Figur 1.11. Nitrogen-kolbede antidepressiva.

Her blev der fremstillet en række dimeriske forbindelser, der ville kunne indikere omder foruden et S1-site også fandtes et S2-site i SERT. Dette blev testet på forskningscenteret,Risskov Psykiatriske Hospital. Ifølge testresultaterne blev S1-sitet inhiberet, men der varikke en stærk inhibering af S2-sitet i SERT. Man fandt at inhiberingen var i størrelsesordnenmikromolær, mens man ville forvente et resultat i størrelsesordnen nanomolær, hvis der var en


stærk inhibering i S2-sitet. Disse resultater indikerer derfor, at S2-bindings-sitet ikke findes iområdet, hvor nitrogen-koblede TCA binder til SERT.

1.5.2 ProjektidéI en model for binding af tricykliske antidepressiva har en række undersøgelser af antidepres-sivas binding til LeuT vist, at der ved antidepressivas 3-position er mere plads, og dermedkan der være mulighed for, at det hypotetiske S2-site er i området omkring antidepressivas3-position, som er vist i Fig. 1.12.2

88

7766

99

N55

11111010

4433

22

11

N

Imipramin 7

Figur 1.12. Nummerering af atomer for Imipramin.

Da nitrogen-koblet antidepressiva ikke interagerede med det hypotetiske S2-site er ideenat sætte en linker på i 3-positionen af imipramin, og dermed undersøge om S2-sitet findesderomkring. Formålet med projeket var dermed at syntetisere en række forbindelser afdimere, som i dette projekt er en heterodimer bestående af en imipramin koblet med enlinker i 3-positionen, der indeholder en naphthol-gruppe. Derved kan det undersøges, omdet hypotetiske S2-bindings-site eksisterer, når 3-positionen benyttes i modsætning til detidligere nitrogen-koblede antidepressiva. Testene af dimernes binding til SERT kan udførespå forskningscenteret på Risskov Psykiatriske Hospital, og hvis der i forbindelse med testeneviser sig at være en forøget inhibitorisk effekt for en af liganderne, vil det bekræfte, at derfindes et S2-bindings-site i SERT. Ligander, der viser tegn på en interaktion med et sådantS2-site, kan derudover blive testet for deres bindende karakter og for deres affinitet modmutanter lokaliseret i S1-site og S2-site.

I Fig. 1.13 ses den overordnede reaktion fra udgangsstoffet clomipramin til dannelse afdimeren. Den primære udfordring var dog i første omgang ikke at danne dimeren, men at fåførste reaktionstrin i Fig. 1.13 til at forløbe. Der skulle således findes nogle reaktionsbetingel-ser, der ville tillade en Sonogashira-koblingsreaktion med det meget lidt reaktive chlorid påclomipramin.

1.5. BACHELORPROJEKT 11

N

N

Cl

Sonogashira kobling

OTHP N

N

N

N

O

On

n = 1, 2, 3 ...

1) Afbeskyttelse

2) Kobling af linkerClomipramin 2 4

5

OTHP

3

O

O

Figur 1.13. Reaktionsskema for syntesen af dimeren fra clomipramin.

13

KAPITEL 2

Resultater og diskussion

2.1 Sonogashira-koblingsreaktionerDen primære udfordring i forbindelse med dette projekt har været at finde de optimalereaktionsbetingelser for en koblingsreaktion imellem det meget lidt reaktive chlorid i 3-positionen på udgangsstoffet clomipramin og en terminal alkyn. Der skulle altså dannes enbinding imellem et sp2-hybridiseret og et sp-hybridiseret kulstofatom, og inden for organisksyntese har man en meget anvendt metode til lige netop dannelsen af en sådan C(sp2)-C(sp)-binding, nemlig en Sonogashira-koblingsreaktion, der første gang blev opdaget i midten af1970’erne.20 Formelt set er en Sonogashira-kobling en organisk reaktion imellem en terminalalkyn og et aryl- eller vinylhalid katalyseret af palladium. I denne opgave gennemgås kunkoblinger med arylhalider.

Sonogashira-koblinger kan udføres både med kobber og uden kobber, hvor den mestkendte og mest benyttede Sonogashira-koblingsreaktion er med kobber. Først lang tid ef-ter, at den første Sonogashira-kobling blev opdaget, begyndte man at udføre Sonogashira-koblingsreaktioner uden kobber. Dette skyldtes, at der opstod tvivl omkring kobberets effekt,hvilket vil blive forklaret i større detalje i afsnit 2.1.3. I Fig. 2.1 ses mekanismen for den op-rindelige Sonogashira-kobling, og som oftest blev anvendt, ind til nye Sonogashira-reaktionerbegyndte at vinde frem inden for de senere år.

R C C H R C C Cu R C C R'CuI

Base

Pd0

R' X

Figur 2.1. Reaktionsskema for Sonogashira-koblingsreaktion med kobber.

Man kender stadigvæk ikke reaktionsmekanismerne for Sonogashira-koblingerne fuld-stændigt, men man har opnået en grundlæggende forståelse af de forskellige trin i reaktionerne.Nedenfor beskrives mekanismerne enkeltvist og efterfølgende gennemgås resultaterne fra deSonogashira-koblingssynteser, der er udført i laboratoriet.

Reaktiviteten og effektiviteten af en Sonogashira-koblingsreaktion er meget dårlig, når deter chlorid, der er koblingspartneren i modsætning til, hvis det havde været enten bromid eller

14 KAPITEL 2 – RESULTATER OG DISKUSSION

iodid. Reaktiviteten af haliderne er følgende Ar-I � Ar-Br > Ar-Cl.21. Indtil nu er der kunopnået begrænset succes med Sonogashira-koblinger imellem alkyner og arylchlorider, hvorforder arbejdes på at finde katalytiske betingelser, der optimerer reaktionerne med arylchloriderog samtidig nedsætter de, til tider, lange reaktionstider. Det lykkedes i forbindelse med detteprojekt at få en alkyn til at koble med chloridet på clomipramin ved en Sonogashira-kobling,men der er stadigvæk behov for at forbedre effektiviteten og udbyttet af disse Sonogashira-reaktioner.

Reaktiviteten af haliderne har indflydelse på hvilke reaktionsbetingelser, man benytter. EnSonogashira-kobling med halidet iodid, som er det mest reaktive, udføres oftest ved svagereaktionsbetingelser. Derfor bliver de fleste iodid reaktioner oftest udført ved stuetemperatur,og med den mest anvendte palladiumkatalysator, [PdCl2(PPh3)2], der er en af de mindrereaktive. Reaktionsbetingelserne for Sonogashira-koblinger med bromid adskiller sig ikkemeget fra Sonogashira-koblingerne med iodid. Ind imellem benyttes dog en højere temperatur,samt katalysatoren PtBu3, dog oftest sammen med en palladiumkatalysator som en ligand.Dette gøres for at øge reaktiviteten, da bromids reaktivitet er lidt dårligere end iodids. Reak-tionsbetingelserne for en Sonogashira-kobling med chlorid adskiller sig oftest markant fra deto andre halider. Betingelserne skal være meget kraftigere, for at chloridet med meget svag re-aktivitet kan Sonogashira-koble med en alkyn. Temperaturen er oftest høj cirka 80–100◦C ognogle gange foregår reaktionen endda under opvarmning med mikrobølgestråling. Derudoverbenyttes en meget mere reaktiv palladiumkatalysator.

I de fleste af de nedenstående synteser benyttes en XPhos-prækatalysator, der beskrivesyderligere i næste afsnit. XPhos-prækatalysatoren ses i Fig. 2.2.22,23 De angivne reaktions-betingelser er blot de typiske betingelser, men i hver enkelt syntese er man ofte nød til atoptimere brugen af palladiumkatalysatorer, baser, temperaturer, osv. Disse betingelser erafhængige af for eksempel hvilke reaktanter, der benyttes i Sonogashira-koblingerne.

PdNH2

II

P

iPr

iPr

iPr

Figur 2.2. Struktur af XPhos-prækatalysatoren.

2.1.1 Palladiumkatalyserede-reaktionerEt af de mest alsidige og nyttige overgangsmetaller i organisk syntese er palladium, Pd. ISonogashira-reaktionen benyttes palladium, som en homogen katalysator, hvilket betyder, atden er i væskefasen med reaktanterne. Palladium er primært i to oxidationstrin, henholdvisPd0 og PdII. Pd0 har 14 valenselektroner og er således koordinativt umættet. Det betyder, atPd0 er reaktiv og kan lave en oxidativ additionsreaktion med et passende substrat, hvorvedder dannes et kvadratisk plant stabilt PdII-kompleks med 16 valenselektroner.24 I følge densåkaldte 18-elektron-regel er 16 valenselektroner koordinativt umættet og reaktivt. Palladiun

2.1. SONOGASHIRA-KOBLINGSREAKTIONER 15

har imidlertidigt den specielle egenskab at være stabilt ved 16 valenselektroner. I den oxidativeadditionsreaktion, som ses i Fig. 2.3 dannes en σ -alkyl-binding, der er meget reaktiv overforblandt andet C(π)-C(π)-bindinger, og det er denne høje reaktivitet, der danner grundlag forde mange Pd0-koblingsreaktioner. Således også for Sonogashira-reaktionerne.

M + X-Y X-M-Y

Figur 2.3. Reaktionsskema for en oxidativ additionsreaktion.

Fælles for Sonogashira-koblingerne med og uden kobber gælder det, at de benytter etaktiveret Pd0-kompleks. Dette kan eksempelvis reagere med et arylhalid og dermed danneet PdII-kompleks, som første trin i mekanismerne. Oftest er det et PdII-kompleks, der bliverreduceret til et aktiveret Pd0-kompleks. Den generelle Sonogashira-kobling udføres oftestmed et palladium-fosfan-ligand-kompleks, som for eksempel [PdCl2(PPh3)2]. Det reduceresin situ til Pd0 ved dannelse af et homokoblingsprodukt, som vist i Fig. 2.4.25

PdPh3P

Ph3P Cl

Cl

IICu R CuCl

PdPh3P

Ph3P II

R

R R R

Pd0L2

Figur 2.4. Reduktion af PdII-komplekset til et aktivt Pd0-kompleks.

Som tidligere nævnt, er de fleste Sonogashira-reaktioner i dette bachelorprojekt udførtved hjælp af Xphos-prækatalysator, også kaldet Buchwalds Xphos-prækatalysator, udviklet afprofessor Stephen L. Buchwalds gruppe. PdII-komplekset kan meget hurtigt aktiveres ved atreducere det til et Pd0-kompleks, og er meget reaktivt i koblingen imellem arylchlorider ogalkyner. Dets reaktivitet moduleres af liganden XPhos. Pd0-komplekset dannes ved en såkaldtBuchwald-Hartwig reaktion.26

PdNH2

II

P

iPr

iPr

iPr

Cs2CO3

NH

+ Pd0-XPhos

XPhos

Figur 2.5. XPhos-prækatalysatorens reduktion til det meget aktive Pd0-Xphos-kompleks.

