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et discipline ou spécialité

Jury :

le

Université Toulouse 3 Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier)

Camille Lehuédé

vendredi 29 mai 2015

Rôle paracrine des adipocytes dans la progression tumorale mammaire

et la chimiorésistance : sécrétions impliquées et régulation par l'obésité

ED BSB : Biotechnologies, Cancérologie

IPBS, CNRS, UMR 5089

Pr Bettina COUDERC Examinateur

Pr Charles DUMONTET Rapporteur

Pr Bruno FEVE Rapporteur

Pr Catherine MULLER Directeur de thèse

Pr Philippe VALET Directeur de thèse

Pr Catherine MULLER

Pr Philippe VALET

Remerciements

Je remercie tout d’abord le Pr Charles Dumontet, le Pr Bruno Feve ainsi que le Pr Bettina Couderc de m’avoir fait l’honneur de participer à mon jury de thèse. Merci d’avoir accepté de juger mon travail et d’avoir permis d’élargir le sujet sur des discussions très intéressantes lors de la soutenance. Merci également d’avoir aidé à rendre cette journée parfaite.

Je souhaite vraiment remercier mes deux directeurs de thèse, le Pr Catherine Muller et le Pr Philippe Valet. Cathie, je vous remercie sincèrement de m’avoir fait grandir tout au long de cette thèse. J’ai bien conscience de ne plus être tout à fait la même personne. Merci de m’avoir fait confiance dès le début pour mener cette thèse à bien et merci pour votre créativité scientifique qui est une excellente base pour la suite de mon projet professionnel. Merci également pour votre disponibilité. Philippe, merci pour votre gentillesse, merci de veiller sur nous du haut de la colline. Merci également d’avoir été là dans les moments importants de ma thèse.

Je remercie tous les membres de l’équipe MICA, qu’ils soient « anciens » ou « nouveaux » ont tous partagé ce moment important de ma vie.

Merci à Lud, mon « ange gardien ». C’est toi qui m’as tout appris, de la culture des adipo aux petits conseils bien distribués tout au long de ma thèse. Merci de m’avoir fait confiance pour reprendre ton projet. Merci aussi pour le super film !!!!

Merci à Fred d’avoir largement contribué au projet chimiorésistance. Merci également de le reprendre. Je te confie mon « bébé » avec sérénité.

Thank you to Xia, for your participation to the chemoresistance project. It was a very good experience for me to supervise you. Thank you for understanding my English ;)! Good luck for your thesis!

Je remercie particulièrement la princesse Ikrame, qui au fur et à mesure de ces années, est devenue une vraie amie. Merci pour ton énorme soutien autant professionnel que personnel. J’ai bien conscience que ma thèse n’aurait pas été la même sans toi ! Je n’ai aucun doute qu’on continuera à garder contact sans trop de problème ! « Ah oui hein ! ».

Un grand merci à Laurence. Merci de m’avoir supervisée quelques temps. Merci pour ton expertise scientifique et technique et surtout pour tous les petits conseils que tu m’as donnés tout au long de ma thèse. Merci aussi pour toutes les discussions professionnelles ou non qu’on a pu avoir autour d’un café.

Merci à ma petite poule (ça y’est c’est adopté !) Emily. Merci pour ces derniers mois, où ta présence est devenue très importante pour moi. Merci à toi pour ton soutien et ton aide scientifique. Tu es toute jeune et déjà très douée.

Merci à Victor d’avoir partagé ces 4 ans avec moi. Merci de m’avoir toujours aidée et épaulée pendant ma thèse, aussi bien expérimentalement que scientifiquement, avec toujours une humeur égale et jamais de jugement. C’était vraiment chouette de partager ma thèse avec toi !

Merci à Steph pour ton énorme contribution sur le projet. Merci pour ton expertise en microscopie et pour ta formation « béton » (quasi double aveugle !). Merci également pour tes conseils au quotidien et les découvertes musicales.

Merci à Delphine, surtout pour ces derniers mois. J’ai beaucoup apprécié te connaître de plus en plus. Merci pour ta bonne humeur, ta gentillesse et tes conseils (professionnels ou non).

Thanks to YuanYuan for your kindness. It was very nice to share some good moments with you in our office and to discover the Chinese culture.

Merci à Adrien, d’avoir partagé le bureau quelques temps. Merci pour ta générosité et ta disponibilité pour les souris. Merci aux « Charlottes », pour votre dynamisme et votre investissement sur les différents projets. Merci à Matthieu et Aurélie d’avoir partagés la vie de labo avec moi pendant quelques temps.

Merci à mes stagiaires, Camille, Marion et Marie, qui ont participé aux différents projets et qui m’ont bien faite progresser dans l’organisation, la rédaction, la pédagogie et aussi la confiance en moi.

Merci à Yvane pour ton aide pour la « paperasse », ta gentillesse et ta disponibilité. Merci à Sébastien pour ton aide précieuse en informatique. Merci de ne jamais me prendre pour un « boulet » (ou en tout cas de ne jamais le montrer ;))

Merci à Sophie de prendre bien soin de nos petites souris !

Un grand merci à Oriane pour ta sensibilité, ton humour, ton amitié, tes « pauses-café », ta relecture de ma thèse, tes conseils et ton soutien sans faille pendant toutes ces années. Je me retrouve beaucoup en toi et tu as un été un « modèle » pour moi. Ne change surtout pas, tu es parfaite comme ça !

Merci à Emilie, pour ta disponibilité sans limite, ton sourire, ta gentillesse, tes bons repas et ta pédagogie sur les glandes mammaires ! Tu as également été d’un grand soutien pour moi tout au long de ma thèse.

Merci à Cécile d’avoir partagée les bons moments et les galères pendant ma thèse, surtout au début et à la fin. On peut dire qu’on a traversé notre thèse côte à côte et c’était super chouette de t’avoir à mes côtés ! Merci à Relo pour ton soutien, ton honnêteté. Merci pour cette complicité qui s’est progressivement tissée. Merci au maître pour ta générosité et de te rendre toujours disponible pour tout et n’importe quoi. Merci à Baérasse et Pauline pour les bons moments passés ensemble.

Merci à toutes les personnes de l’IPBS avec qui j’ai pu interagir, en particulier Nathalie, Isa, Leyre, Serge, Pascal, Bertrand, Anaïs et Fatima.

Je tiens particulièrement à remercier sincèrement tous mes amis. Merci à Aline, Aurel, Orély, Etienne, Max, Nico, Sam, Marielle, les Chouchoux, Antoine, Carline … Merci à vous pour tous les moments « extra-thèse », passés à Toulouse ou ailleurs qui ont été tellement importants et qui ont permis d’équilibrer de manière cruciale ma vie pendant la thèse. Merci pour votre soutien, votre affection et tout simplement votre amitié. Je ne suis pas sûre que j’aurais réussi à traverser cette épreuve sans vous. Merci à Neige et les filles qui m’ont permis de me détendre et de me défouler, ainsi que de passer des moments supers et des fou-rires.

Enfin, je remercie chaleureusement ma famille sans qui rien n’aurait été possible. Merci à mes parents pour votre amour et votre disponibilité sans limite. J’ai conscience de l’énergie que vous déployez pour m’aider au mieux dans mes projets. Merci de m’aider à assumer mes choix, malgré les doutes qui ont pu exister. Vous représentez un vrai pilier pour moi. Merci à mes frères, mes belles-sœurs et les petits loups pour vos sourires et tous ces moments ressourçants…

1

Rôle paracrine des adipocytes dans la progression tumorale mammaire

et la chimiorésistance : sécrétions impliquées et régulation par

l’obésité

3

Résumé de la thèse

De nombreux arguments ont mis en évidence que la progression tumorale est non seulement dépendante des cellules tumorales mais aussi des cellules « saines » du microenvironnement (encore appelées stroma) qui entourent la tumeur. Parmi les cellules stromales présentes dans le microenvironnement du cancer du sein, les adipocytes représentent des acteurs émergents dans la progression tumorale. Mon équipe est l’une des premières à avoir montré l’importance des adipocytes péritumoraux dans l’agressivité des cancers du sein. Le dialogue bidirectionnel entre les adipocytes et les cellules tumorales donne lieu à des modifications des deux types cellulaires : les cellules tumorales « éduquées » par les adipocytes présentent une augmentation de leurs capacités invasives et une résistance plus importante à la radiothérapie et les adipocytes co-cultivés avec les cellules tumorales acquièrent un phénotype activé, que nous avons appelé CAAs pour « Cancer-Associated Adipocytes ». Etudier le dialogue croisé entre adipocytes et cellules tumorales est d’importance en médecine, car l’obésité est un facteur reconnu de mauvais pronostic dans de nombreux cancers, notamment le cancer du sein. Chez ce type de patientes, on retrouve des cancers plus agressifs et une résistance plus importante à la chimiothérapie.

Le premier objectif de ma thèse a été de poursuivre la caractérisation de l’interaction entre adipocytes et cellules cancéreuses afin de mieux comprendre le rôle des adipocytes dans la progression tumorale mammaire ainsi que les mécanismes impliqués. Ainsi, nous avons montré que lorsque les CAAs sont maintenus en présence des cellules tumorales pendant un temps prolongé, ils sont profondément remaniés aussi bien sur le plan morphologique que fonctionnel. En effet, les CAAs s’allongent progressivement jusqu’à l’apparition d’une morphologie fibroblastique. L’ensemble de leurs caractéristiques, notamment l’expression de FSP-1 (Fibroblast specific protein-1), suggère fortement que ces cellules modifiées représentent une sous-population de fibroblastes associés au cancer (CAFs). Nous avons nommé ces cellules, ADFs pour « Adipocytes-Derived Fibroblasts » et montré que ces derniers, présents dans des tumeurs mammaires humaines, favorisent de manière importante l’invasion des cellules tumorales.

Le deuxième objectif de ma thèse a été d’évaluer le rôle des adipocytes dans la chimiorésistance des cellules tumorales mammaires. En effet, la résistance est une limite majeure à l’efficacité des traitements et contribue à l’apparition de rechutes. Ainsi, nos résultats montrent que les adipocytes sont capables de promouvoir une résistance pléiotropique (doxorubicine, paclitaxel et 5-fluorouracile) dans diverses lignées tumorales mammaires, en favorisant l’expulsion de la drogue en dehors de son site d’action nucléaire. Ce mécanisme d’efflux est réalisé par un processus original, qui implique la protéine LRP/MVP (Lung resistance protein / Major vault protein) et l’encapsulation de drogue dans des vésicules exocytotiques afin de permettre son efflux hors de la cellule. Enfin, cette chimiorésistance médiée par les adipocytes est amplifiée en conditions d’obésité.

En conclusion, nos résultats montrent que les adipocytes péritumoraux sont capables d’influencer considérablement la progression tumorale, d’une part en participant à la réaction desmoplasique avec les fibroblastes activés localement présents et d’autre part en favorisant la chimiorésistance. Ces travaux pourraient expliquer, en moins en partie, le mauvais pronostic des cancers du sein chez les patientes obèses et ouvrent donc, à plus long terme, des perspectives thérapeutiques intéressantes, destinées à interrompre le dialogue délétère entre adipocytes et cellules tumorales, en particulier chez les patients obèses.

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Thesis abstract

Compelling evidence has demonstrated that tumor progression is the product of an evolving crosstalk between tumors and their surrounding stroma, constituting the tumor microenvironment. Among stromal cells present in breast cancer, adipocytes represent emerging players in tumor progression. My team was among the first to decipher the importance of peritumoral adipocytes in breast cancer aggressiveness. The bidirectionnal crosstalk between adipocytes and tumor cells gives rise to changes in both cell types: tumor cells "educated” by adipocytes exhibit an increase in their invasive abilities and a greater resistance to radiotherapy, and adipocytes cocultivated with tumor cells acquire an activated state. We called these cells CAAs for "Cancer-Associated adipocytes". Studying the role of adipocytes in cancer is a major interest since epidemiological studies have convincingly established that obesity is associated with a poor outcome for several cancers, especially breast cancer, where patients present with more aggressive cancers and increased chemotherapy resistance.

The first topic of my PhD was to further characterize the interaction between adipocytes and breast cancer cells to better understand the role of adipocytes in breast tumor progression. Thus, we demonstrated that some CAFs (Cancer-Associated Fibroblasts) present in the breast tumor stroma arise from the “dedifferenciation” of adipocytes upon prolonged stimulation by tumor cells. Adipocytes cocultivated with breast cancer cells exhibit a marked decrease in lipid content and progressively acquire features of activated-fibroblasts including overexpression of FSP-1 (Fibroblast Specific Protein-1). This population was named ADFs (Adipocytes-Derived Fibroblasts) and was found in clinical samples of breast cancer. We further demonstrated that ADFs stimulate the invasive capacities of tumor cells.

The second aim of my thesis was to evaluate the role of adipocytes in the chemoresistance of breast tumor cells. Drug resistance represents one of the major obstacles in cancer treatment leading to reduced efficacy of chemotherapy and relapses. Thus, our results suggest that adipocytes promote multidrug resistance (doxorubicin, paclitaxel and 5-fluorouracil) in various breast cancer cell lines. Adipocyte-induced chemoresistance is mediated by an original mechanism driving the drug away from intracellular targets. This efflux process is performed by an emerging concept dependent on LRP / MVP (Lung Resistance Protein / Major Vault Protein) and the release of extracellular vesicles-containing doxorubicin. Finally, we demonstrated that adipocyte-induced chemoresistance is amplified by obesity.

In conclusion, our findings highlight the role of tumor surrounding adipocytes in cancer progression, which participate in the desmoplastic reaction through the dedifferentiation into activated fibroblasts, and which promote chemoresistance. This work may explain, at least in part, the poor prognosis of breast cancer in obese patients and could provide interesting therapeutic targets in order to interrupt this deleterious crosstalk, particularly in obese patients.

7

LISTE DES ABREVIATIONS BMDCs (Bone

ATP-Binding Cassette Adipocyte-Derived Fibroblast Adipose Derived-Stem Cells Acide Gras Anti-Aromatase Atrial Natriuretic Peptide Adenomatous Polyposis Coli ADP-ribosylation factor 6 Adipocyte Triglyceride Lipase Ataxia Telangiectasia Mutated Brown Adipose Tissue B-Cell Lymphoma-2 Breast Cancer Resistance Protein Base Excision Repair Bone Marrow Adipose Tissue Bone Marrow-Derived Cells Brain Natriuretic Peptide Breast Cancer BRown in whITE Cancer-Associated Adipocyte Cancer-Associated Fibroblast Cell Adhesion-Mediated Drug Resistance Carbonylreductase Chemokine Ligand Cluster of differenciation CAAT/Enhancer Binding Protein Checkpoint Kinase Crown-Like Structure Cyclooxygenase Cyclic AMP-responsive Element-Binding protein 3-Like protein 1 Cancer Stem Cell ou Cellule Souche Cancéreuse Connective Tissue Growth Factor Chemokine (C-X-C motif) Ligand Dedifferenciated Fat Cells DNA Damage Repair DNA double-Strand Break Dishevelled Epidermal Growth Factor Environment Mediated Drug Resistance Epithelial-Mesenchymal Transition Endothelial-Mesenchymal Transition Estrogen Receptor Endosomal Sorting Complex Required for Transport Endotrophine Fatty Acid Binding Protein Focal Adhesion Kinase Fibroblast Activated Protein Fibroblast Growth Factor

ABC ADF ADSCs AG AI ANP APC ARF6 ATGL ATM BAT Bcl-2 BCRP BER BMAT BMDCs BNP BRCA BRITE CAA CAF CAM-DR CBR CCL CD CEPB Chk CLS Cox CREB3L1 CSC CTGF CXCL DFAT DDR DSB Dvl EGF EMDR EMT EndoMT ER ESCRT ETP FABP FAK FAP FGF

8

Forkhead box P3 Fibroblast Specific Protein-1 Fumitremorgin-C 5-Fluorouracil Frizzled Glycosylceramide synthase Glycogen Synthase Kinase -3β Glutathion Glutathion S-Transferase Human Epithelial growth factor Receptor High Endothelial Venule Hepatocyte Growth Factor Hypoxia-Inducible Factor High Mobility Group Box 1 Homologous Recombination Hormonosensitive Lipase Interstrand Crosslink Invasive Ductal Carcinoma Interferon Insulin Growth Factor Interleukin Invasive Lobular Carcinoma Indice de Masse Corporelle Institut National du Cancer Janus Kinase Kruppel-Like zinc Finger transcription factor Lymphoid-Enhancer-Binding factor / T-Cell specific transcription factor Lysyl Oxydase Lipoprotein Lipase Lung Resistance Protein Lipoprotein Receptor-related Protein-5 or 6 Monoacylglycerol Lipase Mammary Adipose Tissue Metastatic Breast Cancer Monocyte Chemoattractant Protein Macrophage Colony Stimulating Factor Multidrug Resistance Matrice Extra-Cellulaire Mesenchymal-Epithelial Transition Metabolic Healthy Obese Matrix Metalloproteinase Mismatch Repair Mesenchymal-Mesenchymal Transition Mouse Mammary Tumor Virus Multidrug Resistance-associated Protein Mesenchymal Stem Cell Microvesicle Microvesicular Body Major Vault Protein

FOXP3 FSP-1 FTC 5-FU FZD GSC GSK-3β GSH GST HER HEV HGF HIF HMGB1 HR HSL ICL IDC IFN IGF IL ILC IMC InCA JAK KLF LEF/TCF LOX LPL LRP LRP5/6 MAGL MAT MBC MCP M-CSF MDR MEC MET MHO MMP MMR MMT MMTV MRP MSC MV MVB MVP

9

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Nucleotide Binding Domain Nucleotide Excision Repair Nuclear Factor kappa B Neural Glial antigen 2 Non-Homologous End-Joining Natural Killer Nitric Oxyde Synthase Nuclear Pore Complex Oncostatine Plasminogen Activator Inhibitor-1 Planar Cell Polarity Platelet-Derived Growth Factor Platelet-Derived Growth Factor Receptor Podoplanine P-glycoprotein Proviral integrations of moloney virus Protéine Kinase dépendante de l’AMPc Protéine Kinase dépendante du GMPc Peroxysome Proliferator Activated Receptor Preadipocyte secreted factor-1 Récepteur aux Estrogènes Récepteurs Hormonaux Récepteur à la Progestérone Reactive Oxygen Species Risque Relatif Subcutaneous Adipose Tissue Stromal Derived Factor-1 Selective Estrogen Receptor Modulator Secreted Frizzled-Related Protein Solute Carrier α-Smooth Muscle Actin Soluble N-éthylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptors Superoxyde Dismutase Sterol Regulatory Element Binding Protein Signal Transducer and Activator of Transcription Stromal Vascular Fraction Tissu Adipeux Tumor-Associated Fibroblast Tumor-Associated Macrophage Tumor-Associated Neutrophil Telomerase-Associated Protein-1 Triglycéride Transforming Growth Factor-β Type-2 TGF-β Receptor T-helper Tumor-Infiltrating Lymphocyte Tissue Inhibitor Metalloproteinase Toll-Like Receptor Transmembrane Domain Triple Negative Breast Cancer

NADH NBD NER NF-κB NG2 NHEJ NK NOS NPC OSM PAI-1 PCP PDGF PDGFR PDPN P-gp Pim PKA PKG PPAR Pref-1 RE RH RP ROS RR SAT SDF-1 SERM SFRP SLC α-SMA SNARE SOD SREBP STAT SVF TA TAF TAM TAN TEP-1 TG TGF-β TGFBR2 Th TIL TIMP TLR TMD TNBC

10

Tumor Necrosis Factor-α Topoisomérase II Tumor – Nodes - Metastasis T-regulator Uncoupling Protein-1 Urokinase type Plasminogen Activator Visceral Adipose Tissue Vésicule Extra-cellulaire Vascular Endothelial Growth Factor Very Low Density Lipoprotein Vault Poly (Adenosine diphosphate Ribose) Polymerase White Adipose Tissue Wingless-type MMTV integration site

TNF-α Topo2 TNM Treg UCP-1 uPA VAT VE VEGF VLDL VPARP WAT WNT

11

SOMMAIRE

INTRODUCTION .............................................................................................................. 15

INTRODUCTION GENERALE........................................................................................... 17

PARTIE I : LE MICROENVIRONNEMENT TUMORAL................................................... 19

1) Composition du microenvironnement tumoral ....................................................................... 19

1-1) Généralités .................................................................................................................... 19

1-2) Les cellules immunitaires ............................................................................................... 20

a) Les TAMs (Tumor-Associated Macrophages) ................................................................ 21

b) Autres populations leucocytaires .................................................................................... 22

1-3) L’angiogenèse ............................................................................................................... 23

1-4) La matrice extra-cellulaire (MEC) .................................................................................. 25

2) Les CAFs (Cancer-Associated Fibroblasts) ............................................................................ 26

2-1) Généralités .................................................................................................................... 26

2-2) Caractérisation des CAFs ............................................................................................... 28

2-3) Origines des CAFs ......................................................................................................... 30

a) Les fibroblastes résidents ............................................................................................... 30

b) Les MSCs (Mesenchymal Stem Cells) ........................................................................... 31

c) Cellules tumorales ......................................................................................................... 32

d) Cellules endothéliales .................................................................................................... 32

e) ADSCs (Adipose-Derived Stem Cells) ........................................................................... 32

f) Autres sources de CAFs ................................................................................................. 33

2-4) Rôle de CAFs dans la progression tumorale (pour revue (Ohlund et al 2014)) ................ 34

3) Les adipocytes ....................................................................................................................... 38

3-1) Le tissu adipeux (TA) .................................................................................................... 38

a) Composition du TA ....................................................................................................... 38

b) Localisation des différents tissus adipeux blancs ............................................................ 39

3-2) Les adipocytes ............................................................................................................... 41

a) Origine et différenciation ............................................................................................... 41

b) La plasticité des adipocytes ............................................................................................ 47

c) Rôle physiologique des adipocytes ................................................................................. 47

3-3) Adipocytes et cancer ...................................................................................................... 50

a) Le tissu adipeux dans le stroma tumoral ......................................................................... 50

b) Rôle paracrine des adipocytes dans la progression tumorale : les CAAs.......................... 51

c) Rôle endocrine des adipocytes dans la progression tumorale .......................................... 53

d) Rôle des ADSCs dans la progression tumorale ............................................................... 55

PARTIE II : L’OBESITE ET LE CANCER DU SEIN .................................................... 59

1) Le cancer du sein ................................................................................................................... 59

12

1-1) Epidémiologie et facteurs de risque ................................................................................ 59

a) Epidémiologie ............................................................................................................... 59

b) Facteurs de risque .......................................................................................................... 59

1-2) Origine du cancer du sein ............................................................................................... 61

a) La glande mammaire ..................................................................................................... 61

b) Origine du cancer du sein ............................................................................................... 62

1-3) Classification des cancers du sein................................................................................... 63

a) Classification histopathologique actuelle ........................................................................ 63

b) Classification moléculaire .............................................................................................. 64

1-4) Traitements et limites des traitements des cancers du sein .............................................. 66

a) Chirurgie et radiothérapie .............................................................................................. 66

b) Chimiothérapie, hormonothérapie et thérapie ciblée ....................................................... 67

c) Résistance à la chimiothérapie ....................................................................................... 69

2) L’obésité : un facteur de risque et un facteur affectant le pronostic du cancer du sein ............. 70

2-1) Généralités .................................................................................................................... 70

2-2) Les modifications des tissus adipeux par l’obésité .......................................................... 71

a) Le TA sous-cutané et viscéral ........................................................................................ 71

b) Le TA mammaire........................................................................................................... 74

2-3) Modèles d’études de l’obésité in vitro ............................................................................ 75

3) Obésité et cancer du sein ....................................................................................................... 76

3-1) Epidémiologie ............................................................................................................... 76

a) Obésité et incidence des cancers .................................................................................... 76

b) Obésité et pronostic des cancers ..................................................................................... 77

3-2) Mécanismes non biologiques affectant le pronostic ........................................................ 78

a) Le dépistage tardif ......................................................................................................... 78

b) Administration insuffisante des doses de chimiothérapie ................................................ 78

3-3) Mécanismes biologiques affectant la progression tumorale (figure 23) ........................... 79

a) Hyperglycémie et hyperinsulinémie ............................................................................... 79

b) Les hormones sexuelles ................................................................................................. 79

c) L’inflammation chronique ............................................................................................. 80

d) Les adipokines ............................................................................................................... 81

e) Hypoxie, angiogenèse et lymphangiogenèse ................................................................... 81

f) Fibrose .......................................................................................................................... 82

g) Autres mécanismes ........................................................................................................ 82

3-4) Cas particulier : Obésité et chimiorésistance................................................................... 84

a) Arguments cliniques ...................................................................................................... 84

b) Arguments pharmacocinétiques ..................................................................................... 84

c) Arguments biologiques .................................................................................................. 85

PARTIE III : LES MECANISMES DE CHIMIORESISTANCE .................................... 89

13

1) Mécanisme d’action de la doxorubicine ................................................................................. 89

1-1) Généralités .................................................................................................................... 89

1-2) Pharmacocinétique de la doxorubicine ........................................................................... 90

1-3) Poison des topoisomérases II (figure 28) ........................................................................ 90

1-4) Rôle des radicaux libres (figure 28) ................................................................................ 91

1-5) Formation d’adduits et de pontages à l’ADN (figure 28) ................................................ 93

1-6) Libération de céramide (figure 28) ................................................................................. 93

2) Les mécanismes de résistance de la doxorubicine .................................................................. 94

2-1) Généralités .................................................................................................................... 94

2-2) Modification de la disponibilité intra-tumorale du médicament (figure 29) ..................... 95

a) L’influx ......................................................................................................................... 95

b) La métabolisation de la drogue....................................................................................... 96

2-3) Modifications de la topoisomérase II (figure 29) ............................................................ 97

2-4) La réparation des dommages à l’ADN (figure 29). ......................................................... 98

2-5) Echappement à la mort cellulaire (figure 29) .................................................................. 99

2-6) La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT).......................................................... 100

3) Mécanismes d’efflux de la doxorubicine .............................................................................. 101

3-1) Les transporteurs ABC ................................................................................................. 102

a) Généralités .................................................................................................................. 102

b) Transporteurs ABC et multi-résistance ......................................................................... 103

c) La glycoprotéine P ....................................................................................................... 104

d) La sous-famille des MRPs ........................................................................................... 107

e) La BCRP ..................................................................................................................... 108

3-2) La protéine MVP / LRP ............................................................................................... 109

a) Découverte .................................................................................................................. 109

b) Structure et composition .............................................................................................. 110

c) Localisation et fonctions biologiques ........................................................................... 111

d) MVP et chimiorésistance ............................................................................................. 111

e) Hypothèses du rôle de MVP dans la chimiorésistance .................................................. 112

3-3) L’efflux vésiculaire ...................................................................................................... 114

a) Les vésicules intra-cytoplasmiques .............................................................................. 114

b) Les vésicules extra-cellulaires ...................................................................................... 115

4) Rôle du microenvironnement dans la chimiorésistance ........................................................ 117

4-1) Généralités .................................................................................................................. 117

4-2) Rôle des adipocytes dans la résistance aux drogues ...................................................... 118

OBJECTIFS DE THESE ................................................................................................. 121

RESULTATS .................................................................................................................... 125

Article 1. Un nouveau phénotype d’origine adipocytaire : Les fibroblastes dérivés des adipocytes ou ADFs (Adipocytes-Derived Fibroblasts) ....................................................... 127

14

Article 2. Les adipocytes péritumoraux participent à la chimiorésistance des cellules tumorales mammaires à la doxorubicine, potentiellement via un mécanisme dépendant de LRP/MVP et des vésicules.................................................................................................. 129

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ............................................................................. 131

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................ 145

ANNEXE ........................................................................................................................... 175

15

INTRODUCTION

17

INTRODUCTION GENERALE

Au cours de ces dix dernières années, de très nombreuses observations ont mis en exergue que la

progression tumorale est issue non seulement des modifications des cellules tumorales elles-mêmes,

mais également des cellules du microenvironnement ou stroma tumoral. Parmi les cellules qui

constituent le microenvironnement tumoral, les adipocytes représentent le composant majoritaire du

stroma de certains cancers, notamment le cancer du sein, qui est le modèle d’étude que j’ai utilisé pour

ce travail de thèse. De plus, hormis leur fonction de stockage des graisses, les adipocytes sont des

cellules plastiques, capables de sécréter diverses molécules (appelées adipokines), susceptibles de

moduler le comportement de la tumeur. Par conséquent, la caractérisation du rôle joué par les

adipocytes dans le cancer représente un objectif crucial, d’autant plus que l’obésité est un facteur de

mauvais pronostic global notamment pour le cancer du sein. En effet, les femmes obèses atteintes d’un

cancer du sein présentent une diminution de la survie globale, de la survie sans maladie et une

augmentation des métastases, des rechutes et de la résistance à la chimiothérapie. La chimiothérapie

représente actuellement le traitement de référence pour traiter un cancer du sein localement agressif

(traitement adjuvant ou néoadjuvant) ou métastatique. Malheureusement, une résistance à la

chimiothérapie est souvent observée et est à l’origine de la progression de la tumeur et de

l’augmentation des rechutes. De nombreux arguments suggèrent que cette résistance peut être médiée

par les cellules du stroma tumoral.

L’objectif de ma thèse a donc été de caractériser le rôle des adipocytes dans la progression tumorale

mammaire, en étudiant, d’une part, le dialogue qui s’établit entre les adipocytes et les cellules

cancéreuses et d’autre part en évaluant l’effet des adipocytes sur un aspect précis de la progression

tumorale : la chimiorésistance. Au cours de ces travaux, un objectif important de ma thèse a été de

déterminer si le dialogue délétère qui s’établit entre les cellules tumorales et les adipocytes est amplifié

dans des conditions d’obésité. Avant de présenter mes résultats, je ferai le point sur l’état des

connaissances actuelles concernant le microenvironnement tumoral, en me focalisant plus

particulièrement sur les adipocytes. Dans un deuxième temps, le cancer du sein, l’obésité et le lien qui

les réunit seront étudiés. Pour finir, je terminerai cette introduction, en décrivant des mécanismes

d’action et des mécanismes de résistance de la doxorubicine, molécule thérapeutique majeure dans le

traitement des cancers du sein.

Les résultats obtenus au cours de ma thèse se découpent en deux parties distinctes. Dans la première

partie, nous montrerons que les cellules tumorales mammaires influencent considérablement le

phénotype des adipocytes. En effet, sous l’influence prolongée des sécrétions tumorales, les

adipocytes se réorientent progressivement en cellules fibroblastiques, présentant des caractéristiques

de fibroblastes associés au cancer. Nous avons appelé ces cellules ADFs pour Adipocyte-Derived

Fibroblasts et montré qu’elles participent à la progression tumorale (Article 1). Dans la seconde partie,

18

nous avons mis en évidence que les adipocytes contribuent à la résistance des cellules tumorales

mammaires à la doxorubicine, lesquelles présentent un phénotype de résistance croisée à diverses

chimiothérapies. De manière intéressante, cette chimiorésistance est amplifiée dans un contexte

d’obésité (Article 2).

19

PARTIE I : LE MICROENVIRONNEMENT TUMORAL

1) Composition du microenvironnement tumoral

1-1) Généralités

Bien que longtemps considéré comme une masse unique de cellules malignes, il est maintenant

clairement établi que le cancer représente un véritable organe complexe et multicellulaire (Mueller and

Fusenig 2004). Les cellules tumorales évoluent et coexistent dans un microenvironnement ou stroma

tumoral, composé de nombreux types cellulaires non tumoraux. Ces cellules dites « saines » sont

recrutées et/ou activées localement par les cellules tumorales. L’interaction dynamique entre les

cellules tumorales et les cellules stromales permet la progression de la tumeur (Balkwill et al 2012).

En effet, au cours de la progression du cancer, les cellules tumorales modifient profondément les

cellules du microenvironnement, qui vont en retour favoriser la croissance, la dissémination et la

résistance de la tumeur aux traitements (Mueller and Fusenig 2004). C’est en 1986 qu’Harold Dvorak

remarque que la formation du stroma tumoral et le processus de cicatrisation présentent des

similitudes. En effet, ces deux événements mettent en jeu des processus, tels que la prolifération, la

survie, la migration, contrôlés par des facteurs de croissance, des cytokines, des signaux

inflammatoires et angiogéniques. Cependant, une différence majeure existe entre ces deux processus :

alors que la cicatrisation est auto-limitée dans le temps et dans l’espace, les tumeurs activent leur

stroma de façon constitutive et permanente. H. Dvorak définit ainsi une tumeur comme « une plaie qui

ne cicatrise jamais » (Dvorak 1986).

Le microenvironnement tumoral est classiquement composé de cellules immunitaires, de cellules

endothéliales, de péricytes, de fibroblastes, d’adipocytes et de précurseurs cellulaires, comme des

BMDCs (Bone Marrow-Derived Cells), des ADSCs (Adipose Derived-Stem Cells) et des MSCs

(Mesenchymal Stem Cells) ; ces cellules sont comprises dans une matrice extra-cellulaire (MEC)

caractéristique. La tumeur est ainsi vascularisée par un réseau de vaisseaux sanguins et lymphatiques

(figure 1).

La communication inter-cellulaire est régie par différents facteurs solubles, tels que des cytokines, des

chimiokines, des facteurs de croissance et des enzymes impliquées dans le remodelage de la MEC,

mais également par des vésicules extra-cellulaires. La perturbation des propriétés physiques et

chimiques des tissus joue également un rôle dans la progression tumorale (Balkwill and Mantovani

2001) (Balkwill et al 2012).

Les caractéristiques communes de la plupart des cellules du microenvironnement tumoral ainsi que

leur faible taux d’instabilité génétique, suggèrent que le ciblage du microenvironnement tumoral, ou

des médiateurs de leur communication inter-cellulaire pourrait avoir des applications thérapeutiques

20

intéressantes en complément ou non d’autres options thérapeutiques (Balkwill and Mantovani 2001)

(Balkwill et al 2012).

Figure 1. Composition du microenvironnement tumoral. Les cellules tumorales (« tumour cell ») sont entourées de cellules immunitaires (« immune infiltrate »), de fibroblastes activés (« cancer-associated fibroblast »), irrigués par des vaisseaux sanguins (« blood vessel ») et lymphatiques (« lymphatic vessel ») compris dans une matrice extra-cellulaire (MEC) (d’après (Junttila and de Sauvage 2013)).

1-2) Les cellules immunitaires

Le système immunitaire a classiquement pour fonction de reconnaitre et protéger les tissus de

l’organisme d’infections et de dommages extérieurs (Junttila and de Sauvage 2013). Cependant, le

processus d’inflammation chronique a également un rôle dans le développement de pathologies, telles

que des pathologies articulaires et neurodégénératives (Balkwill and Coussens 2004). Un lien entre

inflammation et cancer est depuis longtemps suspecté. En effet, l’abondance des cellules immunitaires

au sein du microenvironnement tumoral a été observée précocement par les pathologistes, mais le rôle

de ces cellules dans la progression tumorale a été fortement discuté. D’une part, les cellules

immunitaires expriment des antigènes à l’origine du déclenchement d’une réponse immunitaire,

favorisant ainsi l’éradication des cellules tumorales par l’hôte. D’autre part, l’inflammation chronique

est favorable au développement de la tumeur. C’est en 1850 que R. Virchow a souligné l’effet pro-

tumoral de l’inflammation (Mueller and Fusenig 2004). Depuis, de nombreux arguments sont venus

renforcer cette théorie. Le premier est qu’il existe un lien entre des situations pathologiques chroniques

(Papillomavirus, Helicobacter pylori, hépatite chronique, maladie de Crohn) et le développement de

cancers (respectivement : cancers du col de l’utérus, de l’estomac, du foie et du côlon) (Balkwill and

21

Mantovani 2001). Le second argument concerne l’importance de la composante inflammatoire dans

les tumeurs, ainsi que la sécrétion de chimiokines, cytokines pro-inflammatoires par les cellules

tumorales, destinées à attirer les cellules immunitaires, chacune participant à la progression tumorale.

a) Les TAMs (Tumor-Associated Macrophages)

Les macrophages représentent un type cellulaire important dans la plupart des tumeurs (jusqu’à 50%

de la masse tumorale) et sont des acteurs fondamentaux de l’inflammation associée au cancer. De

manière physiologique, ils exercent un vaste rôle dans la défense anti-infectieuse de l’organisme ainsi

que dans le maintien de l’homéostasie tissulaire (Chanmee et al 2014). Population hétérogène, les

macrophages proviennent classiquement des précurseurs monocytaires de la moelle osseuse (Bone

Marrow-Derived Monocytic Precursors). Les monocytes sanguins se différencient ensuite en

macrophages après extravasation dans les tissus cibles et se polarisent en différentes sous-populations

en fonction des signaux environnementaux sécrétés (Chanmee et al 2014). De façon générale, on

distingue les macrophages de type M1 (activés de façon classique) et les macrophages de type M2

(activés de façon alternative), qui présentent des profils phénotypiques, sécrétoires et métaboliques

différents (Solinas et al 2009). Les macrophages M1 ont essentiellement un rôle pro-inflammatoire

(sécrétion des interleukines IL-6, IL-12, IL-23, du Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α)) et un rôle anti-

tumoral, alors que les macrophages de type M2 exercent un rôle plutôt anti-inflammatoire et pro-

tumoral. Ces derniers sont subdivisés en macrophages de type M2a, M2b, M2c et M2d en fonction des

cytokines sécrétées (figure 2). Il est classiquement admis que les macrophages associés aux tumeurs

(TAMs pour Tumor-Associated Macrophages) présentent essentiellement un phénotype de type M2 et

plus particulièrement M2d (Chanmee et al 2014).

Figure 2. Polarisation des macrophages. Les monocytes circulants, provenant des précurseurs monocytiques de la moelle osseuse se différentient en macrophages de type M1 et de type M2 (M2a, M2b, M2c et M2d) en fonction de l’environnement sécrétoire (d’après (Chanmee et al 2014)).

22

Les TAMs sont retrouvés de manière abondante dans le microenvironnement tumoral de la plupart des

cancers, où ils exercent un rôle pro-tumoral, en jouant sur la prolifération tumorale, la survie,

l’angiogenèse et la dissémination métastatique. Ces processus sont liés à la sécrétion de divers facteurs

comme les chimiokines (CXCL8, CXCL1, CCL2), le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) et

le TNFα. La chimiokine CCL2 (Chemokine Ligand 2) a un rôle majeur dans le recrutement des

monocytes dans le stroma tumoral (Solinas et al 2009). Récemment, les TAMs ont également été

décrits in vitro et in vivo, comme étant capables d’induire une chimiorésistance à la gemcitabine dans

un modèle d’adénocarcinome pancréatique en agissant sur l’apoptose (Weizman et al 2014). De

nombreuses données pré-cliniques et cliniques soulignent le lien entre la présence abondante de TAMs

dans le microenvironnement tumoral des cancers et le mauvais pronostic associé (Balkwill et al 2012).

b) Autres populations leucocytaires

Les TAMs représentent la population leucocytaire majoritaire du microenvironnement tumoral,

cependant d’autres populations de cellules immunitaires peuvent exercer un rôle dans la progression

de la tumeur. Comme les TAMs, les TANs (Tumor-Associated Neutrophils) peuvent être recrutés au

sein de la tumeur, par des chimiokines d’origine tumorale ou macrophagique (comme CXCL8) afin

d’exercer un rôle pro-tumoral (Vitale et al 2014). Cependant, d’autres études semblent au contraire

suggérer un rôle suppresseur de tumeurs des TANs, en éliminant directement les cellules tumorales ou

indirectement en inhibant le TGF-β (Transforming Growth Factor-β) (Balkwill et al 2012). Les

cellules de l’immunité adaptative, quant à elles, ont un rôle pro ou anti-tumoral en fonction de leur

type. Initialement, de nombreuses études ont montré que des taux élevés de TILs (pour Tumor-

Infiltrating Lymphocytes) dans la tumeur sont associés à un bon pronostic, notamment pour les

cancers ovariens, colorectaux, du sein, et le mélanome (Solinas et al 2009) (Yu and Fu 2006) (Mao et

al 2014). En fait, il semblerait que le type de lymphocytes recrutés au site tumoral serait plus

déterminant sur le pronostic que leur nombre. En effet, les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques sont

capables de reconnaître et de tuer les cellules tumorales et leur présence dans les cancers est associée à

un bon pronostic. Les lymphocytes T CD4+ sont subdivisés en lymphocytes T CD4+ th1 (T helper

type 1), en lymphocytes T CD4+ th2 et en lymphocytes Treg (T regulators) (Joyce and Pollard 2009).

Les lymphocytes T CD4+ th1 peuvent aider les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques dans la lutte anti-

tumorale, alors que les lymphocytes T CD4+ th2 favorisent plutôt la progression tumorale, en générant

notamment un environnement inflammatoire par la sécrétion d’IL-4, d’IL-5 et d’IL-13. Initialement

décrits par Gershon et Kondo en 1971, les lymphocytes Treg, caractérisés par l’expression de FOXP3

(Forkhead box P3) et CD25 (Cluster of Differenciation 25), sont considérés comme étant pro-

tumoraux de par leur capacité à inhiber la reconnaissance et la destruction immunitaire des cellules

tumorales (Joyce and Pollard 2009) (Balkwill et al 2012) (Allen and Louise Jones 2011). Les

lymphocytes cytotoxiques NK (Natural Killer) sont retrouvés au sein du microenvironnement tumoral

mais à distance des cellules tumorales. Ils ont été montrés comme étant un facteur de bon pronostic

23

pour les cancers colorectaux, gastriques, du poumon, du rein et du foie (Balkwill and Mantovani

2001). Enfin, les lymphocytes B, producteurs d’anticorps, sont faiblement retrouvés au sein du

microenvironnement tumoral (Balkwill et al 2012). Le rôle général des cellules immunitaires dans la

progression tumorale est résumé dans la figure 3.

Figure 3. Rôle global des cellules immunitaires dans la progression tumorale. Les cellules immunitaires jouent un rôle pro-tumoral et/ou anti-tumoral. Concernant les cellules myéloïdes : les neutrophiles, les macrophages de type M2, les mastocytes (mast cells), les MDSCs (Myeloid-Derived Stem Cells) ont un rôle plutôt pro-tumoral, alors que les cellules dendritiques, les macrophages de type M1 et certains neutrophiles ont un rôle anti-tumoral. Dans la population lymphocytaire, les lymphocytes T CD4+ Th2, T regulateurs (Treg) et les lymphocytes B favorisent généralement la progression de la tumeur, alors que les lymphocytes NK, T CD4+ Th1, les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (TC) et certains lymphocytes Treg inhibent la progression tumorale (d’après (Goubran et al 2014)).

1-3) L’angiogenèse

Dans des conditions physiologiques, le processus d’angiogenèse intervient principalement durant le

développement embryonnaire et de manière isolée chez l’adulte dans des contextes particuliers, tels

que le processus de cicatrisation et lors du cycle menstruel chez la femme (Weis and Cheresh 2011).

Comme un tissu normal, les tumeurs ont besoin d’un réseau vasculaire permettant une oxygénation

adéquate, l’approvisionnement en nutriments et en métabolites ainsi que l’évacuation des déchets

métaboliques et du dioxyde de carbone (Allen and Louise Jones 2011). Etape clé dans la progression

tumorale, l’angiogenèse permet également la dissémination des cellules tumorales à distance et donc la

formation de métastases. C’est en 1971 que Judah Folkman pose les bases de l’angiogenèse : il

formule le concept que pour grandir au-delà d’une taille critique (2 mm3), la tumeur doit être

24

vascularisée (Folkman 1971). Lorsque la tumeur atteint une taille critique, les cellules tumorales

situées à distance des vaisseaux sanguins manquent d’oxygène et de nutriments et meurent par

apoptose ou par nécrose. En réponse à ce processus, les cellules tumorales induisent la formation de

nouveaux vaisseaux sanguins majoritairement par bourgeonnement de vaisseaux préexistants

(néoangiogenèse) ou à partir du recrutement de précurseurs appelés angioblastes (vasculogenèse). La

transition d’une tumeur peu vascularisée vers une tumeur croissante très vascularisée est connue sous

le terme de « switch angiogénique » (Bergers and Benjamin 2003) (figure 4). Ce switch angiogénique

est orchestré par une balance entre les facteurs activateurs (comme les VEGFs, les FGFs (Fibroblast

Growth Factors), les PDGFs (Platelet-Derived Growth Factors) et certaines chimiokines) et inhibiteurs

de l’angiogenèse (thrombospondine-1, angiostatine, endostatine) sécrétés dans le microenvironnement

par les cellules tumorales elles-mêmes mais également par les cellules stromales, telles que les TAMs,

les CAFs (pour Cancer-Associated Fibroblasts) et les adipocytes (Allen and Louise Jones 2011). Le

VEGF (encore appelé VEGF-A) est le principal acteur pro-angiogénique (Potente et al 2011).

Principal stimulus de l’angiogenèse, l’hypoxie (caractérisée par une diminution du taux d’oxygène,

liée à la croissance tumorale) permet la stimulation des protéines HIF (Hypoxia-Inducible Factor) qui

vont non seulement avoir un rôle global dans le développement des cellules tumorales (métabolisme,

prolifération, apoptose …), mais également avoir un rôle spécifique dans l’angiogenèse en induisant

l’augmentation de facteurs pro-angiogéniques (Potente et al 2011). Suite à une stimulation pro-

angiogénique, les cellules endothéliales (constituants principaux des vaisseaux sanguins)

« s’activent », c’est-à-dire qu’elles prolifèrent, migrent et participent à la formation de la lumière du

vaisseau sanguin et de la membrane basale. Un recrutement de péricytes et de cellules musculaires

lisses est ensuite observé. Ces cellules entourent les tubules de cellules endothéliales permettant ainsi

la stabilité et la perfusion des vaisseaux sanguins (Potente et al 2011).

Figure 4. Le switch angiogénique. Au fur et à mesure de la progression de la tumeur, un processus de néoangiogenèse et de lymphangiogenèse se met en place, permettant l’approvisionnement de la tumeur en oxygène, en nutriments mais aussi en offrant une voie de dissémination des cellules tumorales via le réseau sanguin pour former des métastases à distance (www.scienceofcrc.org (Diana Saville)).

http://www.scienceofcrc.org/

25

La vascularisation tumorale est anormale dans la plupart des cas, en termes de structure et de fonction.

En effet, les vaisseaux sanguins sont irréguliers, tortueux, dilatés, branchés de manière anarchique et

hémorragiques. Par conséquent, la vascularisation des tumeurs est souvent peu efficace et affecte

considérablement l’efficacité des chimiothérapies, classiquement administrées par voie sanguine

(Balkwill et al 2012) (Weis and Cheresh 2011) (Joyce and Pollard 2009). D’autre part, les premiers

signes d’un cancer invasif sont l’envahissement des ganglions lymphoïdes. Ces métastases sont

acheminées par une voie annexe appelée lymphangiogenèse via des vaisseaux lymphatiques et agit de

manière synergique à l’angiogenèse (Riabov et al 2014) (figure 4). Cependant, la mise en place de

vaisseaux sanguins associés à la tumeur peut aussi être en faveur d’un bon pronostic. En effet, des

résultats obtenus récemment par l’équipe de Jean-Philippe Girard ont mis en évidence un rôle clé des

HEV (High Endothelial Venules) dans le recrutement des lymphocytes B et T qui vont inhiber la

progression tumorale, notamment dans le cancer du sein (Moussion and Girard 2011) (Martinet and

Girard 2013).

1-4) La matrice extra-cellulaire (MEC)

Composant non cellulaire du microenvironnement tumoral, la MEC est définie comme un mélange

complexe de protéines (collagènes, ténascine, fibronectine, cadhérines et intégrines) et de

protéoglycanes. Le rôle physiologique de la MEC est de former un support matriciel et mécanique aux

cellules permettant ainsi le maintien de l’intégrité fonctionnelle et structurale des cellules et tissus

(Schultz and Wysocki 2009). L’architecture de la MEC joue un rôle important dans les grandes

fonctions cellulaires et tissulaires, comme la prolifération, la migration, l’apoptose et la différenciation

cellulaire, mais module également le réseau vasculaire et les fonctions immunitaires (Cirri and

Chiarugi 2012). En fait, la structure de la MEC affecte la morphologie cellulaire, via la signalisation

des intégrines et le cytosquelette des cellules ; processus agissant sur le contrôle du cycle cellulaire

(Cirri and Chiarugi 2012). La composition de la MEC est profondément remaniée qualitativement et

quantitativement dans des conditions physiopathologiques comme le processus de cicatrisation et le

cancer. Dans le cas du cancer, les CAFs exercent un rôle majeur dans le remodelage de la MEC, car ce

sont les cellules majoritaires sécrétrices des composants de la MEC (collagène, fibronectine…) mais

également des protéases et autres enzymes responsables de sa dégradation. Ainsi, les CAFs contrôlent

la synthèse, la dégradation et la modification de la MEC, nécessaires à la progression de la tumeur

(Gaggioli et al 2007) (Zhang and Liu 2013). Dans les tumeurs solides, une augmentation de la

synthèse des composants structuraux de la MEC a été observée, tels que le collagène I (principal

constituant de la MEC), le collagène III (collagènes interstitiels), la ténascine C et la fibronectine.

D’autres composants sont à l’inverse dégradés comme le collagène IV, qui est le principal constituant

de la membrane basale. En effet, un événement clé de la progression tumorale est la perte de l’intégrité

de la membrane basale permettant ainsi l’invasion des cellules et l’évolution du cancer vers un stade

26

invasif (Monboisse et al 2014) (Egeblad et al 2010). D’autre part, au cours de la progression tumorale,

la MEC devient de plus en plus rigide. Ce phénomène est lié à la formation de liaisons covalentes

entre les fibres de collagène, réaction catalysée majoritairement par l’enzyme LOX (Lysyl Oxydase).

Cette enzyme est exprimée par les fibroblastes dans les stades précoces de cancer et induite par des

conditions d’hypoxie dans des stades plus tardifs (Egeblad et al 2010) (Cirri and Chiarugi 2012).

L’expression de LOX et la rigidité de la MEC sont associées à un mauvais pronostic et à un risque

élevé de développement de métastases. En effet, dans un modèle murin spontané de tumeurs

mammaires MMTV-neu, l’inhibition de LOX induit une diminution des liaisons covalentes entre les

fibres de collagène entraînant ainsi une diminution de la rigidité de la MEC. Ce phénomène a pour

conséquence une réduction de la survenue des cancers (Levental et al 2009). La rigidité de la MEC

tumorale a également pour effet de corrompre les réseaux vasculaires et lymphatiques, empêchant

ainsi une distribution normale de chimiothérapie (Cirri and Chiarugi 2012).

Le remodelage de la MEC requiert également la lyse protéique des composants matriciels. Cet

événement est majoritairement réalisé par des métalloprotéases appelées MMPs (Matrix

Metalloproteinases), des cystéines protéases (cathépsine B), et des sérines protéases comme

l’urokinase (uPA pour urokinase type Plasminogen Activator), FAPα (Fibroblast-Activated Protein α)

et PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor-1) (Zhang and Liu 2013). De nombreuses études ont mis en

évidence la surexpression des MMPs dans différents cancers. En effet, en clivant les composants de la

MEC, les MMPs favorisent l’invasion des cellules tumorales et le processus de métastases, mais

permettent également des modifications dans l’interaction cellule-matrice via les intégrines, ce qui

induit des altérations dans les signalisations en aval, telles que l’adhésion cellulaire, le cytosquelette et

l’expression de la kinase d’adhésion focale (FAK pour Focal Adhesion Kinase) impliqués dans la

migration cellulaire. Les MMPs sont sécrétées de manière majoritaire par les cellules stromales telles

que les CAFs et les TAMs et minoritairement par les cellules tumorales. Le clivage des protéines

matricielles a une autre conséquence indirecte sur la progression tumorale, qui est la libération de

facteurs de croissance (comme le VEGF), chimiokines et cytokines (comme le TGF-β), piégés dans la

MEC. Ces molécules sont impliquées dans tous les processus de la progression tumorale, notamment

l’angiogenèse et le processus métastastatique (Balkwill et al 2012).

2) Les CAFs (Cancer-Associated Fibroblasts)

2-1) Généralités

Encore appelées cellules de soutien, les fibroblastes sont les cellules mésenchymateuses les plus

abondantes dans les tissus conjonctifs. Ils permettent de joindre et de maintenir tous les autres tissus et

organes ensemble dans l’organisme. Ces tissus conjonctifs sont composés de fibroblastes espacés,

compris dans une MEC. Les fibroblastes assurent l’homéostasie et le renouvellement de la MEC en

27

sécrétant les protéines (collagènes I, III, IV, V, fibronectine, élastine) et protéoglycanes qui la

composent ainsi que les protéases qui la remodèlent (MMPs) (Kendall and Feghali-Bostwick 2014).

Dans des conditions physiopathologiques, comme la cicatrisation, les fibroblastes (ayant un faible

index de prolifération et de faibles capacités métaboliques) « s’activent » : ils se mettent à proliférer, à

sécréter abondamment des protéines de la MEC et acquièrent des propriétés contractiles, leur

permettant de rejoindre le site infectieux. Ces fibroblastes « activés », encore appelés myofibroblastes

(en référence à leurs propriétés contractiles) produisent également des chimiokines, aboutissant au

recrutement de cellules immunitaires destinées à combattre l’infection. La fibrose désigne le processus

physiologique, qui, généralement en réponse à une infection et/ou une destruction tissulaire, permet la

transformation d’un tissu sain en tissu composé de fibroblastes et de protéines de la MEC. Une fois, la

lésion « réparée », les myofibroblastes retrouvent leur phénotype initial et les fibroblastes

excédentaires meurent par apoptose (Xouri and Christian 2010). Comme souligné précédemment, H.

Dvorak est le premier à avoir remarqué que le processus de cicatrisation et le processus tumoral

présentent des similitudes. Ainsi, les fibroblastes associés aux cancers, encore appelés CAFs (Cancer-

Associated Fibroblasts), TAFs (Tumor-Associated Fibroblasts) ou fibroblastes activés, présentent un

phénotype similaire aux myofibroblastes présents dans le processus de cicatrisation. Ce phénotype est

à l’inverse, fonctionnellement et morphologiquement différent des fibroblastes normaux (figure 5).

Cependant, les CAFs restent activés de façon constitutive, contrairement aux myofibroblastes de la

cicatrisation. Les CAFs arborent une morphologie allongée, fusiforme, un gros noyau, des jonctions

communicantes et adhérentes et des myofilaments d’actine cytoplasmiques (Xouri and Christian 2010)

(Zhang and Liu 2013) (figure 5). Les CAFs sont présents dans la plupart des tumeurs solides et

représentent une population majoritaire dans le microenvironnement de différents cancers, comme le

cancer du sein, de la prostate et du pancréas (Cirri and Chiarugi 2012) (Kalluri and Zeisberg 2006)

(Pietras and Ostman 2010) (Ohlund et al 2014). Dans le microenvironnement du cancer du sein,

environ 80% des fibroblastes présentent un phénotype activé (Kalluri and Zeisberg 2006) (Sappino et

al 1988).

28

Figure 5. Les fibroblastes et les fibroblastes activés. (a) Les fibroblastes normaux évoluent au sein d’une matrice extra-cellulaire (MEC) fibrillaire. Les fibroblastes interagissent avec leur environnement grâce à des intégrines, comme les intégrines α1β1. Morphologiquement, ce sont des cellules fusiformes, avec un cytosquelette d’actine et de vimentine. FSP-1 (Fibroblast-Specific Protein 1) est un marqueur spécifique des fibroblastes. (b) Les fibroblastes peuvent acquérir un phénotype « activé », associé à une augmentation de l’index de prolifération et une augmentation de la sécrétion de nombreuses molécules de la MEC, comme le collagène I et la ténascine C, ainsi que la fibronectine. Ces fibroblastes activés sont souvent caractérisés phénotypiquement par l’expression d’α-SMA (α-Smooth Actin Muscle) (d’après (Kalluri and Zeisberg 2006)).