Mange palladiumreaktioner er luftfølsomme, hvorfor reaktionerne skal udføres i en inertatmosfære, som for eksempel argon eller nitrogen. Det skyldes, at palladiumkatalysatorerneskatalytiske aktivitet kan forsvinde, hvis der er ilt tilstede. Således er alle palladiumreaktioner


udført i forbindelse med dette bachelorprojekt, først blevet blandet i et præparatglas i en hand-skeboks, og derefter er præparatglasset blev lukket med et tætsluttende låg. I handskeboksener der en inert atmosfære af argon, hvormed man undgår ilt i reaktionerne. Pd0 kan nemligreagere på tre forskellige måder. Først og fremmest kan Pd0 indgå i en katalytisk cyklus,hvilket er det man ønsker. Dog kan Pd0 også aggregere og udfælde som black palladium.Dette vil naturligvis stoppe katalysatorens aktivitet. Den trejde og sidste måde er, at ilt kanoxidere Pd0 til PdO2, hvilket ligeledes vil medføre at katalysatoren inaktiveres. Derfor blevalle nedenstående Sonogashira-reaktioner blandet i en handskeboks.

2.1.2 Sonogashira-reaktion med kobberDer findes, som tidligere nævnt, forskellige reaktionsbetingelser for Sonogashira-koblingsre-aktioner med kobber. Oftest anvendes et Pd0-kompleks, en base og kobberiodid som en co-katalysator. Betingelserne tilpasses reaktiviteten af halidet, alkynen og basen, der benyttes.25

PdII

Pd0L2

R1 X

R3N

R3NH X

R2H

XCu

R2HXCu

A

B

C

R2R1D

E

F

L

L

R R2

Pd

L

L

R1 XII

R2CuI

Oxidativ

addition

Trans-

metallering

cis/transisomering

Reduktivelimination

KobbercyklusPalladiumcyklus

Figur 2.6. Reaktionsmekanismen for en Sonogashira-koblingsreaktion med kobber.

Reaktionsmekanismen for den kobberkatalyserede Sonogashira-koblingsreaktions kendesstadigvæk ikke med sikkerhed, men den generelt accepterede mekanisme er vist i Fig. 2.6.Koblingsreaktion mener man består af to uafhængige katalytiske cyklusser, henholdvis en pal-ladiumcyklus og en kobbercyklus. Den aktive palladiumkatalysator er 14-elektron Pd0L2 kom-plekset (A), der reagerer med et arylhalid og danner, via oxidativ addition, PdII-komplekset(B). I det efterfølgende trin forbindes palladiumcyklussen med kobbercyklussen. Dette trin eren transmetallering, hvor alkynen indsættes ved palladium. Der er stadigvæk uenighed omhvilken rolle kobbercyklussen spiller. Der spekuleres dog i, at hvis basen ikke er basisk noktil at deprotonere alkynen, så kan kobberacetylidet, der er en del af transmetallering trinet,ikke dannes. Derfor dannes der i kobbercyklussen et π-alkyn-kobberkompleks (E), som gørden terminale alkynproton mere sur og således medfører at basen kan deprotonere alkynen.Herved dannes det aktiverede kobberacetylid (F). Kobberacetylidet kan nu transmetalleremed PdII-komplekset og danne et nyt PdII-kompleks (C). Sidste trin i palladiumcyklussen eren reduktiv elimination, men før den reduktive elimination, skal de to ligander elimineres,så de sidder i en cis-konfiguration i forhold til hinanden. Dette sker via cis/trans isomerise-

2.1. SONOGASHIRA-KOBLINGSREAKTIONER 17

ring på PdII-centeret. Herefter dannes diacetylene (D) og Pd0 regenereres i den reduktiveeliminationsreaktion.

2.1.3 Sonogashira-reaktion uden kobberSonogashira-reaktionerne udføres oftest som beskrevet ovenfor ved hjælp af kobber, da detifølge flere medvirker til en forøget katalytisk aktivitet, men nogle gange kan kobber ogsåhave den modsatte effekt.27. Derudover blev kobberfrie Sonogashira-reaktioner afprøvetpå grund af en mulig sidereaktion i Sonogashira-reaktionerne med kobber. Sidereaktionenkan forekomme i forbindelse med dannelsen af kobberacetylider i kobbercyklussen, hvorkobbersalte som for eksempel kobberiodid kan blive aktiveret og mediere en homokobling afde terminale alkyner, hvis kobberacetylidet udsættes for oxidative agenter eller luft. Koblingenkendes som Glaser-koblingen og er vist i Fig. 2.7.25

R H2Cu(I)-kat

Base, O2R R

Figur 2.7. Reaktionsskema for Glaser-koblingsreaktion.

I litteraturen findes der allerede et eksempel, hvor udgangsstoffet ligesom for dette projektvar arylchlorid, og hvor palladiunkatalysatoren var XPhos.27 Her opdagede man at kobberikke virkede effektivt, men nærmere havde den omvendte effekt. Artiklen omhandler en rækkeeffektive palladiumkatalyserede koblinger af arylchlorider og tosylater med terminale alkyner.På baggrund af serien af reaktioner fandt man ud af, at når CuI blev tilsat, blev produktom-dannelsen undertrykt. Når der for eksempel blev tilsat 1mol% CuI blev der dannet cirka 5%af produktet, hvorimod man uden tilsætning af CuI fik dannet 35% af produktet. Derfor eralle Sonogashira-reaktioner udført i forbindelse med dette bachelorprojekt kobberfrie.

Der blev, som udgangspunkt benyttet reaktionsbetingelser svarende til dem fra litteratu-ren.27 Dette skyldes dels, at andre forsøg med en Sonogashira-kobling imellem clomipraminog den terminale alkyn med andre reaktionsbetingelser ikke dannende det ønskede produkt.

Ligesom for Sonogahira reaktioner med kobber kendes den eksakte mekanisme forSonogashira-reaktioner uden kobber ikke, og det har medført, at der er foreslået to forskelligemekanismer, vist i Fig. 2.8. Den ene er kendt som Deprotonering foreslået af professor ArashSoheili og er meget identisk med den generelle Sonogashira-mekanisme med kobber. Detførste trin er en oxidativ additionsreaktion, hvor Pd0-komplekset (A) reagerer med arylhalidetog danner et PdII-kompleks (B). Efterfølgende koordineres alkynen til PdII-centeret og alkyn-PdII-komplekset (G) dannes. Herefter deprotoneres komplekset, da protonen på alkynenefter kompleksdannelsen er sur nok til at blive deprotoneret af basen, og alkynen bindes tilPdII, hvorved palladium-acetylid-komplekset (I) dannes. I slutningen af cyklussen dannesdiacetylen (D) og Pd0 regenereres i den reduktive eliminationsreaktion.

Den alternative mekanisme for Sonogashira-kobling uden kobber er foreslået af nobel-prisvinder professor Richard F. Heck og ses til venstre i Fig. 2.8. Denne mekanisme kaldesfor Carbometallering. Ligesom for deprotoneringen er det første trin en oxidativ additionsre-aktion, hvor PdII-komplekset (B) dannes efterfulgt af en alkyn-koordination til PdII, hvorvedalkyn-PdII-komplekset dannes (G). Herefter dannes palladiumkomplekset (H) ved en carbome-tallering, hvor en Z-isomer dannes ved at palladiumkomplekset syn-migrerer og arylgruppen


overføres til den mindst hindrede position. I sidste trin regenereres Pd0 og alkynproduktet (D)dannes via en β -hydrid eliminationsreaktion.28

Der er flere ligheder for de forskellige reaktionsmekanismer. De starter alle med oxidativadditionsreaktion, hvor Pd0-komplekset oxideres og danner et PdII-kompleks. I sidste tringælder det for alle tre mekanismer, at der sker en eliminationsreaktion, hvorved det ønskedealkynprodukt dannes Pd0-komplekset gendannes.

[Pd0L2]Ar X

Pd

L

L

Ar X

RAr

II

carbo-metallering

Oxidativ additionβ-hydrid

elimination

A

B

D

PdXL

Ar

Pd

L

Ar XII

HR

G

HR

L

H

CarbometalleringDeprotonering

[Pd0L2]Ar X

Pd

L

L

Ar XPd

L

Ar R

RAr

II

HRLPd

L

Ar XII

HRBase

Deprotonering

Oxidativ addition

Kompleks-dannelse

II

Reduktiv elimination

A

B

G

I

D

Figur 2.8. To mulige reaktionsmekanismer for Sonogashira-koblingsreaktioner uden kobber.

I dette projekt benyttes Sonogashira-koblingsreaktionen uden kobber selvom den nøjagtigereaktionsmekanisme fortsat er ukendt. Resultaterne af disse laboratorieforsøg er beskrevet ide næste afsnit.

2.2 Syntese af THP-beskyttet propargylalkohol (3)I Sonogashira-forsøgene blev det besluttet at beskytte propargylalkohol med tetrahydropyran(THP), således produktet kan benyttes, som den terminale alkyn i Sonogashira-reaktionen. Iprincippet burde man kunne lave en Sonogashira-koblingsreaktion ved tilstedeværelsen afen fri hydroxygruppe, men i en Sonogashira-koblingsreaktion, der beskrives senere, vil detvise sig, at beskyttelsen er nødvendig. THP-beskyttelsen af propargylalkohol blev udført somtidligere beskrevet i litteraturen.29 I Fig. 2.9 ses reaktionsskemaet sammen med de anvendtereaktionsbetingelser.

OOH

pTsOH H2OO O1 ækv.

4 ækv.

1 %14 18Diethylether, N2 atm.

Figur 2.9. Reaktionsskema og -betingelser for syntesen af (3).

Kemikalierne blev blandet ved 0◦C, hvorefter reaktionen stod ved stuetemperatur i en N2atmosfære på grund af faren ved dihydropyran (DHP). DHP er nemlig brandfarligt, hvorfor

2.3. SYNTESE AF 3-(THP-BESKYTTET PROPARGYLALKOHOL)IMIPRAMIN . . . 19

det skal beskyttes mod ilteksponering, så man undgår peroxid-dannelser. Desuden kan DHPogså nemt nedbrydes med en mild hydrolyse.

Der laves en acetal-dannelse for at danne produktet (3), den THP-beskyttede propargylal-kohol. Det frie elektronpar på oxygen i DHP danner en dobbeltbinding, hvorved oxygenetprotoneres og oxocarbeniumion-intermediatet dannes. Propargylalkoholen laver et nukleo-filt angreb ind på det elektronfattige kulstof, oxygenet deprotoneres, syren regenereres ogen tetrahydropyranylether, som var det ønskede produkt (3) dannes.30 Mekanismen ses iFig. 2.10.

O

H

O

OH

OH

O- H

O O24 %

14

3

Figur 2.10. Reaktionsmekanisme for dannelse af tetrahydropyranylether (3) ved en acetal-dannelse.