2-2) Caractérisation des CAFs

En dépit du rôle crucial des CAFs dans la progression tumorale, il existe une certaine ambiguïté dans

l’identification de ces cellules au sein du tissu tumoral. Divers éléments contribuent à l’hétérogénéité

de cette population cellulaire, notamment le type de tissu dans lequel le cancer se développe, le type

cellulaire à l’origine des CAFs, l’environnement local et les interactions paracrines sous-jacentes

(Augsten 2014) (Xouri and Christian 2010) (Kalluri and Zeisberg 2006). Non seulement il existe des

différences dans les CAFs provenant de différents cancers, mais même au sein d’un même cancer la

composition des CAFs peut varier. L’équipe d’E. Puré a isolé des CAFs provenant d’échantillons de

cancers du sein, classés en différents sous-groupes (ER+ (positif pour les récepteurs aux œstrogènes),

TNBC (Triple Negative Breast Cancer) et HER2+ (Human Epithelial growth factor Receptor 2)) et

une étude du profil d’expression génique a été réalisée. Les résultats de cette étude suggèrent qu’il

existe une hétérogénéité de marqueurs exprimés par les CAFs en fonction des différents sous-types de

cancer du sein (Tchou et al 2012). De la même manière, à l’échelle d’une même tumeur, les marqueurs

de CAFs sont exprimés à des niveaux variables d’un CAF à l’autre (Kidd et al 2012) (Gaggioli et al

2007).

Pendant longtemps, les CAFs ont été identifiés uniquement par leur niveau d’expression d’α-SMA (α-

Smooth Muscle Actin) ; protéine impliquée dans la contractilité des cellules. Cependant des analyses

immuno-histochimiques ont démontré que certains fibroblastes péri-tumoraux n’exprimaient pas ce

29

marqueur (Bochet et al 2013) (Andarawewa et al 2005). De plus, α-SMA est retrouvé dans d’autres

types cellulaires, comme les péricytes, les cellules musculaires lisses intestinales, les cellules

myoépithéliales de la glande mammaire, les cardiomyocytes et même les fibroblastes normaux dans

certains cas, suggérant que ce marqueur n’est ni spécifique, ni sélectif (Hinz et al 2001) (Ohlund et al

2014). A ce jour, l’identification des CAFs repose sur des critères morphologiques, sur l’expression

d’un ensemble de marqueurs, sur leur profil sécrétoire et sur leurs propriétés fonctionnelles,

notamment leurs capacités pro-tumorigéniques (De Wever et al 2014) (Augsten 2014). Parmi les

marqueurs les plus retrouvés, il y a α-SMA, FSP-1 (Fibroblast Specific Protein 1, encore appelé

S100A4), FAPα (encore appelé FAP), NG2 (Neuron-glial Antigen-2), PDFGR-β, podoplanine

(PDPN), Thy-1, desmine et Ténacine-C (Ohlund et al 2014) (Polanska and Orimo 2013) (Xing et al

2010). D’autres marqueurs mésenchymateux sont classiquement utilisés pour identifier les CAFs,

comme la vimentine, la fibronectine, le collagène I et la prolyl-4 hydroxylase (Polanska and Orimo

2013). L’absence de certains marqueurs contribue également à la détermination des CAFs, telle que la

perte de la cavéoline-1, des marqueurs épithéliaux (cytokératine) ou endothéliaux (CD31 pour Cluster

of Differenciation 31) (Xing et al 2010). D’autre part, même si les CAFs sont relativement stables

génétiquement, certaines altérations génétiques ont été rapportées, comme des mutations ponctuelles,

des pertes d’hétérozygotie sur des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeurs comme p53 et

PTEN (Xing et al 2010). Parmi tous ces marqueurs, FSP-1 semble être un marqueur qui définit une

population unique de fibroblastes (Kalluri and Zeisberg 2006). L’équipe de R. Kalluri a mis en

évidence dans des modèles murins de cancers pancréatique et mammaire que les CAFs peuvent se

répartir en deux sous-groupes majeurs. Le premier est positif pour le marqueur FSP-1 mais n’exprime

aucun des autres marqueurs étudiés (NG2, α-SMA et PDGFRβ), alors que le deuxième groupe

n’exprime pas FSP-1 mais exprime les trois autres marqueurs NG2, α-SMA et PDGFβ (Sugimoto et al

2006). De manière intéressante, l’expression relative des différents marqueurs a été proposée comme

critère pronostic. En effet, une étude immuno-histochimique récente de cancers colorectaux a mis en

évidence que les CAFs qui expriment la podoplanine (PDPN(+)) sont plutôt associés à des cancers peu

agressifs et de bon pronostic alors que les CAFs qui n’expriment pas la podoplanine mais qui

expriment α-SMA ou FSP-1 (PDPN(-)/α-SMA(élevé) ou PDPN(-)/FSP-1(élevé)) sont associés à un

pronostic défavorable (Choi et al 2013). Au cours de nos expériences, les marqueurs FSP-1, FAP-α et

α-SMA nous ont particulièrement intéressés.

La protéine FSP-1 (encore appelée Mts1 pour Metastasis associated protein) est exprimée dans les

CAFs, les cellules tumorales agressives et les macrophages (Ohlund et al 2014). C’est une protéine

liant le calcium, capable d’interagir avec des partenaires intra et extra-cellulaires. Ainsi, FSP-1 peut se

lier à la myosine et à l’actine intra-cellulaires régulant ainsi le cytosquelette et la motilité cellulaire

(Egeblad et al 2005). Elle peut également interagir avec p53 et réguler son activité transcriptionnelle

(Schmidt-Hansen et al 2004). Facteur crucial dans le processus métastatique, FSP-1 peut stimuler les

30

cellules tumorales pour qu’elles sécrètent des chimiokines ou des cytokines, capables d’activer en

retour les cellules stromales (cellules endothéliales et inflammatoires) (Bettum et al 2014). Une

expression importante de FSP-1 favorise la croissance de la tumeur et sa capacité à métastaser

(Rasanen and Vaheri 2010). En effet, des cellules tumorales injectées à une souris FSP-1-/- forment

moins de tumeurs et aucune métastase, contrairement aux souris FSP-1+/+. De plus, la co-injection de

fibroblastes FSP-1+/+ avec des cellules tumorales dans des souris FSP-1-/- restaure la croissance

tumorale et le potentiel métastatique, observé dans les souris FSP-1+/+. L’expression de FSP-1 est

associée à un mauvais pronostic dans les cancers (Grum-Schwensen et al 2005).

FAP est une sérine protéase, présente à la surface des cellules qui possède une activité enzymatique

peptidase-collagénase. C’est également un marqueur classique des CAFs, notamment dans les tumeurs

du sein, du poumon, de l’ovaire et du pancréas (Ohlund et al 2014). FAP n’est pas spécifique des

CAFs : son expression a été rapportée dans les cellules tumorales gastriques, du sein, colorectal et

dans les mélanocytes et les mélanomes, mais pas dans les fibroblastes normaux (Kelly et al 2012). Elle

exerce un rôle physiologique dans l’hématopoïèse et dans le maintien de la masse musculaire (Roberts

et al 2013). Dans le cas du cancer, l’induction de FAP a été associée à une croissance tumorale

importante et à une augmentation de l’angiogenèse. Du fait de son activité enzymatique, FAP a un rôle

important dans le remodelage de la MEC et dans l’invasion des cellules tumorales (Kelly et al 2012).

L’ensemble de ces données souligne clairement l’hétérogénéité des CAFs, qui présentent non pas un

mais des phénotypes différents. En dépit des efforts réalisés, beaucoup de questions restent en

suspens : combien de sous-populations de CAFs existe-t-il au sein d’un type tumoral donné, quelle est

la proportion relative de chaque sous-population, les différentes sous-populations de CAFs sont-elles

associées à une origine cellulaire précise (Augsten 2014) ?

2-3) Origines des CAFs

De la même façon que l’identification des CAFs, leur origine demeure un sujet à débat. Encore une

fois, la difficulté provient du fait que les CAFs représentent une population hétérogène, aux origines

diverses et variées. En effet, les CAFs peuvent provenir de fibroblastes résidents, de cellules

tumorales, de cellules endothéliales, de péricytes, de cellules inflammatoires, de cellules

mésenchymateuses, d’ADSCs et d’adipocytes (figure 6). Ces derniers ont fait l’objet d’une publication

lors de ma thèse, qui sera développée dans la partie résultats (Bochet et al 2013).

a) Les fibroblastes résidents

L’activation de fibroblastes localement présents a classiquement été considérée comme la source

majeure de CAFs (Allen and Louise Jones 2011). Ce processus est appelé transition mésenchymo-

mésenchymateuse (MMT pour Mesenchymal-Mesenchymal Transition) (Cirri and Chiarugi 2012).

31

Les cellules tumorales sécrètent des facteurs de croissance comme le TGF-β, le PDGF-β et le FGF2

(Fibroblasts Growth Factor 2) qui induisent les changements phénotypiques et fonctionnels observés

dans les CAFs. TGF-β se lie à son récepteur TGFBR2 (Type-2 TGF-β Receptor), présent à la surface

des fibroblastes, ce qui induit le recrutement et la phosphorylation de TGFBR1 et l’expression de

facteurs impliqués dans la production et le remodelage de la MEC. PDGFR a également été décrit

pour son rôle pro-prolifératif des CAFs et comme facteur initiateur de la réaction desmoplasique dans

les tumeurs, qui sera décrite plus tard dans cette introduction (Ohlund et al 2014). L’équipe d’A.

Orimo a mis en évidence dans un modèle murin de xénogreffes que la co-implantation de fibroblastes

normaux avec des cellules tumorales mammaires permet la conversion de fibroblastes en

myofibroblastes durant la progression tumorale ; processus, médié et amplifié par une boucle de

signalisation autocrine CXCL12 (Chemokine (C-X-C motif) Ligand 12)) encore appelé SDF-1

(Stromal-Derived Factor 1) et TGF-β (Kojima et al 2010). L’activation des fibroblastes résidents en

CAFs peut également être médiée par les cytokines IL-8 et IL-1β d’origine tumorale (Schauer et al

2011). En plus des facteurs de croissance et des cytokines, d’autres mécanismes d’activation des

fibroblastes ont été décrits. L’équipe d’E. Leuguyel a apporté les preuves qu’une reprogrammation de

miRNAs permet aussi la conversion de fibroblastes en CAFs dans un modèle de cancer ovarien (Mitra

et al 2012). Très récemment, l’équipe de R. Rhokha a mis en évidence que la perte de TIMP-3 (Tissue

Inhibitor Metalloproteinase 3) dans des fibroblastes de souris mutées permet l’induction d’un

phénotype CAFs-like (Shimoda et al 2014). Des exosomes d’origine tumorale ont été identifiés

comme capables de recruter et activer des fibroblastes et des MSCs (Mesenchymal Stem Cells) au sein

du microenvironnement tumoral (Kahlert and Kalluri 2013) (Chowdhury et al 2014). Enfin, les

espèces réactives de l’oxygène (ROS pour Reactive Oxygen Species) générées lors de la progression

tumorale peuvent induire la conversion de fibroblastes en myofibroblastes, via l’accumulation de HIF-

1α (Toullec et al 2010). Il est à noter, que l’identification du phénotype de CAFs se base

classiquement sur l’acquisition progressive d’α-SMA et sur les capacités fonctionnelles de ces cellules

à favoriser la progression tumorale.

b) Les MSCs (Mesenchymal Stem Cells)

Les cellules souches mésenchymateuses ont été décrites comme étant une source de CAFs importante.

Ces progéniteurs, recrutés à partir de la moelle osseuse, sont capables de se différencier en cellules de

l’os, en tissu adipeux et en cartilage. Ils sont recrutés au sein du microenvironnement tumoral par

différentes sécrétions tumorales et stromales et exercent plusieurs rôles dans la progression tumorale,

notamment dans le recrutement de progéniteurs endothéliaux et dans leur différenciation en cellules

favorisant la formation des vaisseaux sanguins (Madar et al 2013). Une étude réalisée par l’équipe de

D. Barnejee a mis en évidence que des MSCs humains traités par du milieu conditionné de cellules

tumorales leurs confèrent des propriétés de CAFs, notamment l’expression de α-SMA, de FSP-1 et de

vimentine. De plus, ces cellules activées sécrètent SDF-1 et favorisent in vitro et in vivo la progression

32

de la tumeur (Mishra et al 2008). Les MSCs seraient une importante source de CAFs mais la

proportion relative de CAFs provenant des MSCs varierait en fonction des cancers : environ 25% dans

un modèle d’adénocarcinome pancréatique et 20% dans un modèle de cancer gastrique pour exemples

(Zhang and Liu 2013) (Direkze et al 2004) (Augsten 2014) (Quante et al 2011).

c) Cellules tumorales

Les CAFs peuvent aussi provenir de cellules tumorales ayant fait la transition épithélio-

mésenchymateuse ou EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition). Première étape vers l’acquisition

d’un phénotype invasif, l’EMT permet aux cellules épithéliales polarisées d’adopter une morphologie

mésenchymateuse. Ces cellules sont caractérisées par une morphologie allongée, des capacités

migratoires et invasives augmentées, la perte des adhérences cellule-cellule et cellule-matrice et une

augmentation de la sécrétion de protéines matricielles. Ce phénotype permet aux cellules de migrer et

d’envahir à travers la MEC afin de disséminer à distance. De nombreux facteurs comme le PDGF, le

TGF-β et l’EGF peuvent favoriser l’EMT en initiant un grand nombre de voies de signalisation, qui

mènent, à terme, à l’activation de facteurs de transcription comme Snail, Slug, Twist et FOXC2

(Kalluri and Zeisberg 2006) (Mao et al 2013). Dans un contexte de fibrose rénale, l’équipe de Neilson

a démontré que des cellules épithéliales non transformées peuvent également se transdifférencier en

myofibroblastes, qui expriment FSP-1 et le collagène I, suite à une EMT (Iwano et al 2002).

Cependant, cette source de CAFs semble minoritaire car contrairement aux cellules tumorales, les

CAFs ne présentent pas ou peu d’altérations génétiques (Kalluri and Zeisberg 2006) (Orimo et al

2005).

d) Cellules endothéliales

De la même façon que les cellules épithéliales, les cellules endothéliales peuvent acquérir un

phénotype de CAFs, grâce au processus appelé transition endothélio-mésenchymateuse (endoMT).

Ces cellules perdent les marqueurs endothéliaux comme CD31, acquièrent des marqueurs

mésenchymateux comme FSP-1 et α-SMA et des propriétés migratoires et invasives (Nie et al 2014).

Le TGF-β est également un facteur inducteur de l’endoMT (Xouri and Christian 2010). Les cellules

endothéliales ayant fait l’endoMT représenteraient une source conséquente de CAFs et exerceraient un

rôle important dans l’angiogenèse (Rasanen and Vaheri 2010) (Potenta et al 2008).

e) ADSCs (Adipose-Derived Stem Cells)

Les ADSCs sont des cellules souches mésenchymateuses comprises dans le tissu adipeux (Wang et al

2012). Des travaux, publiés par C. Jotzu et al. ont montré que les ADSCs peuvent se transdifférencier

en CAFs, sous l’influence des sécrétions de lignées tumorales mammaires via la signalisation du TGF-

β1. Ce phénotype CAF-like est caractérisé par l’expression d’α-SMA et de la ténascine C et par un

rôle pro-invasif sur les cellules tumorales in vitro. De manière intéressante, ce phénotype peut être

33

réversé par l’utilisation d’un anticorps bloquant dirigé contre le TGF-β1 (Jotzu et al 2011). Plus

récemment, l’équipe de FC. Marini a confirmé la capacité des ADSCs à se convertir en CAFs et a en

plus souligné l’hétérogénéité phénotypique des CAFs en fonction de leur provenance. En effet, dans

un modèle syngénique de cancer du sein et de l’ovaire, les auteurs ont montré que les BMSCs (Bone-

Marrow Stem Cells) se différencient préférentiellement en CAFs, exprimant FSP-1 et FAP et sont

majoritairement localisés à la périphérie de la tumeur. A l’inverse, les ADSCs se différencient en

CAFs exprimant α-SMA et NG2 et sont retrouvés à proximité des vaisseaux sanguins (Kidd et al

2012). Cho et al. ont également montré que les exosomes de cellules tumorales ovariennes induisent

une transdifférenciation des ADSCs en CAFs, exprimant α-SMA, qui peuvent en retour favoriser la

progression de la tumeur, via une signalisation SDF-1 et TFG-β (Cho et al 2011). Plus engagés dans le

lignage adipocytaire, les pré-adipocytes sont également une source de CAFs. En effet, il a été proposé

in vitro et in vivo, que les pré-adipocytes de la lignée 3T3-L1, soumis aux sécrétions de cellules

tumorales mammaires favorisent l’accumulation de fibronectine et le remodelage de la MEC,

participant ainsi à la réaction desmoplasique (Chandler et al 2012).

f) Autres sources de CAFs

Les péricytes (cellules présentes autour des vaisseaux sanguins et régulant la perméabilité vasculaire),

ainsi que les cellules musculaires lisses ont également été décrits comme capables de se différencier en

myofibroblastes (Kendall and Feghali-Bostwick 2014) (Xouri and Christian 2010). Une étude réalisée

par Binai et al. a aussi proposé les monocytes circulants comme origine de myofibroblastes. En effet,

en condition de fibrose, les monocytes circulants provenant de patients atteints de sclérose systémique

expriment α-SMA et le collagène I, contrairement aux monocytes isolés à partir de patients sains

(Binai et al 2012).

Par conséquent, les CAFs regroupent un ensemble de cellules, qui proviennent de différentes origines.

On peut ainsi imaginer que ces cellules, au même titre que leurs différences phénotypiques, ont un rôle

spécifique dans la progression tumorale variant selon les types de tumeurs, les sécrétions paracrines du

microenvironnement et les marqueurs qu’elles expriment. Bien que les multiples origines des CAFs

soient couramment établies par la communauté scientifique, l’importance fonctionnelle relative de ces

différentes sous-populations dans la progression tumorale reste très mal connue (figure 6).

34

Figure 6. Les multiples origines des CAFs dans le stroma tumoral. Huit mécanismes possibles ont été décrits pour expliquer l’origine des CAFs : l’activation de fibroblastes localement présents, le recrutement de cellules souches mésenchymateuses, la transition épithélio-mésenchymateuse de cellules épithéliales, la transition endothélio-mésenchymateuse de cellules endothéliales, la transdifférencitation de péricytes, de cellules musculaires lisses, de cellules inflammatoires et des cellules du tissu adipeux (ADSCs, pré-adipocytes et adipocytes) (d’après (Zhang and Liu 2013)).

2-4) Rôle de CAFs dans la progression tumorale (pour revue (Ohlund et al 2014))

Les CAFs sont capables d’agir à toutes les étapes clés de la progression tumorale (figure 7). Leurs

effets passent principalement par la sécrétion de différentes molécules, comme des facteurs de

croissance (TGF-β, HGF, EGF (Epidermal Growth Factor), IGF (Insulin Growth Factor), CTGF

(Connective Tissue Growth Factor), VEGF), des cytokines (CCL7, CXCL12, IL-6, IL-1β) et des

protéines impliquées dans la constitution (collagènes, fibronectine) et le remodelage de la MEC

(MMPs, FAP) (Mao et al 2013). Ainsi ils peuvent exercer un rôle pro-tumoral directement sur les

cellules cancéreuses et aussi indirectement via la stimulation des cellules stromales.

De nombreuses études ont souligné le rôle des CAFs dans l’initiation tumorale. En utilisant des

expériences de co-cultures et de transplantations chez la souris, Olumi et al. ont montré que des CAFs

(à la différence des fibroblastes normaux) induisent la prolifération et l’initiation tumorale à partir de

cellules humaines prostatiques épithéliales non tumorales immortalisées. En revanche, les CAFs ne

stimulent pas le développement tumoral de cellules prostatiques épithéliales non immortalisées, ce qui

suggère qu’un évènement génétique initiateur est nécessaire pour exercer cet effet pro-tumoral (Allen

and Louise Jones 2011) (Augsten 2014) (Olumi et al 1999). Dans un modèle murin de xénogreffes des

composants épithéliaux et stromaux humains récapitulant la glande mammaire, Kuperwasser et al. ont

mis en évidence que la surexpression de TGF-β et/ou d’HGF (Hepatocyte Growth Factor) dans des

fibroblastes murins, avant l’implantation, induit l’initiation du cancer du sein (Kuperwasser et al

2004).

35

Les CAFs agissent également sur la progression de la tumeur primaire, en favorisant, la prolifération,

l’invasion et le processus d’angiogenèse. Dans un modèle de cancer du sein, il a été montré que l’IL-6,

sécrétée par les CAFs (en quantité 100 fois supérieure à la sécrétion par les fibroblastes normaux)

permet la migration des cellules tumorales mammaires MDA-MB231 et induit l’EMT des cellules

ER+ (MCF-7 et T47D) (Hugo et al 2012) (Mao et al 2013). L’équipe de R. Weinberg a apporté les

preuves que les CAFs isolés du stroma d’un carcinome invasif mammaire augmentent de manière

importante la croissance tumorale, dans un modèle de xénogreffes (co-implantation CAFs/cellules

tumorales). Cet effet n’est pas retrouvé avec des fibroblastes normaux du même patient. En fait, les

CAFs produisent des taux élevés de CXCL12 qui, d’une part augmente la croissance tumorale via sa

liaison sur son récepteur CXCR4, exprimé à la surface des cellules tumorales et d’autre part recrute les

progéniteurs endothéliaux EPCs (Endothelial Progenitor Cells) au sein de la tumeur pour favoriser

l’angiogenèse. De manière intéressante, ces caractéristiques de CAFs sont maintenues même en

l’absence de contact avec les cellules tumorales (Orimo et al 2005).

La réaction desmoplasique

Comme nous l’avons vu précédemment, une des caractéristiques des CAFs est leur capacité à

synthétiser et remodeler la MEC (voir partie MEC). Certaines tumeurs (pancréas, sein, colorectal,

poumon …) sont caractérisées par la présence d’une réaction desmoplasique (encore appelée

desmoplasie). Elle est définie par le développement anormal d’un tissu fibreux en réponse à une

lésion. Dans le cas du cancer, la réaction desmoplasique correspond au recrutement et à la prolifération

de fibroblastes activés, capables de sécréter des protéines matricielles et des enzymes protéolytiques,

ce qui forme une « MEC permissive à la progression tumorale ». Histologiquement, la réaction

desmoplasique est caractérisée par une « coque » rigide qui se forme autour de la tumeur (composée

de CAFs et riche en collagène I) et à une prolifération accrue des CAFs au sein de la tumeur. La

réaction desmoplasique est associée à une augmentation de la prolifération tumorale, un phénotype

invasif et une augmentation de la chimiorésistance. Elle représente ainsi un facteur de mauvais

pronostic dans les cancers du poumon, du pancréas, du sein et colorectal (Ohlund et al 2014). En

régulant la MEC, les CAFs influencent considérablement la progression tumorale, en agissant sur le

recrutement des autres composants stromaux au sein de la tumeur, capables eux aussi d’agir sur la

prolifération, la migration des cellules tumorales et le processus métastatique (Ohlund et al 2014).

En plus d’agir sur la carcinogenèse et sur la croissance de la tumeur primaire, les CAFs peuvent

considérablement influencer le processus métastatique. Ce processus requiert l’enchainement de

plusieurs évènements : l’EMT des cellules tumorales, qui adoptent ainsi un phénotype invasif,

l’angiogenèse, l’intravasation des cellules tumorales dans le réseau sanguin et leur extravasation dans

des tissus à distance, où les cellules font une MET (Mesenchymal-Epithelial Transition) pour former

des colonies à des sites distants de la tumeur primaire (Mao et al 2013). En plus d’induire l’EMT des

36

cellules tumorales et de participer à l’angiogenèse, les CAFs favorisent l’intravasation des cellules

tumorales en se coopérant aux macrophages via une signalisation CCL2 (Mao et al 2013) (Tsuyada et

al 2012). Ils peuvent également influencer l’invasion des cellules par la sécrétion de chimiokines, de

cytokines et de MMPs. De plus, les CAFs sont dotés de propriétés migratoires et invasives leur

permettant de circuler eux-mêmes dans l’organisme avec les cellules tumorales (Xing et al 2010)

(Cirri and Chiarugi 2012). Cornil et al. ont montré que seules les cellules provenant de mélanomes

invasifs prolifèrent de manière accrue en présence de CAFs, ce qui suggère le potentiel des CAFs à

créer une niche favorable au développement de métastases (Cornil et al 1991). Le transport des CAFs

avec les cellules tumorales protège ces dernières de l’apoptose dans le réseau sanguin et leur permet de

se développer plus facilement une fois arrivées aux sites métastatiques (Duda et al 2010). L’injection

de CAFs dans des souris déficientes pour FSP-1 (qui présentent moins de métastases que les souris

FSP-1+/+) restaure partiellement le phénotype et le potentiel métastatique (Grum-Schwensen et al

2005). Il a été rapporté que les CAFs favorisent la capacité des cellules tumorales à acquérir un

phénotype de cellules-souches cancéreuses (encore appelées CSCs pour Cancer Stem Cells). Il est bien

connu que dans la tumeur, une proportion des cellules adopte ce phénotype, les rendant plus

résistantes aux traitements et plus enclines à former de nouveaux foyers tumoraux. Les CAFs sont

capables de promouvoir l’auto-renouvèlement des cellules tumorales et d’augmenter leur niveau

d’expression en marqueurs de CSCs (CD133- et ratio élevé de CD44/CD24) (Klarmann et al 2009)

(Cirri and Chiarugi 2012).

Les CAFs peuvent également participer au maintien d’une inflammation chronique, favorable à la

progression tumorale (voir partie sur les cellules inflammatoires), en exprimant des facteurs pro-

inflammatoires, capables de recruter des cellules myéloïdes (monocytes et macrophages) (Ohlund et al

2014) (Torres et al 2013). Ils sont aussi dotés d’un rôle immunosuppressif en inhibant notamment

l’action des lymphocytes NK (Balsamo et al 2009) (Zhang and Liu 2013).

Les CAFs agissent sur le métabolisme des cellules tumorales afin de promouvoir la tumorigenèse. Le

métabolisme de la cellule tumorale est un processus complexe et hautement hétérogène. Les cellules

tumorales utilisent le glucose principalement via la glycolyse anaérobie, aboutissant à la production de

lactate, même en présence d’oxygène (processus appelé « effet Warburg »), alors que les cellules

normales catabolisent complétement ce processus via la phosphorylation oxydative aboutissant à la

production d’ATP. Un switch vers la glycolyse aérobie a été également rapporté dans les CAFs à

proximité des cellules tumorales, ce qui permet la génération de lactate et de pyruvate. Ces métabolites

peuvent ainsi être utilisés par la cellule tumorale comme combustible, afin d’alimenter le métabolisme

mitochondrial (cycle de Krebs, phosphorylation oxydative), aboutissant à terme, à la formation d’ATP

et au développement de la tumeur. Ce processus a été référé comme « reverse Warburg effect »

(Pavlides et al 2009) (Ohlund et al 2014). Les CAFs participent, ainsi, à la dynamique du métabolisme

tumoral en s’adaptant aux besoins métaboliques de la cellule tumorale (Ohlund et al 2014).

37

Les effets pro-tumorigéniques des CAFs sont aussi liés à la résistance aux traitements. Il a été rapporté

que l’HGF, sécrété par les CAFs, induit une résistance au gefitinib (inhibiteur de l’EGFR) dans un

modèle de cancer du sein triple négatif. Les CAFs peuvent aussi favoriser une résistance aux

chimiothérapies, à l’hormonothérapie et aux thérapies anti-angiogéniques (Dittmer and Leyh 2014).

Crawford et al. ont isolé des fibroblastes de tumeurs résistantes ou sensibles aux anti-VEGF. Ils ont

mis en évidence le fait que les CAFs provenant de tumeurs résistantes sont capables de rendre des

cellules tumorales précédemment sensibles, résistantes aux anti-VEGF, en agissant donc comme un

« cheval de Troie » (Crawford et al 2009).

Figure 7. Rôles des CAFs dans la progression tumorale. Les CAFs peuvent agir sur toutes les étapes clés de la progression tumorale : ils peuvent 1) recruter d’autres cellules stromales, qui vont s’associer aux CAFs dans la promotion tumorale, 2) favoriser l’activation et la reprogrammation de cellules stromales en CAFs, 3) initier la progression tumorale, 4) réguler le potentiel « cellules-souches » des cellules tumorales, 5) induire un shift métabolique, 6) remodeler la MEC, la rendant « permissive à la progression tumorale », 7) favoriser une inflammation chronique, 8) supporter l’angiogenèse, 9) potentialiser le processus métastatique et aider les cellules tumorales à résister aux traitements (d’après (Ohlund et al 2014)).

38

3) Les adipocytes

Longtemps oubliés dans la caractérisation du microenvironnement tumoral, il s’avère que le tissu

adipeux (TA) et plus particulièrement les adipocytes exercent un rôle important dans la progression

tumorale. En effet, le TA est présent en quantité importante dans l’organisme (environ 20% chez les

hommes et 28% chez les femmes) et ses fonctions multiples lui permettent d’influencer

considérablement le devenir de la tumeur (Thompson et al 2012).

3-1) Le tissu adipeux (TA)

a) Composition du TA

Le TA est un tissu conjonctif, plastique, composé d’un grand nombre de cellules. Sa fonction première

est de stocker l’énergie excédentaire sous forme de triglycérides (TG) et de mobiliser cette énergie

sous forme d’acides gras (AG), en fonction des besoins énergétiques de l’organisme. Il permet

également d’assurer un support mécanique pour les tissus alentours et sert d’isolant thermique pour

l’organisme. De plus, le TA est maintenant décrit comme un organe endocrine, qui sécrète une grande

variété de molécules, regroupées sous le terme d’adipokines, telles que des hormones, des facteurs de

croissance, des enzymes et des cytokines, pouvant agir sur un grand nombre de fonctions biologiques

comme la régulation de la masse adipeuse, de la différenciation des adipocytes, du flux sanguin, de la

fonction immunitaire et des fonctions plus larges, comme la prise alimentaire. L’ensemble des

sécrétions du TA exerce, ainsi, un rôle important dans des pathologies, telles que l’obésité ou la

lipodystrophie (Poulos et al 2010).

Il existe majoritairement deux types de TA : le TA blanc encore appelé WAT (pour White Adipose

Tissue), que je vais détailler ci-après et le TA brun (BAT pour Brown Adipose Tissue). A l’inverse du

WAT, le BAT contient plusieurs petites vacuoles lipidiques et de nombreuses mitochondries, riches en

cytochromes leur conférant leur couleur brune. Ils sont principalement responsables de la

thermogenèse en dissipant l’énergie sous forme de chaleur sans production d’ATP (grâce à

l’oxydation des AG et au découplage de la chaine respiratoire mitochondriale). Ce processus est

majoritairement réalisé par la protéine UCP-1 (Uncoupling Protein-1), localisée au niveau de la

membrane mitochondriale (Lee et al 2014) (Sanchez-Gurmaches and Guertin 2014). Chez l’Homme,

ce TA est surtout présent chez le nouveau-né et tend à disparaître chez l’adulte. Récemment, un

troisième type de TA a été identifié, appelé TA beige ou brite (pour BRown in whITE). Ce TA est

caractérisé par un phénotype intermédiaire et serait retrouvé chez l’adulte (contrairement au BAT)

sous forme de dépôts au sein du WAT (Hyvonen and Spalding 2014) (Shabalina et al 2013). Le TA

blanc est organisé en lobules, délimités par des cloisons (septa) de tissu conjonctif. Les adipocytes

sont serrés les uns aux autres, prenant ainsi une forme polygonale. Ce TA est composé de deux

populations principales : les adipocytes matures, qui représentent la population cellulaire majoritaire

39

(80-90% du volume du TA et 60-70% du nombre de cellules présentes dans le TA) et un groupe

hétérogène de cellules, regroupé sous le terme de SVF (Stromal Vascular Fraction) (Thompson et al

2012). Parmi ces cellules, figurent des précurseurs adipocytaires (pré-adipocytes), des cellules

endothéliales (formant un réseau vasculaire conséquent), des fibroblastes, des cellules immunitaires,

des fibres nerveuses et des cellules souches mésenchymateuses (ADSCs), comprises dans une MEC

(Cousin et al 2006) (figure 8). L’ensemble de ces cellules participent au maintien, au développement

ainsi qu’à la viabilité du tissu. Les adipocytes du TA blanc (à l’inverse des adipocytes du TA brun)

présentent une large vacuole lipidique uniloculaire, occupant la quasi-totalité du cytoplasme (environ

90% de la cellule). Ce sont de grosses cellules rondes et volumineuses (diamètre moyen : 130µm) avec

un noyau périphérique accolé à la membrane plasmique et dont la taille peut varier assez rapidement

en fonction de la balance énergétique (figure 8).

Figure 8. Composition du tissu adipeux blanc. Les adipocytes matures sont les éléments principaux du TA. Les autres types cellulaires, présents au sein du TA sont les précurseurs adipocytaires (ADSCs et pré-adipocytes), des fibroblastes, des cellules immunitaires (macrophages, T cells), des vaisseaux sanguins et une MEC (d’après (Ouchi et al 2011)).

b) Localisation des différents tissus adipeux blancs

La morphologie et la physiologie du TA varient considérablement en fonction du type et de la

localisation. En effet, chez le mammifère, le TA blanc est disséminé dans des sites anatomiques

divers. Les deux sites majoritaires sont le TA viscéral (mésentérique, rétro-péritonéal et péri-

gonadique (péri-ovarien et péri-prostatique)) et le TA sous-cutané, classiquement localisé au niveau de

l’hypoderme (fémoro-glutéal et abdominal). Le TA est aussi localisé au niveau de la glande mammaire

(TA mammaire) et dans la moelle osseuse (TA médullaire) (figure 9). Cependant, dans des conditions

pathologiques comme l’obésité, le TA peut s’accumuler à d’autres endroits dans l’organisme,

notamment autour des reins, du cœur, et des poumons (Ouchi et al 2011). Il existe un dimorphisme

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sexuel, quant à la répartition du TA : les hommes accumulent plus les TG dans le TA viscéral

(répartition androïde) et dans le TA sous-cutané abdominal alors que les femmes stockent plus les

graisses dans le TA sous-cutané fémoro-glutéal (répartition gynoïde).

Figure 9. Répartition des différents TA dans l’organisme chez la femme et chez l’homme. Le TA viscéral et le TA sous-cutané sont les deux TA majoritaires. D’autres localisations sont retrouvées comme le TA médullaire, le TA péri-ovarien chez la femme et le TA péri-prostatique chez l’homme (d’après (Laurent et al 2014)).

Le TA viscéral (VAT) et le TA sous-cutané (SAT). Alors que le SAT est plutôt responsable de

l’isolation thermique de l’organisme, des études épidémiologiques ont mis en évidence qu’un excès de

VAT est associé à un risque d’insulino-résistance et à des complications métaboliques, responsables

de pathologies, telles que le diabète de type II, l’hypertension, l’athérosclérose … ; le SAT serait plus

un facteur protecteur pour ces pathologies (Sanchez-Gurmaches and Guertin 2014). Les différences

entre VAT et SAT peuvent s’expliquer par des capacités de stockage, de mobilisation des AG et par

un profil sécrétoire différent. Par exemple, l’insuline, qui est l’hormone majeure impliquée dans le

stockage et la mobilisation des AG est plus active dans le VAT (Hayashi et al 2008). De plus, la

plupart des études s’accorde pour dire que les adipocytes du VAT sont plus sensibles aux agonistes β-

adrénergiques (signal inducteur de la lipolyse) que les adipocytes du SAT, ce qui a pour conséquence

que le VAT possède une plus forte activité lipolytique que le SAT. Les différences fonctionnelles de

ces deux TA s’expliquent également par des profils sécrétoires différents. En effet, le VAT sécrète

davantage de cytokines pro-inflammatoires que le SAT, notamment l’IL-6, IL-8, PAI1 (Plasminogen

activation inhibitor I), ainsi que les molécules impliquées dans l’immunité innée, alors que le SAT

sécrète plus de leptine, qui est une hormone importante dans le contrôle de la prise alimentaire et de la

régulation du stockage énergétique (voir le chapitre adipokines). Comme le SAT est moins actif

métaboliquement que le VAT, il assurerait un meilleur stockage des TG à court et à long terme. De

41

plus, les adipocytes du VAT sont plus petits que les adipocytes du SAT. Ainsi, en cas d’excès

énergétique, le SAT est plus mobilisé pour accumuler les TG (Bjorndal et al 2011). Les différences

entre le VAT et le SAT impliquent également la SVF. En effet, Tchkonia et al. ont montré que les pré-

adipocytes provenant du SAT ont de plus grandes capacités adipogéniques que les pré-adipocytes

viscéraux isolés à partir du même individu (Tchkonia et al 2002).

Le TA mammaire (MAT). Le MAT est un TA particulier car il fait partie intégrante de la glande

mammaire et a un rôle primordial pour son développement. En effet, la glande mammaire est une

glande exocrine, composée de cellules épithéliales (formant les canaux galactophores et les lobules) et

de cellules myoépithéliales, comprises dans un stroma complexe, composé majoritairement

d’adipocytes et de fibroblastes inclus dans une MEC. Son architecture et son développement seront

développés dans la partie II. De nombreuses études ont montré que le MAT est essentiel au

développement de l’épithélium mammaire, à toutes les étapes. Un dialogue intime se crée entre les

cellules épithéliales et les adipocytes du MAT (Hovey et al 1999). Outre le tissu adipeux blanc et le

tissu adipeux brun, un troisième type d’adipocytes a été décrit chez la souris, appelé adipocytes roses.

Les auteurs à l’origine de ce concept ont mis en évidence que pendant la lactation, les cellules

épithéliales alvéolaires mammaires produisant le lait, proviennent de la transdifférenciation

d’adipocytes sous-cutanés, soulignant la grande plasticité des adipocytes (Giordano et al 2014).

Le TA médullaire (BMAT pour Bone marrow adipose tissue). Encore très peu décrits, les

adipocytes médullaires représentent un composant important du microenvironnement de la moelle

osseuse. Ce type de TA aurait un profil unique, intermédiaire entre le BAT et le WAT, caractérisé par

des adipocytes de petite taille (Lecka-Czernik 2012).

3-2) Les adipocytes

a) Origine et différenciation

Le nombre d’adipocytes chez l’adulte est relativement constant. Le turnover des adipocytes serait

d’environ 0.2-0.3% par jour correspondant à une demi-vie de 300 à 400 jours pour ces cellules

(Spalding et al 2008) (Thompson et al 2012). En cas de perte de poids, seule la taille adipocytaire, et

non le nombre, diminue (Hyvonen and Spalding 2014).

Les adipocytes, au même titre que les myocytes, les chondrocytes, les ostéocytes et les fibroblastes

dérivent d’un même précurseur : les MSCs. Ce processus, appelé adipogenèse se traduit par une

première phase de détermination, qui implique l’engagement d’une cellule souche mésenchymateuse

vers un adipoblaste, qui deviendra pré-adipocyte. Les pré-adipocytes sont des cellules allongées, de

morphologie fibroblastique. Ils ne peuvent pas être différenciés morphologiquement, de leur

précurseur, mais ils ont perdu la capacité à se différencier en une cellule d’un autre lignage. Jusqu’à ce

42

stade, les cellules ont encore la capacité de proliférer. Cette phase a été peu caractérisée

(Christodoulides et al 2009) (figure 10).

La seconde phase, appelée phase de différenciation adipocytaire correspond à la transition du pré-

adipocyte en adipocyte, qui deviendra mature. A ce stade, l’adipocyte possède ses capacités

fonctionnelles et la machinerie enzymatique nécessaire à ses fonctions, telles que la synthèse et le

transport de lipides, la réponse à l’insuline et la sécrétion de nombreuses protéines (Feve 2005) (figure

10). C’est au cours de cette étape que d’importants changements morphologiques s’opèrent, tels

qu’une augmentation importante de la taille de la cellule, un « arrondissement » de la cellule et une

accumulation de vacuoles lipidiques. Au début de cette phase, un profond remaniement du

cytosquelette et de la MEC est observé, jouant un rôle important dans l’acquisition du phénotype de

l’adipocyte mature et dans le bon déroulement de cette phase. Cette étape est suivie d’une expansion

clonale, qui consiste à quelques mitoses, puis s’ensuit une perte irréversible des capacités

prolifératives. Enfin, lors de la différenciation terminale, l’adipocyte acquiert ses propriétés

lipogéniques, lipolytiques et sécrétoires. Une fois les capacités métaboliques de l’adipocyte acquises,

ces derniers commencent à accumuler des lipides. Les lignées cellulaires murines pré-adipocytaires

3T3-F442A et 3T3-L1, couramment utilisées, sont déjà déterminées vers le lignage adipocytaire, mais

permettent de récapituler in vitro la phase de différenciation adipocytaire. Ces lignées sont établies à

partir d’une sélection clonale de fibroblastes, dérivés d’un embryon d’une souris swiss 3T3, âgée de

17 à 19 semaines (Feve 2005) (Lafontan 2012).

43

Figure 10. Etapes clés de l’adipogenèse : la détermination et la différenciation adipocytaires. La détermination adipocytaire consiste à l’engagement d’une MSC dans le lignage adipocytaire. La différenciation adipocytaire est l’étape permettant la transition d’un pré-adipocyte vers un adipocyte mature. Ces deux phases sont sous le contrôle étroit de facteurs de transcription et de régulateurs extra-cellulaires (d’après Gregoire et al. 1998, Physiology Reviews and Feve et al. 2005).

Le contrôle transcriptionnel de l’adipogenèse :

Comme cette étape est associée à de profonds changements phénotypiques et métaboliques de la

cellule, elle est sous le contrôle de facteurs transcriptionnels, comme les PPARs (Peroxisome

Proliferator Activated Receptor) et les protéines de la famille des CEBPs (CAAT/Enhancer Binding

Proteins) ou encore les SREBPs (Sterol Regulatory Element Binding Proteins) et les KLFs (Kruppel-

Like zinc Finger transcription factor).

Le modèle classique de l’adipogenèse suggère une induction initiale et transitoire des facteurs C/EBPβ

et C/EBPδ. L’expression précoce de ces facteurs permet l’expression de PPARγ. Par la suite, l’action

conjointe de C/EBPβ, C/EBPδ et de PPARγ induit C/EBPα. Une fois activés, ces deux facteurs

(PPARγ et C/EBPα) agissent en synergie et s’autorégulent afin de maintenir leur expression et activent

de nombreux gènes codant pour des protéines impliquées dans le métabolisme et l’acquisition du

phénotype adipocytaire (Du et al 2010) (figure 10). PPARγ représente le facteur clé de l’adipogenèse.

44

Membre de la superfamille des récepteurs nucléaires, son expression est suffisante pour induire la

différenciation adipocytaire. Jusqu’à présent, aucun autre facteur n’a été montré capable d’induire

l’adipogenèse en absence de PPARγ (Lee and Ge 2014). Le rôle de PPARγ n’est pas seulement

important pour induire l’adipogenèse, il est également crucial pour maintenir les adipocytes dans un

état différencié et dans la régulation de la sensibilité à l’insuline (Tamori et al 2002). Des mutations de

PPARγ ont ainsi été associées à des pathologies comme la lipodystrophie (caractérisée par une

diminution voire une absence de TA) et des maladies métaboliques, comme l’hypertension et une

insulino-résistance (Lee and Ge 2014). Il existe deux isoformes de PPARγ : PPARγ1 et PPARγ2,

générés par épissage alternatif. PPARγ2 est exclusivement exprimé par les adipocytes et fortement

induit lorsque les cellules rentrent dans la phase de différenciation adipocytaire (Feve 2005). Les

membres de la famille C/EBP (C/EBPα, C/EBPβ et C/EBPδ) sont exprimés par les adipocytes et ont

donc un rôle important dans l’adipogenèse. C/EBPα est impliqué dans la régulation directe de

nombreux gènes adipocytaires et exerce aussi un rôle dans le maintien des adipocytes différenciés et

dans leur sensibilité à l’insuline (Rosen and MacDougald 2006).

Régulation extra-cellulaire de l’adipogenèse :

L’adipogenèse est donc le résultat d’une activation séquentielle de facteurs de transcription, dont les

plus importants sont les PPARs et les C/EBPs mais une multitude d’autres facteurs de transcription

sont régulés dans les adipocytes. D’autres signaux intra et extra-cellulaires peuvent également réguler

ce processus, afin d’adapter la croissance et la différenciation des nouveaux adipocytes en fonction des

besoins énergétiques. La signalisation insuline / récepteur IGFR-1et les gluco-corticoïdes figurent

parmi les facteurs pro-adipogéniques, alors que le TGF-β, les cytokines pro-inflammatoires, Pref-1

(Preadipocyte secreted factor 1), la voie de signalisation Notch et les membres de la famille WNT

(Wingless-type MMTV integration site) inhibent l’adipogenèse (Rosen and MacDougald 2006). Cette

dernière est apparue comme un régulateur clé de l’adipogenèse et nous a particulièrement intéressé

(Bochet et al 2013) (figure 11).

Les membres de la famille Wnt sont des glycoprotéines secrétées, pouvant agir de manière autocrine

ou paracrine afin d’influencer le destin cellulaire et le développement (Feve 2005). Les ligands Wnt

exercent leurs effets via des signalisations « canoniques » et « non-canoniques » (Christodoulides et al

2009). La voie de signalisation canonique Wnt/β-caténine converge vers l’activation du facteur de

transcription β-caténine. En l’absence de ligands Wnts, la β-caténine est recrutée par le complexe de

dégradation, composé entre autres par l’Axine et APC (Adenomatous Polyposis Coli), ce qui facilite

sa phosphorylation par la caséine kinase 1 et par GSK3β (Glycogen Synthase Kinase-3β). Ceci conduit

la β-caténine à l’ubiquitinylation et à sa dégradation protéasomale. Ainsi, la β-caténine est maintenue à

un niveau d’expression faible dans la cellule. Elle est surtout localisée au niveau des membranes et au

cytosquelette, liée à l’E-cadhérine et à l’α-caténine, afin de réguler les processus d’adhésion cellulaire

45

(Collu et al 2014). Lorsque les Wnts se lient aux récepteurs frizzled (FZD) et aux co-récepteurs

LRP5/6 (Lipoprotein Receptor-related Protein-5 or 6), une inactivation du complexe de dégradation

est observée. Puis, Dishevelled (Dvl) et l’Axine sont recrutés au niveau de la membrane, loin du

complexe de dégradation. La β-caténine hypophosphorylée s’accumule alors dans le cytoplasme,

transloque alors au noyau et se lie aux facteurs de transcription de la famille LEF/TCF (Lymphoid-

Enhancer-Binding factor/T-Cell specific transcription Factor) pour activer des gènes cibles, tels que

PPARδ, Axin2, c-Myc, cycline D1, matrilysine et CD44 (Collu et al 2014) (Christodoulides et al 2009)

(Mulholland et al 2005) (figure 11). Les voies de signalisation non canoniques induites par les Wnts,

indépendantes de la β-caténine sont moins bien caractérisées. On distingue la voie Wnt/PCP (Planar

Cell Polarity) et la voie Wnt/calcium impliquées dans des fonctions cellulaires diverses, telles que la

migration cellulaire (Christodoulides et al 2009) (Collu et al 2014).

Figure 11. La voie de signalisation Wnt/β-caténine. (A) En absence de ligands Wnt, la β-caténine est prise en charge par le complexe de dégradation Axine / APC, qui va contribuer à la phosphorylation de la β-caténine par la caséine kinase-1 et par GSK3β. Ceci conduit la β-caténine à l’ubiquitinylation et sa dégradation protéasomale. (B) Les ligands Wnt se lient aux récepteurs membranaires Frizzled et co-récepteurs LRP5/6, ce qui recrute la protéine Dishevelled et l’Axine, empêchant la formation du complexe de dégradation. La β-caténine cytosolique s’accumule alors, transloque au noyau et se lie aux facteurs de transcription TCF/LEF, afin d’activer ses gènes cibles (d’après (Collu et al 2014)).

La voie de signalisation Wnt/β-caténine exerce un rôle crucial de frein dans l’adipogenèse (figure 12).

Au contraire, une inactivation de cette voie en intra ou extra-cellulaire, par des protéines

recombinantes SFRPs (Secreted Frizzled-Related Proteins) ou par l’expression constitutive de l’Axine,

induit une adipogenèse spontanée à partir de pré-adipocytes et de précurseurs mésenchymateux

(Wright et al 2007) (Ross et al 2000). La voie Wnt/β-caténine inhibe la phase de différenciation

adipocytaire en bloquant l’expression de PPARγ et C/EPBα. Les cibles de la β-caténine : c-myc et la

46

cycline D1 facilitent cet effet en se liant à ces deux facteurs de transcription. La régulation négative de

la voie Wnt/β-caténine sur PPARγ et C/EPBα est réciproque car en présence de stimuli adipogéniques,

l’induction de ces deux facteurs de transcription mène à une diminution de l’expression des Wnts

(figure 12). Les ligands Wnt les plus étudiés dans l’adipogenèse sont Wnt10b, Wnt10a, Wnt6, Wnt3a

et Wnt1 (Mulholland et al 2005). L’expression de Wnt10b est élevée dans les pré-adipocytes et

diminue rapidement après l’induction de la différenciation (Christodoulides et al 2009). In vivo, des

souris transgéniques exprimant Wnt10b sous le contrôle du promoteur FABP4 (Fatty Acid Binding

Protein 4), fortement fonctionnel dans les adipocytes présentent une diminution de 50% de leur masse

graisseuse et sont résistantes à l’obésité induite par un régime hyperlipidique (Longo et al 2004). Une

étude a souligné, chez l’homme, l’impact de Wnt10b dans l’obésité. En effet, une mutation portant sur

le gène de Wnt10b a été retrouvée chez plus de 200 sujets obèses, présentant une obésité sévère

précoce (Laudes 2011). De plus, des études récentes ont mis en évidence que la voie Wnt serait

également impliquée dans l’interaction des adipocytes avec les cellules inflammatoires, afin

d’impacter l’inflammation chronique observée chez les patients obèses atteints de diabète de type 2

(Laudes 2011). Cependant, certains ligands Wnt, tels que Wnt5b sont décrits pro-adipogéniques, en

activant probablement des voies Wnt non canoniques (Christodoulides et al 2009).

La voie canonique Wnt/β-caténine contrôle également la balance entre l’adipogenèse et la myogenèse.

Dans des précurseurs mésenchymateux, une activation de cette voie stimule l’ostéoblastogenèse au

dépens de l’adipogenèse (Bennett et al 2005) (Rosen and MacDougald 2006). Via l’activation de la

voie Wnt/β-caténine, Wnt3a, présent dans les cellules souches mésenchymateuses induit l’expression

de plusieurs facteurs pro-myogéniques, tels que PAX7, MYOD et la myogénine et la diminution de

C/EBPα et PPARγ (Laudes 2011) (Shang et al 2007).

Figure 12. Rôle de la voie Wnt/β-caténine dans l’adipogenèse. Cette voie inhibe l’adipogenèse au niveau de la détermination et de la différenciation adipocytaires (d’après (Christodoulides et al 2009)).

47

b) La plasticité des adipocytes

Les adipocytes se sont révélés être des cellules hautement plastiques, capables de se convertir en

d’autres types cellulaires, représentant ainsi un nouvel outil dans la médecine régénérative. Un switch

entre les adipocytes bruns et blancs peut être observé en fonction des conditions physiologiques et des

signaux sous-jacents (Casteilla et al 2008). La conversion d’adipocytes blancs en adipocytes bruns-

like a été appelée « browning » et peut être induite par une exposition au froid et une stimulation β-

adrénergique (Himms-Hagen et al 1994) (Lee et al 2014). D’autres études ont mis en évidence la

capacité des adipocytes à se dédifférencier. Par une technique appelée « ceiling culture », les

adipocytes matures, obtenus à partir de tissus humains ou murins, se dédifférencient en cellules

fibroblastiques capables de proliférer et de se différencier en d’autres lignages. Nommés DFAT

(Dedifferenciated Fat Cells), ces adipocytes dédifférenciés perdent l’expression de marqueurs

adipocytaires et acquièrent des marqueurs de cellules souches mésenchymateuses, tels que RUNX2 et

SOX9 ; phénotype proche des ADSCs. In vitro, les DFAT sont capables de se différencier en

adipocytes, en chondrocytes, en ostéoblastes, en cardiomyocytes et en péricytes et représentent ainsi

une source cruciale de progéniteurs multipotents (Matsumoto et al 2008).

Une étude publiée par Gustafson et al. a mis en évidence que le traitement des adipocytes différenciés

à partir de la lignée 3T3-L1 par le ligand Wnt3a et le TNFα induit une dédifférenciation des

adipocytes. Ces cellules dédiffenciées adoptent un phénotype fibroblastique, caractérisé par une

diminution des marqueurs adipocytaires et des propriétés prolifératives et migratoires (Gustafson and

Smith 2010). L’équipe de MC. Rio a également mis en évidence que les cellules tumorales et les

adipocytes établissent un dialogue réciproque, induisant la sécrétion de la MMP-11 dans les

adipocytes péritumoraux, qui permet leur dédifférenciation en cellules de type fibroblastique. Cette

MMP régule aussi négativement l’adipogenèse (Motrescu et al 2008) (Andarawewa et al 2005).

c) Rôle physiologique des adipocytes

Du fait du manque de connaissances, le TA et les adipocytes ont longtemps été considérés comme des

acteurs passifs du métabolisme énergétique. Depuis une vingtaine d’années, de nouvelles fonctions des

adipocytes ont été identifiées, telles que la production de composants biologiquement actifs, qui font

des adipocytes de véritables cellules endocrines, ayant également un rôle actif sur le métabolisme

énergétique.

Fonctions métaboliques de l’adipocyte

Les adipocytes ont un rôle primordial dans le maintien de l’homéostasie énergétique. En effet, ils

permettent d’une part de stocker les lipides sous forme de TG (lipogenèse + synthèse des TG) et

d’autre part de les libérer dans l’organisme sous forme d’AG (lipolyse), qui peuvent aller dans le sang

48

vers le foie et les muscles, où ils seront utilisés afin de fournir de l’énergie, grâce à la β-oxydation en

fonction des besoins (Wilfling et al 2014).

La synthèse des TG. Il existe deux mécanismes différents permettant de synthétiser les TG. La

première et principale source est le captage des TG provenant de la circulation sanguine. Les TG sont

contenus dans des lipoprotéines (chylomicrons et VLDL (Very Low Density Lipoprotein)) et seront

hydrolysés par l’enzyme LPL (Lipoprotein Lipase) en AG, enzyme sécrétée par les adipocytes et

présente à la surface des cellules endothéliales. La deuxième source d’AG est la lipogenèse de novo,

permettant la formation d’AG à partir des précurseurs glucidiques. Dans les deux cas, il s’ensuit une

réaction d’estérification par greffe de trois molécules d’AG sur un squelette glycérol aboutissant à la

formation de TG. Le glycérol est obtenu à partir du glycérol-3-phosphate, formé par la glycolyse

(Proenca et al 2014). Chez les mammifères, le stockage des TG est assuré dans la vacuole lipidique de

l’adipocyte. Cette vacuole est composée plus précisément d’un corps de lipides neutres (triacylglycérol

ou des esters de cholestérol), entouré par une monocouche de phospholipides et séparé du cytosol par

une couche de protéines structurales, comme les protéines de la famille périlipine (Wilfling et al

2014). A la surface de cette vacuole lipidique, il y a également des enzymes (impliquées dans la

synthèse de phospholipides et de TG, les lipases et les régulateurs lipolytiques) et des co-activateurs.