Reaktionen blev fulgt med tyndtlagskromatografi (TLC) og efter 4 timer var den færdigreageret. Herefter blev reaktionen stoppet med koncentreret ammoniakvand, som neutralisere-de reaktionsblandingen. I artiklen fra professor Hung-wen Liu’s gruppe blev der tilsat en lillemængde methanol, men årsagen hertil er ikke forklaret.29 Derimod laves her en ekstraktion idiethylether, og undgår dermed filtreringen for at fjerne ammonium p-toluensulfonsyre, da detfjernes med vandfasen i ekstraktionen. De organiske faser blev tørret over natriumsulfat oginddampet. Råproduktet blev oprenset ved søjlekromatografi og isoleret som en klar væske.Produktets udbytte var 76%, men i NMR-analyserne var produktet stadigvæk forurenet ogproduktet blev derfor tørret på en vacuumlinie i nogle timer. Produktets udbytteprocent eftertørring på vacuumlinien var 24%, hvilket tyder på, at produktet (3) er flygtigt. Derfor kunneder heller ikke laves en analyse med massespektroskopi (MS).

2.3 Syntese af 3-(THP-beskyttetpropargylalkohol)imipramin (4): Forsøg 1

Udgangsstoffet clomipramin (2) til dannelsen af produktet (4), er kommercielt tilgængeligt. Iførste Sonogashira-koblingsforsøg blev der taget udgangspunkt i en artikel fra 2008.31 Heroptimeres reaktionsbetingelserne for en Sonogashira-koblingsreaktion imellem et arylchloridog en terminal alkyn, ved at variere solventet, palladiumkatalysatoren, fosfanliganden ogbasen. Det vises, at de reaktionsbetingelser, der giver det største produktudbytte er med DMFsom solvent, 2% [PdCl2(PPh3)2] som palladiumkatalysator, 4% PtBu3 som phosphinligand,Cs2CO3 som base og 10% DBU som katalysator og stærk base. Desuden foregik reaktionen ien mikrobølgeovn. De førnævnte reaktionsbetingelser blev benyttet i Sonogashira-reaktionenimellem clomipramin (2) og den THP-beskyttede propargylalkohol (3) i de forhold, der erangivet i Fig. 2.11.

Solventet DMF blev brugt i stort overskud, ∼ 35 ækvivalenter, og alle kemikalierne blevblandet i et mikroovnsrør i handskeboksen. Derefter blev reaktionen stillet i mikrobølgeovnen.Efter 10 minutter havde reaktionen skiftet farve fra gul til mørkebrun/sort. Dette indikerede,at palladium-reaktionen havde reageret, hvilket netop er kendetegnet ved en brun-sort farve.


N

N

Cl OTHP

2 % [PdCl2(PPH3)2]4 % PtBu310 % DBU1,3 ækv. Cs2CO3

Mikroovn150oC, 10 min

+ N

N

1 ækv. 1,3 ækv.

24

3 OTHP

Figur 2.11. Første forsøg på Sonogashira-reaktionskobling mellem clomipramin og THP-beskyttet propargylalkohol.

Reaktionens råprodukt blev undersøgt ved massespektroskopi. Spektret ses bagest i appendiks.Massespektret viste ingen moltop ved den forventede molekylvægt, mens der i stedet varen moltop ved m/z = 315,0, som svarer til molekylvægten af udgangsstoffet clomipramin.Reaktionsbetingelserne virkede således ikke i dette første forsøg på at lave Sonogashira-kobling imellem clomipramin og den THP-beskyttede propargylalkhol.


I et nyt forsøg på at lave Sonogashira-koblingen afprøves en mere aktiv palladiumkatalysator,da chlorids reaktivitet er meget dårlig. Dette medførte, at der i de følgende synteser blevafprøvet en Xphos-prækatalysator med inspiration fra en artikel fra professor Buchwaldsgruppe publiceret i 2003.27 Reaktionsbetingelserne ses i reaktionsmekanismen i Fig. 2.12.

N

N

Cl

OTHP 1 % XPhos-prækat.2,5 ækv. Cs2CO3

Tør acetonitril, 85oC

+N

N

1 ækv. 1,5 ækv.

2 4

3OTHP

< 20%

Figur 2.12. Andet forsøg på Sonogashira-reaktionskobling mellem clomipramin og THP-beskyttet propargylalkohol.

Den eksperimentelle fremgangsmåde beskrives kun kort, mens en mere detaljeret beskri-velse er givet i kapitel 5, hvor de eksperimentelle data for (4) er angivet. Alle kemikalierneblev blandet i et præparatglas i handskeboksen, som derefter blev lukket med et tætsluttendelåg. I modsætning til før, hvor reaktionsblandingen blev opvarmet i en mikrobølgeovn, såforegik opvarmningen nu i en varmeblok med en jævn opvarmning til 85◦C. Reaktionen blevløbende fulgt med TLC-analyse, den indikerede, at noget var sket med reaktionen. Desudenskiftede farven fra gul til brun-sort, men selv efter at have stået i en dag, var den i følgeTLC-analyserne stadigt ikke færdigreageret og var uændret siden TLC-analyserne fra dagen

2.5. SYNTESE AF 3-(PROPARGYLALKOHOL)IMIPRAMIN (6): FORSØG 3 21

før. Reaktionen blev derfor stoppet og oparbejdet. Reaktionens råprodukt blev undersøgt medMS, og massespekteret viste en massetop ved m/z = 441,3 [M+ + Na+], der var den ønskedemassetop for produkt (4). Spektret ses bagest i appendiks. Råproduktet blev oprenset vedsøjlekromatografi, og produktet blev isoleret som en brun olie. Produktet blev analyseret medTLC-analyse, der viste, at der stadigvæk var lidt urenheder i produktet. På TLC-pladen kunneman se, at det ikke var udgangsstoffet, clomipramin. Produktet blev søjlekromatograferetendnu en gang, og det nye produkt blev igen isoleret som en brun olie. Det nye produktblev tjekket med TLC-analyse, og der var stadigvæk de samme urenheder. Udbytteprocen-ten for forsøget var 20% med urenheder og derfor vil et rent udbytte være mindre end 20%. Udbyttet af reaktionen var dårligt. Derfor blev det besluttet at arbejde videre med reak-tionsbetingelserne på trods af den dårlige udbytteprocent, men reaktionsbetingelserne havdekunnet dannet det ønskede produkt (4) ud fra det meget lidt reaktive chlorid på (2). I de nyesynteser blev mængden af katalysator og alkyn varieret, for at se om det kunne optimereSonogashira-koblingsreaktionen.

2.4.1 UrenhederSonogashira-koblingerne, der beskrives herefter, og oprensningerne ovenfor, viser, at det ikkevar nemt at oprense produkt (4). Når oprensningerne var svære, så blev en præcis bestem-melse af udbytterne for produktet ligeledes svær. Der er således en relativ stor usikkerhedpå angivelsen af udbytteprocenterne. Analyserne af syntesernes produkter viste som regelurenheder, som ikke har kunnet identificeres til et kendt stof. Således kunne man ved hjælp afTLC-analyser også vise at det ikke var udgangsstoffet clomipramin. Årsagen til at produkt(4) giver oprensningsproblemer kan blandt andet være alkylkæden med den tertiære amin ogden apolære THP-gruppe. Når molekylet binder til silica vil den tertiære amin skifte imellemat være protoneret og deprotoneret. Dette vil på blandt andet TLC-pladerne afspejles i enlangstrakt plet, hvilket gør, det er svært at adskille pletterne fra hinanden, idet pletten forurenheden kan falde sammen med pletten, der er udtrukket for produktet. Derfor kan detikke undgås at få urenheder med i produktet. En anden årsag til urenheden kan skyldes, atmolekylet med den apolære THP-gruppe har samme R f -værdi, som urenheden, og derforelueres samtidigt ved søjlekromatografi.

2.5 Syntese af 3-(propargylalkohol)imipramin (6):Forsøg 3

I denne syntese afprøves det, om det er nødvendigt, at propargylalkohol er beskyttet, når derlaves en Sonogashira-kobling med clomipramin. Som forklaret tidligere burde en Sonogashira-kobling i teorien kunne udføres på tilstedeværelsen af en fri hydroxylgruppe. Der benyttessamme reaktionsbetingelser som for syntesen ovenfor i afsnit 2.4, blot med den forskel, athydroxygruppen ikke er beskyttet. Reaktionsskemaet med de angivne reaktionsbetingelser sesi Fig. 2.13.

Reaktionen blev løbende fulgt med TLC-analyse, der indikerede, at der kun var udgangs-stof i reaktionen. Efter 4 timer blev reaktionens råprodukt undersøgt med MS, og massespekt-ret viste en massetop ved m/z = 315. Denne top svarede ikke til moltoppen for det ønskedeprodukt (6). Det viste sig, som forventet fra TLC-analyserne at være moltoppen for udgangs-stoffet clomipramin. Det blev dermed vist, at hvis propargylalkoholen ikke er THP-beskyttet,så virker Sonogashira-koblingsreaktionen imellem clomipramin og alkynen ikke med disse


N

N

Cl

OH 1 % XPhos-prækat.2,5 ækv. Cs2CO3


+ N

N

1 ækv. 2,5 ækv.

26

0 %

OH3

Figur 2.13. Tredje forsøg på Sonogashira-reaktionskobling. Her mellem clomipramin ogpropargylalkohol.

reaktionsbetingelser, og derfor blev de efterfølgende Sonogashira-koblingsreaktioner kunudført med en THP-beskyttet propargylalkhol.


Syntesen følger reaktionsbetingelserne fra forsøg 2 (se afsnit 2.4), men det afprøves om enøget mængde alkyn og palladiumkatalysator kan optimere Sonogashira-koblingen imellemclomipramin (2) og den THP-beskyttede propargylalkohol (3). Reaktionsbetingelserne er visti Fig. 2.14.

N

N

Cl

OTHP 3 % XPhos-prækat.2,5 ækv. Cs2CO3


+ N

N

1 ækv. 2,5 ækv.

24

OTHP3

<49 %

Figur 2.14. Fjerde forsøg på Sonogashira-reaktionskobling mellem clomipramin og denTHP-beskyttet propargylalkohol. Her er mængden af alkyn og palladiumkatalysator øget iforhold til syntesen fra afsnit 2.4

Reaktionen blev løbende fulgt med TLC-analyse. Allerede efter en time kunne man se, atder var sket en reaktion, men efter fem timer var der ikke sket yderlige ændringer. Reaktionenoparbejdedes ligesom forsøg 2, som beskrevet i det eksperimentelle afsnit for (4) (se kapitel5). Produktet isoleres som en brun olie og gav 47% i udbytte, men som tidligere er der lidturenheder i, der ikke fjernes ved oprensning. Spektret for forsøg 4 er vedlagt i appendiks.Et rent udbytte vil være mindre end 47%, og dette er derfor stadigt et utilfredsstilendeudbytte. Problemet med denne reaktion og de tidligere Sonogashira-koblinger er imidlertid,at reaktionen ifølge TLC-analyserne kun reagerede i nogle timer, hvorefter der ikke sketemere. Umiddelbart tyder det på, at et kemikalie i reaktionsblandingen stopper dens funktion

2.7. SYNTESE AF 3-(THP-BESKYTTET PROPARGYLALKOHOL)IMIPRAMIN . . . 23

og således medvirker til at hele reaktionen stopper. Der blev derfor prøvet en ny variation afSonogashira-koblingen, som ses i afsniitet nedenfor.