Le stockage des TG est primordial, car en cas de diminution, une lipotoxicité peut avoir lieu par

libération de TG circulants. Ce processus est à l’origine de pathologies, telles que la résistance à

l’insuline. La synthèse des TG et la lipogenèse sont soumises à des régulations hormonales et

nutritionnelles importantes. Facteurs très importants, les catécholamines (via l’AMPc et la protéine

kinase dépendante de l’AMPc (PKA)) inhibent la lipogenèse ainsi que la synthèse et l’activité de la

LPL. A l’inverse, l’insuline est un facteur pro-lipogénique important et inducteur de la synthèse des

TG.

La lipolyse. Ce processus consiste en l’hydrolyse des TG présents dans la gouttelette lipidique, en AG

et glycérol. Les AG pourront ainsi être utilisés comme substrats énergétiques par la cellule, comme

médiateurs de la signalisation et pour la synthèse des membranes. Les AG sont pris en charge par des

transporteurs appelés FABPs cytosoliques, leur permettant de circuler dans la cellule et d’être adressés

à différents compartiments cellulaires (Storch and Thumser 2010). La lipolyse est réalisée

majoritairement par trois lipases : ATGL (Adipocyte Triglyceride Lipase), HSL (Hormonosensitive

Lipase ou LHS pour Lipase Hormonosensible) et MAGL (Monoacylglycerol Lipase). La LHS

représente l’étape limitante de la lipolyse. En effet, l’activité de la LHS est contrôlée de façon étroite

par phosphorylation réversible, réalisée par une PKA et PKG (protéine kinase dépendante de l’AMPc

ou du GMPc). Les périlipines interviennent probablement dans le maintien de la LHS. La lipolyse est

régulée de façon précise par de multiples signaux d’origine nerveuse, paracrine ou endocrine. Les

cathécholamines, en agissant par l’intermédiaire des récepteurs β-adrénergiques (β1, β2 et β3) (pro-

lipolytiques) ou bien sur les récepteurs α-adrénergiques (anti-lipolytiques) sont des effecteurs

49

puissants de la lipolyse. L’insuline est considérée comme le plus puissant inhibiteur physiologique de

la lipolyse, puisqu’elle stimule la phosphodiestérase, qui entraîne la diminution des taux intra-

cellulaires d’AMPc, et donc une diminution de l’activation de la PKA et de la LHS (Kitamura et al

1999). Les peptides natriurétiques (ANP (Atrial natriuretic peptide) et BNP (Brain natriuretic peptide))

exercent un effet lipolytique, via l’activation de récepteurs membranaires spécifiques et par un

processus indépendant à l’AMPc. De manière intéressante, Sangenes et al. ont démontré que les

peptides natriurétiques pouvaient également favoriser la lipolyse via une voie dépendante du GMPc

mais indépendamment de l’AMPc (Sengenes et al 2000).

Fonctions sécrétoires des adipocytes

Au cours de ces dernières années, des études ont mis en évidence les différents facteurs produits et

libérés par les adipocytes, permettant de définitivement asseoir leur nature multi-sécrétrice. En effet, la

découverte de la leptine en 1994 par le groupe de Friedman a profondément changé la vision générale

du rôle des adipocytes dans l’organisme. Cette hormone agit, via la circulation sanguine, sur la

régulation de la prise alimentaire, la dépense énergétique et le métabolisme énergétique (Zhang et al

1994). Depuis, de nombreux facteurs sécrétés par l’adipocyte, regroupés sous le terme d’adipokines,

ont été identifiés. L’intérêt croissant porté au rôle sécrétoire des adipocytes repose sur le nombre et la

variété des rôles biologiques des facteurs secrétés. Certaines adipokines sont libérées dans la

circulation sanguine et agissent à distance sur les grandes fonctions de l’organisme, comme la leptine

et l’adiponectine, qui sont considérées comme des hormones adipocytaires. D’autres ont un rôle plutôt

local, paracrine ou autocrine. Les fonctions générales des adipokines sont très vastes et comprennent :

la régulation du métabolisme énergétique (adiponectine, leptine, apeline ou résistine), du système

cardio-vasculaire (angiotensinogène, angiotensine, PAI1), du système immunitaire (protéines du

complément, cytokines pro-inflammatoires et chimiokines) et des fonctions plus générales (facteurs de

croissance). La plupart de ces molécules sont d’origine peptidique mais les adipocytes synthétisent

également des médiateurs lipidiques (prostaglandines, acide lysophosphatidique, stéroïdes …) (Poulos

et al 2010). Dans les années à venir, il est évident que d’autres adipokines seront découvertes.

L’expression des adipokines peut être altérée dans de nombreuses situations pathologiques, comme

l’obésité et le diabète (voir partie II) (Ouchi et al 2011).

De par leur fonction très particulière, leur omniprésence dans l’organisme et leur capacité sécrétrice,

les adipocytes représentent un constituant stromal abondant, qui peut influencer considérablement les

cellules tumorales aussi bien de manière endocrine que paracrine (Ouchi et al 2011) (Vona-Davis and

Rose 2007).

50

3-3) Adipocytes et cancer

a) Le tissu adipeux dans le stroma tumoral

Le microenvironnement tumoral est classiquement composé de cellules inflammatoires, de CAFs, de

progéniteurs, de cellules endothéliales et d’adipocytes compris dans une MEC. Parmi toutes ces

cellules (décrites dans les deux premières sous-parties), le rôle des adipocytes a été révélé depuis peu,

alors qu’ils représentent un composant cellulaire majeur, notamment dans le cancer du sein, de la

prostate, du côlon, du pancréas, de l’ovaire, de l’utérus, les leucémies et le mélanome (figure 13)

(Sheng and Mittelman 2014) (Laurent et al 2014) (Wang et al 2012). Dans le cas du cancer du sein, le

TA fait partie intégrante de la glande mammaire, ainsi une proximité s’établit d’emblée entre les

cellules tumorales et les adipocytes. C’est d’ailleurs dans ce modèle que l’interaction adipocytes et

cancer a été le mieux caractérisée. Dans le cas des autres cancers, la tumeur doit disséminer et donc

devenir invasive localement pour entrer en contact avec les adipocytes.

Figure 13. Marquages hématoxyline/éosine du front invasif de mélanome, de cancer colorectal, de la prostate et du sein. Lorsque les cancers deviennent invasifs, les cellules tumorales (rose-mauve) rencontrent le TA, majoritairement composé d’adipocytes (ronds blancs) (d’après Laurent et al., 2014, Obésité).

Le rôle du TA dans la progression tumorale a été abordé dans les années 1990 par l’équipe de ZQ

Cheng. Cette étude a mis en évidence que la co-injection intra-dermique de cellules tumorales murines

avec des fragments de TA mammaire ou ovarien dans la souris, induit une croissance tumorale et une

capacité métastatique plus importantes qu’en absence de TA (Elliott et al 1992). Dans les années 2000,

quelques études ont ensuite mis en évidence le rôle des adipocytes dans la prolifération des cellules

tumorales mammaires ; processus médié par les sécrétions adipocytaires (Amemori et al 2007)

51

(Manabe et al 2003) (Tokuda et al 2003). Depuis, un intérêt croissant portant sur le rôle des adipocytes

dans la progression tumorale a été observé. Ainsi, les adipocytes ont été incriminés pour leur rôle

promoteur de la croissance ou des métastases des tumeurs du sein, de la prostate, du côlon, de

l’estomac, du rein, de l’ovaire et des leucémies (Park et al 2014) (Nieman et al 2013). Outre les

adipocytes, le TA est composé d’ADSCs, qui ont également un rôle dans la progression tumorale. Les

molécules impliquées dans le dialogue paracrine entre adipocytes et cancer commencent à être bien

identifiées : cytokines pro-inflammatoires, protéines de la MEC ou de son remodelage et acides gras

libres (Nieman et al 2013) (Hefetz-Sela and Scherer 2013), ainsi que le rôle des adipokines endocrines

telles que la leptine et l’adiponectine. Une étude réalisée en 2005 a étudié les adipokines produites par

le TA mammaire dans un contexte tumoral, par une approche protéomique. Au total, 359 protéines ont

été répertoriées comme lui étant spécifiques, soulignant ainsi le rôle du TA dans la progression

tumorale (Celis et al 2005).

b) Rôle paracrine des adipocytes dans la progression tumorale : les CAAs

De par la proximité physique qui s’établit entre les cellules tumorales et les adipocytes, un rôle local

des adipocytes sur la progression tumorale a été spéculé via une interaction paracrine. Notre équipe a

été l’une des premières à valider l’hypothèse d’un dialogue bidirectionnel entre les adipocytes et les

cellules tumorales (Dirat et al 2011) (Dirat et al 2010) (Andarawewa et al 2005). Pour cela un système

de co-culture en 2D a été mis en place, dans lequel les cellules tumorales et les adipocytes sont séparés

par un insert poreux, permettant uniquement la diffusion des sécrétions des deux types de cellules,

sans établir de contact direct entre elles. Dans le modèle du cancer du sein, les cellules tumorales

préalablement co-cultivées avec des adipocytes présentent une augmentation de leurs capacités

invasives in vitro et in vivo. En effet, lorsque les cellules tumorales mammaires, préalablement co-

cultivées avec des adipocytes sont injectées dans la queue d’une souris syngénique, le nombre et la

quantité de métastases pulmonaires sont augmentés (Dirat et al 2011). D’autre part, les adipocytes co-

cultivés avec les cellules tumorales subissent d’importantes modifications morphologiques et

fonctionnelles et présentent un phénotype spécifique, caractérisé par trois grands types de

modifications qui font d’eux des cellules « activées » : une délipidation, une diminution des marqueurs

adipocytaires, la surexpression de protéines pro-inflammatoires (IL-6, IL-1β, PAI1) et la surexpression

de protéines de la MEC ou impliquées dans son remodelage. Ainsi, par analogie aux CAFs ou aux

TAMs, nous avons nommé ces cellules : CAAs pour Cancer-Associated Adipocytes (figure 14). Ces

CAAs, dont le phénotype a été défini in vitro, sont présents au niveau du front invasif des tumeurs

humaines et présentent les caractéristiques similaires à ce qui a été décrit in vitro. Nous avons mis en

évidence que l’IL-6 joue un rôle majeur dans l’augmentation de l’invasion induite par les adipocytes

(Dirat et al 2011). De façon intéressante, nous avons montré que l’expression (ARNm) de l’IL-6 est

corrélée avec la taille des tumeurs et à l’envahissement ganglionnaire mais non à l’expression des

récepteurs aux œstrogènes, du type ou du grade des tumeurs mammaires (Dirat et al 2011). Outre

52

l’inflammation, la deuxième caractéristique des CAAs est qu’ils expriment des protéines de la MEC et

de son remodelage. L’équipe de Philipp Scherer a mis en évidence qu’une expression importante de

collagène VI est retrouvée dans les adipocytes péritumoraux et cela favorise la croissance des tumeurs

mammaires in vivo (Iyengar et al 2005). Plus récemment, cette même équipe a montré qu’un fragment

de clivage du collagène VI, l’endotrophine, agit comme molécule de signalisation afin de promouvoir

la fibrose, l’angiogenèse et l’inflammation dans le microenvironnement des tumeurs mammaires,

favorisant ainsi l’agressivité tumorale et en particulier l’apparition de métastases (Park and Scherer

2012). Le groupe de Marie-Christine Rio a montré que les CAAs expriment également la MMP11 (ou

stromelysine 3), métalloprotéase qui favorise la progression tumorale, via sa capacité à cliver la MEC

et certains de ses substrats, comme le collagène VI (Andarawewa et al 2005) (Motrescu et al 2008). La

dernière caractéristique des CAAs est la perte des TG contenus dans les gouttelettes lipidiques. Dans

l’équipe, nous avons montré que les AGs libérés par les adipocytes sont transférés dans les cellules

tumorales mammaires et prostatiques (Laurent et Wang, en préparation). En dépit du fait que le

phénotype CAA a été principalement identifié dans le cancer du sein, un phénotype similaire a été

décrit dans le cancer de la prostate invasif, de l’ovaire, du côlon et le mélanome (Finley et al 2009)

(Nieman et al 2013) (Kushiro et al 2012). De plus, le transfert de lipides a été identifié dans le cancer

de l’ovaire et de la prostate (Nieman et al 2011). Dans le cancer de l’ovaire, les cellules tumorales

disséminent fréquemment dans l’omentum, région riche en adipocytes présente dans la cavité

péritonéale. Sous l’effet d’un processus de lipolyse, les adipocytes se délipident et les cellules

tumorales ovariennes accumulent des lipides, sous forme de gouttelettes. Ce transfert de lipides (sous

forme d’AG) est important pour la croissance de la tumeur dans l’omentum. Ces AG peuvent être

utilisés par les cellules tumorales comme constituants des membranes, comme facteurs de

signalisation mais aussi comme source d’énergie pour la tumeur à travers la β-oxydation au niveau des

mitochondries (Wang en préparation), (Nieman et al 2011). Ainsi, au même titre que le « reverse

warburg effect » dans les CAFs, une véritable symbiose métabolique se crée entre les adipocytes et les

cellules tumorales, fournissant à ces dernières l’énergie nécessaire à leur invasion vers des sites

métastatiques (Nieman et al 2013). La figure 14 résume le rôle des CAAs sur la progression tumorale

et leurs caractéristiques.

Dans l’équipe, nous avons également montré que les CAAs favorisent la radiorésistance des cellules

tumorales mammaires. Ces dernières, co-cultivées avec des adipocytes présentent une résistance plus

importante aux radiations ionisantes, associée à une diminution de la mort post-mitotique (Bochet et al

2011). Un rôle des adipocytes dans la chimiorésistance a également été suggéré mais les mécanismes

décrits seront détaillés dans la partie III de cette introduction. Outre le rôle des adipocytes dans l’effet

prolifératif et invasif des cellules tumorales, un rôle dans l’angiogenèse a également été soulevé. En

effet, les adipocytes sécrètent de manière importante des facteurs pro-angiogéniques, tels que le

VEGF. Dans un modèle de cancer du côlon, une étude récente a montré que le milieu conditionné

53

d’adipocytes favorise l’angiogenèse in vitro (modèle de la membrane chorioallantoïde d’un embryon

de poulet) (Xiao et al 2014). Dans ce cas, le dialogue bidirectionnel entre les cellules tumorales et les

adipocytes n’a pas été pris en compte. L’effet pro-tumoral observé est uniquement lié aux sécrétions

basales des adipocytes.

Figure 14. Rôle des CAAs dans la progression tumorale. Sous l’effet des sécrétions tumorales, les adipocytes se réorientent en CAAs, caractérisés par (i) une délipidation et une diminution des marqueurs adipocytaires, (ii) une surexpression de molécules pro-inflammatoires, (iii) une surexpression de protéines de la MEC ou de son remodelage. Les CAAs en retour favorisent la progression tumorale, en augmentant la croissance, l’invasion et la radiorésistance des cellules tumorales. Ces processus peuvent être médiés, par l’IL-6, le collagène VI (COLVI), les MMP11 et 9 et les acides gras (AG) provenant des adipocytes (d’après (Wang et al 2012)).

c) Rôle endocrine des adipocytes dans la progression tumorale

En plus d’avoir un rôle paracrine, certaines adipokines peuvent agir de façon endocrine, via le réseau

sanguin. En effet, les adipokines TNF-α, IL-6, IL-8, MCP-1 (CCL2) ont été impliquées dans la

progression tumorale (Inouye et al 2007) (Sartipy and Loskutoff 2003) (Nieman et al 2013). Dans

cette partie, seules les adipokines les plus connues dans le cancer seront détaillées, comme la leptine et

l’adiponectine.

La leptine. Produit du gène ob, la leptine est une hormone sécrétée majoritairement par les adipocytes,

certaines cellules épithéliales et récemment elle a aussi été identifiée dans les CAFs (Barone et al

2012). La leptine a initialement été décrite pour son rôle dans l’homéostasie énergétique et dans la

54

régulation de la prise alimentaire, comme facteur de satiété, au niveau du système nerveux central.

Ainsi, les souris mutées pour le gène de la leptine ob/ob ou son récepteur db/db présentent une obésité

très importante, associée à une insulino-résistance (Park et al 2011) (Ouchi et al 2011). Outre son rôle

dans le métabolisme énergétique, la leptine exerce un rôle important dans l’immunité, l’inflammation,

l’angiogenèse, l’hématopoïèse et la reproduction (Ouchi et al 2011) (Muoio and Lynis Dohm 2002).

Son activité est médiée, via son récepteur LEP-R transmembranaire, codé par le gène db. La liaison de

la leptine à son récepteur induit une cascade de signalisation en aval, notamment les voies de

signalisation JAK2-STAT3 (Janus Kinase 2 - Signal Transducer and Activator of Transcription 3),

MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase), PI3K-AKT (Phosphatidylinositol 3 Kinase – Protein

kinase B), impliquées dans différents processus cellulaires, comme la prolifération, la migration, la

survie des cellules ; voies identifiées comme pro-tumorales (Ando et al 2014). En effet, la leptine et

son récepteur sont surexprimés dans certains cancers, notamment le cancer du sein, où elle est associée

à des tumeurs de haut grade et métastatiques (Ishikawa et al 2004). Son rôle pro-tumoral est multiple :

il a été montré in vitro et in vivo que la leptine favorise la prolifération et la transformation des

cellules, l’angiogenèse, les voies anti-apoptotiques des cellules tumorales, diminue l’efficacité des

traitements et favorise l’EMT des cellules (Ando et al 2014). L’insuline, l’hypoxie, l’IGF-1, le TNF-α,

les C/EBPs et les œstrogènes stimulent la production de leptine dans les adipocytes et dans les cellules

cancéreuses (Schaffler et al 2007). De façon intéressante, la leptine est également capable d’activer le

récepteur aux œstrogènes. Ainsi, une corrélation a été trouvée dans le cancer du sein entre le niveau

d’expression du récepteur à la leptine et les tumeurs positives pour le récepteur aux œstrogènes (Ando

et al 2014). Elle est également surexprimée dans de nombreuses cellules tumorales : mammaires,

pancréatiques, gastro-intestinales, du poumon et leucémiques (Park et al 2014) (Hefetz-Sela and

Scherer 2013). La leptine a un rôle important dans l’obésité, comme le démontre le phénotype des

souris mutées pour son gène. De plus, sa synthèse et sa concentration plasmatique sont augmentées

proportionnellement à la masse de tissu adipeux, ce qui a pour conséquence une augmentation de la

leptine chez les patients obèses (Ando et al 2014). Toutefois, un lien direct entre l’augmentation de la

leptine et la survenue de tumeur dans un contexte d’obésité reste à être démontré (Park et al 2014)

(Hefetz-Sela and Scherer 2013).

L’adiponectine. L’adiponectine est quasi exclusivement synthétisée par les adipocytes et est présente

à des concentrations élevées dans le sang. Son expression est plus importante dans le TA sous-cutané

que dans le TA viscéral (Ouchi et al 2011). Son action est médiée via les récepteurs AdipoR1,

AdipoR2 et T-cadhérine (CDH13), localisés spécifiquement dans différents tissus. En effet, AdipoR1

est plutôt présent dans les muscles et AdipoR2 dans le foie. La liaison de l’adiponectine à ses

récepteurs active en aval les voies de signalisation dépendantes de l’AMPc, les MAPK et c-Jun (Park

et al 2011) (Vona-Davis and Rose 2007). Les rôles physiologiques de l’adiponectine sont multiples :

rôle protecteur contre l’obésité et les maladies cardiovasculaires (action anti-athérogène), diminution

55

de la résistance à l’insuline, sécrétion de cytokines anti-inflammatoires, augmentation de l’oxydation

des AG. La production d’adiponectine par les adipocytes est inhibée par des facteurs pro-

inflammatoires (TNF-α, l’IL-6), l’hypoxie et le stress oxydatif (Ouchi et al 2011). Il est maintenant

bien connu que les taux plasmatiques d’adiponectine sont inversement proportionnels à la masse de

TA. Ainsi, les patients obèses présentent des faibles taux d’adiponectine dans l’organisme. Le rôle de

l’adiponectine dans la progression tumorale est à l’heure actuelle encore controversé. Elle a tout

d’abord été négativement corrélée avec des cancers du sein post-ménopausiques, de l’endomètre, du

rein, du côlon, gastrique, pancréatique et les leucémies (Hefetz-Sela and Scherer 2013). Autrement dit,

les patients atteints de cancers présentent des taux plasmatiques très faibles d’adiponectine, suggérant

un rôle anti-tumoral (Park et al 2011). Cette action serait médiée par un effet inhibiteur sur la

croissance tumorale et anti-angiogénique via l’apoptose des cellules tumorales et des cellules

endothéliales (Brakenhielm et al 2004). Il a également été montré que l’adiponectine peut exercer une

action anti-proliférative sur les cellules tumorales en séquestrant des facteurs de croissance (Wang et

al 2005). Cependant, les cellules tumorales expriment les récepteurs AdipoR1 et AdipoR2 et les

cellules endothéliales associées aux tumeurs expriment le récepteur T-cadhérine à un niveau

important, soulignant la possibilité que l’adiponectine et ses récepteurs puissent favoriser la

progression tumorale (Hefetz-Sela and Scherer 2013). En effet, dans un modèle murin, qui développe

spontanément des tumeurs murines (MMTV-PyMT), l’absence de l’adiponectine est en faveur d’une

diminution de la croissance tumorale, associée à une diminution de l’angiogenèse. Alors qu’à des

stades tardifs, la perte de l’adiponectine est associée à des tumeurs plus agressives. Le mécanisme

moléculaire de l’adiponectine a été expliqué par une action angio-mimétique dans la vascularisation

tumorale (Landskroner-Eiger et al 2009). Un autre mécanisme d’action de l’adiponectine a été

identifié : ses récepteurs ont une action céramidase, qui convertit le céramide en sphingosine. La

sphingosine peut rapidement se convertir en sphingosine 1 phosphate qui a une action pro-tumorale et

pro-angiogénique avérée (Reynolds et al 2004).

d) Rôle des ADSCs dans la progression tumorale

Comme il a été souligné auparavant, le TA n’est pas seulement composé d’adipocytes. Il contient

d’autres composants comme les ADSCs, capables d’influencer la progression de la tumeur (Wang et al

2012). Dans le TA, les ADSCs (encore appelées ASCs) sont localisés entre les adipocytes et la MEC,

autour des petits vaisseaux sanguins (Tran et al 2012) (Bielli et al 2014). Le rôle physiologique des

ADSCs est de contribuer au turnover des adipocytes et d’assurer l’homéostasie vasculaire du TA

(Bielli et al 2014). Avant la découverte de la grande plasticité des ADSCs, les MSCs provenant de la

moelle osseuse étaient considérées comme la source majoritaire de cellules souches. Les ADSCs et les

MSCs présentent des grandes similitudes : le potentiel « cellules-souches », la capacité à se

différencier en cellules de différents lignages et des propriétés vasculogéniques (expression de

marqueurs péricytaires). Cependant, ces deux types de progéniteurs présentent des différences. La

56

capacité proliférative en culture des ADSCs est supérieure à celle des MSCs. Certains antigènes de

surface sont différents : La présence de CD34 à la surface des ADSCs n’a pas été rapportée sur les

MSCs, ce qui permet leur identification différentielle (Bielli et al 2014). Comme les adipocytes, les

ADSCs se retrouvent à proximité étroite des cellules tumorales, leur conférant un rôle actif dans la

progression tumorale. De plus, les signaux d’origine tumorale (cytokines pro-inflammatoires, facteurs

de croissance, chimiokines) permettent le recrutement de différents composants stromaux à distance,

comme les MSCs, alimentant la progression de la tumeur. Une étude réalisée par Kidd et al. a montré,

in vivo, que les ADSCs sont recrutés au niveau de la tumeur et favorisent la progression tumorale,

pour former le stroma vasculaire et fibrovasculaire (Kidd et al 2012). Ainsi, les ADSCs peuvent se

différencier en CAFs et participer à la réaction desmoplasique sous l’action des sécrétions tumorales

(voir partie sur les CAFs), cellules qui ont été appelées APDFs pour Adipose-Progenitors Derived

Fibroblasts dans la figure 15. Cette hypothèse a également été validée par une étude démontrant que

des ADSCs « activés » participent à la sécrétion de composants de la MEC et à sa contraction,

favorisant la rigidité observée dans certaines tumeurs (voir partie sur la MEC) et la progression de la

tumeur (Chandler et al 2011). Il a été rapporté que les ADSCs favorisent in vitro et in vivo la

croissance, la survie et les capacités migratoires et invasives des cellules tumorales (Pinilla et al 2009)

(Muehlberg et al 2009) (Welte et al 2012) (Walter et al 2009) (Wang et al 2012). Certaines molécules

ont été identifiées dans l’effet pro-invasif observé, comme l’IL-8, IL-6, CCL5, CXCL12 (Pinilla et al

2009) (Muehlberg et al 2009) (Welte et al 2012) (Walter et al 2009) (Wang et al 2012). Plus

récemment, il a été démontré que les ADSCs favorisent l’expansion des cellules souches cancéreuses

(CSCs) et induisent l’EMT des cellules cancéreuses, via une signalisation dépendante de PDGF

(expression de α-SMA, fibronectine et vimentine) (Devarajan et al 2012). Dans le cancer du sein, les

ADSCs provenant de TA viscéral humain favorisent la capacité métastatique de cellules tumorales et

l’angiogenèse in vivo, dans un modèle de xénogreffes (Rowan et al 2014). Les ADSCs favorisent

également la chimiorésistance des cellules tumorales, ce processus sera décrit ultérieurement dans la

partie III (Chen et al 2014). L’effet pro-tumoral des ADSCs a été observé dans les cancers du sein, de

la prostate, du poumon non à petites cellules, de l’ovaire, du pancréas et le glioblastome (Ji et al 2013).

Cependant, quelques études ont démontré un rôle plutôt anti-tumoral des ADSCs. Takahara et al. ont

montré que les ADSCs inhibent la prolifération et favorisent l’apoptose de lignées tumorales

prostatiques in vitro et in vivo (Takahara et al 2014). Des résultats similaires ont été observés par

Cousin et al., dans le cancer du pancréas (Cousin et al 2009). Le rôle des ADSCs dans la progression

tumorale doit être pris en considération, car la grande plasticité de ces cellules et leur capacité à

augmenter la vascularisation a été mis à profit par les chirurgiens plastiques dans la technique du

lipofilling (injection de TA +/- ADSCs dans le cas d’une reconstruction mammaire, suite à une

résection tumorale) (Wang et al 2013b).

57

Plus engagés dans le lignage adipocytaire, les pré-adipocytes peuvent également interagir avec les

cellules tumorales. Il a été rapporté que la différenciation adipocytaire est inhibée lors de la co-culture

de pré-adipocytes avec des cellules tumorales, processus dépendant du TNF-α et de l’IL-11 sécrétés

par les cellules tumorales (Meng et al 2001). Une étude publiée l’année dernière par l’équipe d’Olivier

de Wever, à laquelle j’ai eu l’occasion de participer, suggère que l’Oncostatine (OSM) sécrétée par les

leucocytes CD45+ de la fraction SVF du TA, isolé à partir de tumeur, favorise l’invasion, le

remodelage du cytosquelette d’actine des cellules tumorales mammaires et l’angiogenèse, via une

signalisation dépendante de STAT3 (Lapeire et al 2014) (voir Annexe). Cette étude suggère très

clairement que le TA dans sa globalité favorise la progression tumorale.

Figure 15. Rôle des ADSCs et des APDFs dans la progression tumorale. Sous l’effet des sécrétions tumorales, les ADSCs s’activent en APDFs (Adipose-progenitors derived fibroblasts), qui présentent un phénotype de CAFs et participent à la réaction desmoplasique. Les APDFs stimulent en retour la progression tumorale (d’après (Wang et al 2012)).

En conclusion, le rôle du microenvironnement tumoral est capital dans la progression du cancer.

La tumeur est capable de recruter et de modifier les cellules du microenvironnement à son profit.

Parmi les composants de ce microenvironnement, les CAFs ont un rôle majeur sur tous les aspects de

la progression tumorale. De nombreuses études ont clairement établi que sous l’effet des sécrétions

tumorales, d’autres cellules stromales peuvent se transdifférencier en CAFs et participer ainsi à la

réaction desmoplasique. Souvent oubliés, les adipocytes se sont révélés être des cellules originales,

douées de capacités métaboliques uniques et de capacités sécrétoires importantes. De plus, ce

sont des cellules plastiques, capables de s’adapter à leur environnement et se transdifférencier. Ainsi

un dialogue bidirectionnel s’établit entre les cellules tumorales et les adipocytes, à l’origine d’un

58

véritable cercle vicieux modifiant les cellules tumorales et les adipocytes. Etant donné les

caractéristiques particulières des adipocytes précédemment décrites, l’étude d’une transdifférenciation

des adipocytes en CAFs sous l’influence prolongée des sécrétions tumorales a été le premier objectif

de ma thèse. De plus, dans des conditions pathologiques comme l’obésité, un profond remaniement du

TA et des adipocytes est observé, pouvant potentialiser le dialogue néfaste qui s’instaure entre les

cellules tumorales et les adipocytes. Par conséquent, l’obésité et son lien avec le cancer seront l’objet

de la 2ème partie de cette introduction.

59

PARTIE II : L’OBESITE ET LE CANCER DU SEIN

1) Le cancer du sein

1-1) Epidémiologie et facteurs de risque

a) Epidémiologie

Le cancer du sein est le cancer féminin le plus répandu, en termes d’incidence sur l’ensemble des pays

du monde (25% des cancers) (InCA, www.e-cancer.fr). Il représente la cinquième cause de mort par

cancer (tous cancers confondus). A l’heure actuelle, il reste la première cause de mortalité chez la

femme par cancer dans les pays en voie de développement (14.3% au total soit 883 000 cas). Pendant

longtemps considéré comme la première cause de mortalité par cancer chez la femme dans le monde

entier, il est depuis peu passé à la deuxième place dans les pays développés (198 000 cas soit 15.4%),

après le cancer du poumon (globocan 2012 : globan.iarc.fr). En 2012, on estimait à 48 763 le nombre

de nouveaux cas en France. Actuellement, le cancer du sein touche 1 femme sur 8, dont la majorité est

âgée de 50 ans et plus. De manière isolée, ce cancer peut aussi apparaître chez l’homme (moins de 1%

des cancers du sein) (Vaysse et al 2013). Malgré une augmentation du nombre de nouveaux cas, on

constate depuis quelques années une baisse de la mortalité. Actuellement, le cancer du sein bénéficie

d’un pronostic relativement favorable à long terme, d’autant plus que son diagnostic et sa prise en

charge se font précocement. En effet, on estime à environ 89% le taux global de survie relative à 5 ans

après le diagnostic. Cette évolution inverse s’explique notamment par un dépistage organisé, qui

conduit à des diagnostics plus précoces et par l’amélioration des prises en charge (InCA, www.e-

cancer.fr).

b) Facteurs de risque

Le cancer du sein, comme la plupart des cancers, est une maladie multifactorielle, imputable à de

nombreux facteurs, comme le patrimoine génétique, l’âge, le statut hormonal, l’alimentation et

l’exposition à des cancérigènes environnementaux (Bernstein 2002). Cependant, les études

épidémiologiques suggèrent que la connaissance des facteurs de risques pourrait expliquer seulement

40% des cancers du sein (Kruk 2014).

- L’âge. L’âge demeure le principal facteur de risque de survenue de cancer du sein. En effet, 75% des

cancers du sein se déclarent après l’âge de 50 ans. Leur survenue est rare avant l’âge de 35 ans et reste

exceptionnelle avant 20 ans. L’âge moyen de diagnostic est de 61 ans (InCA, www.e-cancer.fr).

- Les antécédents familiaux. Il n’y a pas de définition unique de « cancers du sein familiaux », mais

on considère généralement que les critères suivants représentent un facteur de risque, nécessitant de

proposer une consultation génétique : s’il existe au moins trois cas de cancers du sein et/ou de l’ovaire

http://www.e-cancer.fr/




60

dans une famille, deux cas de cancers du sein dans une famille proche, avec au moins un diagnostiqué

avant l’âge de 50 ans, deux cas de cancers avant 40 ans, ou encore un cancer du sein et/ou de l’ovaire

chez un même patient. Les mutations les plus connues pour les cancers du sein sont les gènes BRCA1

et BRCA2 (Breast Cancer 1 and 2). Ces gènes sont à haute pénétrance, c’est-à-dire qu’une mutation /

délétion / réarrangement sur ces gènes confèrent un risque élevé de développer des cancers. En effet,

une mutation sur BRCA1 induit un risque de 52% en moyenne (26-69%) de développer un cancer du

sein avant l’âge de 70 ans et 47% en moyenne (29-60%) pour une mutation sur BRCA2 (Milne et al

2008). D’autres gènes à pénétrance modérée, voire faible ont été identifiés, comme CHK2 (Checkpoint

Kinase 2) ou ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) pour exemples (Shiovitz and Korde 2015).

- L’histoire hormonale et reproductive de la femme. La durée d’exposition prolongée des hormones

endogènes sur la glande mammaire augmente le risque de développement d’un cancer du sein. En

effet, des menstruations précoces (avant 12 ans) et une ménopause tardive (après 50 ans) sont

associées à un risque plus élevé (Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer (2012)).

En plus des hormones endogènes, la femme est très souvent exposée aux hormones exogènes, via les

contraceptifs oraux et les traitements substitutifs hormonaux, prescrits lors de la ménopause pour

pallier à la chute hormonale observée. Des études ont mis en évidence une corrélation entre la prise de

ces hormones exogènes et le risque de développer un cancer du sein. Concernant les contraceptions

orales, le risque est faible mais significatif (RR=1.08) (RR pour risque relatif) (Gierisch et al 2013).

D’autres facteurs en lien avec la vie reproductive de la femme ont été corrélés à un risque plus accru

de développer un cancer du sein. En effet, la nulliparité et l’âge tardif de la première grossesse sont

des facteurs de risque, surtout pour les cancers positifs pour les récepteurs hormonaux. A l’inverse,

l’allaitement est un facteur protecteur pour tous les types de cancers du sein surtout les cancers triples

négatifs (Anderson et al 2014).

- Le mode de vie et l’environnement. Un mode de vie sédentaire, caractérisé par une faible activité

physique et une alimentation riche en graisses animales et en sucres est considéré comme facteur de

risque du cancer du sein. Dans la continuité, l’obésité est également associée à une augmentation du

nombre de cancers chez la femme ménopausée et sera étudiée dans la partie obésité et cancer. La

consommation d’alcool (surtout chez la femme ménopausée) et de tabac est aussi corrélée à la

survenue de cancers du sein (Kruk 2014).

- Autres facteurs. Une hyperplasie bénigne atypique du sein, une densité élevée des seins à la

mammographie et l’exposition aux radiations ionisantes ont été également associées au

développement de cancers du sein (Kruk 2014).

61

1-2) Origine du cancer du sein

a) La glande mammaire

La glande mammaire est une glande exocrine, dont le rôle physiologique est la production de lait lors

de l’allaitement. L’épithélium mammaire est composé de cellules épithéliales luminales (à l’intérieur)

et de cellules myoépithéliales basales (à l’extérieur). Une MEC sépare l’épithélium du stroma, qui est

constitué majoritairement d’adipocytes. Parmi les cellules épithéliales, on distingue les cellules

canalaires et les cellules lobulaires. Les lobes de la glande mammaire sont divisés en lobules, eux-

mêmes constitués d’alvéoles formant les unités sécrétrices de la glande. Chaque alvéole s’ouvre sur un

canalicule, dans lequel est éjecté le lait. Les canalicules s’abouchent sur un canal intermédiaire, qui

rejoint un canal galactophore, permettant de drainer le lait jusqu’à l’extérieur du sein, via l’aréole

(Brisken 2002) (figure 16). Les cellules myoépithéliales possèdent des propriétés contractiles

(expression d’α-SMA) et présentent des marqueurs épithéliaux comme des cytokératines spécifiques.

De par leurs propriétés contractiles, ces cellules permettent l’acheminement du lait à travers les

canaux. Les cellules myoépithéliales sont aussi impliquées dans la morphogenèse de la glande

mammaire, en modulant la prolifération et la différenciation des cellules luminales et dans la

stabilisation structurale de la glande (Moumen et al 2011).

Figure 16. Structure de la glande mammaire. La glande mammaire est composée de cellules épithéliales (canalaires et lobulaires) et de cellules myoépithéliales, comprises dans un stroma, composé d’adipocytes, de fibroblastes, de vaisseaux sanguins et d’une MEC (adapté de (Radisky et al 2003)).

La glande mammaire est l’unique organe qui se développe majoritairement après la naissance (Fata et

al 2004). Elle est en perpétuel remaniement et passe par différents stades au cours des différentes

62

étapes de la vie : naissance, puberté, grossesse et lactation, involution et enfin ménopause. A la

naissance, le développement de la glande est inachevé ; elle est réduite à un réseau de canaux ramifiés.

A la puberté, la glande mammaire subit de profonds changements morphologiques, sous l’influence

des hormones sécrétées. Ainsi, les œstrogènes permettent la prolifération de la glande et la formation

de ramifications. Une augmentation du tissu conjonctif et de la vascularisation du TA mammaire est

aussi observée à ce stade, liée en partie à la sécrétion d’œstrogènes et de progestérone. Lors de la

grossesse et de l’allaitement, la glande mammaire termine son développement, par la mise en place de

nombreuses alvéoles. Cette étape se fait en deux temps : tout d’abord, les cellules lobulaires

prolifèrent, puis une augmentation de leur activité sécrétoire est observée afin de préparer la glande

mammaire à l’allaitement. De plus, les adipocytes subissent un processus de dédifférenciation en pré-

adipocytes et de transdifférenciation en cellules épithéliales sécrétrices (voir partie I) (Giordano et al

2014) (Wiseman and Werb 2002). Lors du sevrage, les alvéoles régressent et la glande mammaire

revient à son état initial ; ce processus est appelé involution. A la ménopause, il y a un déclin des

structures de la glande, qui sont remplacées par du TA (figure 16) (Wiseman and Werb 2002) (McGee

et al 2006).

b) Origine du cancer du sein

Les cancers les plus fréquents sont des adénocarcinomes : ils peuvent se développer à partir des

cellules épithéliales lobulaires ou canalaires, mais dans la majorité des cas, l’origine est l’épithélium

canalaire. On considère actuellement, que la majorité des cancers provient de cellules épithéliales

luminales. En effet, les cellules myoépithéliales seraient plutôt limitantes dans la progression de la

tumeur. Elles sont à l’origine de tumeurs bénignes et de cancers rares nommés myoépithélias (Sopel

2010). Cependant, des études récentes ont souligné des similitudes dans les marqueurs entre le cancer

du sein triple négatif basal-like et les cellules myoépithéliales, suggérant une origine commune.

D’autre part, ces cellules sont en interaction continue avec le stroma, propice à la progression de la

tumeur, comme nous l’avons vu dans la première partie. Ainsi, la contribution directe ou indirecte des

cellules myoépithéliales dans le développement de cancer du sein doit être davantage évaluée

(Moumen et al 2011).

Durant son cycle de développement, la glande mammaire subit des modifications morphologiques et

fonctionnelles, comparables au développement d’un cancer du sein. D’une part, la croissance et le

développement de la glande mammaire sont régulés au niveau systémique par des hormones

ovariennes ou hypophysaires et au niveau local par des interactions paracrines entre les cellules

épithéliales et les cellules stromales. Les cellules stromales, qui composent la glande mammaire sont

des adipocytes, des fibroblastes, des cellules inflammatoires et une MEC (figure 16). Les cellules

stromales sécrètent des facteurs de croissance, des composants de la MEC et de son remodelage afin

d’interagir avec le compartiment épithélial. Réciproquement, les cellules épithéliales influencent le

63

stroma, afin de l’adapter au développement de la glande et à leurs besoins. D’autre part, le

développement de la glande mammaire nécessite des étapes observées lors de la progression tumorale,

telles que l’invasion dans le stroma environnant, la prolifération cellulaire, la résistance à l’apoptose,

l’angiogenèse et le remodelage de la MEC (Wiseman and Werb 2002).

1-3) Classification des cancers du sein

Les cancers du sein représentent un groupe de maladies hétérogènes, qui diffèrent par leur

morphologie, leur comportement biologique ou leur évolution clinique (Chacon and Costanzo 2010).

Le diagnostic du cancer du sein repose sur un bilan initial, composé d’un examen clinique, d’une

imagerie par mammographie, souvent associée à une échographie et d’un examen

anatomopathologique sur prélèvement (par micro ou macro-biopsie). Ce bilan initial permet d’affirmer

le diagnostic et d’orienter la thérapeutique. Un bilan d’extension loco-régional et à distance est ensuite

recommandé afin d’évaluer la dissémination de la maladie.

a) Classification histopathologique actuelle

- Facteurs pronostiques. L’examen histopathologique permet de déterminer le stade de la tumeur, en

évaluant d’une part l’infiltration de la tumeur primaire et d’autre part son étendue dans l’organisme.

Pour la tumeur primaire, on distingue classiquement les carcinomes intra-canalaires ou in situ, les

carcinomes canalaires infiltrants (IDC pour Invasive Ductal Carcinoma) et les carcinomes lobulaires in

situ ou infiltrants (ILC). Les carcinomes in situ restent localisés dans l’épithélium mammaire.

Autrement dit, la tumeur est localisée dans les canaux ou les lobules et n’a pas franchi la membrane

basale. Les IDC correspondent à la majorité des cancers (70-80% des cas) et représentent des tumeurs

dures, à contour étoilé non régulier, présentant une distorsion architecturale et des microcalcifications.

D’autres formes plus rares sont retrouvées comme les carcinomes canalaires inflammatoires,

médullaires ou mucineux…

Des critères d’agressivité peuvent être établis permettant de déterminer le grade de la tumeur, comme

l’architecture tumorale (tissu plus ou moins différencié), la forme et la taille des noyaux ainsi que les

mitoses. Les cancers sont classés de I à III (du moins au plus agressif) (Boisserie-Lacroix et al 2013).

La classification TNM permet de déterminer la taille et l’agressivité de la tumeur. « T » correspond à

la tumeur primaire, « N » à l’envahissement ganglionnaire, qui représente le premier site métastatique

de la tumeur et « M » pour les métastases dans des organes périphériques. Les sites classiques de

métastases pour le cancer du sein sont les poumons, l’os et le foie.

- Facteurs prédictifs. Une détection immunohistochimique des récepteurs hormonaux (RH) est

réalisée en routine (RE pour récepteurs aux œstrogènes et RP pour récepteurs à la progestérone), ainsi

que la recherche de l’amplification de l’oncogène HER2 (pour Human Epidermal growth factor

64

Receptor 2). L’amplification HER2 est présente dans environ 18% des cancers du sein et est associée à

des cancers généralement négatifs pour les RH, particulièrement agressifs, mais de bon pronostic

depuis l’arrivée de la thérapie ciblée : trastuzumab (Boisserie-Lacroix et al 2013). Ces trois marqueurs

donnent des informations prédictives très importantes, car les patients RH+ peuvent bénéficier d’une

hormonothérapie et les patients HER2 d’une thérapie ciblée au trastuzumab (Herceptin®, anticorps

monoclonal dirigé spécifiquement contre HER2). Les cancers négatifs pour les RH et pour la

surexpression de HER2 sont appelés triple négatif ou TNBC (Triple Negatif Breast Cancer). Les

patientes atteintes de ce type de tumeurs ne bénéficient donc pas d’une hormonothérapie ou d’une

thérapie ciblée. Les tumeurs TNBC sont souvent associées à un mauvais pronostic avec des taux de

récidives importants et précoces augmentant le taux de mortalité (figure 17) (Vuong et al 2014)

(Yersal and Barutca 2014)

b) Classification moléculaire

Décrite par Perou, la classification moléculaire est basée sur le type morphologique des cancers et sur

l’expression différentielle de certains gènes (Perou et al 2000) (figure 17).

- Luminal A. Ces cancers représentent environ 50-60% des cancers du sein. Nommé « luminal A »

par similitude avec l’expression de protéines présentes dans les cellules épithéliales luminales, ce type

de cancer est caractérisé par une expression très importante des récepteurs aux œstrogènes (RE+), un

faible index de prolifération, un tissu assez différencié et une absence de surexpression de l’oncogène

HER2 (HER2-). Ils correspondent à des cancers canalaires ou lobulaires in situ, ou invasifs de grade I

ou II et sont plutôt de bon pronostic. Le taux de rechute de ces cancers est relativement faible. Les

cancers de type luminal A peuvent métastaser dans les os, mais rarement dans le foie, les poumons et

le cerveau (Boisserie-Lacroix et al 2013) (Yersal and Barutca 2014).

- Luminal B. Ce type de cancer concerne environ 20% des cancers du sein. L’expression du RE est

plus faible que pour les cancers de type luminal A. Ils sont caractérisés par des cellules, présentant un

index de prolifération élevé et une distorsion architecturale. L’oncogène HER2 est surexprimé dans

environ 30% des cas (Loi et al 2009). Cliniquement, ils correspondent à des cancers infiltrants de

grade II ou III et sont de pronostic moins favorable que le type luminal A (Boisserie-Lacroix et al

2013) (Yersal and Barutca 2014).

- HER2+. L’oncogène HER2 est un membre de la famille des tyrosine-kinases membranaires. Le

récepteur HER2 est codé par le gène HER2, localisé sur le chromosome 17q21 (Yersal and Barutca

2014). L’activation de ce récepteur peut se faire sans ligand, par homodimérisation ou

hétérodimérisation du récepteur avec d’autres récepteurs de la même famille (Yersal and Barutca

2014). Cela induit une cascade de signalisation en aval, telles que les voies de signalisation

PI3K/Akt/mTOR et ras/MAPK, impliquées dans la cancérogenèse (Fumoleau et al 2007). Ces tumeurs

65

représentent environ 10-15% des cancers du sein. Elles sont caractérisées par l’absence d’expression

des récepteurs hormonaux, une forte expression de l’amplicon HER2 et un index de prolifération

élevé. D’un point de vue clinique, les cancers HER2+ sont généralement des carcinomes invasifs de

grade II ou III agressifs. Environ la moitié des tumeurs HER2+ exprime le récepteur aux œstrogènes

mais généralement à des niveaux très bas (Yersal and Barutca 2014). Ce sous-type de cancer du sein a

un potentiel métastatique important vers le cerveau et le foie (Yersal and Barutca 2014). Présentant un

mauvais pronostic de base, ces tumeurs peuvent être traitées par la thérapie ciblée trastuzumab, ce qui

a considérablement amélioré le pronostic de ces patientes (Slamon et al 2001).

- Basal-like. La majorité des cancers basal-like sont des cancers triple négatifs, c’est-à-dire qu’ils

n’expriment ni les récepteurs hormonaux, ni l’oncogène HER2. Ils représentent environ 10 à 25% des

tumeurs mammaires et 56 à 85% des cancers triples négatifs. La caractéristique de ces cellules est

l’expression de cytokératines (5 - 6 et 17) et de la laminine. Ils sont nommés « basal-like » par

analogie d’expression avec les cytokératines des cellules basales myoépithéliales. Ces tumeurs sont

des carcinomes invasifs, de grade III, faiblement différenciés, très prolifératifs, présentant des zones de

nécrose tumorale et une forte réaction fibrotique intra-tumorale (Boisserie-Lacroix et al 2013). La

grande majorité de ces tumeurs est mutée pour p53. Les tumeurs basal-like sont de mauvais pronostic

et traitées classiquement par chimiothérapie conventionnelle (Perou 2010).

- Claudin-low. Ce type de cancer triple négatif a été récemment identifié. Leur nom « claudin-low »

est lié à la faible expression de gènes claudines, notamment la claudine 3, 4 et 7. Les claudines sont

des protéines impliquées dans les jonctions cellule-cellule, comme l’E-cadhérine. Ces tumeurs sont

proches des tumeurs basal-like mais possèdent toujours un infiltrat très important de cellules

immunitaires. De plus, les cellules tumorales possèdent des caractéristiques de cellules-souches et de

transition épithélio-mésenchymateuse. Ce sont des tumeurs de haut grade, très peu différenciées. Le

pronostic de ces tumeurs est aussi, voire plus, défavorable que les tumeurs basal-like (Perou 2010).

- Normal like. Ces tumeurs représentent environ 5-10% des carcinomes du sein. Elles ont été peu

caractérisées et certains chercheurs pensent qu’elles représentent un artefact technique, lié à une

contamination avec du tissu sain, durant l’analyse par puces à ARN. Elles expriment des gènes,

retrouvés dans le stroma mammaire (notamment du TA). Comme elles n’expriment ni ER, PR et

HER2, elles seraient classées dans les TNBC, mais ne sont pas considérées comme des basal-like, car

elles n’expriment pas les cytokératines et l’EGFR (Yersal and Barutca 2014).

66

Figure 17. Classification simplifiée des cancers du sein. En fonction de leur expression des récepteurs hormonaux (RH), de la surexpression de l’oncogène HER2, de leur morphologie, de l’expression de certaines protéines et de leur index de prolifération, les cancers du sein peuvent être classés en 5 sous-types : luminal A, luminal B, HER2+, Basal-like et Claudin-low. Cette classification moléculaire des cancers du sein permet d’orienter la thérapeutique. TNBC : cancers triple-négatifs, CK : cytokératines (d’après (Boisserie-Lacroix et al 2013) (Perou 2010) (Yersal and Barutca 2014)).

1-4) Traitements et limites des traitements des cancers du sein

a) Chirurgie et radiothérapie

A l’heure actuelle, la prise en charge thérapeutique du cancer du sein repose sur plusieurs méthodes,

telles que la chirurgie, la chimiothérapie, l’hormonothérapie, les thérapies ciblées et la radiothérapie,

qui seront pratiquées en fonction de l’étendue et l’agressivité de la maladie au diagnostic, ainsi que de

l’expression des récepteurs hormonaux et de HER2.

- La chirurgie. La chirurgie est très souvent le traitement de première intention. Dans le cas des

cancers in situ, la chirurgie seule (par tumorectomie ou mastectomie) peut suffire ou bien en

association avec la radiothérapie. Pour les carcinomes infiltrants, selon l’étendue de la maladie, la

chirurgie est soit conservatrice (tumorectomie) ou non, par ablation du sein (mastectomie totale). Une

expertise ganglion est réalisée soit par la technique du ganglion sentinelle si les tumeurs sont de petites

tailles soit par curage axillaire.

67

- La radiothérapie. Cette thérapie est plus souvent réalisée en adjuvant de la chirurgie. Elle consiste à

irradier le sein et / ou la paroi thoracique, associée plus ou moins aux chaînes ganglionnaires en

fonction de l’extension de la maladie. Cette technique a pour but d’entraver la division cellulaire et

d’induire la mort des cellules tumorales. Généralement, la dose totale est de 50 gy, délivrée en 25

fractions de 2 gy. Dans le cas de cancers in situ, la radiothérapie est indiquée uniquement après

chirurgie conservatrice. Concernant les cancers infiltrants, la radiothérapie est préconisée

systématiquement après chirurgie conservatrice et dans certains cas après mastectomie totale.

b) Chimiothérapie, hormonothérapie et thérapie ciblée

Dans la majorité des cas, le traitement débute par la chirurgie et selon l’agressivité des cancers

infiltrants, elle est suivie d’une chimiothérapie dite adjuvante, associée ou non au trastuzumab. Dans

certains cas, la chirurgie est précédée d’un traitement néoadjuvant, composé d’une chimiothérapie ou

d’une hormonothérapie. Tandis que l’hormonothérapie néoadjuvante est recommandée dans la plupart

des cas, la chimiothérapie néoadjuvante est de plus en plus utilisée pour tous les types de cancers du

sein. Le traitement néoadjuvant est utilisé pour diminuer la taille de la tumeur avant la chirurgie afin

d’augmenter le taux de chirurgies conservatrices et de permettre ainsi aux femmes de conserver leur

sein malgré un cancer invasif (Untch et al 2014) (van Nes et al 2009). Il est également utilisé en cas de

cancers agressifs, dont la priorité du traitement consiste à réduire le risque de diffusion

micrométastatique de la maladie par voie systémique. Pour les cancers du sein RH+ (luminal A et

luminal B), l’hormonothérapie peut être utilisée seule ou associée à la chimiothérapie (Miller et al

2014).

- L’hormonothérapie. Il existe deux catégories majeures de thérapie endocrine : les modulateurs

sélectifs du récepteur aux œstrogènes ou SERMs (Selective Estrogen Receptor Modulators) et les

inhibiteurs de l’aromatase. Les SERMs se lient aux récepteurs aux œstrogènes de manière compétitive

afin d’inhiber leur action. Le chef de fil de cette classe de médicaments est le tamoxifène. Les anti-

aromatases (AI) inhibent l’action de l’aromatase, qui convertit les androgènes circulants en

œstrogènes ; source majoritaire d’œstrogènes (Milani et al 2014). Les AI sont utilisés uniquement chez

la femme ménopausée et représentent dans ce cas le traitement de choix (Miller et al 2014).

- La chimiothérapie. La chimiothérapie ou thérapie anti-cancéreuse est le traitement du cancer,

destiné à induire la mort des cellules cancéreuses. Elle consiste à l’administration de molécules

thérapeutiques, encore appelées cytotoxiques, qui vont cibler les cellules à prolifération rapide, en

stoppant leur division cellulaire aboutissant à leur mort. Les cellules cancéreuses ne sont

malheureusement pas les seules cellules touchées. Certaines cellules saines peuvent être atteintes,

comme les entérocytes ou les cellules hématologiques, ce qui aboutit aux effets indésirables, observés

lors du traitement. Dans le cas des cancers HER2+, une association avec un inhibiteur de HER2

(trastuzumab) est indiquée. Pour plus d’efficacité, une association de plusieurs molécules

68

(polychimiothérapie) ayant des mécanismes d’action différents, est très souvent utilisée, selon le type

de tumeur, sa localisation, son stade et l’état du patient (Joensuu and Gligorov 2012) (Connolly and

Stearns 2013) (Miller et al 2014). La figure 18 résume les différentes associations classiquement

utilisées pour traiter un cancer du sein, ainsi que les molécules qui les composent et leur classe

thérapeutique. Les anthracyclines (doxorubicine, daunorubicine) et les taxanes (paclitaxel et

docetaxel) représentent les deux classes de cytotoxiques les plus utilisés dans le cancer du sein précoce

et agressif. Ils sont communément indiqués en traitement adjuvant ou néoadjuvant et / ou dans le cas

de cancers d’emblée métastatiques. Bien que les cancers du sein métastatiques ou MBC (Metastatic

Breast Cancer) soient incurables, l’utilisation de chimiothérapie systémique a montré un véritable

bénéfice, sur la prolongation de la survie des patientes, le retard de la progression de la maladie et

l’amélioration des symptômes (Andreopoulou and Sparano 2013) (Greenberg et al 1996). Parmi

l’arsenal thérapeutique dont on dispose, la doxorubicine, le paclitaxel et le 5-fluorouracile nous ont

particulièrement intéressés au cours de mes travaux de thèse et seront développés dans la partie III.

Figure 18. Résumé des différentes combinaisons thérapeutiques utilisées pour traiter un cancer du sein.