2.7.1 Tilsætning af THP-beskyttet propargylalkohol efter 25 minutterI et nyt forsøg på at optimere reaktionsbetingelserne for Sonogashira-koblingsreaktionen, blevder benyttet de samme reaktionsbetingelser som dem, der ses i Fig. 2.14, men med den forskel,at den THP-beskyttede propargylalkohol først blev tilsat til reaktionsblandingen efter 25minutter. Hypotesen er, at blandt andet XPhos-prækatalysatoren kan nå at aktiveres (som vist iFig. 2.5), inden den skal reagere med alkynen. I de tidligere synteser blev alle reaktanter tilsatsamtidigt, og XPhos-prækatalysatoren skulle derved aktiveres samtidig med at den skullereagere i Sonogashira-koblingen. Reaktionen blev igen løbende fulgt med TLC-analyse, ogligesom tidligere tyder det på, at reaktionen ikke var forløbet fuldstændigt. Den oparbejdedesog råproduktet blev oprenset. Produktet, en brun olie, blev isoleret og gav et 81% udbytte medfå urenheder. Udbyttet var således væsentlig bedre end tidligere, men stadigvæk ikke optimalt,da den reelle udbytteprocent uden urenheder vil blive lidt mindre end de 81%. Jævnførendealle resultaterne fra TLC-analyserne, havde der i alle Sonogashira-synteser været problemermed både en ikke færdig reageret reaktion og oprensningen, hvor råproduktet ikke kunneoprenses til et rent produkt. Derfor blev udbyttet accepteret, idet tiden ikke rakte til flereSonogashira-koblinger imellem clomipramin og den THP-beskyttet propargylalkohol. Derblev i stedet arbejdet med den mængde af (4), der var blevet produceret, for at kunne kommevidere fra første trin i reaktionsmekanismen (Fig. 1.13) og mod det endelig produktet, endimer.

På baggrund af de ovenstående Sonogashira-reaktionskoblinger imellem clomipramin (2)og (3), kan det således foreløbigt konkluderes, at der opnåes den bedste udbytteprocent forproduktet (4), når alkynen tilsættes efter 25 minutter.

2.8 Afbeskytning af 3-(THP-beskyttetpropargylalkhohol)imipramin (6a)

Ud fra 3-(THP-beskyttet propargylalkhohol)imipramin (4) blev 3-(propargylalkhohol)imipramin(6a) ved at reagere med p-toluensulfonsyre. Reaktionen blev udført i metanol ved stuetempe-ratur. Her blev der brugt flere ækvivalenter p-toluensulfonsyre modsat tidligere rapporteredereaktionsbetingelser fra data i laboratoriet.32 Reaktionsskemaet ses i Fig. 2.15.32

Mekanismen for syrehydolysen af udgangsstoffet (4) ses i Fig. 2.16. I første trin protoneres–C−−−CCH2O– af den katalytiske aktive p-toluensulfonsyre. Oxygenet, der ikke protoneres,bruger herefter dets frie elektronpar til at danne en dobbeltbinding imellem oxygenet ogkulstof i THP-gruppen og samtidig elmineres både produktet (6a), som en udtrædende gruppe,og det karbokationiske THP-intermediat, som en elektrofil. Nukleofilen H2O laver et nukleofiltangreb ind på det elektronfattige kulstof i det karbokationiske THP-intermediat, og der dannesen protoneret hemiacetal. Oxygenets elektronpar i hydroxylgruppen danner en dobbelbindingimellem dens oxygen og karbon, og bryder samtidigt bindingen i THP-gruppen. I sidste trindeprotoneres ketonen og den katalytiske syre regenereres.


N

N

O

4

pTsOH H2O N

N

OH

6a

MeOH,

1,9 ækv.

0,1 MO

stuetemp.

66 %

Figur 2.15. Reaktionsskema og -betingelser for THP-afbeskyttelsen af 3-(THP-beskyttetpropargylalkhohol)imipramin (4).

H

N

N

O

+

OH2OOHO

HHOO

O

N

N

OHO

N

N

OH

- H

6a

4

Figur 2.16. Reaktionsmekanisme for THP-afbeskyttelsen.

Efter reaktionen var forløbet blev produktet (6a) oparbejdet ved blandt andet ekstraktion,hvor syren blev fjernet med vandfasen. Råproduktet blev oprenset ved søjlekromatografi ogproduktet (6a) blev isoleret, som et hvidt fast stof og gav et udbytte på 66%. Afbeskytningenaf alkholen gav et rent produktudbytte, men udbytteprocenten er ikke særlig høj. Årsagen kanvære, at afbeskytningen er udført på et urent produkt (4), hvor de tidligere urenheder fjernesved oprensningen.

2.9 Syntese af 3-((triisopropylsilyl)acetylen)imipramin (7)Produkt (7) syntetiseres ud fra clomipramin og (triisopropylsilyl)acetylen ved endnu enSonogashira-kobling. Dette produkt (7) skal efterfølgende bruges til at syntetisere et kontrol-stof. Syntesen følger betingelserne, som for de tidligere Sonogashira-koblinger, som vist iFig. 2.17.

Reaktionen blev løbende fulgt med TLC og efter 5 timer var reaktionen næsten færdi-greageret. Efter yderligere to timer var TLC-analysen fortsat uændret. Reaktionsproduktetblev oparbejdet og oprenset med søjlekromatografi. Produktet (7) blev isoleret som en brunolie og gav et udbytte på 87%. Inden denne syntese blev en lignende Sonogashira-koblingudført, i stedet for triisoproylsilyl-gruppen blev syntesen afprøvet med en trimethylsilyl-gruppe. Reaktionsbetingelserne var de samme, men udbyttet af syntesen var 0%. Det vil sige,

2.9. SYNTESE AF 3-((TRIISOPROPYLSILYL)ACETYLEN)IMIPRAMIN (7) 25

N

N

Si

3 % XPhos-prækat.2,5 ækv. Cs2CO3


N

N

Cl Si

7

+ 2 ækv.1 ækv.

87 %

2

Figur 2.17. Reaktionsskema og -betingelser for syntesen af 3-((triisopropylsilyl)acetylen)-imipramin (7).

at trimethylsilyl-gruppen er for ustabil i denne Sonogashira-koblingsreaktion i forhold tiltriisopropylsilyl-gruppen.

2.9.1 Syntese af kontrolstof: Afbeskytelse af3-((triisoprylsilyl)acetylen)imipramin (8)

Kontrolstoffet (8) blev dannet ud fra 3-((triisopropylsilyl)acetylen)imipramin (7) ved atreagere med tetrabutylammonium fluorid-tetrahydrofuran (TBAF-THF). Kontrolstoffet skalbruges til at kontrollere, om imipramin med en koblet alkyn i 3-positionen kan binde tilS1-sitet i SERT. I tidligere studier er det blevet vist, at TCA kan binde i S1-sitet, men dennekontrol skal teste for om TCA med en alkyn i 3-positonen også kan binde. En THF opløsningaf TBAF blev tilføjet over fem minutter til en opløsning af (7) i THF. Dette skete ved 0◦Ci en nitrogenatmosfære. Reaktionen reagerede herefter videre under omrøring i et døgn ien nitrogenatmosfære i modsætning til reaktionsbetingelserne beskrevet i en artikel33 fraDongwhan Lee’s gruppe, hvor reaktionen blot reagerede i 5 timer. Reaktionsskemaet forsyntesen ses i Fig. 2.18.33

N

N

8

N

N

Si

7

1 ækv.

3 ækv. TBAF-THF

Tør THF, stuetemp., 5 timer, N2 atm.

<83%

Figur 2.18. Reaktionsskema og -betingelserne for syntesen af 3-(3-ethynyl-10,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin-5-yl)-N,N-dimethylpropan-1-amine (8).

Produktet (8) dannes ved en desilylering. Den effektive elektronegative nukleofil, F–,angriber siliciumatomet i udgangsstoffet (7) ved en substitution og danner et negativt ladetpentakoordinat-intermediat. Pentakoordinat-intermediatet nedbrydes, fordi Si-F bindingen ermeget stærk, hvilket medfører, at bindingen imellem siliciumatomet og alkynen brydes. Pro-duktet (8) dannes sammen med biproduktet silicium-fluorid. Mekanismen er vist i Fig. 2.19.


N

N

8

N

N

Si

7

N

F

N

N

SiF

Si

F

Figur 2.19. Reaktionsmekanisme for produkt (8).

Da reaktionen var færdig blev produktet (8) oparbejdet blandt andet ved en vask for atfjerne biproduktet silicium-fluorid, der er et salt. Efterfølgende blev råproduktet oprenset, ogder blev isoleret en brun olie, hvilket gav et 83% udbytte. Ligesom for produkt (4), der ogsåindeholder en tertiær amin-gruppe så var det svært at oprense, hvorfor der stadigvæk var lidturenheder tilbage.

2.10 Syntese af linker med 2-(2-chloroethoxy)ethanol ognaphthol (9)

Som tidligere nævnt, har vores gruppe tidlgere syntetiseret N-koblede imipramindimere forat undersøge om det hypotetiske S2-site eksisterer. I stedet for en imipramin-dimer blev derher valgt at benytte en naphthol-del som en linker til imipramin-delen. Derved spares der påden begrænsede mængde imipramin, der er blevet koblet med propargylalkohol. Derudoverkan naphthol-delen benyttes, fordi tidligere resultater i vores gruppe indikerer at et naphthol-molekyle kan binde til det potentielle S2-site. Disse resultater er imidlertid under patentering,og derfor endnu ikke offentliggjorte. Således syntetiseres altså en heterodimer bestående afen imipramin-del og en naphthol-del til at teste for S2-sitet. Ud fra naphthol blev linkeren (9)dannet ved at reagere med 2-(2-chloroethoxy)ethanol og en base, K2CO3. Reaktionen blevudført i tør dimethylformamid (DMF) i en nitrogenatmosfære ved 80◦C. Reaktionsskemaetfor syntesen er vist i Fig. 2.20.34

Reaktionen er en etherdannelse ud fra et primær alkylhalid og en alkohol, også kaldet enWilliamson ether syntese, som følger mekanismen vist i Fig. 2.21. I første trin deprotonerer ba-sen, K2CO3, hydroxylgruppen i napthol og danner en alkoxidion. Herefter laver alkoxidionenen nukleofil substitution ved en SN2-mekanisme, med chlorid som den udtrædende gruppe.

2.11. MESYLERING AF 3-(PROPARGYLALKOHOL)IMIPRAMIN (10) 27

OH 2-(2-chloroethoxy)ethanol

3 ækv. K2CO3

2 ækv.

Tør DMF, N2 atm, 80oC

OO

OH

9

<91 %

Figur 2.20. Reaktionsbetingelser for produkt (9).

Derved dannes det ønskede produkt (9). Chlorid er en meget bedre udtrædende gruppe endhydroxylgruppen, da det er en mere stabil anion end hydroxylgruppen.

OHBO

ClO

OH

OO

OH

9


Efter reaktionen var forløbet, blev produktet oparbejdet, hvor blandt andet de organiskefaser blev vasket indtil alt DMF var fjernet. DMF er meget svært at fjerne fra reaktionen,da det er et meget polært organisk stof. DMF er altså blandbart både med den organiskefase og den vandige fase, hvilket vanskeliggør fjernelsen. Råproduktet blev oprenset vedsøjlekromatografi, og produkt (9) blev isoleret som en rød-brun olie og gav et 91% udbyttemed få urenheder.

Inden ovenstående syntese blev en syntese for samme linker afprøvet, men med andrereaktionsbetingelser. Ud over naphthol og 2-(2-chloroethoxy)ethanol blev kemikalierne NaI,K2CO3 og tør acetone benyttet. Det hele blev blandet i et mikrobølgeovnsrør, som blev satover i en time ved 100◦C. Herefter blev råproduktet undersøgt med MS og det viste sig, atreaktionen ikke var foregået, da der kun var en moltop for udgangsstoffet naphthol.

2.11 Mesylering af 3-(propargylalkohol)imipramin (10)For at linkeren (9) senere kan reagere med produkt (6a) og dermed danne heterodimeren,så skal der være en udtrædende gruppe på produktet (6a). Derfor blev hydroxylgruppenmesyleret. Produktet (10) blev dannet ved at reagere (6a) med methansulfonylchlorid ogtriethylamin i tør diethylether ved 0◦C i en nitrogenatmosfære. Reaktionsskemaet ses iFig. 2.22.∗

Produktet (10) følger reaktionsmekanismen vist i Fig. 2.23. I første trin vil det frie elek-tronpar på nitrogen i triethylamin-basen deprotonere mesylchlorid og danne en carbanion.Carbanionen laver en eliminationsreaktion og chlorid forlader mesylchlorid som den udtræ-dende gruppe, hvorved HCl elimineres og det meget ustabile mellemproduktet sulfen dannes.

∗Reaktionen er udført på baggrund af ikke-publiceret data fra vores laboratorium.


N

N

OH

6a

1,5 ækv. MsCl2 ækv. Et3N

Tør Et2O, 0 oC, N2 atm.N

N

OSO

O1 ækv.

10

Figur 2.22. Reaktionsskema for produkt (7).

Svovl i sulfun er meget elektrofilt, og den primære alkhols oxygenatom i produkt (4) vil laveet nukleofilt angreb på svovlatomet, hvorved en ny carbanionen dannes. Carbanionen laver etnukleofilt angreb, hvor den deprotonerer oxygenet og det mesylerede produkt (10) dannes.

Et3NSO

O

HH

H

SO

O

HH

ClClS

OO

N

N

OSO

O

10

HCl

N

N

OH

6a

N

N

OSO

O

CH2

H


Efter en time blev der ved hjælp af en TLC-analyse testet for om reaktionen var færdig re-ageret. Dette viste sig at være tilfældet, hvorfor produktet blev oprenset ved søjlekromatografiog isoleret som et hvidt fast stof. Der var igen problemer med oprensningen, da produktet blevanalyseret med kernemagnetisk resonans (NMR) med hydrogen kunne man se, at produktetikke var helt oprenset. Der var således en del uforklarlige toppe, samt indikationer på ataminen var blevet deprotoneret. Dette reaktionsprodukt skal oparbejdes og oprenses igen,men på grund af mangel på tid vil dette først ske efter udarbejdelsen af denne rapport. Derforkan der heller ikke laves en ny NMR analyse eller en bestemmelse af udbytteprocenten forproduktet (10).

29

KAPITEL 3

Fremtidigt arbejde

I løbet af dette projekt er det lykkes at syntetisere 3-(THP-beskyttet propargylalkohol)imipramin(4). Desværre er det endnu ikke lykkes at nå til det endelige produkt, der blandt andet skalteste om SERT har et S2-bindings-site. I de kommende måneder skal der først og fremmestudføres to trin inden at heterodimeren, bestående af imipramin og naphthol, kan dannes.Derudover vil det fremtidige arbejde bestå i at danne en imipramin-dimer, på samme mådesom heterodimeren er blevet fremstillet. Denne skal ligeledes benyttes til at teste for omder eksisterer et S2-site. Når heterodimeren er dannet skal ligandlængderne varieres for atfinde afstanden mellem S1-sitet og det mulige S2-site. Dette samme vil også blive testet forimipramin-dimeren. Et forslag til den resterende del af syntesen er vist i Fig. 3.1

N

N

OSO

O

10

+

OO

OH

9NaHTør DMF

N

N

OO

O

6

Figur 3.1. Reaktionsskema for det sidste trin i dannelse af produkt (5).

Første trin er en mesylering af produkt (6a), som danner det mesylerede produkt (10).Denne reaktion er delvist fuldført, som beskrevet i afsnit 2.11, men mangler endnu opar-bejdningen og oprensning af produktet. I andet trin skal heterodimeren (5) dannes ud fraprodukterne (10) og (9) via en Williamson ethersyntese. Basen, NaH, deprotonerer alkoholeni produkt (9) og danner en alkoxidion, som laver et nukleofiltangreb ved en SN2-mekanisme,hvor methansulfonat-anionen er den udtrædende gruppe og danner det ønskede slutprodukt(5), der blandt andet skal teste for om det mulige S2-bindings-site findes i SERT. Når dimerne

30 KAPITEL 3 – FREMTIDIGT ARBEJDE

med deres varierende længder er syntetiseret, vil deres bindinger med SERT blive testet påforskningscenteret på Risskov Psykiatriske Hospital.

n

N

N

OO

O

6

N

N

OO

O N

N11

n

Figur 3.2. Strukturer af molekylerne (5) og (11), der skal undersøge bindings-sitet i SERT.

31

KAPITEL 4

Konklusion

Det er i løbet af projektet lykkes at etablere reaktionsbetingelser der tillader en Sonogahira-koblingsreaktion imellem det meget lidt reaktive chlorid på clomipramin(2) og den THP-beskyttede alkyn i syntesen af 3-(THP-beskyttet propargylalkohol)imipramin (4). Den bedsteudbytteprocent blev opnået ved, at den THP-beskyttede propargylalkohol i Sonogashira-koblingsreaktionen blev tilsat 25 minutter efter de andre reaktanter. Derved kunne XPhos-prækatalysatoren nå at blive aktiveret til det aktive Pd0-kompleks. Udbytteprocenten forprodukt (4) var 81% med urenheder, når alkynen tilsættes efter 25 minutter.

Normalt ville dette være et for unøjagtigt og ikke tilfredsstillende udbytte, men for detteprojekt er det accepteret, på grund af diverse problemer med produkt (4). Det ville ikkereagere færdigt ifølge TLC-analyserne, og derudover kunne det urene råprodukt ikke oprensesved søjlekromatografi til et helt rent produkt. Derudover var udbytteprocenten, når alkynentilsættes efter 25 minutter meget bedre end de andre udbytteprocenter, der blev opnået forSonogashira-koblingerne med de tilsvarende reaktionsbetingelser, og som ligeledes var urene.Det har desværre ikke været muligt at finde de eksakte udbytteprocenter for Sonogashira-reaktionerne, da urenhederne ikke kunne indentificeres som kendte forbindelser.

Sonogashira-koblinger blev udført med en THP-beskyttet propargylalkohol. Umiddelbartburde en THP-beskyttelse ikke være nødvendig, men i en lignende Sonogashira-koblingsreaktionblev det vist, at propargylalkoholen skal THP-beskyttes for at Sonogashira-koblingsreaktionenvirker. Det viste sig nemlig, at udbytteprocenten for reaktionen med en ikke THP-beskyttetpropargylalkohol var 0%. I den efterfølgende THP-afbeskyttelse af produkt (4) lykkes det, atoprense råproduktet til et rent produkt (6a) med et udbytte på 66%. De fundne reaktionsbetin-gelser for Sonogashira-koblingsreaktionen blev også brugt til at syntetisere kontrolstoffet (8)ud fra clomipramin (2) og (triisopropylsilyl)acetylene. I den forbindelse blev det vist, at entrimethylsilyl-gruppe var for ustabil til en Sonogashira-koblingsreaktion. Liganden (9), derskal koble naphthol-delen sammen med imipramin blev syntetiseret med et udbytte på 91%,dog igen med få urenheder.

Det endelige heterodimerprodukt (5) mangler således halvandet trin inden det er færdig-syntetiseret. Herefter vil der blive syntetiseret en række heterodimere af (5), som endeligt vilkunne teste og besvare problemformuleringen, om hvorvidt der eksisterer et S2 bindings-sitei SERT. Herudover vil imipramindimeren (11) også blive syntetiseret for at blive testet påSERT.

33

KAPITEL 5

Experimental

5.1 GeneralAll the Sonogashira reactions were mixed in the glove box in an argon atmosphere. The otherexperiments with air- and moisture sensitive compounds were conducted in an atmosphere ofnitrogen, in oven dried glassware and in dry solvents. THF was dried over aluminum oxideby a MBraun solvent purification system.

TLC analysis was carried out on silica gel on aluminum foil (Merck Kieselgel 60 F254).The TLC plates were first processed by UV irradiation, if it was possible to see the productwith an UV lamp, initially. Afterwards, the plates were visualized with KMnO4-stain (1.5gKMnO4 in 1.25g 10% NaOH and 200mL H2O) or Ce-mol stain (0.2 % Cerium(IV) sulfateand 5 % ammoniummolybdate in 10 % sulfuric acid) and heating to dryness. Flash columnchromatography was performed out with a Merck silica gel (230-400 Mesh). Evaporation ofsolvents was done under reduced pressure at 40◦C.

5.2 ApparatusNMR spectra were recorded on a Varian Gemini 400 spectrometer (1H NMR at 400 MHzand 13C NMR at 100 MHZ). Chemical shifts (δ ) are reported in ppm relative to the residualsolvent signals (CDCl3 (δ = 7.26 ppm for proton and δ = 77.16 ppm for carbon resonances)).For 1H NMR the coupling constants (J) are given in Hertz (Hz). Mass spectroscopy (MS)spectra was recorded on a Micromass LC TOF with positive electrospray ionization (ES).High-resolution MS (HRMS) were recorded with the following compound as internal standard:BzGlyPheMe: C19H20N2O4Na: m/z = 361.1321. Melting point was measured on a BüchiB-540 instrument. Microwave chemistry was carried out in a Biotage Initiator Microwave.

34 KAPITEL 5 – EXPERIMENTAL

5.3 SynthesisAll spectra are analyzed based on NMR-notes35. The Sonogashira spectra analysis was madefrom imipramine (7). Imipramines spectra and analysis is attached at the end of this appendix.

OO

Figure 5.1. 2-(prop-2-yn-1-yloxy)tetrahydro-2H-pyran (3).