Chimiothérapie classique Composants Classe thérapeutique

docetaxel Taxanes

doxorubicine Anthracyclines

cyclophosphamide Agent alkylant / Moutarde azotée


cyclophosphamide Agent alkylant - Moutarde azotée

paclitaxel Taxanes



docetaxel Taxanes

docetaxel Taxanes


5-fluorouracile Anti-métabolite / Analogue pyrimidine




épirubicine Anthracyclines



méthotrexate Anti-métabolites / Analogue folate




paclitaxel Taxanes

trastuzumab Inhibiteur de HER2

docetaxel Taxanes

carboplatine Platines

trastuzumab Inhibiteur de HER2

CMF

AC + paclitaxel et trastuzumab

TCH

HER2-

HER2+

TAC

AC + paclitaxel

AC + docetaxel

TC

FAC

FEC

69

- Les thérapies ciblées. Comme leur nom l’indique, les thérapies ciblées sont dirigées contre une ou

plusieurs protéines précises, surexprimées dans certains types de cancers. L’avantage des thérapies

ciblées par rapport aux thérapies conventionnelles est le fait qu’elles vont viser spécifiquement les

cellules tumorales et présentent ainsi une toxicité moindre que les thérapies conventionnelles. En

pratique, elles sont classiquement utilisées en association à un traitement systémique par

chimiothérapie conventionnelle (figure 18). Le trastuzumab est un anticorps monoclonal humanisé qui

se lie au domaine extra-cellulaire du récepteur HER2. Ce traitement est utilisé en routine dans le

traitement des cancers du sein HER2+. Autre traitement ciblant HER2, le lapatinib est un inhibiteur

tyrosine kinase mixte de HER et de l’EGFR (Wang et al 2011).

c) Résistance à la chimiothérapie

La réponse à la chimiothérapie est très variable en fonction du type de cancers, de l’évolution de la

maladie et de l’état des patientes. Dans certains cas, des phénomènes de résistance aux traitements

apparaissent, accélérant la progression tumorale, le taux de rechutes et diminuant la survie des

patientes. En clinique, la résistance correspond à une progression de la maladie pendant le traitement

pour un cancer du sein métastatique ou à une rechute du cancer après une période de 6 à 12 mois suite

à un traitement adjuvant (Andreopoulou and Sparano 2013). Autrement dit, la chimiothérapie n’est pas

efficace sur la tumeur, car cette dernière survit voire progresse pendant le traitement, ou juste après le

traitement. La limite de 12 mois a été fixée, car des études ont montré que la rechute du cancer après

12 mois n’est pas liée à une résistance de la tumeur au traitement, car l’utilisation de la chimiothérapie

se montrera à nouveau efficace. (Castiglione-Gertsch et al 1997) (Guo et al 2011). Les taux de réponse

d’un cancer du sein métastatique suite à un traitement en première ligne, composé d’anthracyclines et

de taxanes est de 30 à 70 % (Coley 2008).

Certains sous-types de cancers sont connus pour être plus résistants que d’autres à la thérapie. En effet,

les cancers du type luminal B présentent une résistance plus importante à l’hormonothérapie que les

cancers du type luminal A. Ils seraient également plus résistants à la chimiothérapie néoadjuvante

(doxorubicine / paclitaxel) que les cancers HER2+ et basal-like. Cependant, ils répondraient mieux à

la chimiothérapie (5-fluorouracile / doxorubicine / cycloposphamide) que les cancers luminal A

(Rouzier et al 2005) (Yersal and Barutca 2014). De par leur statut HER2-, RH-, les cancers du sein

triple-négatifs ne peuvent bénéficier que de la chimiothérapie. Cependant, des études ont mis en

évidence le fait que les cancers TNBC présentaient une meilleure réponse à la chimiothérapie que les

autres types de cancers du sein (au moins pour les patientes ne présentant pas d’atteinte ganglionnaire)

(Colleoni et al 2010). Certaines études ont montré que la chimiothérapie néoadjuvante utilisée dans

des cas de TNBC présente deux types de réponses. Une minorité de patientes présente une réponse

complète et un pronostic très favorable. A l’inverse, une majorité de patientes a une maladie résiduelle

après traitement ainsi qu’un mauvais pronostic. Ces données suggèrent qu’un sous-groupe de TNBC

70

est extrêmement sensible à la chimiothérapie mais la grande majorité présente une résistance et un

pronostic incertain (Liedtke et al 2008). Les mécanismes de résistance à la chimiothérapie

conventionnelle, notamment la doxorubicine seront décrits dans la partie III. Les tumeurs HER2+

peuvent aussi développer une résistance aux thérapies ciblées, mais les mécanismes expliquant cette

résistance ne seront pas étudiés ici, au même titre que les mécanismes de résistance à

l’hormonothérapie.

2) L’obésité : un facteur de risque et un facteur affectant le pronostic du cancer du sein

L’obésité est une maladie chronique, qui existe dans les pays développés et dans les pays en voie de

développement et qui touche aussi bien les enfants que les adultes (van Kruijsdijk et al 2009). Elle est

maintenant considérée comme un problème de santé publique majeur. L’obésité est souvent associée à

un syndrome métabolique, à l’origine d’un grand nombre de maladies, telles que le diabète de type II

et les maladies cardiovasculaires. De plus, l’obésité est à l’origine de l’augmentation de l’incidence de

nombreux cancers et représente aussi un facteur de mauvais pronostic pour certains cancers.

2-1) Généralités

L’obésité est définie comme une accumulation anormale ou excessive de graisse. La cause

fondamentale de surpoids et d’obésité est une balance énergétique positive, dans laquelle les apports

excèdent les dépenses énergétiques pendant une durée prolongée, conduisant à l’accumulation de

graisse dans l’organisme et la prise de poids. Cependant, l’obésité est une maladie complexe, qui est la

conséquence de nombreux facteurs, tels qu’une prédisposition génétique, des facteurs

environnementaux, l’alimentation et le mode de vie. En pratique, elle est classiquement définie sur la

base de l’indice de masse corporelle (IMC), calculé par le rapport du poids sur la taille au carré (en

kg/m2). Il existe cinq classes d’IMC, regroupées dans la figure 19.

Figure 19. Classification du statut pondéral en fonction des valeurs de l’IMC.

71

Selon l’OMS, le nombre de cas d’obésité a plus que doublé depuis 1980. En 2014, dans le monde, plus

d’1.9 milliard d’adultes étaient en surpoids et 600 millions étaient obèses. Globalement, environ 13%

(11% des hommes et 15% des femmes) de la population adulte mondiale étaient en surpoids ou obèses

en 2014. Aux Etats-Unis, la prévalence des sujets obèses est de 30% et 65% des sujets sont en

surpoids (Sundaram et al 2013). Le surpoids et l’obésité concernent également près de 42 millions

d’enfants de moins de 5 ans. De plus, le surpoids et l’obésité sont les premiers facteurs de risque de

décès au niveau mondial. Environ 3.4 millions d’adultes en meurent chaque année : 44% liés au

diabète, 23% liés aux cardiopathies ischémiques et de 7 à 41% liés à certains cancers (OMS :

www.who.int). L’obésité associée à une répartition androïde (liée à l’accumulation de TG au niveau

du ventre) est plutôt à l’origine de maladies cardio-vasculaires (hypertension artérielle et insuffisance

coronarienne) et métaboliques (diabète de type II et dyslipidémies). A l’inverse, l’obésité associée au

type gynoïde (excès de graisse au niveau des cuisses) est plutôt liée à des complications mécaniques

(arthrose) ou veineuses (thrombose, varice).

2-2) Les modifications des tissus adipeux par l’obésité

Comme mentionné dans la partie I, il n’existe pas un TA mais plusieurs, dont les caractéristiques

morphologiques et sécrétoires peuvent varier. De nombreuses études ont été réalisées sur les

modifications du TA viscéral, induites par l’obésité mais peu sur le TA mammaire.

a) Le TA sous-cutané et viscéral

Au cours de la prise de poids et de l’obésité, les adipocytes subissent des changements

morphologiques et fonctionnels importants. L’excès de stockage des lipides provoque une

augmentation de la taille des adipocytes (hypertrophie) et de leur nombre (hyperplasie). Deux cas de

figures sont alors observés. Dans la majorité des cas, l’expansion du TA est associée à des

complications métaboliques. Cependant, dans certaines situations, aucune comorbidité n’est associée à

la prise de poids. Ici, l’excès de stockage des lipides entraîne une expansion du TA, via une légère

hypertrophie des adipocytes pré-existants mais surtout via une augmentation du recrutement des

progéniteurs adipocytaires. Ainsi l’oxygénation, l’angiogenèse et le remodelage de la MEC du TA

(qui semble être plus plastique), sont relatifs à l’expansion du TA (figure 20). Ce type de patients,

appelés « metabolic healthy obeses » (MHO) présentent peu de complications métaboliques liées à

leur obésité (Seo and Rhee 2014). A l’inverse, l’expansion pathologique du TA est liée

majoritairement à une hypertrophie massive des adipocytes pré-existants, à une angiogenèse limitée

suivie d’une hypoxie, à une inflammation importante ainsi qu’une fibrose. Tous ces processus mènent

à un stress oxydatif et un stress du réticulum endoplasmique (RE), à l’origine d’un TA dysfonctionnel

(Hefetz-Sela and Scherer 2013) (Sun et al 2011) (figure 20). Les adipocytes dysfonctionnels

présentent des capacités métaboliques moins efficaces et un profil sécrétoire modifié. De nombreuses

http://www.who.int/

72

études ont mis en relation un TA dysfonctionnel avec l’apparition de complications métaboliques,

comme la résistance à l’insuline, le diabète de type II et les maladies cardiovasculaires. Ce TA

pathologique serait également impliqué dans la progression tumorale, notamment de par des sécrétions

inappropriées (voir partie obésité et cancer) et va exclusivement nous intéressés par la suite (Hefetz-

Sela and Scherer 2013). Sécrétée par les cellules β du pancréas, l’insuline est la principale hormone

impliquée dans l’homéostasie glucidique. Elle possède un rôle majeur dans l’utilisation des substrats

énergétiques glucidiques et lipidiques. Son action est médiée via sa liaison à son récepteur à activité

tyrosine kinase, qui active en aval, des voies de signalisation, comme la voie PI3K et la voie des

MAPK. Globalement, lors d’un apport calorique trop important, une insulino-résistance est observée,

liée à des phosphorylations multiples inhibitrices, aboutissant à la perte de l’activité du récepteur à

l’insuline (IR). L’insuline s’accumule dans le sang, ainsi que le glucose (les cellules sont incapables de

capter le glucose), à l’origine d’un diabète de type II. Les AG libres, le glucose, les cytokines pro-

inflammatoires (IL-6, TNF-α) ainsi que la leptine peuvent être à l’origine de ces phosphorylations et

donc de l’insulino-résistance observée.

Figure 20. Expansion du TA « saine » et pathologique lors de l’obésité. (A) L’expansion saine du TA est liée à un recrutement important des progéniteurs adipocytaires, une réponse angiogénique et un remodelage de la MEC appropriés à l’expansion du TA. (B) L’expansion pathologique du TA est associée à une hypertrophie massive des adipocytes pré-existants, une angiogenèse limitée, une hypoxie, une fibrose et une inflammation importante (d’après (Sun et al 2011)).

L’inflammation du TA générée par l’obésité est un paramètre important. On considère que le TA des

sujets obèses est dans un état inflammatoire chronique, dit de « bas-bruit » (Laurent et al 2014). Au fur

et à mesure de l’expansion du TA, une production de molécules chimio-attractrices, notamment CCL-

2, est observée. La sécrétion de chimiokines permet le recrutement de cellules inflammatoires au sein

73

du TA (surtout des macrophages de type M1), elles-mêmes responsables de la sécrétion de

chimiokines et de cytokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-6 et le TNF-α, maintenant le TA dans

un état d’inflammation chronique. L’infiltration de macrophages est plus présente dans le TA viscéral

que dans le TA sous-cutané, ce qui explique pourquoi le TA viscéral est plus impliqué dans l’insulino-

résistance (Ouchi et al 2011). Une infiltration des lymphocytes T, notamment les lymphocytes T

CD8+, est également retrouvée dans le TA obèse (Dalmas et al 2011). Les adipocytes peuvent grossir

jusqu’à une taille critique, au-delà de laquelle ils meurent par nécrose et libèrent les AG libres (Ford et

al 2013). Ces adipocytes nécrotiques sont pris en charge et donc entourés par les macrophages,

formant une structure en couronne, appelée CLS (Crown-Like Structures) (Ouchi et al 2011) (Cinti et

al 2005). La présence de CLS est admise comme étant une caractéristique de l’inflammation associée à

l’obésité. Les CLS seraient 30 fois plus nombreux dans le TA de sujets obèses que dans le TA de

patients normopondéraux. De plus, la densité en CLS est positivement corrélée à la taille adipocytaire

dans le TA viscéral et dans le TA sous-cutané (Cinti et al 2005). Les adipocytes inflammatoires, dont

l’activité lipolytique est élevée, libèrent localement des AG qui stimulent la voie TLR4/NF-κB (Toll-

Like Receptor 4 / Nuclear Factor kappa B) dans les macrophages, contribuant ainsi à une boucle

paracrine délétère entre les adipocytes et les macrophages. L’inflammation présente dans le TA est

également le résultat de l’hypoxie, qui aboutit aussi au recrutement des macrophages au sein du TA

(Dalmas et al 2011). L’hypertrophie des adipocytes entraîne rapidement un appauvrissement du TA en

oxygène. Cette hypoxie induit des cascades de régulation en aval, qui modifient notamment la MEC et

le processus d’angiogenèse (Sun et al 2013). Bien que les adipocytes soient capables d’élaborer un

réseau sanguin, par la sécrétion de molécules pro-angiogéniques, l’angiogenèse du TA obèse est très

souvent insuffisante, le maintenant dans un état hypoxique (Hosogai et al 2007). Lors de l’expansion

du TA, un remodelage de la MEC est nécessaire. En effet, les adipocytes sont entourés par un réseau

de protéines matricielles relativement flexible, afin de s’adapter à une expansion rapide au cours d’un

apport énergétique excessif ou à une réduction drastique lors d’une restriction calorique (Park et al

2014). Lors d’une expansion importante du TA, une augmentation de la fibrose intersticielle est

observée, aboutissant à la perte de la flexibilité de la MEC, ainsi qu’au dysfonctionnement des

adipocytes. Cette fibrose est liée d’une part à l’inflammation et l’hypoxie et d’autre part à la

modification du profil sécrétoire des adipocytes obèses. Ainsi, elle est le résultat d’un déséquilibre

entre la synthèse des composants de la MEC, tels que les collagènes I, III et VI et une dégradation

insuffisante de ces protéines (Sun et al 2013). La fibrose générée dans le TA dysfonctionnel a

également des conséquences sur l’angiogenèse du TA. En plus d’induire une rigidité des vaisseaux

sanguins, la MEC peut directement promouvoir ou inhiber le processus d’angiogenèse, via des

cascades de signalisation en aval. C’est le cas du collagène VI qui est capable d’inhiber le

bourgeonnement des nouveaux vaisseaux sanguins, empêchant à terme la bonne vascularisation du

TA.

74

Comme nous l’avons vu dans la partie I, les adipocytes sécrètent de nombreuses molécules, appelées

adipokines, telles que des protéines impliquées dans la synthèse de la MEC et son remodelage, des

cytokines pro-inflammatoires, des chimiokines, des facteurs de croissance, des hormones ainsi que des

métabolites lipidiques, capables d’influencer de nombreux processus dans l’organisme. De

nombreuses études ont démontré que les adipocytes dysfonctionnels présentent des profils sécrétoires

différents, variant en fonction des TA (figure 21) (Laurent et al 2014) (Ouchi et al 2011) (van

Kruijsdijk et al 2009) (Park et al 2014). Ainsi, dans le TA viscéral de sujets obèses, la leptine, PAI-1,

les cytokines pro-inflammatoires, l’HGF et le VEGF sont augmentés. A l’inverse, l’adiponectine est

plutôt diminuée aussi bien dans le TA viscéral que dans le TA sous-cutané. Dans le TA sous-cutané

obèse, la leptine, PAI-1, l’HGF et le VEGF sont augmentés et les cytokines pro-inflammatoires varient

peu (Laurent et al 2014). De plus, il a été rapporté que les cellules endothéliales isolées de TA viscéral

de patients obèses présentent une plus forte expression des gènes relatifs à l’inflammation et

l’angiogenèse que les cellules endothéliales isolées du TA sous-cutané (Villaret et al 2010). Ces

résultats suggèrent, là encore, que le TA viscéral est plus inflammatoire et associé aux complications

métaboliques inhérentes à l’obésité (Hefetz-Sela and Scherer 2013).

Figure 21. Adipokines sécrétées par le TA viscéral et le TA sous-cutané dans un contexte normopondéral et d’obésité. La taille des flèches, ainsi que l’intensité de coloration indiquent des variations positives des concentrations en adipokines (d’après (Laurent et al 2014)).

b) Le TA mammaire

A l’inverse du TA viscéral, le TA mammaire (MAT) obèse est très peu décrit. Cependant, une étude

réalisée par Subbaramaiah et al. a montré que les souris obèses présentent des adipocytes nécrotiques

entourés de macrophages, formant les CLS dans le TA viscéral et dans le TA mammaire, démontrant

des similitudes entre ces deux TA, quant à l’inflammation induite par l’obésité. De plus, la présence de

75

CLS, dans le TA mammaire des souris obèses, est associée à l’activation de la voie NF-κB et à une

augmentation de l’expression de médiateurs inflammatoires (Subbaramaiah et al 2011). Cette même

équipe a montré peu après, que les résultats obtenus chez la souris pouvaient être transposés chez la

femme. En effet, la présence de CLS a été retrouvée dans le TA mammaire des femmes pré et post-

ménopausées (dans un contexte tumoral, après mastectomie). De manière intéressante, la sévérité de

l’inflammation (définie par un index CLS) est corrélée positivement à l’IMC et à la taille adipocytaire

des patientes (Morris et al 2011). En parallèle, Sun et al. ont montré, dans des conditions non

tumorales, que le TA mammaire obèse est inflammatoire, caractérisé par la présence de macrophages,

cytokines et chimiokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-6, IL-8 et CCR5 (Sun et al 2012).

Récemment, une étude publiée par Arendt et al. a confirmé que la glande mammaire de souris obèses

est enrichie, d’une part en macrophages (notamment de macrophages de type M1 et de façon moindre

de macrophages de type M2) et d’autre part en cellules endothéliales et en péricytes. Ces travaux

suggèrent, que le MAT de souris obèses présente aussi une augmentation de l’angiogenèse (Arendt et

al 2013). L’équipe de Philipp Scherer a également mis en évidence que l’endotrophine (ETP), qui est

un fragment de clivage de collagène VI, est augmentée dans la glande mammaire des souris obèses,

suggérant la présence d’une fibrose importante (Park and Scherer 2012). L’ensemble de ces études

suggère que le TA mammaire, au même titre que le TA viscéral, est modifié dans un contexte

d’obésité, mais d’autres études sont nécessaires afin de caractériser la glande mammaire chez la souris

et chez la femme obèses.

2-3) Modèles d’études de l’obésité in vitro

Un certain nombre de modèles ont été mis au point in vitro afin d’étudier les mécanismes moléculaires

de l’adipogenèse. Pour des raisons de faisabilité, les lignées murines de pré-adipocytes 3T3-L1 et 3T3-

F442A sont très souvent utilisées. Ces lignées présentent une morphologie fibroblastique et sont déjà

engagées dans le lignage adipocytaire. Leur différenciation en adipocytes matures se fait in vitro par

ajout de divers stimuli adipogéniques pour la lignée 3T3-L1 et seulement de l’insuline pour la lignée

3T3-F442A, qui est plus engagée dans la différenciation adipocytaire (Wang et al 2012). Les

adipocytes matures peuvent également être obtenus par différenciation ex vivo des ADSCs provenant

de la SVF du TA (Dirat et al 2011). Récemment, la lignée humaine d’ADSCs : hMAD a été établie et

caractérisée (Lafontan 2012). Bien que ces modèles partagent beaucoup de similitudes avec les

adipocytes primaires (stockage des TG, expression des marqueurs spécifiques des adipocytes, réponse

aux facteurs lipogéniques et lipolytiques), ils ne peuvent en aucun cas mimer l’hypertrophie et les

modifications sécrétoires induites par l’obésité. Afin de garder le phénotype obèse, les explants de TA

obèses peuvent être utilisés. L’inconvénient de travailler sur le TA total est le fait qu’on ne peut pas

distinguer les effets des adipocytes, des effets de la SVF, qui contient un grand nombre de cellules

actives (voir partie I). De plus, ces explants vont rapidement présenter des altérations, dues à une

76

mauvaise oxygénation et un manque de nutriments (Gesta et al 2003). On considère que la culture

d’un explant ne doit pas dépasser 48h (Wang et al 2012). Pour étudier le rôle spécifique des adipocytes

dans un contexte d’obésité, les adipocytes peuvent être isolés par digestion du TA sous l’action de

collagénases. Ces adipocytes primaires ne peuvent pas survivre plus de 24h (Lafontan 2012). Pour

cultiver les adipocytes sur des temps plus longs, ils devront être intégrés dans des matrices en 3D, à

base de collagène I ou d’hydrogel, développé par le groupe de Karine Clément (brevet numéro

CA2800667A1). Ces modèles de matrice en 3D représentent, à ce jour, les modèles les plus

prometteurs pour l’étude des adipocytes dans un contexte d’obésité.

3) Obésité et cancer du sein

3-1) Epidémiologie

a) Obésité et incidence des cancers

De nombreuses études épidémiologiques ont établi un lien entre obésité et cancer. En effet, l’obésité

est à l’origine de l’augmentation de l’incidence de certains cancers, autrement dit de l’initiation du

développement d’un cancer. Une méta-analyse incluant 282 137 patients, a établi un lien entre

surpoids / obésité et une augmentation du risque de développer un cancer. Ces données sont

regroupées dans la figure 22. Ainsi, l’obésité représente un facteur de risque pour les cancers de

l’œsophage, rénal, de l’endomètre, du côlon, de la thyroïde, du sein chez la femme post-ménopausée,

du pancréas (femme), les leucémies et le mélanome (homme) (Renehan et al 2008) (Bhaskaran et al

2014).

Figure 22. IMC et risques relatifs de développer des cancers. Ces données proviennent de la méta-analyse de Renehan et al. (Renehan et al 2008). ND = Non déterminé. * p≤0.05, ** p<0.01 et *** p<0.0001 (d’après (Hefetz-Sela and Scherer 2013)).

Type de cancers Hommes Femmes

Sein ND

post-ménopause 1,12 (***)

pré-ménopause 0,92 (**)

Colon 1,24 (***) 1,09 (***)

Endomètre 1,59 (***)

Oesophage 1,52 (***) 1,51 (***)

Rein 1,24 (***) 1,34 (***)

Leucémie 1,08 (**) 1,17 (*)

Mélanome 1,17 (**) 0,96 (*)

Myélome multiple 1,11 (***) 1,11 (***)

Lymphome non hogkinien 1,06 (***) 1,07 (*)

Pancréas 1,07 1,12 (*)

Prostate 1,03

Rectum 1,09 (***) 1,02

Thyroïde 1,33 (*) 1,14 (**)

Foie 1,24 1,07

77

Concernant le cancer du sein, l’obésité favorise le développement du cancer chez la femme

ménopausée mais pas chez la femme pré-ménopausée. L’obésité serait même un facteur protecteur

vis-à-vis du cancer du sein chez la femme pré-ménopausée. Ceci s’expliquerait par la présence de

nombreux cycles menstruels anovulatoires chez la femme obèse et donc une moindre exposition aux

œstrogènes endogènes (Xia et al 2014). Une méta-analyse très récente a confirmé ces données et a

suggéré que le risque de développer un cancer du sein chez la femme ménopausée est proportionnel à

l’IMC mais de manière non linéaire (IMC 25 kg/m2: RR=1.02, IMC 30: RR=1.12 et IMC 35:

RR=1.26) (Xia et al 2014). L’obésité a également été associée à certains des sous-types du cancer du

sein. Une étude réalisée par Suzuki et al. suggère fortement que l’obésité chez la femme ménopausée

est associée à un risque de 82% de développer un cancer ER+PR+. Ce risque existe aussi chez la

femme pré-ménopausée mais à moindre niveau (20% de risque) (Suzuki et al 2009). Cependant,

certaines études s’accordent pour dire que l’obésité est un facteur de risque pour les TNBC mais

seulement chez les femmes pré-ménopausées (Pierobon and Frankenfeld 2013) (Vona-Davis et al

2008). Pour conclure, l’ensemble de ces études suggère qu’il y a bien un lien entre obésité et incidence

du cancer du sein chez la femme ménopausée, surtout pour le sous-type ER+PR+ (sous-type

majoritairement présent chez les femmes ménopausées). Cependant, il existe une certaine controverse

quant au lien entre obésité et incidence du cancer du sein chez la femme pré-ménopausée.

b) Obésité et pronostic des cancers

Outre l’augmentation du nombre de cancers, l’obésité est également associée à un mauvais pronostic

de nombreux cancers, tels que les cancers de l’œsophage, du côlon, du foie, du pancréas, du rein, de la

prostate, de l’estomac, de l’ovaire, de l’utérus, du col de l’utérus, du sein et le mélanome (Park et al

2014). Une large cohorte sur 900 000 patients, publiée par the New England Journal of Medicine a

établi pour la première fois, qu’aux Etats-Unis, environ 14% des décès par cancer chez l’homme et

20% chez la femme seraient dus à l’obésité (Calle et al 2003). Une étude réalisée par l’institut Curie en

1999 sur une large cohorte de 14 702 patientes a mis en évidence le fait que l’obésité est associée à un

mauvais pronostic pour tous les cancers du sein : mauvais pronostic caractérisé par un cancer avancé

au diagnostic, une diminution de la survie sans maladie et de la survie globale, une augmentation de

l’apparition de métastases et une augmentation des rechutes (Majed et al 2008). Ces résultats ont été

confirmés par d’autres études, notamment dans une, publiée par Ewertz et al. Cette étude suggère que

les patientes obèses présentent un cancer plus avancé au diagnostic, un risque de développer des

métastases après 10 ans augmenté de 46% et un risque de mourir d’un cancer du sein augmenté de

38%. De plus, cette étude suggère que la chimiothérapie (cyclophosphamide, méthotrexate, 5-

fluorouracile, epirubicine) et l’hormonothérapie (tamoxifène) sont moins efficaces après 10 ans chez

les patientes présentant un IMC > 30 kg/m2 (Stark et al 2010) (Ewertz et al 2011). De manière

intéressante, tous les sous-types de cancers du sein s’avèrent être affectés par l’obésité. Les patientes

atteintes de cancers HER2+ semblent être encore plus touchées, en termes de mortalité et de

78

développement de métastases à distance (Ewertz et al 2011). L’impact de l’obésité sur le pronostic du

cancer a particulièrement retenu notre attention, car, contrairement à l’incidence, l’obésité est un

facteur de mauvais pronostic global pour les cancers du sein, indépendamment du sous-type et du

statut ménopausique. De plus, l’obésité influence, de manière importante, la réponse à la

chimiothérapie (voir partie obésité et chimiorésistance).

3-2) Mécanismes non biologiques affectant le pronostic

Les mécanismes physiopathologiques permettant d’expliquer le mauvais pronostic des cancers du sein

chez la femme obèse ne sont pas encore bien connus, mais certains facteurs biologiques ont été

étudiés. Il s’agit d’une part, de facteurs systémiques, tels que les hormones (insuline, œstrogènes,

leptine) et d’autre part, de facteurs locaux, comme les altérations du TA liées à l’obésité (figure 23).

Cependant, l’obésité est une maladie complexe, qui peut faire intervenir d’autres facteurs dits non

biologiques, tels qu’un dépistage tardif et une administration insuffisante des doses de chimiothérapie.

a) Le dépistage tardif

Le mauvais pronostic associé au cancer du sein des patientes obèses peut être associé à un retard au

diagnostic, et donc une maladie plus évoluée au moment de la découverte du cancer, ce qui est très

fréquent chez ce type de patientes (Ewertz et al 2011). Le retard au diagnostic peut provenir d’une

difficulté à identifier la tumeur, liée notamment à l’augmentation de la taille du sein chez les patientes

obèses (Boyd et al 2006) (Crispo et al 2015). Cependant, plusieurs études ont démontré que la

sensibilité des méthodes de détections médicales, telles que la mammographie n’est pas altérée par

l’obésité (Crispo et al 2015) (Elmore et al 2004). Le retard de diagnostic concernerait uniquement les

cas détectés par auto-palpation (Majed et al 2008).

b) Administration insuffisante des doses de chimiothérapie

Les doses de chimiothérapie sont classiquement calculées sur la base de la surface corporelle (en m2),

qui est déterminée en fonction du poids et de la taille du patient. Les patientes obèses ont très souvent

une surface corporelle supérieure à 2 m2. Empiriquement, les médecins ont tendance à diminuer les

doses chez les patientes obèses de peur qu’une dose proportionnelle à leur surface corporelle (donc

élevée) entraîne des effets indésirables trop importants, d’autant plus que ce type de patientes présente

bien souvent des co-morbidités associées. Cependant, les recommandations préconisent la prescription

de la dose exacte ajustée à la surface corporelle et non une sous-dose, susceptible de diminuer leur

pronostic (Lyman and Sparreboom 2013). En effet, plusieurs études suggèrent que les femmes obèses

recevant des doses de chimiothérapie prévues dans le protocole ne subissent pas plus d’effets

indésirables (Carroll et al 2014) (Colleoni et al 2005).

79

3-3) Mécanismes biologiques affectant la progression tumorale (figure 23)

a) Hyperglycémie et hyperinsulinémie

L’obésité est très souvent associée à un phénomène d’insulino-résistance, accompagnée d’un diabète

de type II.

- Hyperglycémie. Les résultats des études cliniques et des méta-analyses suggèrent qu’il y a un lien

entre le diabète sucré et le développement de cancers, tels que les cancers du foie, du pancréas, de

l’endomètre, colorectal, du sein et rénal. Mais les mécanismes physiopathologiques ne sont pas encore

bien connus (Gallagher and LeRoith 2013). Les cellules tumorales utilisent le glucose, comme source

d’énergie majoritaire, afin de produire de l’énergie par l’effet Warburg. L’équipe de Philipp Scherer a

démontré que des souris hyperglycémiques (hyperglycémie induite par apoptose des cellules β

pancréatiques), présentaient des tumeurs plus agressives. Le mécanisme impliqué serait que

l’hyperglycémie induit des modifications épigénétiques de certaines voies de signalisation pro-

tumorales, telles que les voies EGFR, HER2 et HER3 (Park et al 2012) (Park et al 2014).

- Hyperinsulinémie. L’hyperinsulinémie est directement corrélée à des effets pro-tumorigènes. D’une

part, l’insuline peut se fixer sur ses récepteurs IR, exprimés par les cellules tumorales. D’autre part,

l’insuline induit la synthèse de l’IGF-1 (Insulin-Growth Factor-1), qui est un facteur de croissance

peptidique produit par le foie. Les concentrations d’insuline et d’IGF-1 circulants sont augmentés chez

les sujets obèses (Ford et al 2013). De plus, l’insuline partage environ 50% d’homologie de séquence

avec l’IGF-1 et peut ainsi se fixer sur son récepteur IGFR-1 (Insulin Growth Factor Receptor-1).

L’IGF-1 et l’insuline peuvent donc promouvoir la carcinogenèse en activant des voies de signalisation

pro-tumorales, telles que les voies MAPK et PI3K/Akt et en inhibant l’apoptose. Ainsi, des études

épidémiologiques prospectives ont montré une forte association entre la concentration en IGF-1

circulant et le risque de développer des cancers de la prostate, colorectal et du sein chez la femme pré-

ménopausée (Park et al 2014) (Pollak et al 2004). Enfin, l’insuline augmente la synthèse et la

biodisponibilité des hormones stéroïdes sexuelles, incluant les androgènes, la progestérone et les

œstrogènes, connus pour être pro-tumorigènes. L’insuline peut également stimuler la voie de

signalisation de la leptine (Rose and Vona-Davis 2014).

b) Les hormones sexuelles

Le rôle des hormones sexuelles dans la progression tumorale, notamment des œstrogènes, permet

d’expliquer uniquement l’incidence et le pronostic des cancers du sein dépendants des hormones

(ER+PR+). Après la ménopause, les œstrogènes (libérés par les ovaires avant la ménopause) sont

produits presque exclusivement par les cellules stromales (surtout les pré-adipocytes) du TA (Rose

and Vona-Davis 2014). Cette synthèse se fait par l’enzyme aromatase qui permet la conversion des

androgènes en œstrogènes. L’activité aromatase, ainsi que le taux d’œstrogènes sont proportionnels à

80

l’IMC. Les femmes obèses ménopausées présentent, en effet, des quantités importantes d’œstrogènes,

et ceci est associé à une augmentation du risque de développer un cancer du sein (Key et al 2002).

D’autre part les cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et TNF-α) peuvent induire l’expression de

l’aromatase dans les ADSCs (Zhao et al 1996). De plus, dans leur étude sur le TA mammaire obèse,

Subbaramaiah et al. ont montré que l’inflammation du TA induite par l’obésité est associée à une

augmentation de l’expression de l’aromatase par les cellules stromales (Subbaramaiah et al 2011). Les

œstrogènes se lient au récepteur Er-α (Estrogen receptor-α) qui active des voies de signalisation en

aval, permettant d’induire la prolifération cellulaire, de diminuer l’apoptose et de favoriser

l’angiogenèse via l’induction du VEGF (Ford et al 2013).

c) L’inflammation chronique

L’inflammation chronique représente une altération importante du TA induite par l’obésité. Cette

inflammation est liée au recrutement de cellules inflammatoires, telles que des macrophages et

également à la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et de chimiokines, telles que CCL2, IL-6 et

TNF-α, augmentées dans un contexte d’obésité. L’infiltration des macrophages dans le TA de souris et

de personnes obèses peut représenter jusqu’à 40% du TA (Hefetz-Sela and Scherer 2013). Comme

nous l’avons vu dans la partie I, l’inflammation et les macrophages présents dans le

microenvironnement tumoral sont associés à la progression de la tumeur à toutes les étapes

(prolifération tumorale, survie, angiogenèse, chimiorésistance et dissémination métastatique). Dans

l’étude de Morris et al., portant sur la comparaison du TA mammaire des patientes obèses pré-

ménopausées ou ménopausées présentant un cancer du sein, les résultats montrent la présence d’une

inflammation dans le TA mammaire indifféremment du statut ménopausique des femmes. Ainsi,

l’inflammation dans le TA mammaire représente un facteur de risque et de mauvais pronostic pour le

cancer du sein, indépendamment du statut ménopausique (Morris et al 2011). Dans un modèle murin

de carcinome hépatocellulaire induit par diethylnitrosamine, les souris obèses présentent une masse

tumorale plus importante que les souris normopondérales. De manière intéressante, les souris obèses

KO pour l’IL-6 ou pour le TNF-α présentent un hépatocarcinome moins important que les souris

obèses sauvages, suggérant le rôle important de l’inflammation liée à l’obésité, dans le développement

du carcinome hépatocellulaire (Park et al 2010). Très récemment, Arendt et al. ont montré que

l’obésité favorise la progression tumorale, via une augmentation du recrutement de macrophages et via

l’angiogenèse. Les auteurs proposent comme modèle de leurs résultats que les adipocytes obèses du

TA mammaire sécrètent CCL2, qui permet le recrutement de macrophages qui vont former des CLS.

En réponse à CCL2 et IL-1β, les macrophages sécrètent CXCL12, qui favorise l’angiogenèse et la

progression tumorale (Arendt et al 2013). L’équipe de Stephen Hursting a également montré que les

tumeurs mammaires murines dans les souris obèses sont enrichies en marqueurs inflammatoires et

pro-angiogéniques (De Angel et al 2013) (figure 24).

81

d) Les adipokines

Lors de l’obésité, le profil sécrétoire des adipocytes est profondément remanié (figure 21). Parmi

toutes les adipokines, l’adiponectine et la leptine ont largement été étudiées, notamment pour leur rôle

dans le cancer (voir partie I).

- Leptine. La leptine est considérablement augmentée dans le TA et la circulation sanguine de

patientes obèses, faisant d’elle une hormone clé dans le lien entre obésité et cancer. En effet, des

patientes atteintes de cancer du sein, ayant des concentrations élevées d’ARNm du récepteur à la

leptine, au sein de la tumeur, présentent un cancer de mauvais pronostic (Miyoshi et al 2006).

- Adiponectine. A l’inverse, la concentration en adiponectine est inversement corrélée à l’obésité.

Ainsi, un niveau faible d’adiponectine est associé à une augmentation de l’incidence de certains

cancers, comme le cancer de l’endomètre, du sein chez la femme ménopausée, du côlon, de l’estomac,

du rein et les leucémies (Tworoger et al 2007) (Kelesidis et al 2006).

e) Hypoxie, angiogenèse et lymphangiogenèse

L’angiogenèse exerce un rôle pivot dans la progression tumorale : elle permet le passage d’une tumeur

peu vascularisée de faible taille à une tumeur croissante très vascularisée et favorise le processus

métastatique (voir partie I). Comme dans une tumeur, le TA obèse requiert une étroite coopération

entre les adipocytes, les macrophages et les cellules endothéliales, afin de se développer pour répondre

aux demandes énergétiques accrues. Dans un contexte d’obésité, les adipocytes sécrètent davantage de

facteurs pro-angiogéniques, tels que du VEGF, du FGF, la leptine, la résistine, l’adiponectine, PAI-1

et l’IL-6, susceptibles de promouvoir l’angiogenèse tumorale et la progression de la tumeur (Hefetz-

Sela and Scherer 2013). Chez l’Homme, il existe une corrélation entre l’IMC et la masse adipeuse

totale avec la concentration en VEGF sanguine (Rose and Vona-Davis 2014). Gu et al. ont étudié

l’effet de l’obésité sur la progression tumorale mammaire dans un modèle murin de souris

ovariectomisées. Ils ont injecté en orthotopique la lignée tumorale murine ER+ E0771 à des souris

obèses ou non et suivi la progression de la tumeur. Les résultats montrent que la croissance tumorale

est plus élevée dans les souris obèses et ceci est associé à une angiogenèse plus importante,

caractérisée par une augmentation de la densité intra-tumorale des vaisseaux, une augmentation du

VEGF dans le sang, au sein de la tumeur et dans le TA. De manière intéressante, le TA sous-cutané

exprime plus de VEGF que le TA viscéral dans les souris obèses. Ainsi, cette étude suggère que lors

de l’obésité, certaines adipokines sont augmentées dans le TA, qui peut localement favoriser

l’angiogenèse et le développement de la tumeur (Gu et al 2011). Dans un modèle murin de mélanome,

Jung et al. ont montré que les souris obèses présentent des mélanomes, des métastases ganglionnaires

ainsi qu’une lymphangiogenèse plus importants. Les auteurs suggèrent que dans un contexte d’obésité,

un dialogue entre les adipocytes, les macrophages et les cellules tumorales se met en place, permettant

82

d’augmenter la lymphangiogenèse et l’envahissement des cellules tumorales dans les ganglions

lymphatiques ; dialogue médié par CCL2, M-CSF (Macrophages Colony Stimulating Factor), VEGF-

A, C et D, CCL19, CCL7 et CCR7 (Jung et al 2015).

Lié au manque d’angiogenèse et à l’expansion du TA, le TA obèse devient hypoxique. L’hypoxie a été

rapportée comme capable d’activer des voies pro-inflammatoires dans le TA, d’induire une fibrose et

le processus d’angiogenèse. Ces trois processus ainsi que l’hypoxie, en tant que telle, ont un rôle

évident dans la progression de la tumeur (partie I) (Hefetz-Sela and Scherer 2013) (figure 24).

f) Fibrose

Au cours de l’expansion du TA, un important remodelage de la MEC est requis, aboutissant

généralement à une fibrose. La fibrose est un processus important dans la progression tumorale (voir

partie I). Ainsi, l’expression des composants de la MEC est modulée par l’obésité et peut influencer la

progression de la tumeur. L’équipe de Philipp Scherer a montré que l’endotrophine, exerce un rôle

important dans la progression tumorale mammaire, notamment dans les phénomènes de fibrose et

d’inflammation, via le recrutement des macrophages et des cellules endothéliales. L’endotrophine

confère à la tumeur un phénotype plus agressif et un potentiel métastatique plus important (voir partie

I) (Hefetz-Sela and Scherer 2013). L’effet pro-tumoral de l’endotrophine est médié par la signalisation

du TGF-β, contribuant à la fibrose et à l’EMT : processus favorisant l’invasion et la survie des cellules

tumorales (Hefetz-Sela and Scherer 2013). De manière intéressante, l’endotrophine est augmentée

dans le TA obèse et a un rôle crucial dans les complications métaboliques associées à l’obésité.

L’endotrophine exerce ainsi un rôle clé dans la progression tumorale, le processus métastatique et les

complications métaboliques associées à l’obésité (Park and Scherer 2012). Par conséquent, les

protéines impliquées dans la synthèse et le remodelage de la MEC semblent jouer une fonction

importante dans la progression tumorale, associée à l’obésité.

g) Autres mécanismes

- Les métabolites lipidiques. L’insulino-résistance liée à l’obésité induit une lipolyse des adipocytes.

Ainsi, des AG sont libérés dans la circulation générale. D’autres métabolites, comme le diacylglycérol

et les céramides, sont relargués par les adipocytes et peuvent servir de seconds messagers pour activer

des voies de signalisation (voies de signalisation de la PI3K, du NF-κB), impliquées dans l’apoptose,

la prolifération et la croissance cellulaire. De plus, les AG et d’autres métabolites libérés dans la

circulation générale participent à la progression tumorale en augmentant la β-oxydation et la

génération d’espèces réactives de l’oxygène et contribuent à la biosynthèse de nouvelles membranes

lipidiques (Park et al 2011). Bien que l’énergie des cellules cancéreuses semble être fournie

majoritairement par la glycolyse, l’oxydation des AG offre une voie alternative intéressante,

notamment lors de l’augmentation des AG libres, retrouvée dans l’obésité (Schafer et al 2009).

83

- L’EMT. L’équipe de Stephen Hursting a isolé deux lignées tumorales mammaires murines, à partir

de tumeurs mammaires spontanées chez la souris MMTV-Wnt1, qui correspondent aux sous-types de

cancer du sein basal-like et claudin-low. Les auteurs ont injecté ces cellules en orthotopique dans la

glande mammaire de souris obèses, normopondérales ou soumises à une restriction calorique. Les

résultats montrent qu’il existe une relation entre la balance énergétique, l’EMT, la présence de cellules

initiatrices de cancer et la progression tumorale. Autrement dit, les souris obèses développent des

tumeurs plus importantes, caractérisées par la présence de marqueurs mésenchymateux, d’une

infiltration adipocytaire et de CSCs. A l’inverse, les souris mises en restriction calorique, présentent

des tumeurs plus petites, enrichies en marqueurs épithéliaux (Dunlap et al 2012).

- ADSCs. A l’inverse des patients normopondéraux, les patients obèses présentent des quantités

importantes d’ADSCs circulants, en lien probablement avec un recrutement et une prolifération plus

importants de ces cellules lors de l’expansion du TA. De manière importante, la présence d’ADSCs

circulants est exacerbée chez les patients obèses atteints de cancers, notamment de cancer du sein.

Etant donné le rôle important de ces cellules dans la progression tumorale (partie I), il est logique

d’imaginer que les ADSCs pourraient avoir un rôle crucial dans la progression tumorale des patients

obèses (Ghosh et al 2014). L’équipe de Bunell a isolé des ADSCs du TA sous-cutané abdominal de

patients obèses ou non et une étude de l’impact de ces progéniteurs sur la progression tumorale in vitro

et in vivo a été réalisée. Les résultats suggèrent que les ADSCs, provenant de patients obèses

augmentent la prolifération tumorale in vitro et la tumorigénicité in vivo des cellules tumorales

mammaires, via un mécanisme qui implique l’augmentation de la leptine, induite par l’obésité et les

œstrogènes (Strong et al 2013).

Parmi toutes les hypothèses évoquées ci-dessus pouvant faire le lien entre obésité et cancer, les plus

convaincantes impliquent les perturbations du TA, notamment l’inflammation, l’angiogenèse et la

fibrose. En effet, les modifications du TA induites par l’obésité concernant ces trois paramètres

permettent la formation d’un environnement permissif à la progression de la tumeur. D’un point de

vue biologique, de fortes similitudes ont été observées entre les modifications du TA viscéral et du TA

mammaire obèses chez la souris, dans un contexte normal et tumoral. D’un point de vue clinique, le

TA mammaire des femmes obèses n’est pas encore complétement caractérisé mais des études

préliminaires ont mis en évidence que ce TA, au même titre que le TA viscéral est plus inflammatoire,

renforçant l’hypothèse d’un rôle paracrine important du TA sur la progression de la tumeur (figure

24).

84

3-4) Cas particulier : Obésité et chimiorésistance

a) Arguments cliniques

Comme nous l’avons vu auparavant, l’obésité est un facteur de mauvais pronostic global pour les

cancers du sein, en favorisant notamment les rechutes. Le lien entre obésité et mauvais pronostic du

cancer est probablement multifactoriel mais des arguments suggèrent que l’obésité influence la

réponse à la chimiothérapie. Récemment, une analyse rétrospective a été réalisée sur 5 683 patientes

atteintes de cancers du sein opérables et traitées par chimiothérapie adjuvante composée

d’anthracyclines et de taxanes. Les résultats suggèrent que seules les patientes présentant une obésité

sévère (IMC > 35) ont un cancer du sein de très mauvais pronostic, en termes de rechutes et de

mortalité, indépendamment du sous-type de cancers (Pajares et al 2013). Des résultats similaires ont

été rapportés par De Azambuja et al., qui ont étudié l’effet de l’obésité sur le pronostic du cancer de

sein, traité par chimiothérapie adjuvante (doxorubicine et docetaxel). Les auteurs ont démontré que

l’obésité est associée à une diminution de la survie sans maladie et de la survie globale (de Azambuja

et al 2010). Des résultats semblables ont été observés avec la chimiothérapie néoadjuvante. Litton et

al. ont réalisé une étude sur 1 169 patientes, atteintes de cancers du sein et traitées par chimiothérapie

néoadjuvante. Concernant les chimiothérapies administrées, 91% des patientes ont reçu un traitement à

base d’anthracyclines, et parmi ces patientes, 72% ont reçu en plus une chimiothérapie composée de

taxanes ou de trastuzumab. Les données obtenues montrent que les patientes obèses ou en surpoids

présentent un cancer du sein plus avancé, caractérisé par une réponse complète plus faible à la

chimiothérapie néoadjuvante que les patientes de poids normal (Litton et al 2008). Ces résultats ont été

confirmés dans d’autres études (Del Fabbro et al 2012) (Kacem et al 2010). Ainsi, l’ensemble de ces

données suggère que l’obésité est globalement associée à une moindre réponse aux chimiothérapies

adjuvante et néoadjuvante, expliquant en partie le mauvais pronostic des patientes obèses atteintes de

cancer du sein.

b) Arguments pharmacocinétiques

L’obésité peut avoir un rôle systémique sur la chimiorésistance, en altérant la pharmacocinétique des

chimiothérapies. En effet, les drogues lipophiles peuvent partiellement se stocker dans le TA

excédentaire (Cheymol 2000). L’obésité est également associée à une augmentation de l’α-1

glycoprotéine acide, qui pourrait augmenter la liaison plasmatique des drogues basiques, empêchant

leur bonne distribution (Blouin et al 1987). La clairance hépatique et rénale peut être altérée dans

l’obésité, liée à une augmentation de l’activité du cytochrome P450 2E1 et à une augmentation de la

filtration glomérulaire et la sécrétion tubulaire. Ceci peut au final altérer la pharmacocinétique des

drogues hydrophiles (Sheng and Mittelman 2014). Comme l’exposition aux drogues dépend du

volume de distribution et de la clairance, l’obésité pourrait être associée à une toxicité plus importante,

85

mais comme vu précédemment, les études ont montré que ce n’était pas le cas (Lyman and

Sparreboom 2013).

c) Arguments biologiques

De manière intéressante, les différentes modifications du TA liées à l’obésité, telles que la fibrose,

l’inflammation, l’angiogenèse et certaines adipokines ont été associées séparemment à une diminution

de la sensibilité des cellules tumorales à la chimiothérapie (voir partie I et partie III). De plus, certaines

études se sont intéressées au rôle des adipocytes ou du TA dysfonctionnel sur la résistance aux

traitements, dans un contexte d’obésité. La première étude qui a étudié ce processus est l’étude de

Behan et al. en 2009. Après injection d’une lignée tumorale syngénique de leucémie aigüe lymphoïde

à des souris obèses ou non, un traitement à la vincristine (à dose proportionnelle au poids du corps) a

été réalisé. Les résultats montrent que l’obésité augmente les rechutes de la tumeur après traitement.

Afin d’identifier le mécanisme, les auteurs ont co-cultivé les adipocytes de la lignée 3T3-L1 avec des

cellules tumorales leucémiques. De manière intéressante, les adipocytes diminuent l’efficacité de la

vincristine en protégeant les cellules de l’apoptose induite par le traitement. L’effet des adipocytes

n’est pas restreint à la vincristine, les cellules co-cultivées avec les adipocytes sont également plus

résistantes au nilotinib, la daunorubicine et au dexamethasone. Ce processus est associé à une

augmentation des facteurs anti-apoptotiques Bcl-2 et Pim-2 (Proviral integrations of moloney virus 2).

Cette étude souligne l’impact direct des adipocytes dans l’induction d’une chimiorésistance mais le

mécanisme reliant l’obésité et la chimiorésistance n’a pas été étudié (Behan et al 2009). Dans le

modèle du cancer du sein, l’équipe de Philipp Scherer a montré que la quantité d’endotrophine est

augmentée, suite à un traitement au cisplatine. A l’inverse, l’endotrophine cause une chimiorésistance

et un processus d’EMT, en faveur de la progression tumorale. De manière intéressante, les souris KO

pour le collagène VI sont plus sensibles au cisplatine, via une inhibition de l’EMT (Park et al 2013).

Comme l’endotrophine est augmentée dans le TA obèse, l’étude de l’implication de cette protéine dans

la chimiorésistance dans un contexte d’obésité pourrait être intéressante (Park et al 2014). L’équipe de

Stephen Husting a également montré, que les souris obèses sont plus résistantes à la gemcitabine, dans

un modèle de tumeur mammaire. Ils ont démontré que l’inclusion de la gemcitabine dans des

nanoparticules lipidiques contrebalance cette chimiorésistance (De Angel et al 2013). De manière

intéressante, des études ont corrélé l’hyperglycémie (fréquemment retrouvée dans un contexte

d’obésité) avec le phénomène de chimiorésistance. La composition et la dépendance de la tumeur en

glucose dépendent du stade tumoral. Virchvakarma et al. ont étudié in vivo le rôle du glucose dans la

progression tumorale du lymphome à des stades précoces ou tardifs du cancer et ont évalué l’impact

de l’hyperglycémie sur la chimiorésistance. Les résultats suggèrent que l’exposition au glucose des

cellules tumorales à des stades tardifs de la progression tumorale, entraîne une diminution de la

sensibilité des cellules au cisplatine et au méthotrexate. Ce phénomène est associé à une surexpression

de la protéine d’efflux P-gp (voie partie III) (Vishvakarma et al 2013). De manière intéressante, une

86

étude réalisée par Zeng suggère que l’exposition des cellules tumorales mammaires au glucose induit

une résistance au 5-fluorouracile, à la doxorubicine et au paclitaxel. Le mécanisme est lié à une

augmentation de FAS (Fatty Acid Synthase) (enzyme impliquée dans la lipogenèse) ainsi que du

céramide (Zeng et al 2010). Tous les mécanismes, induits par un TA dysfonctionnel et qui peuvent

potentiellement favoriser l’initiation et la progression tumorale, ainsi que les rechutes et la

chimiorésistance sont résumés dans la figure 23. La figure 24 résume les mécanismes connus, faisant

le lien entre les modifications du TA mammaire de souris et de patientes obèses et la progression

tumorale.

Figure 23. Conséquences potentielles des altérations du TA par l’obésité sur l’initiation tumorale, la progression tumorale, les rechutes et la chimiorésistance. L’obésité entraîne des modifications du TA et des adipocytes, qui produisent des niveaux élevés de cytokines pro-inflammatoires, de chimiokines, de facteurs de croissance, d’hormones sexuelles, de métabolites lipidiques. Ce TA dysfonctionnel est une source de protéines matricielles, de CSCs (Cancer Stem Cells) et d’ADSCs. Tous ces facteurs sont susceptibles d’agir à toutes les étapes de la progression tumorale (de l’initiation, à la progression tumorale et aux rechutes). L’obésité induit aussi des changements métaboliques systémiques, tels qu’une hyperglycémie et une hyperinsulinémie, qui contribuent également à créer un environnement permissif pour la tumeur (d’après (Park et al 2014)).

87

Figure 24. TA mammaire et cancer du sein : comparatif des mécanismes connus entre la souris et l’Homme. Sous l’influence de l’obésité, le TA mammaire est modifié. Chez la souris, une hypertrophie des adipocytes est observée, ainsi qu’une fibrose, une angiogenèse et une inflammation. Ce TA dysfonctionnel influence la progression tumorale, en favorisant une chimiorésistance, une fibrose, une inflammation, une angiogenèse et un processus EMT. A l’inverse, une diminution de la survie est observée. Ces processus sont médiés par CCL2, l’endotrophine (ETP) et le VEGF. Le TA des femmes obèses est également modifié. Il est ainsi caractérisé par une hypertrophie adipocytaire et une inflammation. Peu de données sont fournies concernant le rôle du TA mammaire dans la progression tumorale. Les études épidémiologiques suggèrent que les femmes obèses présentent un cancer du sein de plus mauvais pronostic, caractérisé par une augmentation des métastases, des rechutes et de la chimiorésistance et une diminution de la survie globale et la survie sans maladie.

En conclusion, il existe une association évidente entre l’obésité et la progression tumorale

mammaire, et ce, indépendamment du statut ménopausique. En effet, l’obésité est un facteur de

mauvais pronostic global pour les cancers du sein caractérisé, entre autres, par une

augmentation des rechutes, de la mortalité et par une chimiorésistance, suite à un traitement par

chimiothérapie adjuvante ou néoadjuvante. La chimiothérapie demeure un des traitements de

référence du cancer du sein, soit dans des cancers souvent agressifs, soit dans les cancers métastatiques

d’emblée. De nombreuses hypothèses peuvent expliquer l’augmentation de la résistance à la

chimiothérapie chez les patientes obèses, mais les plus convaincantes impliquent les perturbations

du tissu adipeux, qui contribuent à créer un microenvironnement permissif à la tumeur. Au sein du

TA, le rôle des adipocytes dans la résistance aux traitements a été suggéré ; cependant les

mécanismes précis qui relient les adipocytes obèses et la chimiorésistance des cancers du sein ne

88

sont pas bien connus. La partie III consistera à étudier les différents mécanismes moléculaires et

cellulaires connus, impliqués dans la résistance à la chimiothérapie, qui pourraient potentiellement être

influencés par les adipocytes.