To a stirred solution of 3,4-dihydro-2H-pyran(11.8mL, 0.140mol, 4 eq) in dry diethylether (75mL) was added p-toluenesulfonic acid (0.05g, 0.290mmol) and propargyl alcohol(1.95g, 0.0348mol, 1 eq) under N2 atmosphere at 0◦C. The reaction mixture was left for 4hours at roomtemperature, then it was quenced by adding concentrated ammonium hydroxide(1mL). It was diluted with water (20mL) and diethyl ether (20mL). The aqueous phasewas extracted with diethyl ether (3×20mL). The combined organic layers were dried withNa2SO4 filtered and concentrated under reduced pressure. The crude product was purifiedby flash column chromatography (2.5% ethyl acetate in pentane) to give (3) as a clear liquid(1.18g, 24 %)

R f (2.5% ethyl acetate in pentane) 0.31

1H NMR(400MHz, CDCl3): δ 4.83 (1H, t, J = 4, ketalic-H) 4.33-4.22 (1H each, dd, J= 16, 2.8, (OCH2−C−−−CH)) 3.85, 3.55 (1H each, m, CH2O−CH−O−CH2) 2.42-2.41 (1H,dt, J = 3.2, 1.2, (C−−−CH) 1.88-1.50 (6H, m, ring-H’s)

13C NMR(100MHz, CDCl3): δ 95.5 (ketalic-C), 78.5 (OCH2−C−−−CH), 72.8 (OCH2−C−−−CH),60.6 (OCH2−C−−−CH), 52.7 (CH2O−CH−O−CH2), 29.0 (C8), 24.1 (C6), 17.8 (C7) (ring-Cs)

NMR data was in accordance with previously reported data29

5.3. SYNTHESIS 35

Experiment 2

N

N

O

O

Figure 5.2. N,N-dimethyl-3-(3-(3-((tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)prop-1-yn-1-yl)-10,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin-5-yl)propan-1-amine (4).

In a glovebox with argon atmosphere clomipramin (2) ((50.0mg, 0.142mmol, 1 eq)), 2-(prop-2-yn-1-yloxy)tetrahydro-2H-pyran (3) ((32.8mg, 0.213mmol, 1.5 eq), Cs2CO3 ((0.116g,0.356mmol, 2.5 eq)), acetonitrile (0.5mL) and XPhos-precatalyst ((1.05mg, 0.0014mmol,1%) were all mixed in a vial. Subsequent the vial was closed with a lid, removed fromthe glovebox and the reaction mixture was stirred in a heating block at 85◦C. The re-action was followed by TLC analysis. After 5 hours the reaction mixture has changesfrom yellow to brown-black. After 1 day the reaction was still not finished, so the reac-tion was stopped because the TLC analysis showed that nothing had happened since theday before. The mixture was allowed to reach room temperature, then it was diluted withNaHCO3 10% and extracted with ethyl acetate (4×20mL). The combined organic layerswere dried over MgSO4, filtered, and concentrated under reduced pressure. The crude pro-dukt was purified by flash column chromatography (5% methanol in dichloromethane) togive N,N-dimethyl-3-(3-(3-((tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)prop-1-yn-1-yl)-10,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin-5-yl)propan-1-amine (15) as a brown oil (13.5 mg, 20 %)∗

R f (5% methanol in dichloromethane) 0.30

HRMS (ES+): m/z calcd. for C27H34N2O2 + Na+: 441.2518, found m/z: 441.2515

1H NMR(400MHz, CDCl3): δ 7.20-6.82 (7H, m, Aromat(H1, 2, 3, 4, 8, 9, 10) 4.88 (1H, t, J= 2.0, ketalic H) 4.47 (2H, kvartet, J = 16.0, H22) 3.78 (2H, m, H15) 3.90, 3.56 (1H each, m,CH2O−CH−O−CH2) 3.10 (4H, d, J = 8.0 H12, H13) 2.59 (2H, t, J = 8.0, H17) 2.34 (6H,m, 2 x CH3) 1.8 (8H, m, (H25, 26, 27, 16)

13C NMR(100MHz, CDCl3): δ 147.6 (C5, C6), 134.4 (C11, C14), 129.8-120.3 (Aromat C(7,8, 9, 10, 1, 2, 3, 4) 97.0 (ketalic-C) 85.9 (OCH2−C−−−C−R), 84.6 (OCH2−C−−−C−R) 62.1(OCH2−C−−−C−R) 56.9 (C17) 54.9 (CH2O−CH−O−CH2) 48.2 (C15) 44.2 (C18, C19) 32.5(C12, C13) 31.7 (C27) 30.4 (C25) 24.2 (C16) 19.2 (C26)

∗OBS: The yield are with few impurities! The eksperimental have been written for the second Sonogashiracoupling reaction test between clomipramin (2) and 2-(prop-2-yn-1-yloxy)tetrahydro-2H-pyran (3) but it appliesgenerally to all synthesis of product (4) with the same reaction conditions. The difference in the synthesis is thevariation of the alkyne, increased amount of alkyne and precatalyst.


Experiment 5 - alkyne added after 25 minutes

N

N

O

O

Figure 5.3. N,N-dimethyl-3-(3-(3-((tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)prop-1-yn-1-yl)-10,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin-5-yl)propan-1-amine (4).

In a glovebox with argon atmosphere clomipramin (2) ((100.0mg, 0.285mmol, 1 eq)),Cs2CO3 ((0.232g, 0.712mmol, 2.5 eq)), acetonitrile (1mL) and XPhos-precatalyst ((6.31mg,0.0085mmol, 3%) were all mixed in a vial. The yellow suspension was stirred for 25 minutes.Then the alkyne (3) ((99.8mg, 0.712mmol, 1.5 eq) was injected to the vial and the vialwas closed with a lid. It was then removed from the glovebox, and the reaction mixturewas stirred in a heating block at 85◦C. The reaction was followed by TLC analysis. Af-ter 2 hours the reaction mixture had changed from yellow to brown-black. After 8 hoursthe reaction was still not finished, so the reaction was stopped because the TLC analysisshowed that nothing had happened since the last TLC analysis. The mixture was allowed toreach room temperature, then it was diluted with NaHCO3 10% (10mL) and extracted withethyl acetate (4×10mL). The combined organic layers were dried over MgSO4, filtered,and concentrated under reduced pressure. The crude produkt was purified by flash columnchromatography (First dichloromethan followed by 5% methanol in dichloromethane) togive N,N-dimethyl-3-(3-(3-((tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)prop-1-yn-1-yl)-10,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin-5-yl)propan-1-amine (15) as a brown oil (108.1 mg, 81 %)†


HRMS (ES+): m/z calcd. for C27H34N2O2 + H+: 419.2699, found m/z: 419.2699

1H NMR(400MHz, CDCl3): δ 7.18-6.93 (7H, m, Aromat-H(H1, 2, 3, 4, 8, 9, 10) 4.89(1H, t, J = 3.4, ketalic H) 4.47 (2H, k, J = 16.0, H22) 3.79 (2H, t, J = 4 , H15) 3.88, 3.57 (1Heach, m, CH2O−CH−O−CH2) 3.12 (4H, s, H12, H13) 2.69 (2H, s, H17) 2.41 (6H, bs, 2 xCH3) 1.77 (8H, m, (H25, 26, 27, 16)

13C NMR(100MHz, CDCl3): δ 146.4 (C5, C6), 133.5, 133.1 (C11, C14), 128.4-118.6 (Aro-mat C(7, 8, 9, 10, 1, 2, 3, 4) 95.7 (ketalic-C) 84.7 (OCH2−C−−−C−R), 83.2 (OCH2−C−−−C−R)60.8 (OCH2−C−−−C−R) 55.7 (C17) 53.6 (CH2O−CH−O−CH2) 47.0 (C15) 43.1 (C18, C19)31.2, (C12, C13) 30.4 (C27) 29.1 (C25) 24.2 (C16) 23.2 (C26)

†OBS: The yield are with few impurities!

5.3. SYNTHESIS 37

N

N

OH

Figure 5.4. 3-(5-(3-(dimethylamino)propyl)-10,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin-3-yl)prop-2-yn-1-ol (6a).

A solution of (4) ((108.0mg, 0.258mmol, 1 eq)) and p-TsOH ·H2O ((92.9mg, 0.488mmol,1.9 eq)) in methanol (3.0mL) was stirred at room temperature for 2 hours. The solution wasquenched with sat. sodium hydrogen carbonate (10mL). Methanol was removed underreduced pressure. The aqueous solution was extracted with dichloromethane (3×10mL).The combined organic layers were dried over MgSO4, filtered and concentrated under reducedpressure. The crude product was purified by flash column chromatography in a gradient (5%followed by 7.5% followed by 10% methanol in dichloromethane) to give (6a) as a whitesolid (57.6 mg, 66 %)32


mp(uncorr.) 208.5–212.3◦C

HRMS (ES+): m/z calcd. for C22H26N2O + H+: 335.2123, found m/z: 335.2118

1H NMR(400MHz, CDCl3): δ 7.15-6.87 (7H, m, Aromat-H(H1, 2, 3, 4, 8, 9, 10) 4.30(2H, s, H22) 3.72 (2H, triplet, J = 7, H15) 3.43 (1H, bs, H23) 3.1 (4H, s, H12, H13) 2.72 (2H,2, J = 8, H17) 2.41 (6H, s, 2 x CH3) 1.87 (2H, kv, J = 8, H16)

13C NMR(100MHz, CDCl3): δ 147.5, 147.3 (C5, C6), 134.8, 134.1 (C11, C14), 130.4-120.1 (Aromat C(7, 8, 9, 10, 1, 2, 3, 4), 87.1 (HOCH2−C−−−C−R), 84.8 (HOCH2−C−−−C−R),56.6 (C17), 50.8 (HOCH2−C−−−C−R), 47.8 (C15), 43.5 (C18, C19), 32.4, 31.5 (C12, C13),23.5 (C16)


N

NSi

Figure 5.5. N,N-dimethyl-3-(3-((triisopropylsilyl)ethynyl)-10,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]-azepin-5-yl)propan-1-amine (7).

In a glovebox with argon atmosphere clomipramin (2) ((100.0mg, 0.285mmol, 1 eq)),(triisopropylsilyl)acetylene((104.0mg, 0.569mmol, 2 eq)), Cs2CO3 ((0.231g, 0.712mmol,2.5 eq)), acetonitrile (1mL) and XPhos-precatalyst ((6.31mg, 0.0085mmol, 3%) were allmixed in a vial. Subsequent the vial was closed with a lid, removed from the glovebox and thereaction mixture was stirred in a heating block at 85◦C. The reaction was followed by TLCanalysis. After 2 hours the reaction mixture had changed from clear to yellow and after twomore hours it had changed to brown-black. After 7 hours the reaction was stopped because itwas almost finished and nothing had happended since the last TLC. The mixture was allowedto reach room temperature, then it was diluted with NaHCO3 10% (10mL) and extractedwith ethyl acetate (4×10mL). The combined organic layers were dried over MgSO4, filtered,and concentrated under reduced pressure. The crude produkt was purified by flash columnchromatography (Dichloromethane followed by 5% methanol in dichloromethane) to give (7)as a brown oil (128.1 mg, 87 %)


HRMS (ES+): m/z calcd. for C30H44N2Si + Na+: 483.3171, found m/z: 484.3180

1H NMR(400MHz, CDCl3): δ 7.20-6.87 (7H, m, Aromat(H1, 2, 3, 4, 8, 9, 10) 3.77 (2H, t, J= 8, H15) 3.12 (4H, s, H12, H13) 2.48 (2H, t, J = 7.4, H17) 2.27 (6H, d, 2 x CH3) 1.82 (2H,kv, J = 8, H16) 1.13 (21H, s, (triisopropylsilyl gruppen))

13C NMR(100MHz, CDCl3): δ 148.5 148.3 (C5, C6), 135.2, 135.0 (C11, C14), 130.6-120.8 (Aromat C(7, 8, 9, 10, 1, 2, 3, 4) 107.9 (C20) 90.1 (C21) 57.8 (C17) 49.1 (C15) 45.4(C18, C19) 33.0, 32.4 (C12, C13) 25.7 (C16) 19.4, 12.0 (C22)

5.3. SYNTHESIS 39

N

N

Figure 5.6. 3-(3-ethynyl-10,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin-5-yl)-N,N-dimethylpropan-1-amine (8).

To a stirred solution of (7) (76.3mg, 0.166mmol, 1 eq) in THF (0.1 M 1.65mL) underN2 atmosphere at 0◦C was added a THF solution of TBAF (1.0 M, 0.15mL) over a periodof 5 minutes using a syringe. The reaction was stirred for 1 day at room temperature underN2 atmosphere. The solution was dissolved in dichloromethane (50.0mL), washed with 10%NaHCO3 (3×20mL), dried over MgSO4, filtered and concentrated. The crude product waspurified by flash column chromatography in a gradient (Ethyl acetate followed by 2.5%methanol in dichloromethane followed by 5.0% methanol in dichloromethane followed by10.0% methanol in dichloromethane) to give (8) as a brown oil (60.5 mg, 83%)‡

R f (Methanol:Ethyl acetate 1:1) 0.23

HRMS (ES+): m/z calcd. for C21H24N2 + H+: 305.2018 m/z, found m/z: 305.2045

1H NMR(400MHz, CDCl3): δ 7.25-6.90 (7H, m, Aromat-H(H1, 2, 3, 4, 8, 9, 10) 3.77(2H, t, J = 6, H15) 3.14 (4H, s, H12, H13) 3.01 (1H, s, H21) 2.42 (2H, t, J = 8, H17) 2.23(6H, s, 2 x CH3) 1.79 (2H, kv, J = 8, H16)

13C NMR(100MHz, CDCl3): δ 146.9 146.8 (C5, C6), 133.7 (C11, C14), 129.2-118.9(Aromat-C(C7, 8, 9, 10, 1, 2, 3, 4) 82.8 (C20) 75.2 (C21) 56.3 (C17) 47.5 (C15) 44.0 (C18,C19) 31.5, 30.6 (C12, C13) 24.3 (C16)

‡The yield are with impurities


OO

OH

Figure 5.7. 2-(2-(naphthalen-1-yloxy)ethoxy)ethanol (9).

To a stirred solution of 1-naphthol (0.51g, 0.0035mol, 1 eq) in dried DMF (15mL) underN2 atmosphere at room temperature was added K2CO3 (1.4g 0.0104mol, 3 eq), subsequent2-(2-chloroethyoxy)ethanol (0.73 µL, 0.0104mol, 3 eq) was titrated to the mixture via asyringe. The mixture was stirred and heated to 80◦C for 1 day. The solution was dissolvedin H2O (25.0mL), extracted with (2×25mL). Then the organic layers was wash with H2O(2×20mL) and brine (1×25mL) until alle the DMF was removed from the solution. Theorganic layers were dried over MgSO4, filtered and concentrated. The crude product waspurified by flash column chromatography in (Ethyl acetate : pentane 1:1) to give (9) as ayellow-brown oil (0.73g, 91%)§

R f (Pentane:Ethyl acetate 2:1) 0.35

HRMS (ES+): m/z calcd. for C14H16O3 + Na+: 255.0997 m/z, found m/z: 255.0994

1H NMR(400MHz, CDCl3): δ 8.28 (1H, m, H12), 7.81(1H, m, H9), 7.48 (3H, m, H8,H10, H11) 7.37 (1H, t, J = 8, H7) 6.83 (1H, d, J = 8 , H6) 4.32 (2H, dt, J = 4, H5) 4.01 (2H,dt, J = 4, H5) 3.75 (4H, m, H3, H2) 3.64 (1H, kv, J = 4, H1)

13C NMR(100MHz, CDCl3): δ 153.4 (C14), 133.4 (C13), 126.3-119.5 (Aromat C7, 8,9, 10, 11, 12) 103.9 (C6) 71.5 (C5) 68.7 (C4) 66.7 (C3) 60.7 (C2)

§few impurities

5.3. SYNTHESIS 41

N

N

OS

O

O

Figure 5.8. 3-(5-(3-(dimethylamino)propyl)-10,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin-3-yl)prop-2-yn-1-yl methanesulfonate (10).

To a stirred solution of (6a) (32.6mg, 0.0976mmol, 1 eq) in dried diethylether (3.0mL)under N2 atmosphere at 0◦C was added Et3N (0.03mL, 0.195mmol, 2 eq) followed byMsCl(0.01mL, 0.146mmol, 1.5 eq). The reaction mixture was stirred for 1 hour at 0◦C. Thesolution was dissolved in dichloromethane (40.0mL) and H2O (10.0mL), washed with 10%NaHCO3 (3×20mL), dried over MgSO4, filtered and concentrated. The crude product waspurified by flash column chromatography in a gradient (Dichloromethane followed by 5.0%ethyl acetate in dichloromethane followed by 10.0% ethyl acetate in dichloromethane) to give(10)(-)


N

N

Figure 5.9. 3-(10,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin-5-yl)-N,N-dimethylpropan-1-amine (1).

1H NMR(400MHz, CDCl3): δ 7.30-7.24 (6H, m, Aromat-H (H1, 3, 4, 7, 8, 10) 7.07 (2H,t, Aromat(H2, H9) 3.93 (2H, t, J = 6, H15) 3.32 (4H, s, H12, H13) 2.47 (2H, t, J = 6 H17)2.31 (6H, s, 2 x CH3) 1.81 (2H, kv, J = 6, H16)

13C NMR(100MHz, CDCl3): δ 147.3 (C5, C6), 133.2 (C11, C14), 128.7-119.0 (Aromat C(1,2, 3, 4, 7, 8, 9, 10) 56.7 (C17) 47.8 (C15) 44.5 (C18, C19) 31.2 (C12, C13) 25.2 (C16)

43

Litteratur

1 J. Andersen, A. S. Kristensen, B. Bang-Andersen and K. Strø mgaard, Chemical communi-cations (Cambridge, England), 2009, 3677–92.

2 S. Sinning, M. Musgaard, M. Jensen, K. Severinsen, L. Celik, H. Koldsø, T. Meyer,M. Bols, H. H. Jensen, B. Schiø tt and O. Wiborg, The Journal of biological chemistry,2010, 285, 8363–74.

3 Sundhedsstyrelsen, Sundhedsstyrelsen: Folkesygdomme og forebyggelse - idékatalog tilarbejdet i almen praksis, 2005.

4 Indenrigs- og Sundhedsministeriet, Sund hele livet, 2002.

5 PsykiatriFonden, PsykiatriFonden - Fakta & Depression, 2001.

6 WHO, International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems10th Revision, 2007.

7 Sundhedsstyrelsen, Sundhedsstyrelsen antidepressiva , antipsykotika, 2000.

8 F. R. Rang H.P., Dale M.M., Ritter J.M., Pharmacology, Elsevier Ltd, Philadelphia, 6.edn., 2007.

9 M. D. Gershon and J. Tack, Gastroenterology, 2007, 132, 397–414.

10 K. a. Michelsen, J. Prickaerts and H. W. M. Steinbusch, The dorsal raphe nucleus andserotonin: implications for neuroplasticity linked to major depression and Alzheimer’sdisease., 2008.

11 A. R. Siegel GJ, Agranoff BW, Basic Neurochemistry - Molecular, Cellular and MedicalAspects, Lippincott-Raven, Philadelphia, 6th edn., 1999.

12 J. H. Merritt, A. F. Chamness and S. J. Allen, Radiation and Environmental Biophysics,1978, 377, 367–377.

13 J. P. Ruddick, A. K. Evans, D. J. Nutt, S. L. Lightman, G. a. W. Rook and C. a. Lowry,Expert reviews in molecular medicine, 2006, 8, 1–27.

14 S. B. Kater, M. P. Mattson, C. Cohan and J. Connor, Trends in neurosciences, 1988, 11,315–21.

15 Gerlach Jes, Depression - Symptomer, årsager og behandling, PsykiatriFondens Forlag,København, 2006 edn., 2006.

16 O. Jardetzky, Nature, 1966, 211, 969–970.

44 LITTERATUR

17 PsykiatriFonden, PsykiatriFonden - Behandling & depression, 2001.

18 F. López-Muñoz and C. Alamo, Current pharmaceutical design, 2009, 15, 1563–86.

19 A. Brinkoe, Synthesis of Dimeric Nitrogen Interlinked Imipramines Is There a S2 BindingSite Bachelorprojekt, 2010.

20 A. Cwik, Z. Hell and F. Figueras, Tetrahedron Letters, 2006, 47, 3023–3026.

21 A. Elangovan, Y.-H. Wang and T.-I. Ho, Organic letters, 2003, 5, 1841–4.

22 M. Pal, Synlett, 2009, 2896–2912.

23 H. Doucet and J.-C. Hierso, Angewandte Chemie (International ed.), 2007, 46, 834–71.

24 P. Reagents, Palladium reagents and catalysts: new perspectives for the 21st century, 2004.

25 R. Chinchilla and C. Najera, Chemical reviews, 2007, 107, 874–922.

26 M. R. Biscoe, B. P. Fors and S. L. Buchwald, Journal of the American Chemical Society,2008, 130, 6686–7.

27 D. Gelman and S. L. Buchwald, Angewandte Chemie (International ed.), 2003, 42, 5993–6.

28 T. Ljungdahl, T. Bennur, A. Dallas, H. EmtenaÌˆs and J. Må rtensson, Organometallics,2008, 27, 2490–2498.

29 D. Li, G. Agnihotri, S. Dakoji, E. Oh and M. Lantz, Journal of the American ChemicalSociety, 1999, 121, 9034–9042.

30 W. S. Clayden J., Greeves N. and W. P., Organic Chemistry, Oxford University Press,Oxford, 2008.

31 H. Huang, H. Liu, H. Jiang and K. Chen, Journal Organic Chemistry, 2008, 73, 6037–6040.

32 T. T. Tran, in Speciale, 2008.

33 H. Y. Lee, A. Olasz, M. Pink, H. Park and D. Lee, Chemical communications (Cambridge,England), 2011, 47, 481–3.

34 R. T. Hunter, C, Tetrahedron, 2002, 58, 691–697.

35 Kemisk Institut, Anvendt Spektroskopi - Tabeller og opgaver NMR, 2009.

45

Appendiks

47

NMR data for 2-(prop-2-yn-1-yloxy)tetrahydro-2H-pyran (3)