89

PARTIE III : LES MECANISMES DE CHIMIORESISTANCE

1) Mécanisme d’action de la doxorubicine

1-1) Généralités

Découverte dans les années 1960, la famille des anthracyclines se situe parmi les molécules anti-

cancéreuses les plus efficaces, malgré une forte toxicité cardiaque et myéloïde. Cette famille d’agents

anti-cancéreux s’est révélée très active sur un large panel de tumeurs (Jamieson and Boddy 2011). Une

méta-analyse, réalisée par l’EBTCG (Early Breast Cancer Trialist’s Collaborative Group) a prouvé

l’efficacité d’un traitement à base d’anthracycline sur la prévention des récurrences (RR = 0.89) et sur

la survie (RR de mourir d’un cancer du sein = 0.84). De plus, l’utilisation des anthracyclines présente

des avantages en terme de toxicité, par rapport au traitement CMF (Cyclophosphamide, Méthrotrexate,

5-Fluorouracile) (Lal et al 2010). Comme la plupart des antibiotiques, les premières anthracyclines ont

été isolées à partir du pigment produit par la bactérie Streptomyces peucetius et ont été nommées

doxorubicine (ADRIAMYCINE®) et daunorubicine (DAUNOMYCINE®) (figure 25) (Minotti et al

2004). Alors que la doxorubicine est utilisée principalement dans le traitement des tumeurs solides,

telles que le cancer du sein, du poumon, de l’ovaire, de l’estomac, de la thyroïde, les sarcomes et les

lymphomes, la daunorubicine est indiquée dans les leucémies lymphoblastiques et myéloblastiques

(Cortes-Funes and Coronado 2007). Depuis, d’autres antracyclines ont rejoint l’arsenal thrérapeutique

anti-tumoral, comme l’éprubicine, l’idarubicine, la pirarubicine, la zorubicine, l’aclarubicine, la

valrubicine et le mitoxantrone. En dépit de l’utilisation accrue des anthracyclines en clinique, leur

mécanisme d’action reste un sujet à débat (Minotti et al 2004). Les anthracyclines présentent un effet

cytotoxique et antiprolifératif, liés à l’inhibition de la biosynthèse de macromolécules d’ADN et

d’ARN, via deux actions : l’intercalation de l’ADN et l’inhibition de la topoisomérase II. Les

anthracyclines peuvent aussi générer des radicaux libres qui contribuent à leur effet cytotoxique

(Minotti et al 2004).

Figure 25. Structures chimiques des principales anthracyclines. DOX : doxorubicine, DNR : daunorubicine, EPI : épirubicine, IDA : idurabucine (d’après (Minotti et al 2004)).

90

1-2) Pharmacocinétique de la doxorubicine

Au niveau chimique, toutes les anthracyclines présentent une structure rigide aromatique, contenant un

motif quinone, lié par une liaison glycosidique à un sucre aminé : la daunosamine (figure 25) (Cortes-

Funes and Coronado 2007). Concernant la pharmacocinétique de la doxorubicine, elle présente

souvent une clairance plasmatique tri-phasique après injection intra-veineuse. La demi-vie de

distribution de la doxorubicine est de 3 à 5 minutes. Du fait de sa lipophilie, elle rentre rapidement

dans les cellules, majoritairement par voie passive (Tacar et al 2013). Sa concentration intra-cellulaire

est environ 10 à 500 fois supérieure à sa concentration extra-cellulaire (Lal et al 2010). Dans la cellule,

elle est majoritairement retrouvée dans le noyau (concentration nucléaire environ 50 fois supérieure à

sa concentration cytoplasmique). La forme libre intra-cellulaire de la doxorubicine (2% de la quantité

totale intra-cellulaire de doxorubicine) peut être séquestrée dans d’autres compartiments cellulaires,

tels que les lysosomes, l’appareil de Golgi et les mitochondries (Tacar et al 2013) (Danesi et al 2002).

De plus, il existe une faible biotransformation de la doxorubicine en doxorubicinol. Cette

biotransformation a lieu dans le foie et est réalisée par les carbonylreductases 1 et 3. La doxorubicine

et le doxorubicinol sont métabolisés en doxorubicinone et doxorubicinolone. Ces deux métabolites

peuvent être réduits en structures aglycones : 7-deoxydoxorubicinone et 7-déoxydoxorubicinolone qui

sont excrétés après conjugaison avec l’acide glucuronique ou sulphonique. Les aglycones de

doxorubicine sont très transitoires. En effet, ces métabolites ont été détectés dans les liquides

biologiques de seulement quelques patients traités à la doxorubicine et à des concentrations très faibles

(en comparaison avec le doxorubicinol et la doxorubine) (Lal et al 2010). La demi-vie terminale de la

doxorubicine est de 24 à 36 heures, suggérant qu’elle prend beaucoup plus de temps pour s’éliminer

que pour pénétrer dans les tissus (Tacar et al 2013).

1-3) Poison des topoisomérases II (figure 28)

Les topoisomérases II (topo2) sont des enzymes nucléaires qui suppriment les contraintes de torsion de

l’ADN, permettant le bon déroulement de la réplication, de la transcription et de la ségrégation

chromosomique. Ce rôle essentiel repose sur la capacité de la topoisomérase II à réaliser des cassures

double-brin afin de supprimer les super-enroulements de l’ADN, puis à assurer le passage d’une autre

molécule d’ADN à travers la coupure et à réaliser la religature des brins (Nitiss 2009a). Il existe deux

isoformes de la topoisomérase II chez les mammifères : topo2α (exprimée préférentiellement dans les

cellules qui prolifèrent) et topo2β (ubiquitaire) (Lansiaux and Pourquier 2011). Les topoisomérases II

sont des enzymes homodimériques, qui réalisent une cassure double-brin dans un brin d’ADN (appelé

segment G (pour Gate)) et vont passer le second brin (appelé segment T (pour Transported)) à travers

la cassure. Brièvement, en présence de Mg2+, chaque unité de la topo2 se lie à chaque brin de l’ADN

du fragment G, par une liaison phosphotyrosine covalente, provoquant une cassure double-brin. En

présence d’ATP, l’enzyme change de conformation et adopte une forme de « pince fermée »,

91

permettant la capture de l’autre brin d’ADN (le segment T), qui peut ainsi passer à travers la cassure

du segment G et sera libéré de la topo2. Le segment G est religaturé et la pince s’ouvre, libérant le

segment G intact (figure 26) (Nitiss 2009b). La doxorubicine est un poison des topoisomérases II α et

β. Elle peut bloquer la réaction catalytique de la topo2 à deux étapes différentes. A faible

concentration, la doxorubicine bloque la religature de l’ADN. En fait, elle stabilise la réaction

intermédiaire (normalement transitoire), où les brins d’ADN sont coupés et liés de manière covalente

aux résidus tyrosine de la topo2. Un complexe ternaire anthracycline-topo2-ADN est ainsi formé et

stabilisé. Le complexe induit l’accumulation de cassures simple et double-brin, formant d’importants

dommages à l’ADN et la mort cellulaire (Cortes-Funes and Coronado 2007). A forte concentration, la

doxorubicine interfère avec la liaison initiale entre l’ADN et la topo2, empêchant la formation du

complexe clivable et générant des cassures et la mort cellulaire (figure 26) (Pommier et al 2010).

1-4) Rôle des radicaux libres (figure 28)

Un des mécanismes de la doxorubicine, à l’origine de son rôle anti-tumoral et de sa toxicité

notamment cardiaque est la génération de ROS (Reactive Oxygen Species). La structure quinone de la

doxorubicine lui permet d’agir comme accepteur d’électrons, via des réactions d’oxydoréduction

impliquant la cytochrome P450 réductase, la NADH (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)

déshydrogénase et la xanthine oxydase. L’addition d’électrons à la structure quinone de la

doxorubicine la convertit en structure semiquinone. Cette réaction est suivie d’une oxydation

spontanée à l’origine de la quinone de base et des anions superoxydes. Ces anions superoxydes

donnent naissance à des peroxydes d’hydrogène ; réaction catalysée par la superoxyde dismutase

(figure 27) (Jamieson and Boddy 2011). Une des conséquences de la génération intra-cellulaire de

ROS est d’induire des dommages à l’ADN et la mort cellulaire. De plus, les ROS peuvent entraîner la

peroxydation des lipides des membranes (Gewirtz 1999). En effet, durant le cycle d’oxydoréduction,

la semiquinone peut s’oxyder en aglycone, très soluble dans les lipides. Ainsi, l’aglycone peut

s’intercaler dans les membranes biologiques et former des ROS, à l’origine de la fragilisation des

membranes et de la mort cellulaire. Chimiquement, la structure de la doxorubicine et des autres

anthracyclines permet la génération de ROS. Cependant, les études qui ont mis en évidence ce

mécanisme d’action se placent souvent à des doses supracliniques. Dans les cas où la doxorubicine est

utilisée à des doses cliniques, on observe une longue phase de latence entre l’administration de la

drogue et la détection de H2O2 (Gewirtz 1999).

92

Figure 26. Mécanismes d’inhibition de la toposiomérase II par la doxorubicine. (a) Réactions schématiques catalysées par la topo2 : décaténation et relaxation de l’ADN superenroulé. (b) La topoisomérase II réalise une cassure double-brin dans un brin d’ADN (appelé segment G (pour Gate)), et passe le second brin (appelé segment T (pour Transported)) à travers la cassure. La doxorubicine peut bloquer la réaction catalytique de la topo2 à deux étapes différentes. A faible concentration, la doxorubicine bloque la religature de l’ADN, en stabilisant le complexe clivable composé de la topo2 et de l’ADN coupé. Puis cela entraîne des dommages à l’ADN et la mort cellulaire. A forte concentration, la doxorubicine interfère avec la liaison initiale entre l’ADN et la topo2, empêchant la formation du complexe clivable (d’après (Nitiss 2009a) (Pommier et al 2010)).

Figure 27. Formation de ROS par la doxorubicine. En présence de NADH, la structure quinone de la doxorubicine peut être oxydée en structure semiquinone par les enzymes NOS (Nitrite oxyde synthase) et XDH (Xanthine deshydrogénase). Puis une oxydation spontanée par l’oxygène reforme la quinone de base et des anions superoxydes, qui peuvent former H2O2 (d’après (Jamieson and Boddy 2011)).

93

1-5) Formation d’adduits et de pontages à l’ADN (figure 2 8)

De par ses propriétés intercalantes, la doxorubicine est capable de former des liaisons covalentes avec

l’ADN, mais elle aurait aussi la capacité à se lier à l’ADN mitochondrial (Tacar et al 2013). Elle forme

des pontages très stables entre les molécules d’ADN et également des adduits à l’ADN. La

doxorubicine s’intercale préférentiellement entre les bases de l’ADN Guanine et Cytosine adjacentes.

La formation d’adduits doxorubicine-ADN peut activer, en aval, les réponses de dommages à l’ADN

et l’apoptose (Yang et al 2014). Cependant, ces mécanismes impliquent des doses élevées de

doxorubicine (Gewirtz 1999) (Minotti et al 2004). De plus, après réactions radicalaires, médiées par le

fer, les anthracyclines produisent des formaldéhydes, à partir de carbone ou de lipides. La

doxorubicine réagit avec le formaldéhyde généré pour former un intermédiaire appelé DOX-FORM.

De manière intéressante, ce conjugué est capable de s’intercaler dans l’ADN, par liaison covalente très

stable (formation d’une base de Schiff) (Minotti et al 2004). La formation de DOX-FORM renforce de

manière importante la toxicité induite par la doxorubicine (Taatjes and Koch 2001). Des études ont

montré que des niveaux élevés de DOX-FORM étaient détectés dans les cellules tumorales sensibles à

la doxorubicine et non dans des cellules tumorales résistantes ou des cellules normales (Kato et al

2001). Cependant, la formation d’adduits à l’ADN ne semble pas être le mécanisme majeur de la

doxorubicine. En effet, un traitement à la doxorubicine aux doses cliniques entraîne seulement la

formation de 4.4 +/- 1 adduits sur 107 paires de bases de l’ADN (Coldwell et al 2008).

1-6) Libération de céramide (figure 28)

Le céramide est une molécule lipidique, impliquée dans une variété de processus cellulaires, tels que

l’apoptose, la senescence et l’inhibition de la prolifération. De manière intéressante, un traitement des

cellules tumorales sensibles à la doxorubicine induit une augmentation de céramide. Cette

augmentation n’est pas retrouvée dans les cellules tumorales résistantes, suggérant que la quantité de

céramide peut jouer un rôle sur la chimiorésistance (Liu et al 2001). Ainsi, la doxorubicine bloque la

prolifération cellulaire en stimulant la synthèse du céramide et donc l’apoptose. Des études récentes

ont suggéré que la doxorubicine favorise la synthèse du céramide en augmentant la protéolyse de la

protéine membranaire CREB3L1 (Cyclic AMP-responsive Element-Binding protein 3-Like protein 1),

localisée au niveau des membranes du réticulum endoplasmique et de l’appareil de Golgi. La

protéolyse de CREB3L1 libère son domaine amino-terminal, qui peut transloquer au noyau et inhiber

la prolifération cellulaire. De manière intéressante, la production de céramide par la doxorubicine peut

induire cette protéolyse. Le niveau d’expression de CREB3L1 est également associé à la sensibilité à

la doxorubicine (Denard et al 2012). Pour conclure, le ciblage du céramide par la doxorubicine

représente un mécanisme d’action moins connu, mais qui joue un rôle non négligeable dans la

cytotoxicité de la doxorubicine.

94

Figure 28. Résumé des mécanismes d’action cytotoxiques de la doxorubicine. La doxorubicine rentre majoritairement par voie passive dans la cellule. Dans le noyau, elle peut s’intercaler dans l’ADN et inhiber la topoisomérase II, ce qui crée des dommages à l’ADN et la mort cellulaire. La doxorubicine peut être oxydée en structure semiquinone dans la mitochondrie et générer des ROS, par retour à la forme quinone initiale. Les ROS induisent des dommages à l’ADN, la péroxydation des lipides et la mort cellulaire. Enfin la doxorubicine favorise la synthèse de céramide, qui va induire la protéolyse de CREB3L1 membranaire. CREB3L1 peut transloquer au noyau et favoriser la transcription de gènes cibles comme p21, aboutissant à l’arrêt du cycle et la mort cellulaire.

2) Les mécanismes de résistance de la doxorubicine

2-1) Généralités

En dépit des multiples mécanismes d’action de la doxorubicine convergeant vers la mort des cellules

tumorales, l’apparition de résistance est fréquemment observée. A l’échelle cellulaire, la résistance

thérapeutique est définie par la capacité des cellules tumorales à survivre et à proliférer après un

traitement anti-tumoral. On appelle multi-résistance ou MDR (Multidrug Resistance), le fait que les

cellules tumorales développent une résistance à différentes molécules non reliées structurellement et

présentant des mécanismes d’action différents. Décrit pour la première fois en 1970, ce phénotype est

majoritairement responsable de l’échec thérapeutique anti-tumoral dans la plupart des cancers

(Stavrovskaya 2000). La résistance peut provenir des cellules tumorales elles-mêmes ou bien du

microenvironnement tumoral. Les cellules tumorales résistent aux traitements par le biais de plusieurs

95

mécanismes. Les mécanismes de résistance sont divisés en deux catégories : la résistance intrinsèque

et la résistance acquise. La résistance intrinsèque se développe dès le premier contact avec l’agent

anti-cancéreux et suggère la présence initiale de facteurs entravant l’action cytotoxique de la

chimiothérapie. La résistance acquise se développe durant le traitement des tumeurs, initialement

sensibles à la chimiothérapie. Ce type de résistance est souvent associé au développement de

mécanismes adaptatifs durant le traitement, comme une modification de l’expression de la cible

thérapeutique ou l’activation de voies de signalisation compensatoires (Holohan et al 2013). En fait,

suite à l’induction d’un stress, tel qu’un traitement par un agent anti-cancéreux, la cellule tumorale met

en place des mécanismes de défense, afin de limiter la cytotoxicité liée à la drogue, ce qui favorise la

résistance. De plus, les tumeurs contiennent un degré d’hétérogénéité moléculaire et cellulaire élevé,

suggérant que la chimiorésistance peut favoriser la sélection d’une sous-population minoritaire

résistante (Swanton 2012). De manière intéressante, certains mécanismes de résistance de la

doxorubicine peuvent être communs à d’autres drogues. Parmi les mécanismes les plus retrouvés, on

distingue une modification de la disponibilité intra-tumorale du médicament, une altération de la cible

de la drogue, une augmentation des mécanismes de réparation des dommages à l’ADN, une

dérégulation des systèmes de mort cellulaire, une activation de facteurs favorisant la survie cellulaire

et l’EMT (Holohan et al 2013).

2-2) Modification de la disponibilité intra -tumorale du médicament (figure 29)

L’altération de la disponibilité de la drogue représente la première ligne de défense de la cellule

tumorale, en empêchant son entrée dans la cellule (influx), en favorisant sa sortie (efflux) ou en la

métabolisant. Ces trois mécanismes peuvent fonctionner indépendamment ou en synergie. Les

mécanismes d’efflux ont un rôle très important dans les mécanismes de résistance et plus

particulièrement dans la résistance à la doxorubicine. L’efflux nous a particulièrement intéressés lors

de mes travaux de thèse et les différents mécanismes d’efflux seront détaillés dans la partie suivante.

a) L’influx

La famille des protéines SLC (Solute carrier) est constituée de transporteurs membranaires dont leur

fonction principale est l’entrée intra-cellulaire de différents substrats, tels que des métaux, des cations

organiques, des anions, des phosphates, des sucres, des acides aminés, des acides monocarboxyliques,

des oligopeptides, des nucléosides et des vitamines hydrosolubles. Ces transporteurs sont impliqués

dans l’influx de drogues hydrosolubles et de petites molécules, telles que les sels de platine et le

méthotrexate (Januchowski et al 2013) (Lal et al 2010). Une diminution de l’expression des

transporteurs SLC a été associée à une chimiorésistance (Januchowski et al 2013) (Huang and Sadee

2006). De par sa structure plutôt hydrophobe, la doxorubicine a la capacité à traverser les membranes

et rentre dans la cellule majoritairement par voie passive (Huang and Sadee 2006). Cependant, le

96

transporteur SLC22A16, responsable de l’influx de cations organiques, a la capacité à prendre en

charge la doxorubicine. Quelques études ont mis en évidence que ce transporteur peut influencer la

chimiosensibilité et la chimiorésistance des cellules à la doxorubicine. En effet, une transfection stable

de SLC22A16 dans des cellules leucémiques Jurkat confère une sensibilité plus importante des

cellules à la doxorubicine (Bray et al 2010). De manière intéressante, une étude clinique a révélé qu’un

polymorphisme génétique sur le transporteur SLC22A16 est associé à la réponse au traitement AC

(doxorubicine-cyclophosphamide) des cancers du sein (Bray et al 2010). Cependant, de par la

lipophilie de la doxorubicine, l’influx n’exerce qu’un rôle minoritaire dans sa résistance.

b) La métabolisation de la drogue

La métabolisation d’une drogue est un processus physiologique qui permet l’inactivation et

l’élimination de cette drogue. Ainsi, une augmentation de la métabolisation d’un agent anti-cancéreux

peut entraîner son inefficacité et donc une résistance. Plusieurs enzymes sont impliquées dans ce

processus, telles que le cytochrome P450, les carbonylreductases, les aldéhydes déshydrogénases et les

enzymes de détoxification des ROS (les glutathion S-transférases (GST), le glutathion (GSH), la

superoxyde dismutase (SOD), la catalase et la glutathion péroxydase) (Jamieson and Boddy 2011).

- Les carbonylreductases. Ce sont des enzymes ubiquitaires, cytosoliques, qui catalysent la réduction

de différents substrats, tels que des aldéhydes, des cétones, des quinones et autres xénobiotiques. Elles

ont un rôle dans la détoxification de drogues, dans le métabolisme cellulaire, dans la transduction du

signal et dans l’apoptose. Les carbonylreductases 1 et 3 (CBR1 et 3) métabolisent la doxorubicine en

doxorubicinol, moins cytotoxique que la doxorubicine (Rosemond and Walsh 2004). Une étude a mis

en évidence qu’un traitement de la lignée tumorale mammaire MCF-7 à de faibles doses de

doxorubicine, induit une augmentation de CBR1 ; processus accompagné d’une diminution intra-

cellulaire de la doxorubicine. Ces données suggèrent que les cellules tumorales peuvent promouvoir le

métabolisme inactivateur de la doxorubicine, dans un but de détoxification (Gavelova et al 2008).

D’autre part, il existe des polymorphismes génétiques de ces enzymes, ce qui peut avoir un rôle

potentiel dans la résistance à la doxorubicine, mais ces processus n’ont pas été bien caractérisés dans

le contexte de la chimiorésistance (Jamieson and Boddy 2011) (Thorn et al 2011).

- Métabolisation des ROS. Un des mécanismes d’action de la doxorubicine est de former des ROS.

Ce processus est généré par différentes enzymes, telles que la xanthine deshydrogénase, la NAD(P)H

oxydase et l’oxyde nitrique synthase (NOS) (Jamieson and Boddy 2011). D’autres enzymes sont

impliquées dans la détoxification des ROS, telles que la superoxyde dismutase (SOD), la catalase, la

glutathion peroxydase et la glutathion S-transferase (GST). Il existe des polymorphismes génétiques

de la NOS et de la SOD, associés à la réponse à la chimiothérapie. Par exemple, un polymorphisme de

la SOD2 est associé à un mauvais pronostic de patients atteints d’un cancer du sein traités par

doxorubicine. Mais cet effet n’est pas retrouvé pour les patients traités par une autre chimiothérapie

97

(Glynn et al 2009). Une étape clé de l’inactivation cellulaire des xénobiotiques est l’enzyme GST, qui

permet la conjugaison de la drogue avec le glutathion (GSH). Ainsi les médicaments, notamment les

sels de platine (cisplatine, oxaliplatine) et le cyclophosphamide, se lient de manière covalente au GSH.

Certaines pompes d’efflux, telles que le transporteur ABCC1, peuvent reconnaître les drogues

associées au GSH et favoriser ainsi leur expulsion de la cellule (Coley 2008). On a ainsi pu observer

des surexpressions de GSH et GST dans des lignées tumorales résistantes à la doxorubicine (O'Brien

et al 2000).

2-3) Modifications de la topoisomérase II (figure 29)

La sensibilité des drogues peut être affectée par des altérations de leur cible, comme des mutations,

des modifications post-traductionnelles ou des changements de leur niveau d’expression. Le

mécanisme d’action primaire de la doxorubicine est de bloquer l’action de la topoisomérase II. Il

existe une corrélation entre le niveau d’expression de la topo2 et la sensibilité aux anthracyclines. Les

études in vitro et in vivo ont montré une plus forte sensibilité des cellules qui surexpriment l’enzyme et

une résistance des cellules dans lesquelles elle est réprimée, mais ce processus n’a pas été bien

caractérisé dans les études cliniques (Beck et al 1993) (Burgess et al 2008). De manière intéressante,

une association est apparue entre l’amplification de l’oncogène HER2 et le pronostic des patientes

atteintes de cancers du sein, traitées par une chimiothérapie à base d’anthracyclines. En effet, le gène

codant pour la topo2α est associé au gène HER2 par sa localisation sur le chromosome 17. Ainsi, une

co-amplification de ces deux gènes est fréquemment retrouvée en clinique. Ce type de tumeurs serait

plus sensible aux régimes de chimiothérapie à base d’anthracyclines, que les tumeurs HER2+

uniquement (Park et al 2003). Une corrélation clinique entre l’expression de TIMP-1 (Tissue inhibitor

metalloproteinase – 1) et HER2 ou topo2 a également été suggérée. Un profil HT (HER2 amplifié

et/ou TIMP-1 négatif) ou 2T (topo2α aberrant et/ou TIMP-1 négatif) sur des tumeurs mammaires

serait associé à un bon pronostic en terme de mortalité (mais pas en terme de survie sans maladie) pour

des patientes traitées par chimiothérapie à base d’anthracyclines (Ganapathi and Ganapathi 2013)

(Ejlertsen et al 2010) (Hertel et al 2012). Généralement, les cellules présentant des mutations de la

topo2 et donc une moindre réponse à la doxorubicine, sont également moins sensibles aux autres

chimiothérapies ciblant la topo2, tels que l’étoposide (VP-16) et les épipodophyllotoxines (Coley

2008). De plus, des mutations ponctuelles de la topo2 ont été trouvées dans des lignées résistantes à la

doxorubicine. Cependant, le rôle fonctionnel de ces formes mutées est controversé car elles n’ont

généralement pas été observées chez les patients présentant des tumeurs résistantes (Ganapathi and

Ganapathi 2013). D’autres facteurs peuvent influencer la formation de complexes covalents ADN-

topo2, comme les modifications post-traductionnelles de la topo2 (ubiquitination, sumoylation,

phosphorylation) et les interactions avec d’autres protéines qui modulent son activité enzymatique

(Ganapathi and Ganapathi 2013). L’ensemble de ces données suggère que les modifications de la

98

topoisomérase II peuvent avoir un rôle important dans la résistance à la doxorubicine et également aux

autres poisons de la topo2 (étoposide, épipodophyllotoxines) mais ce processus ne peut pas expliquer

la résistance à d’autres agents anti-cancéreux ayant des mécanismes d’action différents.

2-4) La réparation des dommages à l’ADN (figure 29).

La doxorubicine induit des dommages à l’ADN, de par son intercalation à l’ADN, son inhibition de la

topo2 et la production de ROS. Les réponses cellulaires associées à la production de dommages à

l’ADN sont la réparation et la mort cellulaire si les dommages sont trop conséquents. Il existe

différents systèmes de réparation des dommages à l’ADN en fonction du type de lésion et de la phase

du cycle où se trouvent les cellules tumorales. On distingue : la MMR (Mismatch Repair), la NER

(Nucleotide Excision Repair), la BER (Base Excision Repair), la HR (Homologous Recombination),

l’ICL (Interstrand Crossling) et la NHEJ (Non-Homologous End-Joining) (Bouwman and Jonkers

2012). La doxorubicine induit des cassures double-brin de l’ADN ou DSBs (DNA double strand

breaks), qui sont les lésions de l’ADN les plus cytotoxiques et sont essentiellement réparées par HR et

NHEJ (Asakawa et al 2010). La capacité de réponse aux dommages ou DDR (DNA Damage Repair) a

une influence majeure sur l’efficacité des chimiothérapies ciblant l’ADN. Les différentes altérations de

la DDR peuvent avoir des conséquences similaires. En effet, une augmentation de la DDR permet à la

cellule de mieux « réparer » les lésions induites par la drogue et donc d’inhiber son action. A l’inverse,

une déficience dans les mécanismes de réparation confère une chimiosensibilité aux traitements, mais

en même temps génère une instabilité génomique, à l’origine de l’accumulation d’altérations

génétiques supplémentaires en faveur d’une résistance aux traitements et à la progression de la tumeur

(Bouwman and Jonkers 2012). Par exemple, des études ont mis en évidence qu’une augmentation de

la DDR (par recombinaison homologue) est associée à des tumeurs mammaires plus résistantes au

traitement néoadjuvant EC (Epirubicine-Cyclophosphamide) (Asakawa et al 2010). Cependant, des

mutations sur BRCA1 entraînent une diminution de la réparation par recombinaison homologue, qui

mène à une instabilité génomique et à une chimiorésistance (Coley 2008). De la même manière, une

déficience dans la MMR a également été associée à une résistance aux anthracyclines mais pas aux

taxanes, via l’accumulation d’altérations génétiques (Fedier et al 2001). Au final, les dommages à

l’ADN induisent un arrêt du cycle cellulaire, afin de laisser le temps nécessaire aux cellules d’initier

les mécanismes de réparation de l’ADN. Dans certains cancers, la régulation de l’arrêt du cycle

cellulaire est altérée, liée à la surexpression d’oncogène ou la diminution de gènes suppresseurs de

tumeurs. Par exemple, des mutations de p53 qui est un régulateur important de nombreux « points de

contrôle » (checkpoint) du cycle cellulaire, peuvent altérer la DDR. P53 est aussi impliqué dans

l’apoptose et sa mutation est fréquemment associée à une résistance aux drogues (voir sous-partie

suivante) (Holohan et al 2013).

99

2-5) Echappement à la mort cellulaire (figure 29)

Outre l’efficacité de leur système de réparation, les cellules tumorales peuvent également résister aux

chimiothérapies en échappant à la mort induite par le traitement. Les principaux types de mort

cellulaire induits par la doxorubicine sont l’apoptose, l’autophagie et la nécrose. Ces différents types

de mort cellulaire sont spécifiquement induits en fonction de la concentration de doxorubicine

délivrée, la durée de traitement et le type de cancer (Tacar et al 2013). L’apoptose est la mort qui est

majoritairement associée à des traitements induisant des dommages à l’ADN. L’inhibition de facteurs

pro-apoptotiques (Bax, Bad, Bid) ou l’activation de facteurs anti-apoptotiques (Bcl-xL, Bcl-2) sont le

plus souvent responsables d’une résistance à l’apoptose et donc à une résistance aux chimiothérapies

(Holohan et al 2013). Parmi les gènes qui influencent la réponse apoptotique, p53 et Bcl-2 (B-cell

lymphoma 2) ont un rôle crucial (Perego et al 2001). P53, qui est un régulateur important du cycle

cellulaire est activé en réponse aux dommages à l’ADN et permet l’induction de l’apoptose. Il est muté

dans environ 50% des cas et sa mutation est étroitement liée à une résistance aux drogues

(Chuthapisith et al 2006). Par exemple, une étude réalisée par Geisler et al. a mis en évidence dans des

tumeurs mammaires, qu’une mutation sur p53 est corrélée à une résistance à la doxorubicine (Geisler

et al 2001). Les protéines anti-apoptotiques inhibent l’insertion des protéines pro-apoptotiques dans la

membrane mitochondriale nécessaire à la libération du cytochrome c ; processus important dans

l’induction de l’apoptose. La doxorubicine est également capable de diminuer l’expression de Bcl-2,

ce qui suggère l’importance de ce facteur dans l’induction de la mort induite par la doxorubicine et

donc son implication potentielle dans les mécanismes de résistance (Tacar et al 2013).

Comme décrite dans le paragraphe sur les mécanismes d’action de la doxorubicine, une des fonctions

cytotoxiques de la doxorubicine est de cibler la production de céramide. Une modification de ce lipide

peut également promouvoir la chimiorésistance. Suite à un traitement à la doxorubicine, une

augmentation du céramide, pro-apoptotique, est observée. L’induction du céramide augmente

également la GCS (Glucosylceramide synthase), qui permet la conversion du céramide vers sa forme

glucosylée. Ce processus permet à la cellule d’enclencher une réponse adaptative face au stress et donc

une chimiorésistance. Le mécanisme précis, qui permet le switch de la signalisation pro-apoptotique,

via le céramide, vers une signalisation anti-apoptotique est encore mal connu (Liu et al 2008).

L’autophagie est un processus de dégradation lysosomale, qui permet la dégradation des organelles

cellulaires et des protéines, dans le but de maintenir la biosynthèse et la viabilité cellulaire lors d’un

stress métabolique (Holohan et al 2013). Cependant, le rôle de l’autophagie dans le cancer est

paradoxal : en effet, elle exerce, d’une part, un rôle suppresseur de tumeurs mais, d’autre part, favorise

la résistance aux drogues, en facilitant la survie cellulaire durant un stress métabolique (Holohan et al

2013). Des études suggèrent que la doxorubicine est capable d’induire l’autophagie. Une étude a

montré que l’inhibition de l’autophagie et de HMGB1 ((High mobility group box 1), qui possède un

100

rôle dans la réplication ainsi que la réparation de l’ADN et dans la régulation de l’autophagie),

augmente la chimiosensibilité à la doxorubicine de cellules d’ostéosarcomes in vitro et in vivo (Huang

et al 2012).

2-6) La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT)

Des études récentes ont établi un lien entre l’EMT et la chimiorésistance (Holohan et al 2013). Pour

rappel, l’EMT est la transition d’une cellule épithéliale, qui présente une organisation polarisée et des

jonctions cellule-cellule, vers un phénotype mésenchymateux plus agressif, associé à une

augmentation des capacités migratoires et invasives (voir partie I). Afin de résister aux drogues, les

cellules tumorales peuvent réaliser une EMT comme moyen de défense contre les agents anti-

cancéreux. En effet, l’apparition progressive d’une résistance a été associée à un switch vers un

phénotype d’EMT. De manière intéressante, ces cellules possèdent également des marqueurs de CSCs

(cellules souches cancéreuses) (Housman et al 2014) (Holohan et al 2013). Ce type de processus a été

notamment décrit après un traitement à la doxorubicine et a été associé à une multi-résistance (MDR)

(Tsou et al 2015). De nombreux médiateurs sont à l’origine de ce phénomène, tels que des micro-ARN

(miRNA), le récepteur au TGF-β et des modifications épigénétiques (Housman et al 2014) (Han et al

2014) (Jiang et al 2014). De manière intéressante, les cellules stromales peuvent exercer un rôle de

support dans l’induction et le maintien de l’EMT induite par la chimiothérapie, permettant ainsi une

chimiorésistance qui perdure dans le temps (voir partie I) (Housman et al 2014).

101

Figure 29. Résumé des mécanismes intra-cellulaires de résistance à la doxorubicine. Les cellules tumorales peuvent diminuer la quantité intra-cellulaire de doxorubicine, en 1) favorisant sa sortie, via un mécanisme d’efflux, en diminuant son entrée, via les pompes d’influx, et 2) en favorisant sa métabolisation et la détoxification des ROS qu’elle produit. 3) La topoisomérase peut également être modifiée, ce qui empêche l’action de la doxorubicine. 4) Une augmentation / altération des mécanismes de réparation des dommages à l’ADN peut également avoir lieu et enfin 5) des mécanismes d’échappement à la mort cellulaire peuvent se produire. DOX pour doxorubicine, GCS pour glucosylcéramide synthase, SOD pour superoxyde dismutase, CAT pour catalase, GST pour glutathion-S transferase.

3) Mécanismes d’efflux de la doxorubicine

Comme mentionné précédemment, le phénotype de multi-résistance est classiquement défini par le fait

que les cellules tumorales sont ou deviennent résistantes simultanément à différents médicaments anti-

néoplasiques qui ne possèdent pas la même structure ni les mêmes cibles thérapeutiques. Les premiers

mécanismes qui ont décrit ce phénotype ont été associés à une surexpression des pompes d’efflux,

telles que les transporteurs ABC. Cependant, il est maintenant clair que le processus de multi-

résistance est multifactoriel. Une augmentation des voies anti-apoptotiques et des mécanismes de

détoxification peuvent avoir des conséquences générales sur plusieurs molécules

chimiothérapeutiques. De plus, d’autres processus, tels que la séquestration de la drogue dans des

102

vésicules ou bien la surexpression de protéines impliquées dans l’efflux nucléaire, telles que la MVP /

LRP (Major Vault Protein / Lung Resistance Protein) peuvent expliquer l’efflux de nombreuses

thérapies (Larsen et al 2000).

3-1) Les transporteurs ABC

L’implication de la famille des transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) figure parmi les

mécanismes de multi-résistance les plus connus car ils représentent la première ligne de défense de la

cellule. De plus, ces protéines constituent un des mécanismes de résistance prédominants de la

doxorubicine (Kathawala et al 2015).

a) Généralités

La superfamille des transporteurs ABC représente l’une des plus grandes familles de protéines, tant

par leur nombre que par leurs fonctions biologiques. Ce sont des protéines membranaires, présentes

sur les membranes plasmiques et sur les membranes des organelles intra-cellulaires. Leur fonction

principale est le transport unidirectionnel de substrats à travers la membrane plasmique, contre un

gradient de concentration ; on les appelle également « pompes d’efflux » (Kathawala et al 2015). Ces

transporteurs peuvent prendre en charge une grande variété de substrats, tels que des sucres, des acides

aminés, des drogues hydrophobes, des antibiotiques, des lipides, des stérols, des sels biliaires, des

peptides, des nucléotides, des métabolites endogènes et des ions (Sharom 2008). Actuellement chez

l’Homme, 49 membres de la famille des transporteurs ABC ont été isolés et identifiés, répartis dans 7

sous-familles de ABCA à ABCG, caractérisées par la nature du substrat transporté. Il est à noter

qu’une petite partie des protéines ABC est composée de protéines solubles qui ne font pas partie des

transporteurs membranaires. Les transporteurs ABC présentent une grande conservation dans leur

séquence et dans leur organisation structurale. Une protéine est classée en tant que membre de la

famille ABC lorsqu’elle possède un domaine ATP-binding cassette. Ces domaines sont distinctifs et

conservés au sein de la famille des transporteurs ABC. L’unité fonctionnelle d’un ABC transporteur

entier comprend 2 domaines transmembranaires ou TMD (Transmembrane Domains), qui forment un

pore permettant la fixation et le passage du substrat et 2 domaines cytoplasmiques appelés NBD

(Nucleotide-Binding Domains) ou ATP-binding domains, qui permettent de lier et d’hydrolyser l’ATP

(Schneider and Hunke 1998) (figure 30). Les protéines de la sous-famille ABCC possèdent un

domaine transmembranaire supplémentaire en N-terminal, dont la fonction est actuellement inconnue.

Il existe également des demi-transporteurs, tels qu’ABCG2 (encore appelé BCRP pour Breast Cancer

Resistance Protein), qui possède uniquement un domaine TMD et un domaine NBD. ABCG2 a

également la particularité d’avoir une structure inversée : le NBD est positionné du côté N-terminal.

Pour former un transporteur actif, ABCG2 devra être associé sous forme d’homo- ou hétéro-dimères

(figure 30) (Scotto 2003) (Sharom 2008).

103

Un des modèles proposés expliquant le mécanisme de transport des protéines ABC a été appelé « ATP

switch model » ; il nécessite 7 étapes successives. Initialement sous forme « ouverte », le transporteur

peut accueillir un substrat qui se fixe sur les TMD. Cette fixation permet l’initiation du cycle et induit

un changement conformationnel qui rapproche les 2 domaines NBD, permettant ainsi la fixation de 2

molécules d’ATP : le transporteur passe alors sous forme « fermée ». La liaison de l’ATP provoque un

nouveau changement conformationnel, propice à l’expulsion du substrat dans le compartiment opposé.

Les deux molécules d’ATP sont hydrolysées successivement, ce qui déstabilise le dimère de NBD et

provoque la libération de l’ADP et du Pi (phosphate inorganique). Le transporteur retrouve alors sa

forme « ouverte », prêt à accueillir un nouveau substrat (Higgins and Linton 2004).

Figure 30. Structure des principaux transporteurs ABC. (a) ABCB1 (MDR1) possède 2 domaines transmembranaires (TMD) et 2 domaines NBD. (b) ABCC1 (MRP1) possède 3 TMD et 2 NBD. Le TMD supplémentaire est orienté du côté N-terminal. (c) ABCG2 (BCRP) est un demi-transporteur ; il possède 1 TMD et 1 NBD. Il doit être dimérisé pour être actif (d’après (Scotto 2003)).

b) Transporteurs ABC et multi-résistance

La plupart des transporteurs ABC ont un rôle de protection des cellules contre des molécules

endogènes toxiques et contre des xéniobiotiques, en favorisant leur expulsion. La surexpression de

104

certains transporteurs ABC dans les tumeurs a été étroitement corrélée à une résistance croisée à

différentes molécules anti-néoplasiques. Ce processus peut être intrinsèque donc observé avant

l’initiation du traitement ou bien acquis, c’est-à-dire qu’un traitement peut, en lui-même, initier la

surexpression des protéines ABC dans les tumeurs (Videira et al 2014). De plus, des polymorphismes

génétiques de ces transporteurs existent, ce qui peut expliquer les différences de chimiosensibilité au

sein des populations (Sharom 2008) (Jamieson and Boddy 2011). Parmi les transporteurs ABC,

ABCB1, ainsi que les transporteurs de la sous-famille ABCC et ABCG2 ont été particulièrement

étudiés dans ce processus de chimiorésistance et seront décrits dans les parties suivantes. Cependant,

parmi les 49 transporteurs ABC identifiés, 16 ont été associés à la chimiorésistance (Fletcher et al

2010) (figure 31). La doxorubicine est connue pour être un substrat de plusieurs transporteurs :

ABCB1, quelques ABCCs et ABCG2 et également d’autres transporteurs ABC, tels qu’ABCA3,

ABCB4, ABCB5 et ABCD8 (Jamieson and Boddy 2011) (Lal et al 2010). De manière intéressante,

d’autres chimiothérapies majeures, telles que les taxanes, ont également été décrites comme étant

substrats des transporteurs ABC (Holohan et al 2013). Les taxanes (paclitaxel et docétaxel) sont des

molécules naturelles, dont le mécanisme d’action principal est la stabilisation du réseau de

microtubules, ce qui induit un arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose (McGrogan et al 2008).

c) La glycoprotéine P

Découverte en 1976 par Juliano et Ling, la glycoprotéine P, encore appelée P-gp, MDR-1 (Multidrug

Resistance-1) ou ABCB1 a été le premier transporteur ABC identifié et demeure la pompe d’efflux la

plus étudiée dans les mécanismes de multi-résistance (Juliano and Ling 1976). Elle est le produit du

gène MDR-1, localisé sur le chromosome 7. Elle comprend 2 TMD et 2 NBD, répartis en 12 domaines

transmembranaires (figures 30 et 32). Physiologiquement, la P-gp est majoritairement exprimée dans

les tissus excréteurs, au niveau de la membrane apicale des cellules épithéliales et des cellules

endothéliales (Videira et al 2014). Elle agit comme une pompe d’efflux des xénobiotiques dans

plusieurs tissus, tels que les intestins, le foie, le rein, le placenta et la barrière hémato-encéphalique

(Chuthapisith et al 2006) (Videira et al 2014). La P-gp transporte une variété de substrats neutres ou

cationiques, de nature modérément lipophile. Sa surexpression a été associée à la résistance aux

anthracyclines (doxorubicine, daunorubicine, épirubicine, mitoxanthrone), aux vinca-alcaloïdes

(vinblastine, vincristine), aux taxanes (paclitaxel, docetaxel), aux épipodophyllotoxines (étoposide,

ténoposide), aux camptothécines (topotecan), aux anti-métabolites (cytarabine), aux acridines

(amsacrine), aux anthracènes (bisantrène), aux antibiotiques (actinomycine D) et ainsi qu’aux

inhibiteurs de tyrosine kinase (Imatinib, nilotinib, erlotinib) (Chuthapisith et al 2006) (Kathawala et al

2015) (Sharom 2008) (Coley 2008). La P-gp est surexprimée dans de nombreuses tumeurs et son

expression peut également être induite par différentes chimiothérapies. Ainsi, la P-gp a été associée à

l’échec thérapeutique dans plusieurs cancers, tels que le cancer du rein, du côlon, du foie, du sein, de

l’ovaire, de la tête et du cou, les leucémies et les lymphomes (Holohan et al 2013) (Chuthapisith et al

105

2006). Une étude portant sur plus de 400 tumeurs de côlon, du rein, du pancréas, de l’ovaire et du foie

a montré que les tumeurs présentant une augmentation de l’expression de MDR-1 tendent à être plus

résistantes à la chimiothérapie (Goldstein et al 1989).

Figure 31. Liste des transporteurs ABC impliqués dans la chimiorésistance et leurs principaux substrats. ABC : ATP Binding Cassette, cAMP : cyclic AMP, cGMP : cyclic GMP, LT : leukotriene, ND : Not Determined, PAF : platelet activation factor, PG : prostaglandin, S1P : sphingosine-1-phosphate, TX : thromboxane (d’après (Fletcher et al 2010)).

106

Figure 32. Structure de la glycoprotéine P (d’après (Fojo and Coley 2007)).

Une méta-analyse réalisée par Trock et al. a mis en évidence que 41.2% des tumeurs mammaires

surexpriment la P-gp et que cette surexpression est associée à des tumeurs 3 fois plus résistantes au

traitement. De manière intéressante, une exposition aux chimiothérapies ou aux hormonothérapies

augmente de 1.8 la proportion de tumeurs exprimant la P-gp (Clarke et al 2005) (Trock et al 1997).

Certaines protéines peuvent être co-exprimées avec la P-gp comme la cyclooxygenase-2 (COX-2). Des

études ont mis en évidence, que cette co-expression dans les cancers du sein est associée à des tumeurs

de mauvais pronostic (Surowiak et al 2005). L’association entre la surexpression de la P-gp et la

résistance à la doxorubicine est établie depuis longtemps. Les souris MDR1-/- présentent une

accumulation plus importante de la doxorubicine, liée à une altération de sa pharmacocinétique. Chez

ces souris, on observe une augmentation de la doxorubicine et du doxorubicinol dans de nombreux

tissus, une augmentation du volume de distribution et de la demi-vie, ainsi qu’une diminution de la

clairance (van Asperen et al 1999). Hormis son rôle dans l’efflux de drogues, la P-gp peut être

impliquée dans de nombreux processus tumorigéniques. Par exemple, dans le cancer du sein, la

surexpression de la P-gp est associée à des tumeurs mammaires, présentant un phénotype plus agressif

et de plus mauvais pronostic, caractérisé par des capacités invasives et prolifératives plus importantes

(Zhang et al 2014) (Raguz et al 2004). Compte tenu des conséquences importantes sur la progression

tumorale, il est important de connaître les facteurs qui régulent l’expression de la P-gp. Il a été suggéré

que la surexpression de la P-gp résulte de l’amplification du gène MDR-1, l’augmentation de la

transcription du gène MDR-1, des modifications de l’efficacité de la traduction de MDR-1, des

mutations sur le gène et des réarrangements chromosomiques qui aboutissent à la production de gènes

107

hybrides (Videira et al 2014). De nombreux facteurs peuvent réguler positivement l’expression de la

P-gp, notamment certaines protéines impliquées dans la voie de signalisation MAPK, telles que c-Raf

(proto-oncogene serine-threonine protein kinase), MEK1/2 (Mitogen-activated protein kinase 1/2), la

PI3K, la β-caténine, le NF-κB, ainsi que les facteurs de croissance EGF et FGF (Videira et al 2014)

(Housman et al 2014). A l’inverse, HSP90 (Heat schock protein-90) et p53 régulent négativement

l’expression de la P-gp (Housman et al 2014) (Scotto 2003). De plus, la P-gp peut être régulée par des

stress environnementaux, tels que l’hypoxie (HIF-1α) ou l’inflammation (IL-6) (Scotto 2003). De

manière intéressante, un lien entre EMT et surexpression des transporteurs ABC a été démontré in

vitro. En effet, une induction de l’EMT dans les cellules tumorales augmente l’expression des

transporteurs ABC, ce qui est associé à une chimiorésistance, à une migration et à une invasion des

cellules tumorales plus importantes (Saxena et al 2011). Ainsi, le ciblage de la P-gp représente une

approche thérapeutique prometteuse. De nombreux inhibiteurs, compétitifs ou non, existent, tels que

les inhibiteurs de première génération peu spécifiques (vérapamil, cyclosporine A), les inhibiteurs de

deuxième génération (valspodar, biriquodar) et les inhibiteurs de troisième génération très spécifiques

(zosuquidar, tariquidar, elacridar) (Videira et al 2014) (Sharom 2008). Cependant, l’exploitation

clinique de ces inhibiteurs s’est révélée relativement décevante. L’utilisation clinique des inhibiteurs

de première et deuxième générations a été associée à une toxicité très importante, empêchant leur

utilisation (Thomas and Coley 2003). Le tariquidar (XR9576) a montré une activité limitée en

combinaison avec les anthracyclines ou les taxanes dans une petite cohorte de femmes atteintes d’un

cancer du sein, de stade III ou IV (Pusztai et al 2005). Le zosuquidar (LY335979), en phase III, dans

les leucémies aigues s’est révélé significativement efficace, mais pas dans le cancer du sein en

combinaison avec le docetaxel en phase II (Jemal et al 2009) (Ruff et al 2009). L’efficacité limitée de

ces inhibiteurs peut être liée à une pharmacocinétique non optimale (demi-vie courte), un accès

tumoral aux inhibiteurs limité, à une forte redondance entre les transporteurs de la famille ABC ou à

l’implication des autres mécanismes de chimiorésistance (Holohan et al 2013) (Fojo and Coley 2007).

d) La sous-famille des MRPs

La famille ABCC ou MRP (Multidrug Resistance – associated Proteins) contient 9 membres (MRP 1 à

11), dont la plupart ont été étudiés dans la chimiorésistance (Fojo and Coley 2007). Les MRPs ont la

capacité de prendre en charge des anions organiques et des drogues conjuguées au glutathion, aux

sulfates ou au glucuronide (Coley 2008). Ainsi, l’efficacité de transport de certaines drogues non

anioniques par les MRPs dépend du pool cellulaire de GSH (Schinkel and Jonker 2003). Chef de file

de cette famille, MRP1 (ABCC1) possède une structure de base similaire à celle de P-gp mais contient

en plus un domaine NBD. Sa structure globale est constituée de 17 domaines transmembranaires

(figure 30). MRP1 a été isolé en 1992 par Cole et al., dans une lignée de cancer du poumon résistante

à la doxorubicine (Cole et al 1992). Physiologiquement, MRP1 est localisé majoritairement dans les

membranes basolatérales des cellules épithéliales polarisées (Schinkel and Jonker 2003). Il a

108

également un rôle protecteur des tissus contre les substances toxiques, tels que la moelle osseuse, le

rein, les muqueuses intestinale et oro-pharyngée et dans la clairance des drogues dans les testicules, et

le péritoine (Sharom 2008). L’induction précoce de MRP1 a été corrélée à des tumeurs de mauvais

pronostic, mais pas à la taille tumorale, l’envahissement ganglionnaire, le grade histologique, le statut

hormonal ou ménopausique (Leonessa and Clarke 2003). L’expression de MRP1 est relativement

faible dans les tumeurs mammaires avant traitement, en comparaison à celles exposées à la

chimiothérapie (Trock et al 1997). Dans une étude portant sur des femmes présentant un cancer du

sein précoce, l’expression de MRP1 est associée à une survie globale et une survie sans maladie, plus

courtes pour des patientes traitées au CMF (Cyclophosphamide, Méthotrexate, 5-FU) mais pas chez

les patients ayant reçus une hormonothérapie (Filipits et al 2005). MRP1 confère une chimiorésistance

aux anthracyclines, aux anti-folates, au méthotrexate, aux épipodophyllotoxines, à la mitoxanthrone,

aux camptothécines, aux vinca-alcaloïdes et aux inhibiteurs de tyrosine kinases, mais pas aux taxanes

ni au cisplatine (Coley 2008) (Kathawala et al 2015).

MRP2 (ABCC2) possède une structure et des substrats similaires à MRP1, sauf qu’à la différence de

MRP1, MRP2 est également capable de prendre en charge le cisplatine (Ishikawa and Ali-Osman

1993). MRP2 est localisé au niveau apical des membranes des cellules polarisées et possède plutôt un

rôle physiologique dans l’élimination hépatobiliaire (Kruh and Belinsky 2003). MRP5 (ABCC5) a

également été décrit comme étant capable de prendre en charge la doxorubicine et le 5-fluorouracile.

Le 5-fluorouracile, qui appartient à la classe des anti-métabolites est un analogue des pyrimidines. Une

fois métabolisé par la cellule en métabolite cytotoxique, il s’incorpore à l’ADN et à l’ARN, afin

d’aboutir à la mort cellulaire. A l’inverse de ce qui est observé pour la doxorubicine, les pompes

d’efflux classiques ne représentent pas le mécanisme majoritaire de résistance au 5-FU. Cependant,

des études émergentes ont montré qu’il pouvait être pris en charge par certaines pompes d’efflux,

telles qu’ABCB6, ABCC5 et ABCG2 (Wang et al 2013a) (Minami et al 2014) (Nies et al 2015). Il

semble qu’ABCC5 exerce un rôle important dans la chimiorésistance à la doxorubicine dans le cancer

du sein (Lal et al 2010). En effet, les cellules transfectées avec ABCC5 seraient 2 fois plus résistantes

à cet agent anti-néoplasique (Pratt et al 2005). De par l’importance des MRPs dans la

chimiorésistance, certains inhibiteurs ont été développés, tels que les leucotriènes, le MK571, le

sulindac, et le Genistein (Videira et al 2014). Certains inhibiteurs, comme le vérapamil et le

disulfiram, peuvent cibler plusieurs pompes d’efflux, notamment ABCB1 et ABCC1 (Sharom 2008).

D’autres MRPs ont également été corrélés à la chimiorésistance de la doxorubicine, tels que MRP6,

mais les mécanismes moléculaires ont été peu décrits dans ce cas (Chuthapisith et al 2006).

e) La BCRP

ABCG2 ou BCRP (Breast Cancer Resistance Protein) a été initialement découverte en 1998 dans des

cellules tumorales mammaires MCF-7 résistantes à la doxorubicine (Doyle et al 1998). C’est un demi-

109

transporteur, composé de 6 domaines transmembranaires (figure 30). BCRP est localisée sur la

membrane apicale de certains tissus sains, tels que les ovaires, le cœur, le placenta, les intestins et les

reins ainsi que sur l’endothélium microvasculaire (Kathawala et al 2015). Elle exercerait un rôle de

détoxification des xénobiotiques comme les autres pompes d’efflux (Chuthapisith et al 2006)

(Schinkel and Jonker 2003). Elle a également été impliquée dans la chimiorésistance aux

anthracyclines, au méthotrexate, au mitoxanthrone, aux inhibiteurs du topoisomérase I, du 5-FU mais

pas ou faiblement pour les taxanes, la vincristine et le cisplatine (Schinkel and Jonker 2003) (Wang et

al 2013a). Même si elle a été découverte dans le cancer du sein, elle a depuis été retrouvée dans de

nombreuses tumeurs solides, telles que les cancers du tractus gastro-intestinal, de l’ovaire, de

l’estomac, du côlon, de l’endomètre, du poumon, le mélanome et de cancers hématologiques

(Kathawala et al 2015) (Chuthapisith et al 2006). De façon intéressante, BCRP est également présente

dans des cellules tumorales résistantes, qui n’expriment ni P-gp ni MRP1 (Sharom 2008). Certaines

études cliniques ont établi un lien entre la surexpression de BCRP dans les leucémies myéloïdes et un

mauvais pronostic ainsi qu’une mauvaise réponse au traitement (Robey et al 2007). De manière

intéressante, BCRP est exprimée dans une petite sous-population de cellules, qui présentent des

caractéristiques de cellules-souches (CD34+), connues pour avoir un rôle très important dans le

processus de rechutes (Tang et al 2012). Parmi les facteurs de régulation de l’expression de BCRP, on

trouve les œstrogènes qui inhibent sa transcription (Coley 2008). Des études ont mis en évidence que

BCRP est capable d’interagir positivement avec la cavéoline-1, protéine impliquée dans la

signalisation intra-cellulaire et dans les mécanismes de transport (Videira et al 2014). Les cytokines

pro-inflammatoires, telles que l’IL-1β et le TNF-α augmentent aussi l’expression de BCRP (Videira et

al 2014) (Wang et al 2010) (Zhang et al 2011). A l’inverse, comme pour la P-gp, la protéine p53

inhibe son expression (Videira et al 2014). Il existe des inhibiteurs capables de bloquer efficacement

l’action de BCRP. La fumitremorgine C (FTC), par exemple, s’est avérée efficace in vitro et

relativement spécifique de BCRP, car elle a peu d’effets sur la chimiorésistance médiée par P-gp et

MRP1 (Schinkel and Jonker 2003). Cependant, aucun de ces inhibiteurs n’a été encore évalué en

clinique (Sharom 2008).

3-2) La protéine MVP / LRP

a) Découverte

En plus du rôle crucial des transporteurs ABC dans la chimiorésistance, d’autres mécanismes peuvent

expliquer le fait que la drogue soit expulsée de son site d’action ; mécanisme à l’origine d’une

chimiorésistance. La protéine LRP (Lung Resistance Protein) a été découverte en 1993 dans des

cellules tumorales de poumon non à petites cellules. Ces cellules ont été exposées à des concentrations

croissantes de doxorubicine et présentent un phénotype MDR, caractérisé par une résistance croisée à

la doxorubicine, la vincristine et à l’étoposide. De manière intéressante, ces cellules présentent une

110

moindre accumulation intra-cellulaire de drogues, malgré l’absence de P-gp. Ainsi, la surexpression de

LRP a été étroitement corrélée à la chimiorésistance et sa diminution à la chimiosensibilité des cellules

(Scheper et al 1993). Par la suite, les similitudes de structure et de séquences entre LRP et MVP

(Major Vault Protein) ont mis en évidence que ces deux protéines étaient identiques (Scheffer et al

1995).

b) Structure et composition

Les « voûtes » (vault) sont des particules de ribonucléoprotéines présentant une structure en

« tonneau » (figure 33). Chez les mammifères, elles sont composées de trois protéines : la MVP, la

VPARP (Vault Poly (Adenosine diphosphate Ribose) Polymérase) et la TEP1 (Telomerase-Associated

Protein-1) associées à des petits ARN non traduits appelés vRNA. MVP constitue la sous-unité

principale de la particule (environ 70% de la masse totale). Ainsi, l’extinction de la MVP induit la

dissociation de la voûte (Herlevsen et al 2007) (Lara et al 2011). Une voûte est composée de deux

demi-voûtes, constituées chacune de 39 MVP identiques et formant ainsi la structure en tonneau. De

par sa taille, la voûte peut accueillir des centaines de protéines (Lara et al 2011). De manière

intéressante, les demi-voûtes peuvent se dissocier à pH acide et s’assembler avec d’autres demi-

voûtes (Yang et al 2010). La sous-unité TEP1 et probablement VPARP et vRNA, sont localisés dans

la partie « cap » de la voûte (figure 33). La composition de la voûte entière est de 79 à 96 MVP, 8

VPARP, 2 TEP1 et au moins 6 copies de vRNA (Kong et al 2000). Le gène humain codant pour MVP

est localisé sur le chromosome 16, proche du gène codant pour MRP1 (Lara et al 2011).

Figure 33. Structure de la voûte. La voûte est constituée de deux demi-voûtes, qui peuvent se dissocier à pH acide. La voûte est composée majoritairement de molécules de MVPs, mais également de sous-unités TEP1 et VPARP, ainsi que des ARN nommés vRNA. A l’extrémité de la voûte, on trouve des structures appelées « cap », qui contiennent les sous-unités TEP1, VPARP et vRNA. Une cavité interne est formée au sein de la voûte permettant le passage de différents éléments. Une molécule de MVP est colorée en marron (d’après (Lara et al 2011)).

111

c) Localisation et fonctions biologiques

La majorité des voûtes est localisée dans le cytoplasme où elles peuvent interagir avec les éléments du

cytosquelette, notamment les microtubules. De nombreuses études ont rapporté la présence des voûtes

au niveau du noyau : au niveau des nucléoles, des complexes de pores nucléaires (ou NPC pour

Nuclear Pore Complex) et de la membrane nucléaire (Mossink et al 2003). Les voûtes sont présentes

abondamment (1.105 particules par cellule) dans différents types cellulaires, tels que les macrophages,

les kératinocytes, les fibroblastes, les cellules germinatives, les cellules épithéliales ayant une fonction

excrétrice et sécrétoire ainsi que dans les cellules exposées chroniquement à des xénobiotiques

(cellules bronchiques et cellules intestinales) et l’endothélium de différents tissus (de Moraes et al

2013) (Lara et al 2011). Le fait qu’elles soient présentes en très grand nombre dans des variétés

différentes de cellules suggère que leur fonction est essentielle dans les cellules eucaryotes, cependant

leur rôle précis n’est pas encore complètement élucidé (Mossink et al 2003). Les localisations sub-

cellulaire et intra-cellulaire des voûtes ont suggéré un rôle dans le transport intra-cellulaire, en

particulier dans le transport nucléo-cytoplasmique. La co-localisation partielle des voûtes avec les

éléments du cytosquelette suggère qu’elles pourraient servir de « navettes » pour transporter des

protéines le long du cytosquelette et pour protéger le noyau de l’action de composés toxiques

(Mossink et al 2003) (de Moraes et al 2013). Les voûtes ont été également impliquées dans le transport

intra-cellulaire de ribosomes et des récepteurs aux œstrogènes, à la progestérone et aux

glucocorticoïdes (Larsen et al 2000). Au sein des voûtes, le rôle précis de MVP n’est pas encore bien

caractérisé. Plusieurs études ont indiqué que MVP est directement impliqué dans les cascades de

transduction du signal. MVP peut interagir avec les molécules de la voie MAPK, notamment ERK et

aussi de la voie PI3K/Akt, notamment PTEN (Lara et al 2011). De plus, MVP peut agir comme

protéine de maintien, afin de conduire HIF-1α à l’ubiquitinylation et sa dégradation par le protéasome

(Iwashita et al 2010). L’IFN-γ (Interferon-γ) peut réguler positivement l’expression de MVP dans les

macrophages et les cellules dendritiques, via la voie de signalisation JAK/STAT, suggérant un rôle de

MVP dans l’immunité (Steiner et al 2006).

d) MVP et chimiorésistance

La LRP/MVP a été initialement découverte dans des cellules qui présentaient un phénotype MDR,

négatives pour P-gp. Depuis, la surexpression de MVP a été observée dans environ 78% de 61 lignées

cellulaires tumorales (Izquierdo et al 1998) (Izquierdo et al 1996a). De plus, son niveau d’expression a

été corrélé à une résistance à différents agents anti-cancéreux, tels que les anthracyclines, le 5-FU, le

mitoxanthrone et le cisplatine (Laurencot et al 1997) (Lara et al 2011). De manière intéressante, une

surexpression de MVP a été décrite dans de nombreuses lignées tumorales, suite à un traitement par

les anthracyclines, le taxol, l’étoposide, le méthotrexate, le cisplatine et la vincristine, suggérant que le

traitement lui-même peut réguler positivement l’expression de la MVP, comme c’est le cas pour les

pompes d’efflux (Lara et al 2011) (de Moraes et al 2013) (Izquierdo et al 1998) (Berger et al 2000)

112

(Hu et al 2002). Ainsi, la surexpression de MVP n’est pas seulement associée à la résistance aux

drogues classiques impliquées dans le phénotype MDR mais aussi à d’autres drogues (Izquierdo et al

1998). De plus, MVP est souvent exprimée précocement lors de l’apparition progressive de la

chimiorésistance (Izquierdo et al 1998) (Lara et al 2011). De nombreuses études ont relié le phénotype

MDR avec la surexpression de MVP dans les cellules cancéreuses. L’inhibition de MVP a également

été associée à la chimiosensibilisation de cellules tumorales de côlon à la doxorubicine (Kitazono et al

1999). Cependant, son rôle dans la chimiorésistance a été controversé in vitro et in vivo. Des études

portant sur des cellules tumorales ovariennes ont montré qu’une forte expression de MVP est requise,

mais n’est pas suffisante, pour induire un phénotype MDR dans ces cellules. De plus, dans ce même

modèle, aucune relation n’a été trouvée entre la surexpression des voûtes et la résistance à l’étoposide,

la daunorubicine et la vincristine (Siva et al 2001). Les souris MVP-/- ne présentent pas une meilleure

chimiosensibilité aux différents agents anti-néoplasiques, que les souris sauvages. Ces résultats

suggèrent que MVP seule n’est pas suffisante pour induire une chimiorésistance et / ou que d’autres

protéines pourraient être augmentées afin de compenser la perte de MVP (Mossink et al 2002). De

plus, les autres sous-unités qui composent les voûtes, VPARP et TEP1 sont également surexprimées

dans des lignées MDR, ce qui suggère qu’elles pourraient exercer un rôle non négligeable dans la

chimiorésistance (Siva et al 2001). En clinique, plusieurs études ont mis en évidence que l’expression

de MVP dans les tumeurs représente un facteur de mauvais pronostic indépendant, concernant la

réponse à la chimiothérapie et / ou à la survie sans maladie et la survie globale, dans des tumeurs

solides, telles que les sarcomes, le cancer du col, le cancer de l’ovaire, du poumon et le mélanome,

ainsi que les leucémies, le myélome multiple et les lymphomes (Lara et al 2011) (de Moraes et al

2013) (Izquierdo et al 1998) (Lloret et al 2008) (van den Heuvel-Eibrink et al 2000). Dans le cas du

cancer du sein, une étude a mis en évidence que 68% des tumeurs présentaient une expression

modérée ou forte de MVP, mais les auteurs n’ont pas trouvé de corrélation avec le pronostic clinique

des patientes (Pohl et al 1999). Par ailleurs, l’expression de MVP a également été corrélée à la réponse

aux radiations ionisantes (Valenciano et al 2012) (Lara et al 2011).

e) Hypothèses du rôle de MVP dans la chimiorésistance

Les mécanismes moléculaires de son action dans le phénotype MDR ne sont pas encore bien élucidés.

L’hypothèse majeure est que MVP pourrait transporter les drogues du noyau vers le cytoplasme et

favoriser leur internalisation dans des vésicules cytoplasmiques, de manière ATP-indépendante. Ces

vésicules libèreraient les drogues hors de la cellule par exocytose (Izquierdo et al 1996a) (Kolli et al

2004) (de Moraes et al 2013) (Meschini et al 2002) (figure 34). En effet, l’utilisation d’anticorps

bloquants dirigés contre MVP ou d’ARN interférents (siMVP), empêche l’efflux nucléaire de la

doxorubicine et restaure ainsi son accumulation nucléaire et la chimiosensibilité (Herlevsen et al 2007)

(Kitazono et al 1999) (Han et al 2012). Les données montrant que la MVP peut se combiner à des

vésicules concordent avec le fait que l’expression de MVP n’est pas souvent associée à celle des

113

transporteurs ABC. En effet, MVP est surexprimée dans des lignées cellulaires, qui n’expriment

généralement pas les transporteurs ABC, suggérant que le mécanisme d’efflux cellulaire peut être

indépendant des pompes d’efflux classiques (ABCB1, ABCC1, ABCC2, BCRP) (Hu et al 2002)

(Meschini et al 2002). Les vésicules cytoplasmiques permettant l’efflux des drogues sont

classiquement de nature acide, telles que les lysosomes, les endosomes et l’appareil de Golgi (van Zon

et al 2004) (Herlevsen et al 2007). Herlevsen et al. ont montré que l’inhibition de MVP par des ARN

interférents restaure l’accumulation de doxorubicine dans la cellule en empêchant sa séquestration par

les lysosomes, mais n’induit pas de modification de son efflux en dehors de la cellule, ce qui suggère

que d’autres processus sont requis pour expulser la doxorubicine hors de la cellule (Herlevsen et al

2007). La séquestration des drogues dans des vésicules exocytotiques peut être un mécanisme de

multi-résistance en lui-même. En effet, Van Zon et al. ont estimé que l’efflux et la séquestration des

anthracyclines dans des vésicules peuvent être indépendants de la surexpression de la MVP observée

(van Zon et al 2004). Ce mécanisme sera décrit plus précisément dans la partie suivante. D’autres

études, à l’inverse, ont suggéré que même si P-gp et MVP sont rarement surexprimées simultanément,

une surexpression de MVP et de MRP-1 a été observée dans des cellules ABCB1 négatives et a été

associée au phénotype MDR (Izquierdo et al 1996b). Ainsi, l’expression simultanée de MVP et de

certains transporteurs ABC a été retrouvée, soulignant le fait qu’un mécanisme coopératif entre MVP

et les transporteurs ABC n’est pas à exclure (figure 34) (Mossink et al 2003). Les dernières études

faisant le lien entre MVP et MDR suggèrent que MVP peut moduler la chimiorésistance, via les voies

de signalisation PI3K/Akt ou MAPK (de Moraes et al 2013). De par un mécanisme impliquant des

phosphorylations – déphosphorylations, MVP peut moduler ces signalisations intra-cellulaires, qui

sont impliquées dans la survie et la prolifération, ayant un rôle indirect sur la résistance (Kolli et al

2004). Les études qui n’ont pas trouvé de lien direct entre l’expression / l’extinction de MVP et la

chimiorésistance / chimiosensibilité, suggèrent que MVP pourrait agir comme une protéine de réponse

au stress et donc favoriser indirectement la chimiorésistance, probablement lorsque les cellules sont

soumises à des conditions de stress environnemental (pH, chaleur …) (Huffman and Corey 2005) (van

Zon et al 2004). Enfin, les voûtes (via MVP et les autres sous-unités) pourraient exercer un rôle dans

la réparation des dommages de l’ADN. En effet, une corrélation inverse a été trouvée entre

l’expression de MVP et des protéines KU70 et KU80, qui sont des protéines majeures de la réparation

par NHEJ. Ainsi, la surexpression de MVP et des autres sous-unités des voûtes pourrait entraîner une

diminution de KU70/80, diminuant l’activité de la NHEJ. Ces processus entraînent une instabilité

génomique plus importante associée à une augmentation de Bcl-2, et aboutissent à une diminution de

l’apoptose et à une augmentation de la survie des cellules suite à un traitement anti-néoplasique ou par

radiations ionisantes (Lara et al 2011).

Pour conclure, MVP semble avoir un rôle important dans la multi-résistance, probablement dans

l’efflux nucléaire des drogues cytotoxiques, mais les mécanismes sous-jacents sont encore mal connus

114

et restent controversés. En effet, son induction précoce suggère que son expression est importante,

mais pas suffisante, pour induire un phénotype MDR. De plus, des mécanismes compensatoires ou des

interactions avec d’autres facteurs exercent probablement un rôle, masquant son implication directe

dans la chimiorésistance. Enfin, les autres sous-unités des voûtes pourraient exercer un rôle important

dans la résistance, mais les mécanismes moléculaires n’ont pas encore été étudiés à notre

connaissance. Ainsi, d’autres études pré-cliniques et cliniques sont nécessaires afin de comprendre

l’implication directe ou indirecte de cette protéine dans les phénomènes de multi-résistance.

Figure 34. Mécanisme d’action hypothétique de la MVP / voûtes dans le transport nucléocytoplasmique et vésiculaire des drogues. Les voûtes peuvent être impliquées dans l’efflux nucléaire des drogues, via les pores nucléaires ou la membrane nucléaire, puis favoriser la séquestration des drogues dans des vésicules exocytotiques ou favoriser leur transport vers les pompes d’efflux (d’après (Mossink et al 2003)).

3-3) L’efflux vésiculaire

a) Les vésicules intra-cytoplasmiques

Les anthracyclines sont des bases faibles plutôt lipophiles, ce qui leur permet de pénétrer facilement à

travers les membranes à pH normal. Lorsque ces drogues rencontrent un environnement acide, tel que

l’intérieur d’organelles cytoplasmiques (lysosomes, endosomes), elles se convertissent en forme

chargée, ce qui empêche toute traversée passive des membranes. Ainsi, une accumulation de drogues

chargées est observée dans les vésicules acides, ce qui est suivi de leur transport vers la membrane

plasmique et de leur libération dans l’espace extra-cellulaire (figure 34) (Larsen et al 2000). De

115

nombreuses études ont mis en évidence que le trafic vésiculaire peut être impliqué dans le captage, la

distribution et l’efflux de molécules anti-cancéreuses. De plus, une différence dans la distribution

intra-cellulaire des drogues a été mise en évidence entre les cellules sensibles et les cellules résistantes,

présentant un phénotype MDR (Seidel et al 1995) (Coley et al 1993). Dans les lignées sensibles, la

drogue est distribuée dans le noyau et le cytoplasme dans les premières minutes après le traitement,

alors que dans les lignées résistantes, la drogue est retrouvée dans la région péri-nucléaire, qui

correspond vraissemblablement à l’appareil de Golgi. Puis, ces vésicules sont acheminées vers la

périphérie cellulaire (Larsen et al 2000) (Seidel et al 1995). Ainsi, ces études suggèrent que les

anthracyclines peuvent s’accumuler dans des vésicules acides, telles que l’appareil de Golgi, les

vésicules sécrétoires, les lysosomes et les endosomes, où elles seront acheminées vers la membrane

plasmique et libérées dans l’espace extra-cellulaire par exocytose. L’exocytose est le mécanisme par

lequel la cellule libère des macromolécules dans l’espace extra-cellulaire, par fusion entre les vésicules

cytoplasmiques et la membrane plasmique. Il est probable qu’un tel mécanisme soit observé pour les

vinca-alcaloïdes et la mitoxanthrone, qui sont aussi des bases faibles (Larsen et al 2000). De manière

intéressante, des études ont mis en évidence que certains transporteurs ABC (ABCB1, ABCC1) ne

sont pas uniquement localisés à la membrane plasmique, mais aussi au niveau de la membrane des

vésicules cytoplasmiques, contribuant ainsi à la redistribution intra-cellulaire des drogues et à la

chimiorésistance (Van Luyn et al 1998) (Yamagishi et al 2013).

b) Les vésicules extra-cellulaires

De nombreux facteurs régissent la communication inter-cellulaire : des facteurs solubles (cytokines,

chimiokines, facteurs de croissance, enzymes, médiateurs moléculaires …) mais également des

vésicules extra-cellulaires (VE). Les VE sont des vésicules à bicouche lipidique, sécrétées par les

cellules dans le milieu extra-cellulaire. Hormis les corps apoptotiques, libérés lors du processus de

mort cellulaire, deux grands types de vésicules existent : les microvésicules (MV) et les exosomes.

Ces vésicules contiennent divers constituants moléculaires, tels que des protéines, des lipides, des

ARNm et des micro-ARN et sont impliquées dans différents processus biologiques (Azmi et al 2013).

Les MV sont des vésicules hétérogènes présentant un diamètre de 0.1 à 1 µm, formées par

bourgeonnement de la membrane plasmique (Ratajczak et al 2006). Elles sont libérées soit de manière

constitutive, soit suite à des stimuli extra-cellulaires ou à une augmentation intra-cellulaire d’ions

calcium (Jorfi and Inal 2013). Les exosomes sont des vésicules plus petites, de 30 à 100 nm de

diamètre, présentant une densité précise (1.13 à 1.19) (Jorfi and Inal 2013). Ils sont formés à partir des

corps multivésiculaires (MVB pour Microvesicular Body), encore appelés endosomes tardifs, qui,

après fusion avec la membrane plasmique, libèrent les exosomes dans le milieu extra-cellulaire (Azmi

et al 2013) (figure 35). Lors de la biogenèse des exosomes, les endosomes peuvent fusionner avec les

lysosomes pour former des endo-lysosomes (Huotari and Helenius 2011). Plusieurs études émergentes

ont mis en évidence un rôle des vésicules extra-cellulaires dans la chimiorésistance et dans

116

l’acquisition d’un phénotype MDR (Jorfi and Inal 2013) (Azmi et al 2013). Hormis les transporteurs

ABC, les drogues peuvent être effluées de la cellule par encapsulation dans des VE. De manière

intéressante, Shedden et al. ont démontré que les MV provenant de cellules tumorales résistantes

contiennent plus de doxorubicine que les MV provenant de cellules sensibles (Shedden et al 2003).

Ainsi, la doxorubicine peut passivement s’accumuler dans ces vésicules, puis sortir de la cellule par ce

processus, et ce, de manière plus importante dans les cellules chimiorésistantes que dans les cellules

chimiosensibles (figure 35). Ce mécanisme de résistance, indépendant des pompes d’efflux

membranaires, a été retrouvé pour d’autres drogues, moins lipophiles que la doxorubicine, ce qui

suggère que la lipophilie n’est pas le seul déterminant de l’accumulation de drogues dans ces vésicules

(Shedden et al 2003) (Safaei et al 2005) (Corcoran et al 2012). De plus, l’efflux vésiculaire est présent

dans un large spectre de modèles tumoraux. En effet, Shedden et al. ont pu corréler le processus de

libération de MV avec la chimiorésistance, pour 171 drogues dans un large panel de lignées tumorales

(Shedden et al 2003) (Azmi et al 2013). Par ailleurs, les VE ont également un rôle dans le transport de

la cible des drogues. Par exemple, dans un modèle de cancer du sein HER2+, Ciravolo et al. ont

montré que la résistance au Trastuzumab peut être médiée par des exosomes qui surexpriment HER2

(Ciravolo et al 2012). Une étude publiée par Bebawy et al. a montré que des cellules leucémiques

résistantes à la chimiothérapie peuvent transférer des MV contenant P-gp, à des cellules

chimiosensibles. Ces cellules chimiosensibles accumulent P-gp et deviennent progressivement

résistantes (Bebawy et al 2009). Récemment, la même équipe a confirmé ces résultats dans des

cellules tumorales mammaires (Pokharel et al 2014). De manière intéressante, MRP1 peut également

être transmis, via des MV, soulignant le caractère plus général de ce mécanisme (Lu et al 2013). Enfin,

les exosomes et les MV peuvent contenir de nombreux facteurs, tels que des cytokines, des

chimiokines ou des oncogènes susceptibles de favoriser la résistance aux drogues dans les cellules

voisines (Azmi et al 2013).

117

Figure 35. Mécanisme hypothétique d’efflux des drogues via les exosomes. Les drogues peuvent être encapsulées dans des endosomes, qui deviendront endosome tardif ou MBV. Cet endosome tardif, pourra après fusion avec la membrane plasmique, libérer des exosomes contenant les molécules anti-néoplasiques. Ce concept émergent offre une voie d’efflux alternative, qui contribue à la chimiorésistance. Ce processus a été démontré avec les MV qui sont libérées par bourgeonnement de la membrane plasmique (d’après (Azmi et al 2013)).

4) Rôle du microenvironnement dans la chimiorésistance

4-1) Généralités

Comme nous l’avons vu dans la partie I, l’interaction entre les cellules stromales et les cellules

tumorales constitue un véritable cercle vicieux, à l’origine de la progression de la tumeur, de

l’initiation tumorale au processus métastatique. De nombreux arguments ont également mis en

évidence que le microenvironnement représente un acteur important dans la résistance des cellules

tumorales. Ainsi, ce microenvironnement protecteur permet à des cellules tumorales chimiosensibles

de devenir résistantes. Le rôle du stroma dans la résistance aux drogues a été démontré dans différents

modèles, notamment des lignées cellulaires tumorales et des cellules tumorales primaires, ainsi que

des cellules stromales provenant de patients et ceci pour diverses molécules (chimiothérapie

conventionnelle, chimiothérapie ciblée) ou radiothérapie (Bochet et al 2011) (McMillin et al 2013). Ce

processus a été appelé EMDR pour Environment Mediated Drug Resistance. Un stroma protecteur

permet également de favoriser les rechutes (Dittmer and Leyh 2014). Une des premières études qui

suggère que le microenvironnement tumoral est impliqué dans la résistance aux drogues a été publiée

118

en 1990. Teicher et al. ont montré que des cellules tumorales mammaires résistantes à la

chimiothérapie in vivo, perdent cette résistance quand elles sont isolées et cultivées in vitro en absence

de stroma (Teicher et al 1990). De nombreux paramètres microenvironnementaux peuvent expliquer

cette résistance. D’une part, la MEC, de structure dense, représente une barrière physique de

protection et exerce en plus un rôle actif sur la tumeur. D’autre part, les cellules stromales sécrètent

une variété de facteurs à l’origine de la chimiorésistance (voir partie I). De manière intéressante, la

structure de la MEC évolue au fur et à mesure du traitement. En particulier, les collagènes

s’accumulent suite à une chimiothérapie (collagènes I, IV et VI), ce qui renforce la rigidité de la MEC

et réduit la pénétration des drogues (Hattar et al 2009) (Tokes et al 2009) (Sherman-Baust et al 2003).

De plus, la MEC contribue à la chimiorésistance en fournissant des sites d’adhésion aux cellules

tumorales. Ce processus est appelé CAM-DR pour Cell Adhesion-Mediated Drug Resistance et a été

retrouvé dans de nombreux cancers, tels que le cancer du sein, du poumon, les leucémies et le gliome

(Dittmer and Leyh 2014). Les protéines majeures qui causent le processus de CAM-DR sont les

collagènes et la fibronectine, capables de se lier aux intégrines présentes à la surface des cellules

tumorales (Dittmer and Leyh 2014). Un autre facteur microenvironnemental qui favorise la résistance

aux drogues est la densité vasculaire. En effet, comme étudiée dans la partie I, l’angiogenèse est

souvent anormale dans les cancers. Ainsi, la chimiothérapie, majoritairement distribuée par voie

sanguine, n’est pas acheminée correctement à la tumeur. Une des stratégies anti-cancéreuses est

d’ailleurs de « normaliser » la vascularisation tumorale (Weis and Cheresh 2011). Enfin, les cellules

stromales ont un rôle actif sur la chimiorésistance. D’une part, elles participent à la sécrétion de

composants de la MEC, favorisant le processus de CAM-DR. D’autre part, elles sécrètent des facteurs

bioactifs qui vont considérablement influencer les cellules tumorales, quant à la réponse aux drogues

(voir partie I). Enfin, elles sécrètent des vésicules extra-cellulaires, qui contiennent elles-aussi des

facteurs actifs (Dittmer and Leyh 2014). Dans la partie suivante, seul le rôle des adipocytes sera décrit.

Notons que dans certains cas, le microenvironnement s’est révélé être plutôt chimiosensibilisant pour

les cellules tumorales (McMillin et al 2013).

4-2) Rôle des adipocytes dans la résistance aux drogues

Comme nous l’avons mentionné dans la partie II, peu d’études se sont intéressées au rôle des

adipocytes dans la chimiorésistance. L’étude de Behan a mis en évidence que les adipocytes de la

lignée 3T3-L1 diminuent l’efficacité de la vincristine sur des cellules tumorales leucémiques en

inhibant l’apoptose induite par le traitement. Ce mécanisme n’est pas dépendant d’un contact direct

entre les adipocytes et les cellules tumorales, car l’effet protecteur des adipocytes est également

retrouvé lorsque les cellules tumorales sont placées dans des inserts de co-culture (Behan et al 2009).

Ces résultats suggèrent que la chimiorésistance induite par les adipocytes est liée aux sécrétions

adipocytaires, qui n’ont pas encore été identifiées ici. De plus, l’effet des adipocytes n’est pas restreint

119

à la vincristine. Les cellules co-cultivées avec les adipocytes sont également plus résistantes au

nilotinib, à la daunorubicine et à la dexaméthasone. Ce processus est associé à une augmentation des

facteurs anti-apoptotiques Bcl-2 et Pim-2 (Proviral integrations of moloney virus 2) (Behan et al

2009). Ainsi, les adipocytes peuvent être associés à un phénotype de multi-résistance. L’équipe de

Philipp Scherer a confirmé le rôle protecteur des adipocytes dans le modèle du cancer du sein. De

manière intéressante, la quantité d’endotrophine (fragment clivé du collagène VI) est augmentée, suite

à un traitement au cisplatine. A l’inverse, l’endotrophine cause une chimiorésistance et un processus

d’EMT, en faveur de la progression tumorale. De manière intéressante, les souris KO pour le

collagène VI sont plus sensibles au cisplatine, via une inhibition de l’EMT. Ces résultats suggèrent

que le collagène VI d’origine adipocytaire exerce un rôle prépondérant dans la progression tumorale et

en particulier dans la chimiorésistance (Park et al 2013). L’équipe de Stephen Hursting a également

montré un rôle promoteur des adipocytes dans la chimiorésistance. Leurs résultats suggèrent que le

milieu conditionné d’adipocytes de la lignée 3T3-L1 augmente la prolifération, l’invasion et diminue

la réponse des cellules à la gemcitabine (De Angel et al 2013). Des résultats similaires ont été

rapportés dans le mélanome : Chi et al. ont montré que le milieu conditionné d’adipocytes diminue la

réponse des cellules de mélanome au cisplatine, au docetaxel et à l’inhibiteur d’histone déacétylase

SAHA (Suberoylanilide hydroxamic acid). Ces résultats sont associés à une augmentation de

l’activation des voies de signalisation PI3K/Akt et MEK/ERK. La leptine, sécrétée par les adipocytes,

est en partie responsable de ce processus (Chi et al 2014). Dans l’équipe, Ludivine Bochet a mis en

évidence que les CAAs induisent une résistance aux radiations ionisantes dans le cancer du sein. Ce

processus est associé à une augmentation de l’IL-6 et de la phosphorylation de Chk1 (impliqué dans la

réparation de l’ADN et dans l’arrêt du cycle cellulaire) dans les cellules tumorales co-cultivées avec

les adipocytes (Bochet et al 2011). Pramanik et al. ont également émis une hypothèse intéressante dans

les leucémies. Ils ont mis en évidence in vitro que les cellules tumorales leucémiques sont capables de

migrer vers les adipocytes de la lignée 3T3-L1 et contre des explants de TA, via SDF-1α. De plus, les

explants de TA protègent les cellules leucémiques de l’apoptose. Ainsi, les auteurs suggèrent que le

TA pourrait attirer les cellules tumorales, afin de les protéger de l’action des drogues anti-tumorales

(Pramanik et al 2013). Hormis les adipocytes, le TA contient de nombreuses cellules, qui peuvent

potentiellement favoriser un phénotype de chimiorésistance. Les ADSCs ont également été associés à

une chimiorésistance. Récemment, Chen et al. ont mis en évidence que les cellules tumorales

mammaires triple-négatives, mises en présence de milieu conditionné d’ADSCs, sont plus résistantes à

l’action de la doxorubicine. Ce processus est associé à une augmentation de l’efflux de la doxorubicine

de la cellule et une augmentation de BCRP. L’IL-8 sécrétée par les ADSCs semble être à l’origine de

ce mécanisme (Chen et al 2014).

120

En conclusion, la chimiothérapie demeure un des traitements de référence pour traiter un

cancer du sein. Parmi l’arsenal thérapeutique dont on dispose, la doxorubicine représente une

molécule très utilisée pour diverses tumeurs. Elle exerce, en effet, de nombreux mécanismes

d’action parallèles, aboutissant à la mort cellulaire. Cependant, la résistance des cellules tumorales

à la doxorubicine est un processus très fréquemment retrouvé et contribue à l’apparition de

rechutes. Parmi tous les mécanismes de résistance connus, l’efflux de la doxorubicine représente

son mécanisme majoritaire et contribue à l’acquisition d’un phénotype de multi-résistance. Cet

efflux peut être dépendant des transporteurs ABC, qui expulsent la drogue en dehors de la cellule de

manière active. Moins décrit, l’efflux peut aussi dépendre de la protéine MVP, élément majeur des

voûtes présentes au niveau de la membrane nucléaire et du cytoplasme. La MVP peut favoriser

l’efflux des molécules en dehors du noyau. De manière dépendante ou non de MVP, une fois

dans le cytoplasme, les drogues peuvent aller dans des vésicules et sortir de la cellule par

exocytose. Ce mécanisme d’efflux original a été peu décrit mais représente un moyen alternatif pour la

cellule tumorale d’échapper aux traitements. Des arguments émergents suggèrent que le processus

de résistance ne dépend pas uniquement des cellules tumorales elles-mêmes mais aussi du

microenvironnement tumoral. Ainsi, nous avons formulé l’hypothèse que les adipocytes

pourraient contribuer à la résistance du cancer du sein à la chimiothérapie conventionnelle et

que cette résistance pourrait être amplifiée dans un contexte d’obésité.

Les deux revues ci-après, issues de notre laboratoire font un état des lieux sur le rôle des adipocytes

dans la progression tumorale mammaire et les conséquences cliniques de ce dialogue délétère,

notamment sur l’obésité.

ARTICLE ORIGINAL

Explication du titre : Un dialogue bidirectionnels’établit entre les tumeurs et les cellules graisseusesà proximité ce qui favorise la progression tumorale.Ce dialogue pourrait être amplifié chez les sujetsobèses et expliquer ainsi l’agressivité des tumeursdans ce sous-groupe de patients.

RÉSUMÉ

Il est maintenant clairement établi que l’obésité fa-vorise la survenue et affecte le pronostic de nom-breux cancers dont le cancer du sein. En utilisantle cancer su sein comme modèle, nous montronsici qu’un dialogue bidirectionnel s’établit entre lescellules tumorales et le tissu adipeux à proximité.Les adipocytes péritumoraux présentent une déli-pidation et une diminution des marqueurs adipo-cytaires, cellules que nous avons appelé CAAs pour« Cancer-Associated Adipocytes ». Via leur capacitéà sécréter des molécules pro-inflammatoires, desprotéines de la matrice extra-cellulaire ou à libérer

des acides gras, les CAAs stimulent la prolifération,la survie, les capacités invasives des tumeurs et fa-vorisent la résistance aux traitements. Le propos decette revue est de décrire comment les adipocytesaffectent le comportement des tumeurs et de pré-senter les conséquences cliniques de ce dialogue dé-létère. Deux situations seront abordées. Toutd’abord, l’obésité où le tissu adipeux présente desmodifications morphologiques et fonctionnellesqui le rendent plus enclin à favoriser localement laprogression tumorale, pouvant expliquer le pro-nostic défavorable observé chez ces patientes.D’autre part, le risque carcinologique du transfertde graisse utilisé en chirurgie reconstructrice dansle cancer du sein sera décrit au regard de ces nou-veaux éléments de connaissance sur le dialogueentre tissu graisseux et cancer.

Mots-clés : Obésité, Tissu adipeux, Cancer dusein, Microenvironnement, Adipocytes péritumo-raux.

Tissu adipeux et cancer :une proximité dangereuseCamille LEHUÉDÉ1,2#, Ikrame LAZAR1,2#, Laurence NIETO1,2, Yuan Yuan WANG1,2,Ghislaine ESCOURROU3, Philippe VALET1,4, Catherine MULLER1,2*

1Université de Toulouse, UPS, F-31077 Toulouse, France2Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, CNRS UMR 5089, 205 route de Narbonne, BP 64182, F-31077Toulouse, France3Service d’Anatomie pathologique et Histologie-Cytologie, CHU, Hôpital Rangueil, 1, avenue Jean-Poulhes, TSA 50032,31403 Toulouse, France.4Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, INSERM U1048, F-31432 Toulouse, France* Auteur correspondant : Pr Catherine MULLER – Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, CNRS UMR5089, 205 route de Narbonne, BP 64182, F-31077 Toulouse, FranceTel : 0561175932 / Fax : 0561175994 / mail : [email protected] # Contribution équivalente

CANCERS AU FÉMININ • 2013 • N° 1 1

ARTICLE ORIGINAL

CANCERS AU FÉMININ • 2013 • N° 12

Tissu adipeux et cancer : une proximité dangereuse

ABSTRACT

Several epidemiological studies demonstrate posi-tive associations between the prevalence of obesity,as judged by increased body mass index (BMI),cancer incidence, and cancer-related mortality. Wehave recently demonstrated that a bidirectionalcrosstalk is established between breast cancer cellsand tumour-surrounding adipocytes. Tumour cellsecretions are able to modify tumour-surroundingadipocytes to an activated state that we have namedCancer-Associated Adipocytes (CAAs). CAAs, bytheir ability to secrete proinflammatory molecules,extracellular matrix proteins and to liberate freefatty acids, stimulate tumor growth, survival, inva-sive capacities as well as resistance to treatment. Thepurpose of this review is to emphasize the role thatadipose tissue might play by locally affecting breastcancer cell behaviour and subsequent clinical con-sequences arising from this dialog. Two particularclinical aspects are addressed: obesity that was iden-tified as an independent negative prognosis factorin breast cancer and the oncological safety of autol-ogous fat transfer used in reconstructive surgery forbreast cancer patients.

Keywords: à nous transmettre, merci.

L’OBÉSITÉ INFLUENCE LA SURVENUE MAIS AUSSILE PRONOSTIC DE CERTAINS CANCERS

Au cours des dernières décennies, l’obésité est devenueun problème de santé publique majeur. L’organisationmondiale de la santé prévoit qu’en 2015, 3 milliardsd’adultes dans le monde seront en surpoids tandis que700 millions seront obèses. Chaque année, environ 3millions de personnes meurent du fait des complica-

tions de l’obésité et ces chiffres sont en constante pro-gression. Si les complications métaboliques et cardio-vasculaires de l’obésité sont maintenant connues dugrand public, le lien entre obésité et cancer reste lui lar-gement ignoré. En 2003, une large étude épidémiolo-gique publiée par le New England Journal of Medecineétablit pour la première fois qu’aux Etats-Unis, environ14% des décès par cancer chez l’homme et 20% chezla femme seraient dus à l’obésité [1]. Parmi les cancersles plus fréquemment concernés, on trouve des cancersdigestifs (adénocarcinomes œsophagiens, cancers colo-rectaux et pancréatiques), des cancers gynécologiques(endomètre, sein après la ménopause) ainsi que les can-cers du rein [1]. Outre l’augmentation du nombre decancers, un des aspects du lien entre cancers et obésitéqui a retenu notre attention est l’impact de cette der-nière sur le pronostic, en particulier dans le cancer dusein. En effet, dans les carcinomes mammaires, l’obésitéest un facteur indépendant de mauvais pronostic [2],les femmes obèses présentant une diminution de la sur-vie globale, une diminution de la survie sans maladieainsi qu’une augmentation des métastases. Ce caractèrepéjoratif semble indépendant de la ménopause, dustade de la tumeur et de son statut hormonal [pourrevue [2]; [3]; [4]]. Il existe incontestablement des fac-teurs non biologiques qui pourraient expliquer ce ré-sultat, en particulier des retards de diagnostic et desdifficultés à utiliser une approche thérapeutique adap-tée tel que le sous-dosage de la chimiothérapie [5, 6].Cependant, des arguments convaincants montrent àl’heure actuelle que l’hôte, c’est à dire le sujet obèse,pourrait conduire à des modifications des propriétés dela tumeur à la faveur d’une augmentation de son agres-sivité [7] et [5]. Une des particularités du cancer du sein est sa proxi-mité avec le tissu adipeux (TA), un contact physiques’établissant entre TA et cancer dès que ce dernier de-vient invasif (figure 1). Ces vingt dernières années, il aclairement été montré que la progression tumorale dé-pend d’une interaction dynamique avec les cellules« normales » entourant la tumeur [8]; [9]. Ces cellulesnormales, encore appelées cellules du microenvironne-ment ou stroma, sont activées localement ou recrutéespar la tumeur. L’importance dans la progression tumo-

rale de certaines de ces cellules telles que les fibroblastesassociés au cancer (CAF pour Cancer Associated Fi-broblast) ou encore des macrophages (TAM pourTumor Associated Macrophage) a été clairement dé-crite [10]; [11]. Ainsi, dans ce contexte, parmi les cel-lules qui constituent le stroma tumoral, les cellulesadipeuses sont probablement celles dont le rôle a été lemoins bien caractérisé alors qu’ils représentent le typecellulaire prédominant du microenvironnement descarcinomes mammaires. Les adipocytes matures repré-sentent les cellules majoritaires du TA qui contientaussi, dans une fraction dite « stroma vasculaire », d’au-tres cellules telles que des progéniteurs (Adipose Deri-ved Stem Cells ou ADSCs et préadipocytes), desfibroblastes, des macrophages, des lymphocytes, despéricytes ainsi que des cellules endothéliales [12]. L’adi-pocyte gère les fluctuations énergétiques induites parl’apport alimentaire ou les états de jeûne en stockantl’énergie sous forme de triglycérides ou en la libérantsous forme d’acides gras (AG) [13]. Toutefois, à côtéde sa fonction de réservoir d’énergie, l’adipocyte estégalement une cellule endocrine active qui sécrète unegrande variété de molécules (appelées adipokines), in-cluant des hormones, des facteurs de croissance, des

chimiokines ou des molécules pro-inflammatoires [12],clairement susceptible d’influencer le comportementdes tumeurs. Ainsi, l’hypothèse principale de nos tra-vaux est que le dialogue local entre adipocytes et cel-lules tumorales pourrait influencer la survie, laprolifération et le potentiel métastatique de ces der-nières, cet effet pouvant être exacerbé au cours de l’obé-sité où les sécrétions adipocytaires sont altérées [12].

RÔLE DES ADIPOCYTES PÉRI-TUMORAUX DANS LA PROGRESSION TUMORALE : LE CONCEPT DE CANCER-ASSOCIATED ADIPOCYTES (CAAS)

Afin d’étudier l’influence des adipocytes péritumoraux,nous avons mis en place au laboratoire un système decoculture entre cellules cancéreuses et adipocytes, lesdeux populations étant séparées par un insert autori-sant le passage de facteurs solubles (figure 2). Aprèstrois à cinq jours de coculture, nous avons étudié lecomportement de ces cellules tumorales « éduquées »par les adipocytes. Parmi les différentes caractéristiquesdes tumeurs ainsi modifiées, nous avons retrouvé uneaugmentation de leurs propriétés invasives à la fois invitro et in vivo, qu’il s’agisse de cellules exprimant ounon le récepteur aux œstrogènes (RE). Ainsi, des cel-lules tumorales mammaires « éduquées » par des adi-pocytes et injectées dans la queue d’une sourisprésentent une capacité à former des métastases pul-monaires très fortement augmentée [14]. Comment lesadipocytes peuvent-ils influencer le comportement destumeurs ? Quelle que soit la lignée de cancer du seinutilisée, ces adipocytes subissent d’importantes modi-fications. En effet, ils présentent une délipidation par-tielle et une diminution de l’expression des marqueursadipocytaires. Cette « dédifférenciation » s’accompagned’un état d’activation marqué par la surexpression decytokines pro-inflammatoires (interleukine 6 ou IL6,interleukine 1β� ou IL1β, Tumor Necrosis Factorα� ouTNFα) ainsi que de protéines de la matrice extra-cel-lulaire (MEC) et de son remodelage. Fait majeur, nousavons montré que ces adipocytes modifiés sont retrou-vées au front invasif des tumeurs humaines (figure 2),

CAMILLE LEHUÉDÉ & COLL



Figure 1. La proximité entre tissu adipeux et cellulestumorales est retrouvée dans les cancers du sein in-vasif. Coupe histologique de cancer mammaire après colo-ration à l’Hématoxyline-Eosine. Le tissu adipeux estnoté TA, la tumeur T. Les flèches indiquent des zonesreprésentatives ou les cellules tumorales sont aucontact du tissu adipeux.

soulignant ainsi la relevance clinique des résultats ob-tenus dans le système de coculture [14]. Quels sont les médiateurs les plus importants expli-quant l’influence des CAAs sur la tumeur ? Toutd’abord l’inflammation et en particulier l’IL6. En effet,dans une série de 32 échantillons comparant les carac-

téristiques des adipocytes péritumoraux à des adipo-cytes normaux issus de mammoplastie de réduction,nous avons retrouvé une augmentation très importantede l’IL6 (7.5 fois) dans les CAAs. De façon très inté-ressante, le niveau d’expression de l’IL6 dans les CAAsest corrélé à la taille des tumeurs et à l’envahissement

ARTICLE ORIGINAL



Figure 2. Le dialogue entre les adipocytes et les cellules tumorales induisent des modifications phénotypiquescaractéristiques dans les deux populations. A, Le dialogue entre adipocytes et cellules cancéreuses est étudié à l’aide d’un système de coculture en 2D oules deux populations sont séparées par un insert permettant le passage des facteurs solubles entre les deuxcompartiments. Le phénotype des cellules tumorales et des adipocytes cocultivés est comparé respectivementà des cellules tumorales ou à des adipocytes cultivés seuls. B, Après coculture, les cellules tumorales présententdes caractéristiques différentes dont une augmentation de l’invasion. Cette augmentation de l’invasion est il-lustrée in vitro par un marquage de l’actine par une sonde fluorescente en rouge (panneau du haut). Les cellulescancéreuses non cocultivées (NC) montrent une organisation en îlot qui rappelle l’acinus mammaire alors queles cellules cocultivées (C) se séparent, s’étalent sur le support et montrent des extensions membranaires, mo-difications caractéristiques d’un phénotype invasif. In vivo (panneau du bas), les poumons des souris injectéespar voie veineuse avec des cellules cancéreuses cocultivées (C) présentent des métastases (flèches blanches)dont le nombre et la taille sont fortement augmentés comparées aux cellules contrôles non cocultivées (NC).C, Les adipocytes cultivés in vitro (panneau du haut) sont marqués à l’huile rouge (marquage des lipides neutres)et observés au microscope. Les adipocytes cocultivés (C) présentent une diminution franche du nombre et dela taille des goutelettes lipidiques par rapport au contrôle non cocultivé (NC).Coupes histologiques de tissuadipeux à distance (TAD) ou péritumoral (TAP) de carcinome mammaire. Le phénotype « CAA »observé invitro est retrouvé au front invasif dans ces tumeurs humaines.NC : non cocultivés, C : cocultivés, TAD : tissu adipeux à distance de la tumeur, TAP: tissu adipeux péritumo-ral.

ganglionnaire mais non à l’expression du RE, du typeou du grade de ces dernières [14]. Dans notre modèlede coculture, le blocage par des anticorps spécifiquesde l’IL6 adipocytaire diminue l’effet pro-invasif desadipocytes, confirmant l’importance de l’inflammationdans le dialogue TA/cancer. Outre l’inflammation,l’importance des protéines de la MEC ou de son re-modelage a été soulignée par différentes équipes. Unedes protéines de la matrice qui est fortement expriméepar les adipocytes péritumoraux et qui favorise la crois-sance des tumeurs mammaires in vivo est le collagèneVI (COL6) [15]. De plus, il a été récemment montréqu’un des fragments de clivage du collagène, l’endo-trophine, agissait comme une molécule de signalisationet augmentait la fibrose, l’angiogenèse et l’inflamma-tion dans le microenvironnement des tumeurs mam-maires favorisant ainsi l’agressivité tumorale et enparticulier l’apparition de métastases [16]. Les CAAsexpriment aussi la MMP11 (ou Stromelysine 3) quiappartient à la famille des métalloprotéases [17]. L’ex-pression de cette protéine de remodelage de la MECpar les CAAs favorise la progression tumorale via sa ca-pacité à cliver la MEC (étape importante pour l’inva-sion), mais aussi certains de ces substrats, les rendantainsi plus actifs [18]. C’est le cas du COL6 puisqu’il aété montré que le COL6 est un substrat de la MMP11[18]. La dernière caractéristique des CAAs, et qui pour-rait être la plus originale, est la perte des AG contenusdans les gouttelettes lipidiques, perte que nous avonsobservé in vitro et in vivo (Dirat et al, 2011 ; voir figure2). Nous avons récemment montré au laboratoire queces AGs libérés par les adipocytes sont transférés dansles cellules tumorales (Wang et al, résultats non pu-bliés). Ce même dialogue métabolique a été montrédans le cancer de la prostate [19] et dans le cancer del’ovaire disséminé [20]. Les cellules de cancer del’ovaire disséminent fréquemment au niveau del’omentum, région péritonéale riche en adipocytes.Sous l’effet d’un processus de lipolyse, les adipocytesse délipident, et les tumeurs ovariennes se chargentainsi en lipides relargués qu’elles accumulent sousforme de gouttelettes [20]. Ce transfert de lipides estimportant pour la croissance de la tumeur dansl’omentum [2]. Ces AGs pourraient être utilisés

comme constituants des membranes plasmiques,comme molécules de signalisation mais aussi commesource d’énergie pour les tumeurs. En effet, un ensem-ble de travaux récents montrent que les tumeurs, outrele glucose, pourraient utiliser les AGs comme substraténergétique au travers de la �β-oxydation des lipidesqui a lieu dans la mitochondrie [21]. Ces résultats sug-gèrent qu’il pourrait exister une véritable symbiose mé-tabolique entre les adipocytes (« donneurs d’énergie »)et les cellules tumorales (« receveuses »). S’ils étaientconfirmés, l’interaction délétère entre adipocytes etcancer pourrait être efficacement interrompue vial’inhibition du transfert de lipides mais surtout vial’inhibition de la �β-oxydation des lipides, des molé-cules comme l’etomoxir étant déjà connues pour exer-cer cet effet [21]. Le dialogue paracrine entreadipocytes et cancer fait aussi intervenir d’autres adi-pokines importantes telles que la leptine et l’adiponec-tine qui n’ont pas été abordées dans cette revue maisque le lecteur pourra retrouver dans les revues suivantes[22] ; [23] ; [24]. L’ensemble de ces résultats montredonc qu’il existe un dialogue permanent entre adipo-cytes et cancer du sein favorisant la prolifération tu-morale, la survie et surtout l’invasion locale et àdistance [3] ; [4]. L’interaction entre cellules tumoralesmammaires et TA ne se limite pas aux adipocytes ma-tures puisque des travaux récents montrent que les pré-curseurs adipocytaires sont eux aussi capables departiciper activement à l’environnement de la tumeur,soit en générant des cellules proches des CAFs qui vontfaire partie de la réaction desmoplasique, soit en favo-risant l’angiogenèse tumorale (pour une revue détaillée,le lecteur est invité à se référer à [4]). Finalement, lesCAAs sont également impliqués dans des processus deradio- et chimiorésistance. En effet, nous avons montrégrâce au système de coculture précédemment décritque les cellules tumorales mammaires cocultivées avecdes adipocytes présentaient une radiorésistance associéeà une diminution de la mort post-mitotique [25]. Ceteffet semble dépendant de l’IL6 sécrétée par les cellulestumorales, sécrétion autocrine qui est stimulée par laprésence d’adipocytes. De la même façon, il a été mon-tré que des facteurs solubles d’origine adipocytaire pro-tègent des cellules de leucémie aiguë lymphoblastique




(LAL) de l’effet cytotoxique de la vincristine [26].Cette protection vis-à-vis des médicaments antitumo-raux a été retrouvée pour d’autres types de molécules(dexamethasone, daunorubicine et nilotinib), ce quisuggère l’émergence d’un phénotype de résistancepléiotropique (ou « multidrug résistance ») qui pourraitdépendre, dans le cadre des LAL, d’une diminution dela mort par apoptose [26]. Enfin, l’inhibition de l’en-dotrophine, le produit de clivage du COL6 sensibiliseles tumeurs au cisplatine [27]. L’ensemble des modifi-cations résultant de l’interaction entre cellules tumo-rales et adipocytes est résumé dans la figure 2. Du faitde la composition de la glande mammaire, la plupartdes travaux concernant l’interaction entre TA et canceront été consacrés aux cancers du sein. Il n’en demeurepas moins que la plupart des cancers invasifs va se re-trouver à un moment donné de l’histoire de la maladieà proximité du TA. C’est le cas du cancer de la prostateinvasif qui va envahir la graisse périprostatique, du can-cer du côlon qui va se retrouver au contact de la graissepériviscérale, du cancer de l’ovaire qui dissémine au ni-veau de l’omentum ou du mélanome qui va rejoindreles couches profondes du derme. Dans toutes ces situa-tions, une délipidation et une dédifférentiation par-tielle des adipocytes est observée ([28] et résultats denotre équipe non publiés). Certaines modificationsplus spécifiques identifiées dans le cancer du sein sontretrouvées dans d’autres types de cancer comme parexemple l’augmentation de l’IL6 dans la graisse péri-prostatique [29]. Le dialogue métabolique apparaîtquant à lui assez ubiquitaire [28]. Cette « proximitédangereuse » débouchant sur un dialogue délétèrepourrait donc permettre d’aboutir à des concepts plusgénéraux en cancérologie et surtout au développementde stratégies thérapeutiques d’application élargie.

LE DIALOGUE LOCAL ENTRE ADIPOCYTES ET CANCER EXPLIQUE-T-IL LES LIENS DÉLÉTÈRESENTRE OBÉSITÉ ET CANCER ?

Il existe donc un lien maintenant établi entre l’obésitéet le pronostic du cancer du sein, ce lien semblant aussiexister pour d’autres cancers tels que le cancer de la

prostate ou du colon [2]. Comme montré précédem-ment, l’ensemble de nos résultats ainsi que ceux de noscollègues supportent le concept innovant selon lequelles adipocytes participent à un cercle vicieux, initié parles cellules cancéreuses et favorable à la progression tu-morale [3] ; [4] ; [24]. Notre hypothèse est que les adi-pocytes présents à proximité des tumeurs seraient, chezl’obèse, encore plus enclins à stimuler la disséminationlocale et à distance ce qui pourrait expliquer le pronos-tic défavorable observé chez ces patients [7]. Chez lesujet obèse, le nombre (hyperplasie), la taille (hyper-trophie) ainsi que le profil de sécrétion des adipocytesest altéré [24]. Il est maintenant clairement établi quele TA viscéral (TAV), c’est à dire présent dans lescouches profondes de l’abdomen, des sujets obèses pré-sente un état d’inflammation dit de « bas bruit » par-ticipant aux nombreux effets délétères métaboliques etcardiovasculaires de l’obésité [30] ; [31]. Cet état in-flammatoire est marqué par une augmentation de lasécrétion de cytokines pro-inflammatoires (dont l’IL6),et par une infiltration de macrophages entourant leplus souvent des adipocytes nécrotiques, structure encouronne encore appelée « Crown-like structures » ouCLS [12]. Enfin, dans le TAV de sujets obèses, l’ex-pression des composants de la MEC est modulée (afinde s’adapter à l’expansion hypertrophique des adipo-cytes) pouvant créer un état local profibrotique. Si l’onrésume, on trouve donc dans le TAV d’un individuobèse, indépendamment de tout cancer, des modifica-tions qui sont présentes dans les CAAs telles que l’in-flammation, la fibrose et une augmentation de lalibération d’AGs (figure 3). Ainsi ce terrain pourraitêtre tout à fait favorable à un dialogue amplifié avec lacellule tumorale. Il est important ici de souligner quel’ensemble de ces modifications a été décrit pour leTAV. De façon très intéressante deux études récentesmontrent que le tissu adipeux mammaire chez l’obèseprésente des similitudes par rapport au TAV. Une hy-pertrophie adipocytaire, proportionnelle à l’IMC, estégalement observée dans le TA mammaire, ainsi qu’unétat inflammatoire, caractérisé par la présence de CLSet l’augmentation de l’expression des cytokines proin-flammatoires [32] [33]. Ces résultats sont donc tout àfait en faveur de l’hypothèse proposée dans le cancer

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du sein qui reste notre modèle de prédilection. Les mo-dèles animaux offrent une opportunité intéressante devalider cette hypothèse. Ainsi, l’équipe de StephenHursting a récemment montré que l’implantation or-thotopique dans la glande mammaire de lignées triplenégatives (M-Wnt) dans des souris rendues obèses parun régime hyperlipidique, entraine une augmentationde la croissance tumorale, par comparaison à un groupetémoin. A l’inverse, des souris soumises à une restric-tion calorique présentent une diminution significativede la taille tumorale, comparée au même groupe té-moin [34]. De la même manière, l’équipe de L. Mielea montré que la progression tumorale mammaire étaitégalement augmentée dans des souris obèses transplan-

tées avec une lignée ER+, E0071, ce qui était associé àune augmentation de l’angiogenèse tumorale consécu-tive à une sécrétion accrue de VEGF [35]. Les méca-nismes moléculaires impliqués dans ces effets restentencore à caractériser de façon fine à la fois dans des tu-meurs humaines, dans des modèles murins et dans desmodèles de coculture utilisant du TA isolé à partir desujets obèses et normopondéraux. Enfin, si dans la pro-gression tumorale nous pensons que la tumeur est pro-bablement plus encline à utiliser le TA à proximité(effet paracrine), l’importance des mécanismes endo-crines ne doit pas être négligée en particulier dans lesétapes initiales de la carcinogenèse. L’obésité et les mo-difications métaboliques qui y sont associées pourraient




Figure 3 : Dialogue adipocyte/cancer dans un contexte d’obésité. L’hyperplasie et l’hypertrophie des adipocytes rencontrées dans le tissu adipeux (TA) des sujets obèses ont pourconséquences la modification des sécrétions adipocytaires, l’apparition d’une fibrose et un état sub-inflamma-toire. Ces modifications pourraient exacerber le dialogue entre ces deux composants, expliquant le pronosticdéfavorable observé pour les patients obèses. L’intensité de la coloration rouge représente le degré d’agressivitédes tumeurs.

favoriser la carcinogenèse via l’insulino-résistance, lesmodifications des taux d’adipokines circulantes (excèsde sécrétion de leptine et de cytokines pro-inflamma-toires, défaut de sécrétion d’adiponectine). L’augmen-tation de la production d’œstrogènes pour les cancersgynécologiques est aussi à prendre en compte, le TAétant pourvu d’une activité d’aromatisation des andro-gènes en œstrogènes, aspect important surtout en pé-riode post-ménopausique. Le lecteur intéressé par lesfacteurs endocrines pouvant contribuer à la carcinoge-nèse pourra lire les revues suivantes [24] ; [23] ; [36].