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5

f1 (

ppm

)

1.551.591.631.671.741.782.412.412.422.422.422.42

3.523.53

3.563.823.85 4.224.264.28

4.334.824.834.84

3

23

56

OO

1

78 4

48

3.55

3.65

3.75

3.85

3.95

4.05

4.15

4.25

4.35

4.45

4.55

4.65

4.75

4.85

f1 (

ppm

)

3.523.533.553.563.57

3.823.833.853.853.863.873.88

4.224.224.224.224.264.264.264.264.284.284.294.294.304.314.324.32

4.33

4.824.834.84

49

1.50

1.55

1.60

1.65

1.70

1.75

1.80

1.85

1.90

1.95

2.00

2.05

2.10

2.15

2.20

2.25

2.30

2.35

2.40

2.45

f1 (

ppm

)

1.541.551.571.581.591.591.611.621.631.641.641.651.67

1.721.721.731.741.75

1.811.83

1.86

1.88

2.412.412.422.422.422.42

50

2025

3035

4045

5055

6065

7075

8085

9095

100

105

110

115

120

125

130

f1 (

ppm

)

17.75

24.12

28.96

52.67

60.62

72.81

78.54

95.48

51

NMR data for N,N-dimethyl-3-(3-(3-((tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)prop-1-yn-1-yl)-10,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin-5-yl)propan-1-amine (4) - 2. forsøg

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

f1 (

ppm

)

0.26

8.93

6.00

1.72

3.94

0.91

1.950.89

1.64

0.64

6.78

0.07

1.551.641.671.741.751.761.791.901.92

2.37

2.622.64

3.12

3.543.573.763.803.884.414.454.494.534.884.894.89

6.946.956.977.007.047.067.107.127.127.147.167.26

N

N

O

O

9

17

14

715

16131 3

46

5810

2

1112

18

19

2021

22

23

24

2526

27

4

For

søg

2

52

3.55

3.65

3.75

3.85

3.95

4.05

4.15

4.25

4.35

4.45

4.55

4.65

4.75

4.85

f1 (

ppm

)

0.61

2.00

0.59

1.02

0.48

3.57

3.753.773.793.813.823.853.88

4.41

4.45

4.48

4.52

4.884.884.89

53

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2.0

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

3.0

3.1

3.2

f1 (

ppm

)

0.33

6.56

6.05

1.74

4.06

1.25

1.55

1.63

1.761.79

1.861.881.90

2.322.342.37

2.572.592.612.66

3.123.14

54

1520

2530

3540

4550

5560

6570

7580

8590

9510

511

512

513

514

5f1

(pp

m)

19.19

24.19

30.4131.7232.54

44.17

48.16

54.9056.92

62.14

84.5585.90

96.96

120.32120.86123.06123.48126.10

129.76

134.35134.80

147.62

55


0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

f1 (

ppm

)

0.10

8.91

6.00

1.72

3.94

0.92

1.970.97

1.64

0.64

6.91

0.06

1.541.631.661.731.741.751.781.891.911.93

2.37

2.612.632.65

3.11

3.533.56

3.753.793.87

4.404.444.484.52

4.874.884.89

6.936.946.966.997.037.057.097.117.117.14

N

N

O

O

9

17

14

715

16131 3

46

5810

2

1112

18

19

2021

22

23

24

2526

27

4

For

søg

4

56

1520

2530

3540

4550

5560

6570

7580

8590

9510

511

512

513

514

5f1

(pp

m)

18.03

23.0324.34

29.2530.5631.38

43.01

47.00

53.7455.76

60.98

75.6876.0076.32

83.3984.74

95.80

119.16119.70121.90122.32124.94

128.60

133.19133.64

146.46

57


1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7 .0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5

f1 (

ppm

)

0.77

9.40

6.00

4.09

0.81

1.500.81

1.68

0.56

9.84

1.561.77

2.41

3.133.543.57

3.793.873.89 4.424.464.494.534.89

6.967.017.057.067.107.127.157.26

N

N

O

O

9

17

14

715

16131 3

46

5810

2

1112

18

19

2021

22

23

24

2526

27

4

For

søg

5

58

3.60

3.70

3.80

3.90

4.00

4.10

4.20

4.30

4.40

4.50

4.60

4.70

4.80

4.90

f1 (

ppm

)

0.99

2.02

0.94

1.68

0.56

3.79

4.42

4.46

4.49

4.53

4.884.894.90

59

1520

2530

3540

4550

5560

6570

7580

8590

9510

511

512

513

514

5f1

(pp

m)

17.90

23.1824.19

29.1130.4131.24

43.05

46.96

53.5955.66

60.84

83.2284.65

95.65

118.63119.04119.49121.63121.78122.10124.70

128.43

133.08133.52

146.40146.44

60

NMR data for 3-(5-(3-(dimethylamino)propyl)-10,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin-3-yl)prop-2-yn-1-ol (6a)

N

N

OH

9

17

14

7151613

1 34

65

810

2

1112

18

19

202122

23

6a

61

1.8

1.9

2.0

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

3.0

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

3.6

3.7

f1 (

ppm

)

1.88

6.00

1.89

4.11

2.36

1.99

1.831.851.871.891.90

2.29

2.41

2.702.722.74

3.06

3.43

3.703.723.73

62

2025

3035

4045

5055

6065

7075

8085

9095

100

105

110

115

120

125

130

135

140

145

f1 (

ppm

)

23.49

31.5032.40

43.51

47.7750.84

56.56

76.8477.1677.48

84.8487.10

120.13120.90122.65123.54125.76126.76129.65

134.06134.79

147.27147.48

63

NMR data for N,N-dimethyl-3-(3-((triisopropylsilyl)ethynyl)-10,11-dihydro-5H-diben-zo[b,f]azepin-5-yl)propan-1-amine (7)

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5

10.

010

.5f1

(pp

m)

21.61

1.67

6.00

1.70

3.81

1.66

6.99

1.13

1.82

2.272.272.472.48

3.12

3.753.773.79

6.936.946.987.007.037.067.087.097.117.137.16

N

NS

i

3

2

45

67

8

9

1011

1213

14

1516 17

18

19

20 21

22

1

7

64

3.8

4.0

4.2

4.4

4.6

4.8

5.0

5.2

5.4

5.6

5.8

6.0

6.2

6.4

6.6

6.8

7.0

7.2

f1 (

ppm

)

1.66

6.99

3.753.773.79

6.936.946.987.007.037.067.087.097.117.137.16

65

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2.0

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

3.0

3.1

3.2

f1 (

ppm

)

21.61

1.67

6.00

1.70

3.81

1.13

1.781.801.821.831.85

2.272.27

2.472.482.50

3.12

66

510

1520

2530

3540

4550

5560

6570

7580

8590

9510

511

512

513

514

5f1

(pp

m)

11.99

19.35

25.65

32.4433.01

45.36

49.05

57.81

90.12

107.88

120.83122.19123.65123.77126.95130.33

135.01135.25

148.26148.53

67

NMR data for 3-(3-ethynyl-10,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin-5-yl)-N,N-dimethylpropan-1-amine (8)

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5

10.0

f1 (

ppm

)

1.17

4.48

2.03

6.001.87

0.733.91

1.80

6.99

0.891.261.38

1.751.792.232.402.422.44

3.013.14

3.753.773.78

6.936.956.977.007.027.067.087.107.127.147.167.21

9

17

14

7 15 16

131 3

4

65

8

10

2

1112

1819

20 21

8 N

N

68

1.7

1.8

1.9

2.0

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

3.0

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

3.6

3.7

3.8

f1 (

ppm

)

2.03

6.00

1.87

0.73

3.91

1.80

1.751.771.791.801.82

2.23

2.402.422.44

3.01

3.14

3.753.773.78

70

NMR data for 2-(2-(naphthalen-1-yloxy)ethoxy)ethanol (9)

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5

10.0

10.5

11.0

11.5

f1 (

ppm

)

0.08

1.27

0.494.13

1.79

2.00

0.87

3.84

0.80

0.76

1.26

2.032.05

3.623.653.733.753.78

4.00

4.314.324.33

6.826.84

7.267.46

7.797.81 8.278.278.278.278.288.288.288.288.288.29

92

765

43

OO

OH

8

121

1011

9

1413

71

6.8

6.9

7.0

7.1

7.2

7.3

7.4

7.5

7.6

7.7

7.8

7.9

8.0

8.1

8.2

8.3

f1 (

ppm

)

0.87

0.79

2.58

0.80

0.76

6.826.84

7.267.26

7.357.377.39

7.447.467.477.487.497.497.507.51

7.797.817.817.81

8.278.278.278.278.288.288.288.288.288.29

72

3.55

3.60

3.65

3.70

3.75

3.80

3.85

3.90

3.95

4.00

4.05

4.10

4.15

4.20

4.25

4.30

4.35

4.40

4.45

f1 (

ppm

)

0.49

4.13

1.79

2.00

3.623.633.653.66

3.733.753.753.763.783.783.793.793.80

4.004.014.02

4.314.324.33

74

NMR data for 3-(10,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepin-5-yl)-N,N-dimethylpropan-1-amine(1)

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5

10.0

f1 (

ppm

)

1.81

6.001.99

3.83

1.88

1.74

5.60

1.851.871.891.901.92

2.312.452.472.48

3.32

3.923.933.95

7.057.077.097.247.267.287.30

9

17

14

7 15 16

131 3

4

65

8

10

2

1112

1819

1

N

N

75

4.0

4.2

4.4

4.6

4.8

5.0

5.2

5.4

5.6

5.8

6.0

6.2

6.4

6.6

6.8

7.0

7.2

f1 (

ppm

)

1.88

1.74

5.60

3.923.933.95

7.057.077.09

7.247.267.28

76

1.8

1.9

2.0

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

3.0

3.1

3.2

3.3

3.4

f1 (

ppm

)

1.81

6.00

1.99

3.83

1.851.871.891.901.92

2.31

2.452.472.48

3.32

77

2530

3540

4550

5560

6570

7580

8590

9510

010

511

011

512

012

513

013

514

014

5f1

(pp

m)

25.18

31.18

44.49

47.83

56.65

75.6876.0076.32

118.95121.31

125.28

128.70

133.16

147.27

78

MS for første Sonogashira-koblingsreaktion

N

N

Cl

79

MS for anden Sonogashira-koblingsreaktion

N NO O

Har hSERT et S2-bindings-site?chem.au.dk/fileadmin/_migrated/content_uploads/Bachelor_Louise... ·...

Documents

Transcript of Har hSERT et S2-bindings-site?chem.au.dk/fileadmin/_migrated/content_uploads/Bachelor_Louise... ·...