RISQUE ONCOLOGIQUE DE L’UTILISATION DE TISSU ADIPEUX EN CHIRURGIERECONSTRUCTRICE ?

Le rôle des adipocytes dans la progression tumorale,notamment dans le cancer du sein peut égalementavoir un impact dans l’utilisation de l’injection de TAautologue dans des processus de chirurgie réparatriceaprès une mastectomie partielle ou totale. Cette tech-nique, appelée lipotransfert ou lipofilling permet de« combler » les défauts, notamment d’irrégularité et lemanque de volume ou, plus rarement, de reconstruireentièrement un sein. La simplicité, les résultats esthé-tiques et plastiques de cette méthode suscitent un in-térêt croissant [37]. Cette technique, développée parSydney R. Coleman et connue sous le nom de « tech-nique de Coleman » consiste à prélever du TA sous-cu-tané, classiquement au niveau de l’abdomen ou descuisses et à le réinjecter dans le parenchyme mammaire,de la même patiente après une courte centrifugation,afin d’éventuellement éliminer l’huile, l’excès de fluideset les contaminants [37] [38]. Ainsi, la préparation ad-ministrée contient de nombreux types cellulaires pré-sents dans le tissu adipeux comme des adipocytes etdes précurseurs adipocytaires susceptibles de favoriserla progression tumorale [39]. En outre, on sait que lachirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie ne sontpas toujours suffisantes pour éradiquer toutes les cel-lules tumorales lors du traitement et de nombreusesétudes ont montré la présence de cellules quiescentes,« en dormance », cellules potentiellement très sensibles

aux changements de leur microenvironnement [40].Ainsi le risque carcinologique de cette technique doitêtre évalué, d’autant plus qu’un article récent montrechez la souris que le matériel utilisé pour le lipofillingpouvait, après tumorectomie, favoriser l’apparition demétastases secondaires [41]. Dans cette étude, les au-teurs attribuent le risque carcinologique à une sous-po-pulation de cellules souches capables de favoriser lavascularisation tumorale. Une étude clinique rétrospec-tive avec un groupe témoin a été publiée récemmentpar l’Institut Européen du Cancer de Milan. Cetteétude ne montre pas de différence significative du tauxde rechutes entre les deux groupes, toutefois une aug-mentation des rechutes chez les patientes ayant un can-cer in situ a été noté dans le groupe ayant reçu unlipofilling [42]. Une autre étude rétrospective avecgroupe témoin a été réalisée très récemment par lamême équipe, centrée uniquement sur les patientesprésentant des lésions intra-épithéliales, étude quiconfirme les résultats précédents [43]. Si aucuneconclusion définitive ne peut être tirée de ces premierstravaux (car elles concernent un faible nombre de pa-tientes), des études supplémentaires sur des échan-tillons plus importants doivent être impérativementréalisées afin de confirmer ou d’infirmer les risques decette technique sur les possibilités de récidives localesdes cancers du sein in situ traités par tumorectomie.Enfin, les améliorations constantes de cette techniqueavec notamment l’apport de cellules souches adipocy-taires nécessitent aussi des investigations cliniques spé-cifiques si l’on s’en réfère à la potentielle dangerositédes cellules souches révélée par les études effectuéeschez la souris [41] [39] [44].

CONCLUSION

De nombreux arguments soulignent maintenant le rôledu tissu adipeux dans le cancer, notamment le cancerdu sein. Ce tissu complexe, majoritairement composéd’adipocytes, peut être modifié dans des contextes pa-thologiques en particulier l’obésité. L’ensemble de nosrésultats montre le dialogue bidirectionnel néfaste quis’instaure entre les cellules tumorales mammaires et les

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adipocytes présents à proximité des tumeurs, influen-

çant notamment leur capacité métastatique [14]. Ces

adipocytes « activés » par les cellules tumorales ou

CAAs présentent des modifications importantes,

comme une délipidation, l’acquisition d’un phénotype

inflammatoire et profibrotique [14] [20]. Comprendre

et cibler les acteurs impliqués dans le dialogue entre

cellules tumorales et adipocytes permettraient d’appor-

ter un bénéfice thérapeutique important pour les pa-

tients atteints de cancer en particulier dans un contexte

d’obésité.

REMERCIEMENTS

Les travaux effectués dans nos équipes sont soutenues

par l’Institut National du Cancer (INCA PL 2006–

035 et INCA PL 2010-214 GE, PV et CM), La Ligue

contre le Cancer Midi-Pyrénées (Comité du Lot, de la

Haute-Garonne et du Gers, CM), la Fondation de

France (PV et CM), l’Association pour la Recherche

sur les Tumeurs Prostatiques ARTP (CM) and l’Uni-

versité de Toulouse (Appel d’offre du conseil scienti-

fique 2009, CM).

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Cancer Letters 324 (2012) 142–151

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Cancer Letters

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Mini-review

Adipose tissue and breast epithelial cells: A dangerous dynamic duo in breast cancer

Yuan-Yuan Wang a,b,c, Camille Lehuédé a,b,d, Victor Laurent a,b, Béatrice Dirat a,b,d, Stéphanie Dauvillier a,b,Ludivine Bochet a,b,d, Sophie Le Gonidec a,d, Ghislaine Escourrou e, Philippe Valet a,d, Catherine Muller a,b,⇑a Université de Toulouse, UPS, IPBS, F-31077 Toulouse, Franceb Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, CNRS UMR 5089, 205 route de Narbonne, BP 64182, F-31077 Toulouse, Francec Department of Endocrine and Breast Surgery, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, Chinad Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, INSERM U1048, F-31432 Toulouse, Francee Service d’Anatomo-Pathologie, Hôpital de Rangueil, 1, avenue Jean-Poulhes, TSA 50032, 31403 Toulouse, France

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history:Received 28 March 2012Received in revised form 14 May 2012Accepted 16 May 2012

Keywords:Adipose tissueBreast cancerMicroenvironmentObesityInflammation

0304-3835/$ - see front matter � 2012 Elsevier Irelanhttp://dx.doi.org/10.1016/j.canlet.2012.05.019

⇑ Corresponding author at: Institut de PharmacologCNRS UMR 5089, 205 route de Narbonne, BP 64182, F-+33 561175932.

E-mail address: [email protected] (C. Mulle

Among the many different cell types surrounding breast cancer cells, the most abundant are those thatcompose mammary adipose tissue, mainly mature adipocytes and progenitors. New accumulating recentevidences bring the tumor-surrounding adipose tissue into the light as a key component of breast cancerprogression. The purpose of this review is to emphasize the role that adipose tissue might play by locallyaffecting breast cancer cell behavior and subsequent clinical consequences arising from this dialog. Twoparticular clinical aspects are addressed: obesity that was identified as an independent negative prognos-tic factor in breast cancer and the oncological safety of autologous fat transfer used in reconstructive sur-gery for breast cancer patients. This is preceded by the overall description of adipose tissue compositionand function with special emphasis on the specificity of adipose depots and the species differences, keyexperimental aspects that need to be taken in account when cancer is considered.

� 2012 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

1. Introduction

There is now cumulative evidence that cells immediately adja-cent to a tumor are not only passive structural elements but alsoactive actors in tumor progression (for reviews [1–3]). The tumormass is undoubtedly a multifaceted show, where different celltypes, including neoplastic cells, fibroblasts, endothelial andimmune-competent cells, interact with one another continuouslyto favor tumor progression [1,4]. The carcinoma stroma sharesmany traits with conditions of chronic inflammation or woundhealing and accordingly, tumors have been described as ‘‘woundsthat never heals’’ [5]. Infiltration of inflammatory cells includingT cells, neutrophils and macrophages, among others, is a very com-mon feature in breast cancer lesions [6,7]. In addition, it is becom-ing increasingly clear that cancer-associated fibroblasts (CAFs) arealso prominent modifiers of breast cancer progression [2].

Among the many different cell types surrounding breast cancercells, the most abundant are those that compose mammary adi-pose tissue (MAT) (see Fig. 1), mainly mature adipocytes and pro-genitors (preadipocytes and Adipose-Derived Stem cells [ADSCs]).For a long time, MAT has not been considered more than a casual

d Ltd. All rights reserved.

ie et de Biologie Structurale,31077 Toulouse, France. Tel.:

r).

observer, and certainly not a disease modifying entity. However,recent accumulating evidences bring the tumor-surrounding adi-pose tissue into the light as a key component of breast cancer pro-gression. Both progenitors and mature adipocytes are not passivetowards breast cancer cells and exhibit specific traits that beginto be characterized, as their ability to contribute to local inflamma-tion through IL-6 secretion [8,9]. The effect of MAT does not appearto be limited to tumor progression but may also affect the earlystages of carcinogenesis and the response to treatment of estab-lished tumors [10].

Studying the multifaceted role of MAT in breast cancer is ofmajor clinical importance. In fact, obesity has recently emergedas an independent negative prognosis factor for breast cancer inde-pendently of menopause status [11,12]. This relationship has majorconsequences in public health since the prevalence of overweightand obesity has been increasing worldwide over the past decadesand reaches alarming dimensions. According to the World HealthOrganization (WHO), by 2015 there will be 3 billion overweightand 700 million obese adults worldwide. Although not demon-strated experimentally, one might reasonably speculate that thepositive contribution of MAT into tumor progression might beamplified in obese women, therefore explaining in part the poorprognosis observed in this subset of patients. The expected strikingincrease in the incidence of these aggressive cancers in the nearfuture related to obesity turns the knowledge of this field of greatimpact. Another clinical consequence of the experimental studies

http://dx.doi.org/10.1016/j.canlet.2012.05.019

mailto:[email protected]

http://dx.doi.org/10.1016/j.canlet.2012.05.019

http://www.sciencedirect.com/science/journal/03043835

http://www.elsevier.com/locate/canlet

AdAd

IFIF

IF

C

Fig. 1. In breast cancers, early local tumor invasion results in immediate proximityof cancer cells to adipose tissue. Histological examination of an invasive breasttumor after H&E staining (original magnification X 200). Ad, adipose tissue; IF,invasive front; C, tumor center. Note that at the invasive front, the number and sizeof adipocytes are reduced (indicated by arrows).

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on the crosstalk of epithelial cells and MAT concerns the safety ofautologous fat transfer, also defined as lipofilling procedures, usedto improve the results of the total or partial reconstruction inbreast cancer patients [13].

The purpose of this review is to emphasize the role that MATmight play by locally affecting breast cancer cell behavior and sub-sequent clinical consequences arising from this dialog. This will bepreceded by the overall description of adipose tissue (AT) compo-sition and function with special emphasis on the specificity of adi-pose depots and the species differences, key aspects that need to betaken in account when cancer is considered. Of note, AT constitutesan active endocrine organ that can have far-reaching effects on thephysiology of other tissues. To understand the endocrine effect ofadipose tissue on breast cancer the reader is referred to reviewson that topic [14,15].

2. White adipose tissues: common features and differences,consequences on breast cancer studies

2.1. Characterization of white adipose tissues: common features anddepot-specific differences in obesity conditions

Mammals have two main types of adipose tissue: white adiposetissue (WAT), and brown adipose tissue (BAT), each of which pos-sesses unique cell autonomous properties. While WAT is special-ized in storing energy and is an important endocrine organ

Normal Mammary Adipose Tissue

Fig. 2. Differences between in vivo mature adipocytes and in vitro differentiated cells.staining (original magnification X 400). Note that mature white adipocytes have a single la reduced rim of cytoplasm. Right panel, phase contrast microscopy of preadipocytes cellsrounded shape with multiple lipid droplets in the cytoplasm.

involved mainly in the control of weight regulation, the BAT isthe main tissue regulating thermogenesis in response to food in-take and cold. WAT, which will be covered in this review, is mainlycomprised of adipocytes, although other cell types contained in theso-called stroma vascular fraction (SVF) contribute to its growthand function, including ADSCs, preadipocytes, lymphocytes, mac-rophages, fibroblasts and vascular endothelial cells [16]. Maturewhite adipocytes have a spherical shape and a single lipid droplet,surrounded by a reduced rim of cytoplasm, which essentially occu-pies the fat cell volume (see Fig. 2). Mature adipocytes, firstthought as energy-storing cells, have emerged this last decade ashighly endocrine cells which are able to secrete hormones, growthfactors, chemokines or pro-inflammatory molecules, an heteroge-neous group of molecules termed «adipokines» [16]. Traditionally,the two major adipose depots considered and the more extensivelystudied are the visceral (VAT) and subcutaneous (SAT) adipose tis-sues. Differences between adipocytes from visceral and subcutane-ous depots have been recognized for many years including theirunique profile of adipokines production (for review see, [16]). Inaddition, VAT adipocytes exhibit higher rates of fatty acid turnoverand lipolysis, and are less responsive to the anti-lipolytic effects ofinsulin and catecholamines than SAT adipocytes [17]. There isclearly a different impact on VAT versus SAT on human health. In-crease in VAT is particularly linked to obesity-related complicationsuch as type 2 diabetes, cardiovascular diseases and dyslipidemiaswhereas, storage of fat in subcutaneous adipose tissue (SAT) islinked to a lower risk for such conditions [16]. Accumulating evi-dence indicates that a state of chronic low-grade inflammationhas a crucial role in the pathogenesis of obesity-related metabolicdysfunction in intra-abdominal adipose depots as opposed to sub-cutaneous depots. Accordingly, obese subjects were found to har-bor increased AT macrophage content mainly in visceral depots[16,18].

2.2. What are the specificities of mammary adipose tissue?

The different impact of visceral versus subcutaneous fat onhealth during obesity conditions highlights an important conceptin adipose tissue biology, namely, that fat in different body loca-tions exhibits distinct features and functional characteristics.Regarding this later point, what is the specificity of MAT? Themammary gland is comprised of myoepithelial and luminal epithe-lial cells embedded in a complex stroma termed mammary fat padcomposed predominantly of fibroblasts and adipocytes, and cells ofboth the interspersed vasculature and lymphatic systems [19]. A

In vitro differentiated preadipocytes

Left panel, Histological examination of normal mammary adipose tissue after H&Eipid droplet (in white), which essentially occupies the fat cell volume surrounded byafter differentiation into mature adipocytes. Note that the differentiated cells have a

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long-standing line of evidence suggests that, at least in rodents,mammary fat pad is essential for the post-natal development ofmammary epithelium by providing signals mediating ductal mor-phogenesis [19,20]. Adipocytes within the mammary fat pad spe-cifically participate to the development of the normal mammarygland. For example, it has been shown that the total absence ofbreast fat in transgenic mice prevents normal mammary glanddevelopment [21]. The mammary adipocytes are very active duringthe transitions from pregnancy to lactation and into involution(corresponding to the post-lactation regression of mammary epi-thelium) underlying their responsiveness to local signals fromthe epithelium [22]. Briefly, during lactation, mammary adipocytesin close proximity to epithelial cells exhibit rapid depletion of theirlipid store due to enhanced lipolysis. By contrast, the involutionperiod is associated to a refilling of mammary adipocytes that iscompleted approximately within 4 days. Intimate and bidirectionalinteraction with adjacent epithelium is one of the hallmarks ofmammary adipocytes, suggesting that this dialog might persist inphysiopathological conditions such as cancer. It is also very impor-tant to underline that there is undoubtedly species differences con-cerning the composition and function of mammary fat padbetween humans and rodents that should be taken in accountwhen results obtained in rodents are extrapolated to humans. Incontrast to rodents where the mammary fat pad consists primarilyof adipocytes, human mammary adipose tissue is extensivelyinterlaced with a network of fibroblasts and associated connectivetissue [20]. Therefore, in murine mammary glands, the adipocytesare immediately adjacent to the ductal epithelial cells, whereas inhuman mammary glands, a fibrous layer separates the two celltypes. In addition, it has been clearly shown that human mammaryepithelium transplanted into the mammary fat pad of mice did notgrow out unless human stromal fibroblasts are incorporated intothe cleared fat pad [23].

2.3. Models used to study the AT/breast cancer crosstalk: fromestablished preadipose cell lines to freshly isolated cells

These specificities in terms of depots as well as species raise thequestion of the source of adipose cells that should be used inexperimental studies to study the breast cancer/adipose tissueconnection. The detailed description of all the available humanand murine models can be found in the extensive review recentlywritten by Lafontan [24]. For feasibility reasons, the most commonin vitro models used are the murine preadipocyte cell lines 3T3-L1and 3T3-F442A cells. These cell lines were clonally isolated fromSwiss 3T3 cells (derived from disaggregated 17- to 19-day mouseembryos). This clonality circumvents donor-to-donor variabilityof primary cells, providing standardized conditions [24,25]. Theyexhibit a fibroblast-like morphology and are already committedin the adipocyte lineage. Their differentiation into mature adipo-cytes can be achieved in vitro by the addition to confluent cells,in a serum-containing medium, of adipogenic stimuli, includingglucocorticoids (dexamethasone), drugs that increase cyclic AMPlevels (IBMX) and insulin for 3T3-L1 and insulin alone for3T3-F442A, that are committed to a later stage of adipocytedifferentiation [24,25]. Although these in vitro models share manysimilarities with primary adipocytes—including triglycerides stor-age, expression of adipocyte-specific genes and responsiveness tolipogenic and lipolytic factors, some differences persist. For exam-ple, triglycerides are stored in multiple lipid droplets in in vitro dif-ferentiated adipocytes in contrast to normal mature adipocytesthat exhibit a unique large lipid droplet (see Fig. 2). This ‘‘incom-plete’’ differentiation might lead to a lower expression of somegenes and several adipocytes functions such as adipokines secre-tion. This is the case for example of leptin [26], an adipokineinvolved in the stimulation of the proliferative and migratory

properties of cancer cells (see below). To circumvent these limits,the use of long-term culture of 3T3-L1 differentiated on 3D poly-meric scaffolds has been proposed [27]. In vivo transplantationstudies strongly reinforce the interest of these models, especiallythe 3T3-F442A preadipose cell line. In fact, when implanted subcu-taneously into athymic mice at an anatomic site devoid of adiposetissue, the 3T3-F442A preadipocytes differentiate, and within fewweeks, fat pads morphologically similar to normal subcutaneousadipose tissue developed at the site of injection [26]. An original2D coculture system setup in our laboratory using human breastcancer cell lines and in vitro differentiated 3T3-F442A adipocytesmimics the adipocytes changes observed at the invasive front ofbreast tumors [9], underscoring the validity of these mouse modelsin cancer studies (see also below Section 3). More recently, a hu-man multipotent adipose-derived stem cells (hMADS) cell linewas isolated from the adipose tissue of young donors and estab-lished in culture. When differentiated into adipocytes, the cellsshow a lipolytic system similar to that reported in human matureadipocytes, therefore representing a promising tool in adipocytebiology [24]. Finally, mature adipocytes can be obtained from thein vitro differentiation of the SVF of adipose tissues (that containsADSCs) from human and rodents in defined culture conditionseither in 2D or 3D culture systems [24,28].

A clear limitation of the use of these human and murine prea-dipocyte cell lines and primary precursors present in the SVF frac-tion is that they are not suitable models to study obesity-relatedcondition due to their inability to undergo hypertrophy in vitro.Therefore, the use of mature adipocytes isolated from AT of leanand obese subjects should be considered. In fact, adipocytes iso-lated from whole AT of either lean or obese (human or mouse) sub-jects exhibit similar features in vitro than in situ as far as they aremaintained in appropriate culture conditions. From a structuralpoint of view, isolated fat cells from obese are hypertrophied whilethose obtained from lean are smaller. Isolated adipocytes from leanand obese subject exhibit also functional differences in terms of li-pid mobilization and adipokines secretion [29,30]. The isolation ofadipocytes from the extracellular matrix and the SVF fraction is atechnique available in many laboratories whatever the AT consid-ered including MAT [9]. Briefly, collagenase treatment of AT releasethe fat cells from extracellular matrix. Fat cells, owing to their ownfat content are floating whether the SVF fraction remains in thepellet [24]. Coculture system using this source of cells to obtain in-sight into the crosstalk with tumor cell population is clearly lim-ited by the fact that these isolated mature adipocytes cannot beused for long terms culture. Isolated adipocytes in suspension inan appropriate culture medium remain viable for approximately24 h but after this period both survival and function are profoundlyaltered [24]. Primary culture of AT explants represents a usefulalternative to both improve adipocyte viability and preserve theentire tissue environment and structure. Several laboratories havebeen using adipose tissue explants culture to study the influence ofvarious pharmacological or nutritional factors. Adipocytes can alsobe isolated from the explants after the treatment in order to focuson the fat cell itself [29]. However, such a tri-dimensional struc-tures in vitro do not allow an accurate oxygen and nutrients supplyduring long -term periods leading to hypoxia-induced alterationsof adipocyte function such as an increased anaerobic glycolysisor TNF-a accumulation [31]. Therefore, adipose tissue explantsmust be considered as useful over less than 48 h period after cul-ture. Again, 3D culture of isolated adipocytes from lean and obesesubjects on various scaffolds remains the most promising alterna-tive for long-term coculture, model which is currently largely un-tapped with the exception of some studies using isolatedadipocytes from rat and mice AT [32,33]. Finally, to study thein vivo cross-talk in both rodents and human breast tumors,modifications of the tumor-surrounding adipose tissue could be


characterized using either immunochemistry [9,34,35], qPCR onisolated mature adipocytes and precursors [9] or a proteomic ap-proach [36].

To conclude, as a first step, the use of human and murine prea-dipocyte cell lines after in vitro differentiation represents highlyuseful tools to study the crosstalk with breast cancer cells. Never-theless, the results obtained should be validated in vitro usingmammary primary adipose cells in 2D (and ideally in 3D) coculturesystems and in vivo in human breast tumors to ensure theirrelevance.

3. Paracrine role of the different components of adipose tissuein breast cancer progression

There are long standing arguments in the literature showingthat fat tissue is able to support and amplify breast cancer progres-sion. In 1992, Eliott and colleagues showed that the murine carci-noma SP1 cell line grew best when injected in the mesenteric andovarian fat pads and in the mammary gland, but very poorly in thesubcutis or peritoneal cavity [37]. Moreover, mammary tumorscells transplanted into various adipose tissue depots subsequentlymetastasize to different organs. Massive dissemination of tumorsfrom the ovarian and mesenteric sites occurs to the liver, spleenand diaphragm whether metastases from the mammary site occurprimarily in the lung [37]. The positive influence of the local mam-mary fat-rich microenvironment on breast cancer growth is alsosustained by the increase in xenograft success in mice when ortho-topic, rather than subcutaneous, injections are employed [38]. Inhumans, it has been proposed that the adipose tissue invasion(ATI) at the tumor margin, as well as the invasive length of fat inva-sion, are indicators of tumor aggressiveness in early stage breastcancers [39]. It has been previously emphasized that adipose tissueat close distance to breast tumors is a source of pro-inflammatorycytokines such as IL-6, TNF-a, and reactive oxygen species [40]. Adetailed proteomic study of fresh fat tissue samples collected fromtumors of high risk breast cancer patients identified a large array ofproteins, including numerous signalling molecules, hormones,cytokines, and growth factors, involved in a variety of biologicalprocesses such as signal transduction and cell communication, en-ergy metabolism, protein metabolism, cell growth and/or mainte-nance, immune response and apoptosis [36]. As stated before, ATis composed of different cell types. Accordingly, regarding the spe-cific cellular components of this tissue, namely mature adipocytesand preadipocytes/ADSCs, two important questions remain open:do they both participate in breast tumor progression and whatare the signalling pathways involved?

3.1. Mature adipocytes are key actors in breast cancer progression: theconcept of cancer-associated adipocytes (CAAs)

As mentioned before, mature adipocytes are highly active endo-crine cells and are therefore excellent candidates to play a crucialrole in the control of tumor behavior through heterotypic signal-ling processes. One of the first evidence of their role in breast can-cer progression came from the study of Manabe et al. [41], showingthat the rat mature adipocytes, but not the preadipocytes, promotethe growth of several oestrogen-receptor (ER)-positive breast can-cer cell types. The same year, the pioneering study of the group ofP. Scherer demonstrated that the full complement of adipokines,represented by the conditioned-medium of mature 3T3-L1 murineadipocytes, showed an unparalleled ability to promote the growth,cell motility and invasion of ER-negative and positive breast cancercells in vitro [42]. Combined, these first studies shed in light thecrosstalk between adipocytes and breast cancer cells and under-

score the need to fully understand the role of this heterotypic sig-nalling in modulation of tumor behavior.

As stated in the introduction of this review, cancer cells usuallygo about generating a supportive microenvironment by activatingthe wound-healing response of the host. For example, residentfibroblasts are capable of adapting to tissue injury (including can-cer), and as a result change their phenotype to become ‘‘reactive.’’In order to investigate if such phenotypic changes are observed intumor-surrounding adipocytes, a 2D coculture system in whichadipocytes and breast cancer cells were separated by an insert, thatallows the diffusion of soluble factors, was setup in our laboratoryto mimic the adipocyte-cancer cell crosstalk at the tumor invasivefront [9]. Using this original model, we extensively described tu-mor-induced changes in adipocytes that are reproducibly dis-played by both mouse and human mammary adipocytes.Adipocytes cocultivated with various human and murine breastcancer cell lines generally exhibit a loss of lipid content, a decreasein late adipose markers expression, and over-expression of inflam-matory cytokines (such as IL-6 and IL-1b) and proteases (such asMMP-11 and PAI-1). We named these tumor-surrounding adipo-cytes, ‘‘Cancer-Associated Adipocytes’’ (CAAs). Equally important,using immunohistochemistry and quantitative PCR, we confirmedthe presence of these modified adipocytes in human breast tumors.What are the effects of these CAAs on tumor progression? All mur-ine and human tumor cells cocultivated with mature adipocytesexhibited increased invasive, but not proliferative, capacitiesin vitro and in vivo. In tumor cells, these increase invasive capaci-ties were associated with incomplete epithelial to mesenchymaltransition (EMT). In the case of IL-6, we further showed that itplays a key role in the acquired pro-invasive effect, and associatedEMT, by tumor cells. Interestingly, the human breast tumors of lar-ger size and/or with lymph nodes involvement exhibit the higherlevels of IL-6 in tumor surrounding adipocytes [9]. Such an inflam-matory state in the tumor-surrounding adipose tissue has alsobeen described for prostate cancer. High levels of IL-6 were foundin the periprostatic adipose tissue of tumor-bearing patients andthe levels of IL-6 correlated with the aggressiveness of the tumors,highlighting the importance of this cytokine in the adipocyte/can-cer cells crosstalk [43]. Another very important aspect of this cross-talk concerns the remodelling of the ECM. Collagen VI (COLVI) isabundantly expressed in tumor-surrounding adipocytes and adi-pocyte-derived COLVI production is involved in mammary tumorprogression in vivo [35,42]. In the same way, adipocytes at theinvasive front of human tumors consistently exhibit increasedexpression of metalloprotease 11 (MMP-11)/stromelysin 3 [34]. In-crease local fibrosis and its permanent remodelling (generatingECM components functioning as signalling molecules) have beenclearly implicated in tumor progression. This association seemsto justify prominently, the role of both COLVI and MMP-11 overex-pression in a tumor context. In addition, these events might di-rectly contribute to the occurrence of the CAAs phenotype sinceadipocytes actively reorganize the ECM during differentiation pro-cesses [44]. For example, it has been shown that MMP-11 is a po-tent negative regulator of adipogenesis [34]. In fact, a relativedegree of ‘‘dedifferentiation’’ is one of the hallmarks of CAAs [9,34].

Supported by epidemiological evidence, animal models andin vitro studies, two adipokines, leptin and adiponectin, have beenlargely involved in breast cancer occurrence and progression[15,45]. Schematically, leptin appears to promote tumor cellsgrowth by mainly stimulating the activity of signalling pathwaysinvolved in proliferation process whereas adiponectin repressedproliferation and induced apoptosis, in breast cancer cells[15,45]. The paracrine local implication for these adipokines inbreast cancer cells appears to be weaker, or at least less character-ized, than their endocrine effects. We found that CAAs exhibit a de-crease in late adipose markers including leptin (Dirat et al.,


unpublished results), suggesting that this adipokine is not primar-ily involved in the negative crosstalk between adipocytes andbreast cancer cells at the invasive front. By contrast, adiponectinexpression is absent in CAAs suggesting that its negative effecton tumor progression might be hampered in these tumor-modifiedadipocytes [9]. CAAs derived-factors might also affect in turn thesecreted profile of tumor cells. For example, it has been shown thatadipocytes stimulate the expression of genes related to immunefunction and wound-healing in tumor cells, such as the chemokineCCL-20, the macrophage inhibitory cytokine 1 (MIC-1) or even IL-6[10,46,47], contributing among others things, to increase tumorinvasiveness. Finally, one probably underestimated effect of adipo-cyte/cancer crosstalk is its role in the response to antitumor ther-apy. We have recently shown that CAAs contribute to theoccurrence of a radioresistant phenotype in breast tumor cells[10]. In a different tumor model (i.e. acute lymphoblastic leukae-mia) it has been demonstrated that adipocytes impairs leukaemiatreatment by Vinca alkaloids both in vitro and in vivo [48]. Takentogether, all these data strongly support the concept that an inti-mate crosstalk is established between cancer cells and mature adi-pocytes at the invasive front of the tumor, whose relevance hasbeen clearly demonstrated in human tumors [9,34,35]. Invadingtumor cells are able to modify adipocytes phenotype, which, inturn, stimulate cancer cells aggressive behavior, the stimulationof local tumor invasiveness being, to our point of view, one ofthe key events resulting from this crosstalk. The molecular cir-cuitry involved in these processes as well as the resulting pheno-typic changes observed in both populations is summarized inFig. 3.

Fig. 3. Invading tumor cells are able to modify adipocytes phenotype, which, in turn, stiresults in immediate proximity of cancer cells to mature adipocytes. In turns, matuaggressiveness of tumor cells by increasing tumor growth, tumor invasiveness and resistalso affect the secreted profile of tumor cells.

3.2. Contribution of ADSCs and pre-adipocytes to breast cancerprogression

Studies have provided compelling in vivo evidences that mesen-chymal stem cells (MSCs) distally recruited from the bone marrowcontribute to breast cancer progression [49]. Even though adiposetissue is the most abundant stromal constituent in the breast and arich source of mesenchymal stem-like cells, only recent studies ad-dressed the question of the involvement of this resident stem cellspopulation in breast cancer progression [50]. Globally, these stud-ies demonstrated that ADSCs also contribute to tumor progression.ADSCs promote in vitro and in vivo the growth and survival ofbreast cancer cells as well as their migratory and invasive capaci-ties [8,51–55]. Several molecules have been involved in the pro-invasive effects of ADSCs including IL-6 [8], IL-8 [52], CCL-5 [53]and CXCL-12/SDF-1 [55]. More recently, it has been demonstratedthat ADSCs promote the expansion of cancer stem cells and induceEMT in the cancer cells in a PDGF dependent manner [54]. As forother components of the tumor stroma, a complex network isestablished between tumor cells and ADSCs. Tumor cells, throughTGFb signalling, are able to «differentiate» ADSCs into CAF-like cellsexpressing a-smooth muscle actin (a-SMA) and tenascin C [54,56].Interestingly, ADSCs are themselves chemo-attracted towardsbreast cancer cells [52,57]. Therefore, these compelling results sug-gest that ADSCs could directly contribute to the dense network offibroblasts (the so-called desmoplastic reaction) frequently ob-served in the center of breast tumors and, as such, be consideredas a subpopulation of CAFs. Of note most of these studies have beenperformed using ADSCs from abdominal or subcutaneous sources

mulate cancer cells aggressive behavior. In breast cancer, early local tumor invasionre adipocytes exhibit profound changes. CAAs clearly contribute to increase theance to antitumor therapy including ionizing radiation. CAAs derived-factors might


with the noticeable exception of two studies that used MAT [8,50].As stated before since adipose depots have different biochemicalprofiles, it appears important to use breast-derived ADSCs wheninvestigating the effects of ‘‘resident’’ stem cells on breast cancercells. ADSCs obtained from reduction mammoplasty differentiatealong adipogenic, osteogenic and chondrogenic lineages in vitroand exhibit similar gene expression profiles and an indistinguish-able immunophenotype from ADSCs from abdominoplasty speci-mens and bone marrow (BM)-MSCs [50]. However, notable geneexpression differences are observed between stem cells from dif-ferent sources, with abdominal ADSCs being more similar to BM-MSCs and breast-derived ADSCs being more similar amongst themwhen compared to abdominal ADSCs. A comparison of the geneexpression profiles breast ADSCs with BM-MSCs demonstrated thatnumerous genes implicated in cell growth, matrix deposition,remodelling, and angiogenesis are expressed at significantly higherlevels in the local/breast ADSCs relative to BM-MSCs, suggestingthat these resident stem-like cells may play a unique role in breastcancer progression [50]. More committed preadipose cells such aspreadipocytes can also interact with breast cancer cells. It has beendemonstrated that adipocyte differentiation is inhibited when pre-adipocytes are cocultivated with various breast cancer cell lines orin the presence of breast cancer cells conditioned media, this effectbeing dependent of TNF-a and IL-11 secreted by breast tumor cells[58]. Finally, it has been proposed that 3T3-L1 preadipocytes fa-vored in vitro and in vivo fibronectin deposition and remodellingwithin the breast tumor microenvironment [59]. Again, these datafavor the concept of ADSCs/preadipocytes as constituents of theCAFs population surrounding the tumors. However, it is importantto note that most of these data were obtained in coculture systems

Fig. 4. Crosstalk between tumor cells and adipose progenitors contribute to breast cancegrowth factors and cytokines, adipose progenitors. These activated progenitors or AdiposTheir increased migratory/invasive abilities allow them to join the center of the tumprogression. Note however that all these results have been mostly obtained in in vitromodels and have not been fully validated in human tumors.

using breast cancer cell lines and isolated adipose precursors. In aseries of 28 samples, we observed no modifications of inflamma-tory or protease gene expressions between the SVF fractions ofadipose tissue obtained from tumorectomy or reduction mammo-plasty [9]. These results obtained in human tumors suggest thatwithin the cellular complexity of the adipose tissue, the crosstalkwith tumor cells is rather established with mature adipose cells,than with their precursors. However, we cannot exclude thatchanges concern a minor subpopulation that does not affect theoverall level of gene expression of the SVF fraction, which remainshighly heterogeneous. Further experiments are clearly needed toassess that the phenotypic changes observed with isolated adiposeprecursors can also be observed in human tumors. The molecularcircuitry involved in adipose precursors/tumor cells crosstalkdescribed to date as well as the resulting phenotypic changesobserved in both populations are summarized in Fig. 4.

4. Adipocytes could also contribute to carcinogenesis inaddition to tumor progression

It has been proposed that the stroma cells do not contributeonly to the progression of existing tumors but can also contributeto early events in carcinogenesis [4,60]. Key to this ‘‘tumor micro-environment’’ perspective of malignancy is the idea that ‘‘initiated‘‘ genetically primed resident cells within a tissue have a low pre-disposition to develop as a tumor and will probably remain dor-mant unless exogenous stimuli such as factors produced byactivated stroma promote the carcinogenic process. A functionallink between inflammation and cancer has long been recognized.Individuals suffering from chronic inflammatory disorders harbor

r progression. Invasive breast cancer cells could locally activate, via diverse solublee-Progenitors Derived Fibroblasts (ADPFs) exhibit similar characteristics than CAFs.

or and to participate to the desmoplastic reaction. These ADPFs stimulate tumorcoculture studies (mostly using ADSCs from other sources than MAT) and animal


a greatly increased risk for cancer development, owing primarily tothe procarcinogenic environment generated by activated inflam-matory cells [4,60]. Several studies have shown that fibroblastscan also induce a tumorigenic process. For example, when CAFs ob-tained from lesions of prostatic adenocarcinoma are engrafted withinitiated but non tumorigenic prostate epithelial cells in mice,these later cells form tumors [61]. Senescent fibroblasts were alsoshown to have protumorigenic activity, underscoring a relation-ship between aging and cancer [62]. In mice, deleting the activityof one of the TGF-b receptors only within the fibroblasts leads toepithelial tumors in the prostate and forestomach [63].

Is there a role for adipocytes in this ‘‘tissue-integrated’’ view ofcarcinogenesis? Although not directly demonstrated, several stud-ies argue in the favor of the later hypothesis. In mice, injection ofunirradiated mammary epithelial cells into irradiated epithelial-cell-free (cleared) mammary fat pads resulted in neoplastictransformation of the epithelial cells [64]. Interestingly, this effectappears to be independent of the systemic radiation effects sincetumor incidence was restricted to the irradiated site as tested byhemi-body irradiation [64]. Of note, adipocytes by themselves havebeen described to be highly resistant to ionizing radiation [65]. Sim-ilarly, Maffini and co-workers [66] demonstrated that treatment ofcleared mammary fat pads with the carcinogen N-nitroso-methylurea (NMU) generated a stroma environment that allowed thedevelopment of epithelial tumors from transplanted normal epithe-lial cells. They even showed that treatment of the epithelial cellswith NMU was not sufficient to induce tumor in untreated stromalbackground, but rather, required the grafting onto NMU-treatedstroma [66]. The mechanisms by which this ‘‘activated’’ fat pad con-tributes to carcinogenesis and the signalling events involved arepoorly understood. The fat pad consists, in addition to adipocytes,of various cell types. However, while in the human mammarygland, the developing mammary epithelium is closely sheathedby stromal fibroblasts in addition to adipocytes, the mouse mam-mary fat pad consists primarily of adipocytes [22]. Therefore, adipo-cytes are probably key targets of the genotoxic compounds leadingto the stroma-dependent carcinogenesis models described above.Also as part of this concept, it is important to note that many envi-ronmental chemical carcinogens are indeed lipophilic, so they canbio-accumulate into adipocytes lipid droplets [67]. The local releaseof carcinogens from adipocytes might directly initiate, or contributeto the carcinogenesis process in adjacent epithelial cells. All of thesestudies, though still preliminary and mostly conducted in mousemodels, open very interesting perspectives for the prevention,detection and treatment of breast cancer in humans.

5. Direct clinical consequences of the epithelial adipose tissue/crosstalk

5.1. Obesity and breast cancer prognosis

One of the main clinical consequences of the intimate crosstalkbetween adipose tissue and breast cancer concerns the prognosisof breast cancer in obese patients. In fact, overweight (defined asa body mass index [BMI] of 25–29.9 kg/m2) and obesity(BMI P 30 kg/m2) are now established risk factors for cancer andcancer-related mortality (for reviews see [11,12,68]). Concerningbreast cancer, early studies have clearly established that obese wo-men have an increased risk of developing postmenopausal, but notpremenopausal, breast cancer [68]. Interestingly, the level of asso-ciation with increasing adiposity becomes stronger with increasingtime since the menopause [69]. One of the major mechanism con-tributing to the increased risk of post-menopausal breast cancer, aswell as endometrial cancer, associated to obesity is the increase incirculating levels of estrogens since after the menopause the

principal site of estrogens production is in the adipose tissue[69]. Noteworthy, excess bodyweight is not only associated to in-creased incidence of breast cancer, but is also an independent neg-ative prognosis factor independently of menopause status (forreviews see [11,12]). As already discussed before [12,70], multiplefactors might contribute to the poorer survival rates in obese pa-tients with breast cancer including a higher likelihood of co-mor-bid conditions and other ‘‘non-biological’’ effects. However, thereis now clear evidences that host factors contribute to the occur-rence in obese women of tumors exhibiting at diagnosis an aggres-sive biology defined by an increase in lymph nodes involvementand a higher propensity to distant metastasis (reviewed in [12]).In the largest retrospective clinical study published to date, Ewertzet al. report that obesity is an independent prognosis factor for thedevelopment of distant metastases and death after the diagnosis ofbreast cancer [71]. The increased risk for obese women of develop-ing distant metastases after 10 years, increased by almost 50% [71].

Obesity is associated with elevated levels of pro-inflammatorycytokines in VAT and in the circulation, which generates a low-grade, chronic inflammatory state [72]. One hallmark of obesity-associated inflammation is the recruitment of macrophages intoadipose tissue, where they form characteristic ‘‘crown-like’’ struc-tures (CLS) around apoptotic adipocytes [72]. Interestingly, we havedemonstrated that obesity and the defined profile of CAAs shareinflammation as common traits [9]. Furthermore, in breast humantumors, the association of high levels of IL-6 in CAAs with high tu-mor size and enhanced local invasion reflect those traits presentin obese patients [9]. Therefore, it is tempting to speculate that CAAswithin a context of obesity should be more prone to amplify the neg-ative crosstalk with tumor cells. Therefore, this assumption under-lies that such an inflammatory condition also exists in breastadipose tissue. In opposition to VAT, very little is known aboutMAT and inflammation in obese subjects. Nevertheless, Subbarama-iah et al. has recently shown that obese mice (involving both dietaryand genetics models of obesity) exhibit necrotic adipocytes sur-rounded by macrophages forming CLS in both the mammary glandand visceral fat [73]. Moreover, the presence of CLS was associatedwith activation of NF-jB and increased levels of pro-inflammatorymediators in the MAT of obese versus lean mice. The same teamhas shown that these findings can be translated into women sinceCLS were founded in nearly 50% of breast tissue from women under-going mastectomy and the severity of breast inflammation was cor-related with both BMI and breast adipocytes size [74]. Similarly, Sunet al. has recently shown that normal breast tissue, obtained fromreduction mammoplasty of obese women, exhibit macrophagesinfiltration and a significant enrichment for pathways involvingIL-6, IL-8, CCR5 signalling, consistent with a local pro-inflammatorystate [75]. Therefore, these compelling very recent results demon-strate that obesity is associated with a sub-inflammatory state ofthe MAT reinforcing the hypothesis of an amplified paracrine nega-tive crosstalk between adipose tissue and tumor cells to explain thepoor prognosis observed in obese patients. However, this is still ahypothesis that remains to be validated both in vitro and in vivo. Inmouse models, preliminary results have been obtained that linksobesity and the occurrence of high-grade adenocarcinomas, in-creased tumor growth, as well as angiogenesis and distant metasta-sis [76,77]. These mouse models will be very helpful to identify theparacrine mechanisms involved in the stimulation of tumor pro-gression in order to setup specific strategies for the treatment of ob-ese patients exhibiting aggressive diseases.

5.2. Safety concerns between autologous fat grafting and breast canceroccurrence and recurrence

In plastic and reconstructive surgery, autologous fat gratingenables soft tissue augmentation and is increasingly used for


cosmetic indications but also for correction of defect followingbreast cancer treatment. Schematically, this procedure first pro-posed by Coleman, known as the Coleman technique, consists ofthe harvesting of subcutaneous fat usually from the abdominalwall or the thighs by a blunt liposuction cannula connected to asyringe, followed by a short centrifugation and injection of the cel-lular ‘‘fat’’ into the area of interest [78]. To maximize survival, fat isgenerally injected in small parcels and thin strips at different levelsin the sub-cutis region of the breast [79]. Therefore, the injectedpreparation contains mature adipocytes as well as all the cellularcomponents of the SVF including ADSCs/preadipocytes, endothelialcells and progenitors, fibroblasts and macrophages. Because thelipoaspirate contains at least two populations of cells, adipose pre-cursors and mature adipocytes, which are involved in tumor–stro-mal interaction as we discussed before, the potential risk of thisapproach in increasing breast cancer recurrence (and even induc-tion) needs to be addressed. To date, very few, if any, translationalstudies to evaluate the risk of fat grafting using the lipofilling tech-nique described above are available. In our hands, the coinjectionof fat used for lipofilling with human breast cancer cells dramati-cally increases the tumor growth in mice (I. Garrido, unpublishedresults). However, the design of the study was different from theclinical situation since in human, autologous fat transfer is usedin treated patients and is expected to interact with dormant andnot actively growing tumor cells. At clinical levels, available seriesaddressing the oncological risk of lipotransfer in breast cancer pa-tients are also limited [80]. Only one series using a retrospectivecontrol group has been published to date [81]. For each of the321 patients operated for a primary breast cancer between 1997and 2008 who subsequently underwent lipofilling for reconstruc-tive purpose, two matched patients with similar characteristicswho did not undergo a lipofilling were used as a control. This studyconcludes that the lipofilling transfer for breast cancer patientswas a safe procedure. However, it is interesting to note that whenthe analysis was limited to intra-epithelial neoplasia (37 patients),the lipofilling group resulted at higher risk of local events [81].Accordingly, prospective control protocols are clearly needed todefinitively assess the safety of the procedure. In addition, recentfat transfer and lipoinjection protocols have focused on the addi-tion of autologous ADSCs or freshly isolated adipose stromal vascu-lar cells to promote graft volume retention [82]. This type ofprocedures should be considered with even greater caution withrespect to conventional technique. In fact, a recent study demon-strated that the coinjection of human WAT-CD34(+) endothelialprecursors cells (EPCs) from lipotransfer procedures contributedto tumor vascularisation and significantly increased tumor growthand metastases in several orthotopic models of human breast can-cer in immunodeficient mice compared with coinjection withCD34� EPCs or breast cancer cells alone [83]. Interestingly in thisstudy, the increase in axillary and lung metastases in mice injectedwith CD34+ WAT cells was even observed when these cells are in-jected after surgical removal of the initially transplanted tumor.Therefore, this first translational study designed to address thequestion of the safety of fat grafting highlights the urgent needof controlled clinical trials when ‘‘enriched’’ fat sources are usedfor lipofilling.

6. Conclusion and perspectives

The AT has emerged these last 5 years as an integral and activecomponent of breast cancer microenvironment. The role of the var-ious cellular actors of AT begins to be addressed and it is importantto underline that, to date, only the tumor-induced changes ofmature adipocytes, the so-called CAAs, have been demonstratedin both in vitro studies, animal models and human tumors. Since

population of obese people is constantly increasing, it is of funda-mental and of clinical interest to further study the relationshipexisting between adipocytes and breast cancer cells in order toprevent and treat this subset of aggressive diseases. As found in ob-ese patients exhibiting an increase in both local and distant inva-sion, one of the principal hallmarks of the adipose tissue/cancercrosstalk appears to imply the invasive properties of tumor cells.Interestingly, it is suggested from several studies that tumor-sur-rounding adipose tissue, by its ability to secrete pro-inflammatorycytokines such as IL-6, contributes to local inflammation that con-tribute to promote an aggressive phenotype in breast cancer.Therefore, limiting inflammation through inhibition of IL-6 signal-ling might represent an interesting strategy to block disease pro-gression, a strategy that need to be tested in in vitro 3D coculturemodels as well as in lean and obese conditions in vivo. CAAs appearto promote tumor progression by acting at least directly on the tar-get tumor cells. However, these stromal cells might also mediatedisease progression by secreting factors promoting angiogenesisand/or by creating an immunosuppressive microenvironment,hypothesis that remains to be explored. It is likely that the contin-ued characterization of these interactions, and the molecular iden-tification of key mediators, will provide new insights into tumorbiology and suggest further novel therapeutic options.

Acknowledgements

Studies performed in our laboratories were supported by theFrench National Cancer Institute (INCA PL 2006-035 to GE, PVand CM and INCA PL 2010-214 to PV and CM), the ‘Ligue Régionalecontre le Cancer’ (Comité du Lot et Haute-Garonne to CM), the Fon-dation de France (to PV and CM) and the University of Toulouse(AO CS 2009 to CM). CL is a recipient of a PhD fellowship fromthe ‘‘Ligue Nationale contre le Cancer’’. The authors would like tothank Dr Max Lafontan and Pr Jean-Yves Petit for critical readingof the manuscript.

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121

OBJECTIFS DE THESE

123

Il est maintenant clair que le microenvironnement tumoral est un composant extrêmement important

dans la progression tumorale (Mueller and Fusenig 2004). Parmi les cellules stromales présentes dans

le microenvironnement du cancer du sein, deux types cellulaires ont particulièrement retenu notre

attention : les CAFs et les adipocytes. Comme nous l’avons vu dans la première partie de cette

introduction, les CAFs possèdent un rôle très important à toutes les étapes de la progression tumorale.

Ils permettent notamment la création de la réaction desmoplasique, définie par une prolifération accrue

des CAFs, sécrétant des protéines matricielles (collagène I, fibronectine …). De nombreux arguments

ont mis en évidence que la réaction desmoplasique représente un facteur de mauvais pronostic dans le

cancer du sein (Ohlund et al 2014). Malgrè le rôle important des CAFs dans le cancer, il existe une

certaine ambiguité quant à l’identification et l’origine de ces cellules. Cette ambiguité est

probablement liée au fait que les CAFs représentent une population cellulaire hautement hétérogène,

qui possède non pas une mais plusieurs origines (Augsten 2014).

Moins connus, les adipocytes se sont révélés être des cellules originales, hautement plastiques,

capables de sécréter de nombreuses molécules bioactives (Ouchi et al 2011). De par leurs capacités

uniques et leur abondance dans le sein, ils représentent des acteurs émergents dans la progression

tumorale mammaire (Nieman et al 2013). Mon équipe a été l’une des première a montré qu’un

dialogue bidirectionnel s’instaure entre les cellules tumorales mammaires et les adipocytes, à l’origine

de profondes modifications des deux types cellulaires, au profit de la progression de la tumeur (Dirat

et al 2011). Le rôle des adipocytes dans le cancer est d’autant plus important, que l’obésité est un

facteur de mauvais pronostic global pour les cancers, notamment le cancer du sein. En effet, cette

pathologie, caractérisée par une augmentation du nombre et de la taille des adipocytes ainsi que par un

remaniement important du tissu adipeux est liée à des cancers du sein plus agressifs (Ewertz et al

2011).

Un autre aspect de la progression tumorale, potentiellement dépendant des adipocytes est la résistance

à la chimiothérapie. En effet, la chimiothérapie est largement utilisée dans le traitement du cancer du

sein. Cependant, de nombreux mécanismes de résistance sont connus, à l’origine d’une augmentation

des rechutes et de la mortalité des patientes (Holohan et al 2013). Le rôle des adipocytes dans la

chimiorésistance des cancers du sein a été peu décrit, alors qu’ils représentent un composant important

du stroma mammaire. D’autre part, l’obésité est un facteur de mauvais pronostic global pour le cancer

du sein, caractérisé notamment par une chimiorésistance plus importante (Litton et al 2008).

Au vu de l’ensemble de ces données, l’objectif majeur de ma thèse a été d’étudier le rôle des

adipocytes sur différents aspects de la progression tumorale mammaire, en évaluant plus

précisément :

124

1) L’effet prolongé des sécrétions tumorales sur les adipocytes, afin de déterminer si une

partie des CAFs pourrait provenir des adipocytes et d’étudier le rôle de ces cellules sur

la progression tumorale.

2) Le rôle des adipocytes dans la chimiorésistance des cellules tumorales mammaires et de

déterminer si ce processus est amplifié dans un contexte d’obésité.

125

RESULTATS

127

Article 1. Un nouveau phénotype d’origine adipocytaire : Les fibroblastes dérivés des

adipocytes ou ADFs (Adipocytes-Derived Fibroblasts)

L’importance des adipocytes dans la progression tumorale mammaire est désormais établie. Un

dialogue bidirectionnel entre les cellules tumorales et les adipocytes se met en place. Ce dialogue

donne lieu à des modifications des deux types cellulaires. En particulier, les adipocytes co-cultivés

avec les cellules tumorales acquièrent un phénotype activé, que l’on a appelé CAAs pour Cancer-

Associated Adipocytes (Dirat et al 2011). Les CAAs sont présents au niveau du front invasif des

tumeurs mammaires. Au sein du tissu tumoral, plus on se rapproche du centre de la tumeur et plus le

ratio fibroblastes / adipocytes est élevé. Les fibroblastes présents dans la tumeur sont appelés CAFs

pour Cancer-Associated Fibroblasts et sont à l’origine d’une forte réaction fibrotique, appelée réaction

desmoplasique, de par leur présence importante et leur sécrétion accrue de protéines de la MEC. De

nombreux arguments ont très clairement associé la présence des CAFs et l’agressivité des cancers,

notamment leur capacité métastatique (pour revue (Mao et al 2013)). Malgré le rôle avéré des CAFs

dans la progression tumorale, leur origine demeure un sujet débattu, probablement car ils possèdent

non pas une, mais plusieurs origines. Ainsi, l’hypothèse que nous avons avancée est que sous

l’influence des cellules tumorales, les adipocytes pourraient se réorienter en CAFs.

Pour valider cette hypothèse, nous avons réalisé tout d’abord des co-cultures prolongées (de 5 à 8

jours) entre les adipocytes (différenciés à partir de la lignée 3T3-F442A) et des cellules tumorales

mammaires. Nous avons montré que les adipocytes co-cultivés avec les cellules tumorales adoptent

progressivement une morphologie fibroblastique, associée à une diminution drastique des marqueurs

adipocytaires. En injectant des cellules tumorales mammaires dans un « fat pad » exogène constitué

d’adipocytes exprimant la protéine GFP, nous avons montré l’émergence de fibroblastes-GFP

infiltrant les cellules tumorales, associée à la présence d’une forte réaction fibrotique. Cette expérience

a permis de valider in vivo la réorientation des adipocytes en fibroblastes, que l’on a appelé ADFs pour

Adipocytes-Derived Fibroblasts. L’identification des ADFs (expression de FSP-1, propriétés

migratoires et invasives et expression de protéines matricielles) nous a permis de démontrer qu’ils

représentent une sous-population de CAFs. La réorientation des adipocytes en fibroblastes est liée à la

sécrétion de Wnt3a d’origine tumorale, qui active en aval, la voie Wnt/β-caténine dans les adipocytes.

Enfin, nous avons mis en évidence que les ADFs favorisent, de manière importante, l’invasion des

cellules tumorales. De manière intéressante, nous avons montré l’existence des ADFs dans les tumeurs

humaines de cancer du sein.

Nos résultats indiquent, pour la première fois, que les adipocytes sont capables de se réorienter

en cellules fibroblastiques en présence de cellules tumorales. Ils contribuent ainsi à la réaction

desmoplasique et favorisent la progression tumorale. Ce travail a fait l’objet d’une publication dans

le journal Cancer Research.

2013;73:5657-5668. Published OnlineFirst July 31, 2013.Cancer Res Ludivine Bochet, Camille Lehuédé, Stéphanie Dauvillier, et al. Contribute to the Desmoplastic Reaction in Breast CancerAdipocyte-Derived Fibroblasts Promote Tumor Progression and

Updated version

10.1158/0008-5472.CAN-13-0530doi:

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Microenvironment and Immunology

Adipocyte-Derived Fibroblasts Promote Tumor Progressionand Contribute to the Desmoplastic Reaction in BreastCancer

Ludivine Bochet1,2,3, Camille Lehu�ed�e1,2,3, St�ephanie Dauvillier1,2, Yuan Yuan Wang1,2,3, B�eatrice Dirat1,2,3,Victor Laurent1,2, C�edric Dray1,3, Romain Guiet1,2, Isabelle Maridonneau-Parini1,2, Sophie Le Gonidec1,3,Bettina Couderc4, Ghislaine Escourrou5, Philippe Valet1,3, and Catherine Muller1,2

AbstractCancer-associated fibroblasts (CAF) comprise the majority of stromal cells in breast cancers, yet their precise

origins and relative functional contributions to malignant progression remain uncertain. Local invasion leads tothe proximity of cancer cells and adipocytes, which respond by phenotypical changes to generate fibroblast-likecells termed as adipocyte-derived fibroblasts (ADF) here. These cells exhibit enhanced secretion of fibronectinand collagen I, increased migratory/invasive abilities, and increased expression of the CAF marker FSP-1 but nota-SMA. Generation of the ADF phenotype depends on reactivation of the Wnt/b-catenin pathway in response toWnt3a secreted by tumor cells. Tumor cells cocultivated with ADFs in two-dimensional or spheroid culturedisplay increased invasive capabilities. In clinical specimens of breast cancer, we confirmed the presence of thisnew stromal subpopulation. By defining a new stromal cell population, our results offer new opportunities forstroma-targeted therapies in breast cancer. Cancer Res; 73(18); 5657–68. �2013 AACR.

IntroductionOneof the features of breast cancer is the presence of a dense

collagenous stroma, the so-called desmoplastic response, com-prising of fibroblast-like cells known as cancer-associatedfibroblasts (CAF; ref. 1). Accumulating experimental evidencehas shown that CAFs play an active role in breast cancerprogression through the release of growth factors and chemo-kines andby contributing to the remodeling of the extracellularmatrix (for review see refs. 2–4). CAFs are "activated" fibro-blasts and were first identified upon morphologic criteria anda-smooth muscle actin (a-SMA) expression, in the samemanner as wound-healing myofibroblasts (5). However, thismarker is not ubiquitous, highlighting that CAFs is a hetero-geneous cell population (6). Indeed, CAFs are alternativelyreported to stem from resident localfibroblasts, bonemarrow–derived progenitor cells, or trans-differentiating epithelial/endothelial cells (for review, see refs. 4, 7). At present, neither

the origin of these cells, nor the extent to which their origindetermines their contribution to tumor progression can beunanimously agreed upon.

We have recently shown that invasive cancer cells have adramatic impact on surrounding adipocytes. Both in vitro andin vivo, these adipocytes exhibit a decrease in lipid content, adecreased expression of adipocyte markers, and an activatedstate indicated predominantly by the overexpression of proin-flammatory cytokines (8). These cells are present in vivo at thetumor invasive front and retain an adipocyte-like roundedmorphology. We named them cancer-associated adipocytes(CAA; reviewed in refs. 8–10). CAAs also display overexpressionof extracellular matrix (ECM, such as collagen VI) and ECM-relatedmolecules (11–13), events contributing to breast cancerprogression. As the origin of CAFs is unclear, one attractivehypothesis is that during tumor evolution, peritumoral adipo-cytes undergo "dedifferentiation", first into CAAs then intofibroblast-like cells that may account for a part of the CAFspopulation present in the desmoplastic reaction of breastcancers. Although suggested in several reviews (14, 15), thishypothesis has never been directly shown experimentally usingcombined in vitro and in vivo approaches. Independent of theeffect of cancer cells, several recent studies have shown thatmature adipocytes are in fact plastic cells capable of "dedif-ferentiation" towards fibroblast-like cells (16). Although lim-ited data exists on the mechanisms that could potentially beinvolved in this effect, the role of soluble factors such as TNF-a,Wnt3a (17), or specificmitochondrial uncoupling (18) has beendescribed. In vitro, recombinant MMP-11 is also able to "dedif-ferentiate" mature adipocytes (11). However, the existence ofthis phenomenon in human pathology remains elusive. In thepresent study, we use both in vitro and in vivo (including human

Authors' Affiliations: 1Universit�e de Toulouse, UPS; 2CNRS; Institut dePharmacologie et de Biologie Structurale; 3Institut National de la Sant�e etde la Recherche M�edicale, INSERM U1048; 4Institut Claudius Regaud,EA3035; and 5Service d'Anatomo-Pathologie, Hopital de Rangueil, Tou-louse, France

Note: Supplementary data for this article are available at Cancer ResearchOnline (http://cancerres.aacrjournals.org/).

L. Bochet and C. Lehu�ed�e contributed equally to this work.

Corresponding Author: Catherine Muller, Institut de Pharmacologieet de Biologie Structurale, 205 route de Narbonne, 31077 ToulouseCedex, France. Phone: 33-56117-5932; Fax: 33-56117-5994; E-mail:[email protected]

doi: 10.1158/0008-5472.CAN-13-0530

�2013 American Association for Cancer Research.

CancerResearch

www.aacrjournals.org 5657





tumors) approaches to show that breast cancer cells are able toforce mature adipocytes towards fibroblast-like cells, namedadipocyte-derived fibroblasts (ADF), in aWnt-dependentman-ner. We also extensively describe the distinctive phenotype ofthese new stromal cells, expressing some CAFs markers likefibroblast-specific protein 1/S100A4, but not a-SMA, andunderline their ability to promote the spread of breast cancercells.

Materials and MethodsAntibodies, probes, and drugs

All the primary antibodies used in this study are presented inSupplementary Table S1. The Wnt/b-catenin inhibitor, ICG-001 (19) was from Enzo Life Sciences and was used at 2.5 and 5mmol/L final concentrations. The bodipy lipid probe (used at 1mg/mL) and TO-PRO-3 (used at 1 mmol/L final concentration)were obtained from Invitrogen.

Cell culture, cell lines, and isolation of primaryadipocytes

The murine 3T3-F442A preadipocytes cell line was differ-entiated as previously described (20). To estimate the adi-pocyte phenotype, triglyceride content was quantified usinga colorimetric kit (Wako Chemicals) and Red Oil stainingwas conducted as previously described (20). The murine 4T1breast cancer cell line (provided by Dr. S. Vagner, INSERMU563, Toulouse, France) was cultured in Dulbecco's Modi-fied Eagle Medium (DMEM) supplemented with 5% fetal calfserum (FCS). The human breast cancer cell line SUM159PT(provided by Dr. J Piette, IGMM, Montpellier, France) wasgrown in Ham F12 (50:50) medium complemented with 5%FCS, 1 mg/mL hydrocortisone (Sigma), and 0.2 UI/mL insu-lin. All the cell lines were used within 2 months afterresuscitation of frozen aliquots. Cell lines were authenticat-ed on the basis of viability, recovery, growth, and morphol-ogy. The expression status of E-cadherin, N-cadherin, andvimentin using immunofluorescence approaches, as well astheir invasive behavior, was confirmed before they were usedin the experiments (8). Coculture of tumor cells and adipo-cyte was carried out using a Transwell culture system (0.4mm pore size, Millipore) as previously described (8). Incertain experiments, cells genetically modified by lentiviralvectors encoding either eGFP (Genethon, Evry; 3T3-F442A)or Hc-Red (vector core ICR; SUM159PT) were used. Theisolation of mammary adipocytes either from tumor orreduction mammoplasty was carried out as previously de-scribed by our group (8).

In vivo GFP-subcutaneous fat pad formation and tumorinjection

A total of 1 � 107 confluent GFP-3T3-F442A preadipocyteswere injected into the flank of athymic nudemice, as described(21). Fat pad formation was allowed to proceed for 5 weeks,after which fat pads were injected with 4 � 104 4T1 breastcancer cells. Mice with fat pad alone or tumor cells alone wereused as controls. Five mice were used in each group. After 10days, mice were sacrificed and fat pad, tumors, and fat padscontaining tumors were embedded in paraffin after 48 hours of

fixation in buffered formalin. The local Institutional AnimalCare and Use Committee approved the experimental protocolused in our study.

Immunofluorescence and immunohistochemistryAdipocytes differentiated on coverslips grown alone, or

cocultivated for the indicated times with breast cancer cellswere processed for immunofluorescence as previously des-cribed (8). Fluorescence images were acquired with a confocallasermicroscopy system (Leica SP2). The image resolution was512 � 512 pixels and scan rate was 400 Hz. For each sample,more than 100 cells were examined in at least three indepen-dent experiments. Immunohistochemistry was conducted aspreviously described (11). Adjacent sections were stained withhematoxylin and eosin or Masson trichrome to visualizecollagen fibers (murine fat pad experiments). Images werecaptured on a Leica DMRA2.

Western blot analysisWhole-cell extracts and immunoblots were prepared as

previously described (22). All the antibodies used in this studyare presented in Supplementary Table S1.

RNA extraction and quantitative PCRRNA extraction and quantitative PCR (qPCR) were con-

ducted as previously described (23). All the primers used inthis study are presented in the Supplementary Table S2.

Migration and invasion assays (two-dimensional)After 3 or 8 days of coculture in the presence of SUM159PT

cells, adipocytes were trypsinized and used to conduct migra-tion or Matrigel invasion assays as previously described (23).Similar Matrigel invasion assays were conducted with tumorcells grown alone or cocultivated with ADFs or with matureadipocytes during 3 days (8). In these assays, FCS (10%) wasused as a chemoattractant, and similar experiments wererun in parallel in the absence of serum (no chemoattractant,negative control).

Spheroids formation and invasion in a three-dimensional collagen matrix

The hanging-drop method has been adapted to producespheroids of similar diameter (24). Drops (20 mL) containing1,000 tumor cells alone or mixed with 1,000 ADFs or preadi-pocytes were suspended on the lid of 2% agar-coated 24-welldishes containing culture media. After the 7 days required forcell aggregation, the spheroids were transferred to the bottomof a well containing culture medium. Multicellular spheroidswere then allowed to grow for 14 days and the spheroids used inthe invasion experiments had an average diameter of 500 mm.The spheroid invasion in collagen I matrix was conducted aspreviously described (25).

Glucose uptake experimentsDifferentiated adipocytes cocultivated or not during 3 and 8

days with SUM159PT cells were used to measure the uptake of2-deoxy[3H]glucose in the presence or not of insulin as previ-ously described (26).

Bochet et al.

Cancer Res; 73(18) September 15, 2013 Cancer Research5658





Statistical analysisThe statistical significance of differences (at least three

independent experiments) was evaluated using Student t testor ANOVA using Prism (GraphPad Inc.). P values less than 0.05(�), 0.01, (��), and 0.001 (��) were deemed as significant while"NS" stands for not significant.

Results and DiscussionBreast tumor cells are able to causemature adipocytes torevert to fibroblast-like cells in vitro and in vivoTo test our main hypothesis in vitro, we took advantage of

the coculture model recently set up in our laboratory. Aspreviously described, mature 3T3-F442A adipocytes coculti-vated in the presence of breast cancer cells exhibited a decreasein the number and size of lipid droplets (8). We show here thatthis decrease is time-dependent and, after 8 days of coculture,these cells were almost devoid of lipid droplets (Fig. 1A, top). Incontrast with CAAs (typically obtained after 3 days of cocul-ture), which retain their rounded morphology (8), adipocytesthat have been cocultivated for longer times in the presence of

tumor cells took on a highly elongated, fibroblastic shape (Fig.1A, middle). Preadipocyte factor 1 (Pref-1) expression, a pre-adipocyte transmembrane protein that inhibits adipogenesis(27), is progressively detected in cocultivated adipocytes (Fig.1A, bottom). After 8 days of coculture, we also observed thatmature adipocytes exhibit a loss in adiposemarkers expressionthat was more accentuated than in CAAs (8). An overalldramatic reduction of all the tested adipogenicmarkers includ-ing Adipisin, Adiponectin (APN), Ap2, HSL, as well as C/EBPaand PPARg2mRNAwas observed by qPCR analysis (reduced bymore than 70% for all tested genes, P < 0.001, Fig. 1B). Theseresults were confirmed byWestern blots for HSL, Adiponectin,PPARg2, and C/EBPa expression, whose expression was nolonger detected in cocultivated adipocytes (SupplementaryFig. S1A). Similar results were obtained by cocultivating adi-pocytes with the human ZR 75.1, HMT3522-T4.2 or mouse 4T1breast cancer cell lines (Supplementary Fig. S1B), as well aswhen human mammary adipocytes derived from ex-vivo dif-ferentiation of progenitors, purified from mammary adiposetissue of healthy donors undergoing reduction mammoplasty,were used (Supplementary Fig. S1C). At 8 days, cocultivated

Figure 1. Breast cancer cells revertmature adipocytes into fibroblast-like cells in vitro. A,mature adipocyte cultivated in the presence (C) or in the absence (NC)of tumor cells during the indicated times were stained with Bodipy (top), Pref-1 antibody (bottom; scale bars, 20 mm), or observed through phasecontrast microscopy (middle; scale bar, 50 mm). Nuclei were labeled with TO-PRO-3. Similar experiments were conducted with 3T3-F442A preadipocytesused as a control. B, expression of the indicated genes analyzed by qPCR in mature adipocytes cocultivated for 8 days in the presence (C) or in the absence(NC) of SUM159PT tumor cells. C, GLUT4 and GLUT1 gene expression in mature adipocytes cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) ofSUM159PT cells during the indicated times (left). Analysis of Glut1 andGlut4 protein expression was done byWestern blot analysis with extracts frommatureadipocytes cultivated in the presence (þ) or in the absence (�) of SUM159PTcells for the indicated times (right). D, glucose uptake assay in the presence of theincreasing concentrations of insulin conducted in adipocytes cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of tumor cells during 3 and 8 days.Bars and errors flags represent themeans�SD of at least three independent experiments; statistically significant by Student t test; ��,P < 0.01; ��,P < 0.001relative to NC cells or to untreated cells for glucose uptake experiments.

ADF, a Novel Tumor-Promoting Cell Type

www.aacrjournals.org Cancer Res; 73(18) September 15, 2013 5659





adipocytes exhibited a marked decrease in GLUT4 expressionand a concomitant increase in GLUT1 expression (Fig. 1C) andbecame resistant to insulin (Fig. 1D). No gain of proliferativeability was observed in these cocultivated adipocytes exhibit-ing insulin resistance and a fibroblast-like shape. Indeed, thecell number, as well as the cell-cycle distribution, remainedunchanged during the coculture period (see SupplementaryFig. S2).

We next investigated whether this process might be obs-erved in vivo. To address this critical issue, we usedGFP-taggedconfluent 3T3-F442A preadipocytes implanted subcutaneous-ly into athymic BALB/c nude mice, where they developed intotypical fat pads after 5 weeks (21). Murine breast cancer cells4T1 were then either injected into the newly formed fat pads orused alone as a control, whereas untreated fat pads alsoprovided a separate control. Immunohistochemical stainingfor GFP was conducted in fat pads removed 10 days after theinjection (Fig. 2A). Tagged-mature adipocytes were used toensure that the cells with a fibroblast-like shape present in thetumors did in fact arise from local adipocytes and not fromother sources. The fat pads derived from 3T3-F442A–confluentpreadipocytes exhibited histologic features of adipose tissue.Adipocytes were positive for GFPwhereas tumor cells were not(Fig. 2B, bottom). In the case of tumors injected into the fatpads, adipose tissue at the tumor periphery was composed ofadipocytes of small size and elongated cells containing manysmall lipid droplets—all cells that are GFP positive (Fig. 2B,bottom, indicated by arrows). Within the tumor, GFP-positivecells with fibroblast-like shape appear to interdigitate withtumor cells (Fig. 2B, bottom, indicated by asterisks). Staining ofthe tissue sections with Masson trichrome revealed a signif-icant amount of collagen fibrils in the tumor grown within thefat pad, whereas few collagen fibrils were seen in tumor grownalone (Fig. 2B, top). Taken together, these results are consistentwith the fact that breast tumor cells induce phenotypicalchanges in mature adipocytes, leading to cells exhibiting low(if any) lipid content and profound morphologic changesassociated with a marked increase in the expression of matrixproteins in the tumors. Therefore, our results compellinglysuggest that cells with a fibroblast-like shape could be derivedfrom mature adipocytes in a tumor-context both in vitro andin vivo.

ADFs overexpress FSP-1, but not aSMA, and exhibit anactivated phenotype

We then investigated the expression of major markers,previously used to identify CAFs in these cells (6). As shownin Fig. 3A, adipocytes cocultivated with tumor cells exhibit agradual increase in FSP-1 expression, as opposed to a-SMA orFAP expression that remains very low. We confirmed thatmature adipocytes cocultivated for 8 days with tumor cellsoverexpressed FSP-1 mRNA by 3-fold, compared with matureadipocytes grown alone (P < 0.01), whereas the difference inmRNA levels of a-SMA between these two conditions was notstatistically significant (Fig. 3B). These results were confirmedwith human mammary adipocytes (Supplementary Fig. S3).Functionally activated fibroblasts surrounding tumors arehighly contractile and motile and also display increased ECM

expression (3). As shown in Fig. 3C, increased expression of theECM proteins, type I collagen and fibronectin, was alsoobserved during adipocyte conversion. The fibrotic networkproduced by these cells in vitro is in accordancewith the resultsobtained withMasson trichrome staining in vivo (see Fig. 2). Asshown in Fig. 3D (top), coculture of adipocytes with tumor cellswas associated with a profound reorganization of actin cyto-skeleton, marked by the occurrence of stress fibers and theformation of punctuate spots of vinculin at the ends of actinbundles. Accordingly, cocultivated adipocytes, as they acquirea fibroblast-like phenotype, progressively exhibit increasedmigratory (Fig. 3D, bottom left) and invasive (Fig. 3D, bottomright) abilities. Therefore, our compelling results show thattumor cells can causemature 3T3-F442A adipocytes, as well ashuman mammary adipocytes, to revert to an activated FSP-1fibroblastic cell population. Because of the common charac-teristics of CAFs and these cells, highlighting that they repre-sent a subpopulation of CAFs, we named them ADFs. In vitro,the CAA toADF transition is time dependent (Figs. 1 and 3) andintermediate forms of adipocyte phenotypical changes (fromsmall adipocytes to fibroblast-like cells that may or may notstill contain small lipid droplets) could be observed in vitro andin vivo (Figs. 1 and 2). Once modified at the tumor invasivefront, where the cross-talk between breast tumor and adipo-cytes is established (8), our data strongly suggests that ADFsare able to join the center of the tumor and participate in thedesmoplastic reaction by exhibiting increased migratory andinvasive abilities (Fig. 3), as shown in the murine fat padexperiments (Fig. 2).

The Wnt/b-catenin pathway is reactivated in ADFs andcontributes to the occurrence of the ADFs phenotype

Among the many signaling networks involved in relayinginformation fromextracellular signals during adipogenesis, theWnt/b-catenin pathway plays a prominent role (28). Thispathway negatively regulates precursors' commitment anddifferentiation along the adipocyte lineage (28) and its activa-tion has recently been shown to also induce a "dedifferentiated"state in mature adipocytes (17). As shown in Fig. 4A (top),adipocytes cocultivated with tumor cells exhibit a gradualincrease in b-catenin expression, associated with its redistri-bution from the cell membrane to the cytoplasm. Duringactivation of this pathway by Wnt ligands (the so-calledcanonical pathway), the b-catenin is hypophosphorylated andtranslocated into the nucleus where it contributes to theactivation of Wnt target genes (28). A progressive increase inactive b-catenin in the nucleus of cocultivated adipocytes wasdetected (Fig. 4A, bottom). In accordance, cocultivated adipo-cytes exhibit an upregulation of all Wnt target gene mRNAsanalyzed as described for Dishevelled-1 (Dvl1), Wnt10b, End-othelin-1 (EDT1), andmetalloprotease-7 (MMP7; Fig. 4B). Takentogether, our results show that the canonical Wnt/b-cateninpathway is reactivated during coculture and is likely to con-tribute to the occurrence of the ADFs. Given our results, wereasoned that targeted inhibition of this signaling using ICG-001, a unique small molecule that selectively inhibits TCF/b-catenin transcription in a CBP-dependent fashion (19)mightbe able to mitigate the tumor-induced changes in adipocytes.

Bochet et al.






As shown in Fig. 4C, exposure to ICG-001 for 3 days signifi-cantly inhibits the increase in Wnt10b expression induced bycoculture (about 3-fold decrease in 5 mmol/L ICG-001–treatedcells compared with untreated cells, P < 0.05) and partiallyrestores lipid accumulation in cocultivated adipocytes in adose-dependent manner. We next investigated the signalemanating from tumor cells that could have reactivated the

canonical Wnt/b-catenin pathway. Soluble Wnt3a or TNF-ahas been recently shown to induce the "dedifferentiation" ofmurine and human adipocytes through activation of the Wnt/b-catenin pathway (17). TNF-a was undetectable in the super-natant of all breast cancer cell lines thatwere cultivatedwith orwithout adipocytes. In contrast, Wnt3a was expressed andsecreted by the breast cancer cells, as shown in Fig. 4D for the

Figure 2. The phenotypic changes ofmature adipocytes towards fibroblast-like cells are observed in vivo. A, GFP-tagged confluent 3T3-F442A preadipocyteswere implanted subcutaneously into athymic BALB/c nude mice, where they develop into fat pads after 5 weeks. Murine breast cancer cells 4T1 werethen injected into the newly formed fat pads or assayed separately. Immunohistochemical staining for GFPwas conducted in fat pads removed 10 d after theinjection, tumor cells alone being also used as a control. B, representative Masson trichrome–stained sections from fat pads alone, tumors grownalone, or tumors grown into the fat pads with collagen stained in blue and nucleus in red (top). Representative images of the expression of GFP (brown)visualized in fat pads alone, tumors grown alone, or tumors grown into the fat pads (lipids, white; nucleus, blue; middle). Arrows indicate GFP-positiveelongated cells with small lipid droplets present at the tumor periphery, whereas asterisks identify GFP-fibroblast–like cells within the tumor; scale bars,50 mm. The bottom panel shows a two-fold magnified view of the framed areas.







SUM159PT cells. The levels of Wnt3a expression and secretionwere not regulated by coculture. Similar results were obtainedwith the human breast cancer cell lines ZR 75.1 and MDA-MB231 (Supplementary Fig. S4). As shown in Fig. 4E (left), inthe presence of Wnt3a blocking antibody, we observe a clearinhibition of b-catenin upregulation and redistribution ind-uced by coculture, suggesting thatWnt3a is indeedupstreamoftheb-catenin stabilization. Of note, cells that have been treatedwithWnt3a blocking antibody exhibit a significant decrease ofWnt10b mRNA expression (1.6-fold decrease in antibody-trea-ted cells compared with untreated cells, P < 0.05) and con-versely, an increase in lipid content as compared with untreat-ed cells (Fig. 4E, right). Therefore, the occurrence of ADFs is

associated with activation of the Wnt/b-catenin pathway andblocking this pathway partially reversed the ADFs phenotype(Fig. 4C and E). Elevated levels of cytoplasmic and/or nuclearb-catenin are detectable by immunohistochemistry in themajority of breast tissue samples and high b-catenin activitysignificantly correlated with poor prognosis of the patients(29). This activation might rely onWnt ligands because severalstudies have described overexpression of Wnt protein them-selves, including Wnt3a, in breast cancer cells lines as well asbreast tumors relative to normal tissue (30). Expression ofthese ligands is generally thought to activate the canonicalWnt/b-catenin pathway in tumor cells by an autocrine mech-anism (31) to favor tumor growth, migration, inhibition of

Figure 3. ADFs overexpress FSP-1, but not a-SMA, and exhibit an activated phenotype. A, 3T3-F442A mature adipocytes were grown on coverslips andcultivated in thepresence (C) or in theabsence (NC) of tumor cells during 3, 5, and8days (D3,D5, andD8). After this period, cellswerefixedand stainedwith theindicated antibodies. 3T3-F442A preadipocytes served as a control. Nuclei were labeled with TO-PRO-3; scale bars, 20 mm. B, a-SMA and FSP-1 geneexpression was evaluated by qPCR in adipocytes cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of tumor cells during 8 days with tumor cells.Bars and errors flags represent themeans�SEMof at least three independent experiments; statistically significant byStudent t test, ��,P <0.01 relative toNCcells. NS, non significant. C, fibronectin and collagen 1expressionwere assessedby immunofluorescence in adipocytes cultivated in thepresence (C) or in theabsence (NC) of tumor cells during 3, 5, and 8 days (D3, D5, and D8). 3T3-F442A preadipocytes served as a control. Nuclei were labeled withTO-PRO-3; scale bars, 20 mm. D, top, 3T3-F442A mature adipocytes were grown on coverslips and cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) oftumor cells during 3, 5, and 8 days (D3, D5, and D8). After this period, cells were fixed and stained with the indicated antibodies. 3T3-F442Apreadipocytes served as a control. Nuclei were labeled with TO-PRO-3; scale bars, 20 mm. Bottom, adipocytes grown alone (NC) or in the presence of tumorcells (C) for 3 (D3) and 8 (D8) days. Adipocytes were then trypsinised and used for migration (left) or Matrigel invasion (right) assays towards a mediumcontaining either 0% (white bars) or 10% FCS (black bars). Bars and errors flags represent the means� SEM of three independent experiments; statisticallysignificant by Student t test; �, P < 0.05, ��, P < 0.01, ��, P < 0.001 relative to NC cells.

Bochet et al.






Figure 4. The Wnt/b-catenin pathway is reactivated in ADFs and contributes to the occurrence of this new stromal cell population. A, adipocytes cultivated inthe presence (C) or in the absence (NC) of tumor cells during 3, 5, and 8 days (D3, D5, D8) and 3T3-F442A preadipocytes were fixed and stained with theindicated antibodies. Nuclei were labeled with TO-PRO-3; scale bars, 20 mm. B, mRNA expression (qPCR) of the indicated Wnt/b-catenin targets wasevaluated in adipocytes cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of tumor cells during 3, 5, and 8 days (D3, D5, D8). C,Wnt10bmRNA expression(right) and Bodipy accumulation or morphology observed through phase contrast microscopy (left; scale bars, 20 mm) were evaluated in adipocytescultivated in thepresence (C) or in theabsence (NC) of tumor cells for 3dayswith tumor cells in thepresenceof increasingconcentrations of ICG-001.D,Wnt3aexpression and secretion was measured in the SUM159PT cells cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of adipocytes. E, adipocytes werecultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of breast tumor cells in the presence (þ) or absence (�) of a Wnt3a blocking antibody. In theseadipocytes, the expression of Wnt10b mRNA was measured by qPCR (right), and the b-catenin expression and lipid accumulation were evaluated byimmunofluorescence. Nuclei were labeled with TO-PRO-3 (left); scale bars, 20 mm. Bars and errors flags represent the means � SEM of three independentexperiments; statistically significant by Student t test or ANOVA; �, P < 0.05, ��, P < 0.01, ��, P < 0.001 relative to NC cells.







apoptosis, and potentially stem cell renewal in certain tissues(32).Wepropose here a new and paracrine effect ofWnt ligandsin promoting the occurrence of a subpopulation of CAFs.

ADFs stimulate tumor cells' invasive phenotype in two-dimensional and three-dimensional coculture systems

Mature adipocytes were cocultivated with breast cancercells for 5 days to obtain ADFs, which were then used to carryout two-dimensional (2D) coculture experiments or to producemixed spheroids with "na€�ve or unprimed" tumor cells. In 2Dcoculture experiments, ADFs strongly stimulated the invasive

properties of SUM159PT cells (increase of 2.4-fold comparedwith tumor cells grown alone, P < 0.01; Fig. 5A), this effect beingmore pronounced in the presence of ADFs than in the presenceof mature adipocytes (1.5-fold increase as compared withtumor cells grown alone, P < 0.05; 1.6-fold increase in cellscocultivated with ADFs as compared with mature adipocytes,P < 0.05). In addition to the increased cell invasive abilities, wehave previously shown that cocultivated SUM159PT exhibitmorphologic changes along with the reorganization and polar-ization of vimentin (8). As shown in Fig. 5B, after 3 days ofcoculture, ADFs induce similar but more pronounced effects

Figure 5. ADFs enhance tumor cells invasion in 2D and 3D coculture models. A, tumor cells cultivated in the presence (C) or in the absence (NC) of matureadipocytes or ADFs for 3 d were used for Matrigel invasion assay toward a medium containing either 0% (white bars) or 10% (black bars) FCS. Representativeimages of Matrigel invasion assay conducted towards a medium containing 10% FCS are shown below each graph; scale bar, 50 mm. Bars and errors flagsrepresent the means � SD of three independent experiments; statistically significant by Student's t test; �, P < 0.05, ��, P < 0.01 relative to NC cells. B,immunofluorescence experiments usingmonoclonal antibodyagainst vimentin or rhodaminphalloidinwere conductedon tumor cells cultivated in the presence(C) or in the absence (NC) ofmature adipocytes or ADFs for 3 days. Nuclei were labeledwith TO-PRO-3; scale bar, 20mm.C, a representative picture of spheroidinvasion in a collagen matrix [left, scale bar, 250 mm and measurement of the invasion distance (in mm) 48 h after collagen embedding (right)]. Bars anderrors flags represent themeans� SEMof three independent experiments, statistically significant by Student t test; ��,P < 0.01 relative to spheroids composedby tumor cells alone (SUM), NS, nonsignificant. D, confocal microscopy analysis of spheroids invasion 48 hours after collagen inclusion, spheroids beingcomposed by HcRed-SUM, by mixed HcRed-SUM þ GFP-3T3-F442A, or by HcRed-SUM159PT þ GFP-ADF; scale bar, 100 mm. SUM159PT, SUM.

Bochet et al.






on vimentin expression that was associated with profoundactin reorganization, leading to the occurrence of stress fibers.As three-dimensional (3D) invasionmodelsmore closely followthe cell behavior observed in vivo (33), we confirmed our resultsusing a spheroid invasion model within a collagen matrix (25;see Fig. 5C, left, for a representative experiment).We found thatmixed ADFs/tumor cells spheroids exhibit higher invasivecapacities compared with spheroids of tumor cell alone (P <0.01), yet the presence of preadipocytes had no effect on 3Dtumor cells' invasion (Fig. 5C, right), in accordance with theresults previously obtained in 2D (8). HcRed-SUM159PT cells,GFP-preadipocytes, and GFP-ADFs were used to investigatethe invasive behavior of each cell subpopulation. Interestingly,ADFs (and preadipocytes) remained in the center of thespheroids in contrast with tumor cells that invaded the col-lagen matrix (Fig. 5D). These combined results indicate thatADFs stimulate the invasive behavior of tumor cells.

Reorientation of mature adipocytes into ADFs isobserved in human tumors

We next investigated whether ADFs are present in primaryhuman tumors. To address this critical issue, we first con-ducted a histologic analysis of human breast tumors to inves-tigate the presence of cells exhibiting ADF traits. As defined invitro and in vivo in murine fat pads, ADFs originate fromprogressive changes of the morphology of adipocytes, givingrise to small adipocytes and of elongated cells containingmanysmall lipid droplets. As shown in Fig. 6A, we observed aprofound reorganization of the adipose tissue at the tumorinvasive front (see left for the adipose tissue aspect at distanceof the tumors) with numerous cells exhibiting the features ofintermediate forms of ADFs. Of note, elongated cells with lipiddroplets could be observed within the dense desmoplasticreaction surrounding the tumors (Fig. 6A, bottom, indicatedby arrows).

Figure 6. ADFs are found in humantumors. A, histologic examinationof human breast cancers showingdistant adipose tissue (left) andtumor tissue containingreorientated adipocytes (middle)after H&E staining (originalmagnification, �200; scale bar, 50mm.). The right panels showa2-foldmagnification of the framed area.Results of representativeexperiments were obtained usingtumors issued from 2 independentdonors. B, histologic examinationof adipose tissue (lipids, white;nucleus, blue) in a representativebreast tumor after anti FSP-1staining (brown). The resultsobtained in different areas from theadipose tissue away from thetumor to the tumor center areshown (scale bar, 50 mm). C, left,the expression of FSP-1 andaSMAwas visualized (brown) inadipocytes (lipids, white; nucleus,blue) located adjacent to invadingcancer cells (TU) as compared withnormal adipose tissue [reductionmammoplasty (RM)]. Right, theexpression of the indicated geneswas analyzed by qPCR in matureadipocytes obtained from RM orTU (8 independent samples pergroup), statistically significant byStudent t test; �, P < 0.05. NS, non-significant.







To further characterize these cells, we investigated FSP-1expression in the breast-cancer surrounding adipocytes atvariable distances from the tumor center. As shown in Fig.6B, the mature adipocytes further from the tumor are negativefor FSP-1 expression, whereas those closer to the tumor exhibitFSP-1 expression. FSP-1 positivefibroblasts were present in thecenter of the tumors as previously described (6). Therefore, asobserved in vitro, we consistently observed a gradient of FSP-1expression in mature adipocytes exhibiting first CAA, thenADF phenotype (Fig. 6B). Finally, we investigated the differ-ential expression of both aSMA and FSP-1 in tumor-surround-ing adipocytes by immunohistochemistry. In fact, one of thekey findings of our study is that ADFs, at least in vitro, expressFSP-1 but not aSMA (see Fig. 3A and B). Interestingly, usingexperimentally generated tumors in mice, Sugimoto and col-leagues found unique FSP-1-expressing CAFs, which are clearlydistinct from the a-SMA–positive myofibroblasts (6). Thissubpopulation of CAFs is very important functionally, becauseFSP-1–positive fibroblasts promote tumor metastasis (34).Mammary carcinoma cells injected into FSP1�/�mice showedsignificant delay in tumor uptake and decreased tumor inci-dence (34). Coinjection of carcinoma cells with FSP1þ/þmouseembryonic fibroblasts partially restored the kinetics of tumordevelopment and the ability to metastasize, underlying therole of this specific subset of stromal population in invasiveprocesses (34). As shown in Fig. 6C (left), we found that a-SMAexpression was not upregulated in adipocytes close to tumorswhen compared with normal breast adipose tissue (reduc-tion mammoplasty) whereas in the same sample, an upregula-tion of FSP-1 expression was found. To further assess theexpression of these markers by a quantitative approach, adi-pocytes were isolated from fat samples associated with tumorsor reduction mammoplasty. A series of 16 samples, with 8samples in each group (Supplementary Table S3 for the clinicalcharacteristics of the patients), was used, matched withrespect to age (mean: 54.5 � 10.4 vs. 51.1 � 8.3 years) andBMI (mean: 26.1� 3.5 vs. 24.9� 2.3 kg/m2). Adipocytes isolatedfrom tumor samples overexpressed FSP-1 mRNA when com-pared with adipocytes isolated from normal mammaryglands, whereas the mRNA levels of a-SMA were not statis-tically different between the two groups (Fig. 6C, right).Therefore, the phenotype described here both in vitro andin vivo for ADFs is clearly reminiscent of the one of FSP-1–positive CAFs, including the absence of a-SMA expressionand the invasion-promoting effect. Because mature adipo-cytes represent the most abundant cellular type in breastcancer stroma, the process of adipose "dedifferentiation" islikely to provide a large part of this CAFs subpopulation.Interestingly, the impact of tumor cells on various compo-nent of adipose tissue might also participate in the hetero-geneity of CAFs phenotype. In fact, it has been shown bothin vitro and in vivo that breast cancer cells activate adiposestem cells towards a CAFs-like phenotype associated witha-SMA overexpression (for review see refs. 35, 10). Therefore,mature and precursor adipose cells could contribute to diver-gent CAFs subpopulation, whose relative contributions incancer progression remain to be determined in lean and obeseconditions.

To conclude, the proposedmechanism to explain the occur-rence and the role of ADFs in breast cancer is summarizedin Fig. 7. In our model, early local tumor invasion in breastcancer results in immediate proximity of tumor cells andadipocytes. Cancer cells secrete soluble factors, includingWnt3a, that are able to activate Wnt/b-catenin pathway inmature adipocytes, leading to adipocyte "dedifferentiation".Adipocytes undergo morphologic changes, first marked by adecrease in adipocyte size and lipid content (CAAs), then byacquiring a fibroblast-like morphology (ADFs), yet still con-taining small lipid droplets. At the start of this process, tumor-primed adipocytes express FSP-1. ADFs exhibit increasedmigratory and invasive abilities and are able to join the centerof the tumor, where they significantly promote tumor invasion.In the center of the tumor, these cells no longer express adiposemarkers nor exhibit lipid droplets, which render them indis-tinguishable from other CAFs cell population. Studying theprocess of occurrence of ADFs in breast cancer is of majorclinical importance. In fact, the occurrence of specific stromalcells, such as ADFs, is critical to the aggressiveness of nearbytumor cells and they need to be identified to develop targetedtherapeutic strategies inhibiting their development and/ortumor-promoting activity. Implicating adipose tissue in thiscrosstalk is also of major interest because several studiespointed out that obese women exhibit higher propensity forlocal invasion and distant metastasis (10). Obesity condition isalso associated with an increase in adipose tissue fibrosis (15).Therefore, further studies should address whether ADFs areover-represented in the breast tumor stroma of obese patients

Figure 7. Mechanism of ADFs occurrence and role in tumor progression.Schematic representation of the described bidirectional crosstalkestablished between breast cancer and adipose cells, underlying thepresence of ADFs in the desmoplastic reaction of breast cancers.

Bochet et al.






in which they would provide an invasion-promoting popula-tion. Such studies will provide unique opportunities to set upspecific strategies for the treatment of the subsets of patientsexhibiting aggressive diseases.

Disclosure of Potential Conflicts of InterestNo potential conflicts of interest were disclosed.

Authors' ContributionsConception and Design: L. Bochet, C. Lehuede, P. Valet, C. MullerDevelopment of methodology: L. Bochet, B. CoudercAcquisition of data (provided animals, acquired and managed patients,provided facilities, etc.): L. Bochet, S. Dauvillier, Y.Y.Wang, V. Laurent, C. Dray,R. Guiet, I. Maridonneau-Parini, S. Le Gonidec, G. EscourrouAnalysis and interpretation of data (e.g., statistical analysis, biostatistics,computational analysis): L. Bochet, C. Lehuede, S. Dauvillier, Y.Y. Wang,B. Dirat, V. Laurent, C. Dray, G. Escourrou, P. ValetWriting, review, and/or revision of the manuscript: L. Bochet, C. Lehuede,C. MullerAdministrative, technical, or material support (i.e., reporting or orga-nizing data, constructing databases): S. Le GonidecStudy supervision: C. Muller

AcknowledgmentsThe authors thank Pr. Laurence Nieto for helpful technical advices for qPCR,

Guillaume Andrieu, Emilie Mirey, and Nathalie Ortega for critical reading of themanuscript. The authors also thank Jamie Brown for the language editing of themanuscript and Francoise Viala for iconographic assistance.

Grant SupportStudies conducted in our laboratories were supported by the French

National Cancer Institute (INCA PL 2006–035 and INCA PL 2010-214;P. Valet, G. Escourrou, and C. Muller), the 'Ligue R�egionale Midi-Pyr�en�eescontre le Cancer' (Comit�e du Lot, de la Haute-Garonne et du Gers; C. Muller),the Fondation de France (P. Valet and C. Muller), and the Universityof Toulouse (AO CS 2009; C. Muller). In addition, the Fondation pour laRecherche M�edicale, ANR Migre Flame 2010, and ARC #2010-120-1733supported this work (R.Guiet and I. Maridonneau-Parini). C. Lehu�ed�e is arecipient of a PhD fellowship from the Ligue Nationale Contre le Cancer.

The costs of publication of this article were defrayed in part by the paymentof page charges. This article must therefore be hereby marked advertisementin accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.

Received February 19, 2013; revised July 5, 2013; accepted July 13, 2013;published OnlineFirst July 31, 2013.

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Bochet et al.






Figure S1. The occurrence of the ADFs phenotype is reproductively observed with various human and murine breast cancer cells lines andi h h di A A l i f i i f h i di d k d b W bl i h fwith human mammary adipocytes. A, Analysis of protein expression of the indicated markers done by Western blots with extracts from

mature adipocytes cocultivated (+) or not (-) with SUM159PT for the indicated times. B, Upper panel: Western-blot analysis of HSL andC/EBPα expression in murine mature adipocytes cocultivated (+) or not (-) with the indicated tumor cell lines during 3 and 8 days (D3 and D8).Lower panel: mature murine adipocytes cocultivated in the presence (C) or absence (NC) of indicated breast cancer cell lines were stainedwith red oil, scale bars 50µm. C, Upper panel: human mammary adipocytes issued from the ex vivo differentiation of the SVF fraction ofadipose tissue obtained from reduction mammoplasty were cocultivated (C) or not (NC) for 6 days in the presence of indicated cell lines.mRNAs were extracted and the levels of expression of the indicated genes evaluated by qPCR. Data represent the results obtained from 6independent donors ± SEM; statistically significant by Student's t-test, * p<0.05, **p< 0.01, *** p<0.001, relative to NC cells. Shown arepresentative experiment of Red oil staining of human mammary adipocytes cocultivated (C) or not (NC) in the presence of ZR 75. 1 cells for6 days.

Bochet et al, SuppS1

A BA B

Figure S2. Mature adipocytes dedifferentiation is not associated with changes in cell number or cell cycle distribution. A, Murineadipocytes were cocultivated (C) or not (NC) with SUM159PT cells for the indicated times and counted using a Malassez chamber after

( ) ( ) ( )Trypan blue staining. B, cell cycle distribution of adipocytes cocultivated or not (NC) during 3 (D3) and 5 days (D5) with tumor cells. Shown theresult of a representative experiment.


Figure S3. Cocultivated human mammary adipocytes overexpress FSP-1, but not αSMA, and exhibit an activated phenotype. Humanmammary adipocytes, grown on coverslips, issued from the ex vivo differentiation of the SVF fraction of adipose tissue obtained from

( ) ( )reduction mammoplasty were cocultivated (C) or not (NC) with ZR 75.1 during 5 days. Adipocytes were then fixed and stained with theindicated antibodies. Nuclei were labeled with TO-PRO-3, scale bar 20µm.


Figure S4. Breast tumor cells express and secrete Wnt3a. Wnt3a expression and secretion was measured in the ZR-75.1 cells (A) and MDA-MB231 cells (B), cocultivated (C) or not (NC) with mature adipocytes.


1

Supplementary information

Cell Culture. The breast cancer cell line ZR 75.1 (gift of Pr K. Bystricky, LBME, Toulouse, France) was

cultured in DMEM medium supplemented with 10% FCS. HMT-3522-T4-2 mammary epithelial cells (gift of Dr

E. Liaudet-Coopman, IRCM, Montpellier, France) were cultured in H14 medium (Weaver et al, 1997) consisting

in DMEM/F12 with 250 ng/ml insulin, 10 mg/ml transferrin, 2.6 ng/ml sodium selenite, 10-10 M estradiol and 1.4

x10-6 M hydrocortisone. The breast cancer cell line MDA-MB231 (gift of Pr K. Bystricky, LBME, Toulouse,

France) was cultured in RPMI medium supplemented with 10% FCS.

Antibodies. The polyclonal Ab directed against Adiponectin (APN) was obtained from Thermoscientic. The

polyclonal Ab directed against Horomono-Sesitive Lipase (HSL) was from Cell Signaling. Both the polyclonal

Ab that recognized CEBP/α and the monoclonal Ab against PPARγ (clone E-8) were from Santa-Cruz.

Ex-vivo differentiation of human mammary adipocytes. Breast adipose tissue samples were collected from

reduction mammoplasty according to the guidelines of the Ethical Committee of Toulouse-Rangueil. All subjects

gave their informed consent to participate to the study, and investigations were performed in accordance with the

declaration oh Helsinki as revised in 2000. Adipose tissue pieces were immediately used for collagenase

digestion as previously described (Daviaud et al, 2006) and centrifuged to separate adipocytes from the stroma-

vascular fraction pellet, SVF). The SVF fraction issued from mammoplasty reduction adipose tissue samples was

used for ex vivo differentiation as previously described (Bour et al, 2007). Briefly, the stromal vascular pellets

were incubated overnight with DMEM/Ham F12 medium supplemented with 10% FCS. Then, the medium was

replaced by an adipogenic induction medium (DMEM/Ham's F12 (1:1) medium supplemented with 1µg/ml

ciglitazone, 10 mg/ml transferrin, 33 mM biotin, 66 mM insulin, 1 nM triiodothyronine, and 17 mM

pantothenate). Cells were cultivated in this condition during 3 days before the ciglitazone was removed. Cells are

differentiated after 10 days of culture.

Cell cycle. Adipocytes were cocultivated or not with SUM159PT cell lines during 3 or 5 days. Cells were

harvested by trypsinization and pelleted by centrifugation. The pellets were incubated 10 minutes on ice, then

resuspended in 300 µl phosphate-buffered saline containing 25 μg/ml propidium iodide (PI), 100 μg/ml RNaseA

and 0.01 % triton X-100. After staining, 10 000 cells were analysed on a FACScan flow cytometer utilizing

CellQuest software (Becton Dickinson) to determine the cell cycle distribution.

References Bour S, Daviaud D, Gres S, Lefort C, Prevot D, Zorzano A, Wabitsch M, Saulnier-Blache JS, Valet P, Carpene C (2007) Adipogenesis-related increase of semicarbazide-sensitive amine oxidase and monoamine oxidase in human adipocytes. Biochimie 89: 916-925 Daviaud D, Boucher J, Gesta S, Dray C, Guigne C, Quilliot D, Ayav A, Ziegler O, Carpene C, Saulnier-Blache JS et al (2006) TNFalpha up-regulates apelin expression in human and mouse adipose tissue. The FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 20: 1528-1530 Weaver VM, Petersen OW, Wang F, Larabell CA, Briand P, Damsky C, Bissell MJ (1997) Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. The Journal of cell biology 137: 231-245

Supplementary Table 1: Characterization of the antibodies used in the study Target Type Clone Supplier Use Reference Actin m ACTN05 Thermoscientific WB (1) α-tubulin m DM1A Thermoscientific WB (2) αSMA m E184 Abcam IF/IHC (3) β-catenin m 14 BD biosciences IF (4) Active β-catenin m 8E7 Millipore IF (5) Collagen-1 p - Chemicon IF (6) FAP p - Abcam IF (7) Fibronectin m FBN11 Thermoscientific IF (8) FSP-1=S100A4 p - Abcam IF/IHC (9) GFP m 7.1/13.1 Roche IHC (10) Glut1 p - Neomarkers WB (11) Glut4 m 1F-8 Cell Signaling WB (12) Pref-1=DLK p - Abcam IF (13) Vimentin p R28 Cell Signaling IF (14) Vinculin m hVIN-1 Sigma-aldrich IF (15) Wnt3a m 217804 R&D System Blocking Ab (16) Wnt3a p - Abcam WB (17) Abbreviations used: m, monoclonal ; p, polyclonal ; IF, immunofluorescence ; IHC, immunohistochemistry ; WB, Western Blot. References 1. Lessard JL. Two monoclonal antibodies to actin: one muscle selective and one generally reactive. Cell motility and the cytoskeleton. 1988;10:349-62. 2. Breitling F, Little M. Carboxy-terminal regions on the surface of tubulin and microtubules. Epitope locations of YOL1/34, DM1A and DM1B. Journal of molecular biology. 1986;189:367-70. 3. Santos M, Moura RS, Gonzaga S, Nogueira-Silva C, Ohlmeier S, Correia-Pinto J. Embryonic essential myosin light chain regulates fetal lung development in rats. American journal of respiratory cell and molecular biology. 2007;37:330-8. 4. Eger A, Stockinger A, Schaffhauser B, Beug H, Foisner R. Epithelial mesenchymal transition by c-Fos estrogen receptor activation involves nuclear translocation of beta-catenin and upregulation of beta-catenin/lymphoid enhancer binding factor-1 transcriptional activity. The Journal of cell biology. 2000;148:173-88. 5. Staal FJ, Noort Mv M, Strous GJ, Clevers HC. Wnt signals are transmitted through N-terminally dephosphorylated beta-catenin. EMBO reports. 2002;3:63-8. 6. Rukosuev VS, Nanaev AK, Milovanov AP. Participation of collagen types I, III, IV, V, and fibronectin in the formation of villi fibrosis in human term placenta. Acta histochemica. 1990;89:11-6. 7. Chen H, Yang WW, Wen QT, Xu L, Chen M. TGF-beta induces fibroblast activation protein expression; fibroblast activation protein expression increases the proliferation, adhesion, and migration of HO-8910PM [corrected]. Experimental and molecular pathology. 2009;87:189-94. 8. Christensen L. Fibronectin: a discrimination marker between small invasive carcinomas and benign proliferative lesions of the breast. APMIS : acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 1990;98:615-23. 9. Lin SL, Kisseleva T, Brenner DA, Duffield JS. Pericytes and perivascular fibroblasts are the primary source of collagen-producing cells in obstructive fibrosis of the kidney. The American journal of pathology. 2008;173:1617-27. 10. Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, Prendergast FG, Cormier MJ. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 1992;111:229-33. 11. Bouquet F, Ousset M, Biard D, Fallone F, Dauvillier S, Frit P, et al. A DNA-dependent stress response involving DNA-PK occurs in hypoxic cells and contributes to cellular adaptation to hypoxia. Journal of cell science. 2011;124:1943-51. 12. Marette A, Richardson JM, Ramlal T, Balon TW, Vranic M, Pessin JE, et al. Abundance, localization, and insulin-induced translocation of glucose transporters in red and white muscle. The American journal of physiology. 1992;263:C443-52. 13. Drobinskaya I, Linn T, Saric T, Bretzel RG, Bohlen H, Hescheler J, et al. Scalable selection of hepatocyte- and hepatocyte precursor-like cells from culture of differentiating transgenically modified murine embryonic stem cells. Stem Cells. 2008;26:2245-56. 14. Leader M, Collins M, Patel J, Henry K. Vimentin: an evaluation of its role as a tumour marker. Histopathology. 1987;11:63-72. 15. Geiger B, Volk T, Volberg T, Bendori R. Molecular interactions in adherens-type contacts. Journal of cell science Supplement. 1987;8:251-72.

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Supplementary Table 2A: Sequences and concentrations of the primers used to detect murine genes expression by qPCR.

Name Forward Reverse Concentrations (nM)

Adipsin GCCTGATGTCCTGCATCAACT GCGCAGATTGCAGGTTGTC 300

Adiponectin

(APN)

TGGAATGACAGGAGCTGAAGG TATAAGCGGCTTCTCCAGGCT 900

Ap2 TTCGATGAAATCACCGCAGA GGTCGACTTTCCATCCCACTT 900

C/EBPα CAAGAACAGCAACGAGTACCG GTCACTGGTCAACTCCAGCAC 100

Dvl-1 CCTTCCATCCAAATGTTGC GTGACTGACCATAGACTCTGTGC 100

Endothelin-1

(EDT-1)

CCTG-GACATCATCTGGGTC TGTGGCCTTATTGGGAAG 900

FSP-1 GCTGCCCAGATAAGGAACCC TGCGAAGAAGCCAGAGTAAGG 300

Glut1 GGTGTGCAGCAGCCTGTGT CACAGTGAAGGCCGTGTTGA 300

Glut4 CCGGATTCCATCCCACAAG CATGCCACCCACAGAGAAGA 300

HSL GGCTTACTGGGCACAGATACCT CTGAAGGCTCTGAGTTGCTCAA 900

MMP7 CACTCACTGGGTCCTCCATT GAAGAGGGAAACAGGTGCAG 900

PPARγ CCGAAGAACCATCCGATTGA TTTGTGGATCCGGCAGTTAAG 900

αSMA GGAGAAGCCCAGCCAGTCGC AGCCGGCCTTACAGAGCCCA 900

Wnt10b ATGCGGATCCACAACAACAG TGACGTTCCATGGCATTTG 300

Supplementary Table 2B: Sequences and concentrations of the primers used to detect human genes expression by qPCR. Name Forward Reverse Concentrations

(nM) aP2 GCATGGCCAAACCTAACATGA CCTGGCCCAGTATGAAGGAAA 300

C/EBPα ACCCTCAGCCTTGTTTGTACTGTAT GGACTGATCGTGCTTCGTGTT 300

FSP-1 TTGGGGAAAAGGACAGATGAAG TGAAGGAGCCAGGGTGGAAAAA 300

HSL GTGCAAAGACGGAGGACCACTCCA GACGTCTCGGAGTTTCCCCTCAG 900

PPARγ GAACCACCGCACGATGTTG AAGTCGAACACGCTGCTGAA 900

αSMA AGGCACCCCTGAACCCCAA CAGCACCGCCTGGATAGCC 300

Supplementary Table 3A :Age and anthropometric characteristics of control and cases series.

Variables Controls (n=8) Cases (n=8) n (%) n (%)

Age in years [35-50[ 4 (50) 3 (37.5) ≥ 50 4 (50) 5 (62.5)

Body Mass Index in kg/m2 [18-25[ 4 (50) 2 (25) [25-30[ 4 (50) 5 (62.5) ≥ 30 0 (0) 1 (12.5) Supplementary Table 3B: clinical characteristics of the breast cancer patients.

Variables Sub-groups Cases (n=14) n (%) Tumor histology Lobular 1 (12.5) Canalar 7 (87.5) Breast cancer stage I 0 (0) II 5 (62,5)

III 3 (37,5) Menopausal status Pre-menopausal 3 (62.5) Post-menopausal 5 (62.5) Tumor diameter in cm ]0-2] 1 (12.5) ]2-5] 3 (37.5) > 5 2 (25) nc 2 (25) Clinical node involvement N0 1 (12.5) N1 2 (25) N2 5 (62.5) Tumor estrogen receptors status ER (-) 2 (25) ER (+) 6 (75) Tumor HER2 status HER2 (-) 7 (87.5) HER2 (+) 1 (12.5)

129

Article 2. Les adipocytes péritumoraux participent à la chimiorésistance des cellules

tumorales mammaires à la doxorubicine, potentiellement via un mécanisme dépendant

de LRP/MVP et des vésicules.

La chimiothérapie demeure un des traitements de référence du cancer du sein. Parmi les molécules

présentes dans l’arsenal thérapeutique, la doxorubicine, qui appartient à la famille des anthracyclines,

est considérée comme étant une des molécules les plus efficaces dans ce type de cancers (Tacar et al

2013). Cependant, des processus de résistance sont fréquemment observés et vont contribuer à

l’apparition de rechutes, de la diminution de la survie globale et de la survie sans maladie. Les cellules

tumorales peuvent présenter une résistance croisée à diverses molécules, appartenant à différentes

classes anti-néoplasiques et présentant des mécanismes d’actions différents. Ce processus est appelé

multi-résistance ou MDR (Multidrug resistance) et représente une cause majeure d’échec

thérapeutique (Kathawala et al 2015). Des arguments émergents suggèrent que le stroma tumoral

pourrait également participer à l’acquisition d’une chimiorésistance par les cellules cancéreuses

(Dittmer and Leyh 2014). Parmi les différents composants du stroma mammaire, les adipocytes

représentent des acteurs émergents dans la progression tumorale. Dans l’équipe, nous avons montré

qu’ils favorisent l’acquisition d’une résistance aux radiations ionisantes par les cellules tumorales

mammaires (Bochet et al 2011). D’autre part, le rôle des adipocytes dans la progression tumorale est

d’importance en médecine car l’obésité a été reconnue comme un facteur de mauvais pronostic dans le

cancer du sein, indépendamment du statut ménopausique (Ewertz et al 2011). Des arguments cliniques

suggèrent que les femmes obèses présentent une résistance augmentée à l’association

anthracyclines/taxanes administrée en thérapie adjuvante et néoadjuvante ou dans le cadre d’un cancer

métastatique (Ewertz et al 2011) (Litton et al 2008) (de Azambuja et al 2010). Nous avons ainsi

formulé l’hypothèse selon laquelle les adipocytes pourraient contribuer à la résistance des

carcinomes mammaires à la chimiothérapie et que l’obésité pourrait amplifier ce processus.

Nos résultats montrent que les adipocytes favorisent un phénotype MDR (doxorubicine, paclitaxel, 5-

fluorouracile) dans un large panel de lignées tumorales mammaires (représentatives des différents

sous-types du cancer du sein). La chimiorésistance médiée par les adipocytes est liée à un efflux

nucléaire et extra-cellulaire de doxorubicine plus important, qui empêche l’action de la drogue au

niveau de son site d’action : l’ADN. Etonnamment, cet efflux est indépendant des principaux

transporteurs ABC (ATP-binding Cassette) classiquement responsables de ce mécanisme de

résistance. Cependant, nous avons mis en évidence que la protéine MVP (Major Vault Protein) semble

être responsable de l’efflux nucléaire observé. De manière intéressante, nos résultats (bien que

préliminaires) suggèrent que les adipocytes favorisent l’encapsulation des drogues dans des vésicules

extra-cellulaires, ce qui permet l’efflux de la doxorubicine hors de la cellule. Enfin, nos résultats ont

montré que la chimiorésistance médiée par les adipocytes est amplifiée dans un contexte d’obésité. Les

résultats obtenus sur ce projet ont été rédigés en anglais sous forme d’un article, bien qu’à l’heure

130

actuelle, ce travail n’est pas encore finalisé. Des nouvelles données devraient être disponibles et

présentées lors de la soutenance orale.

1

Tumor surrounding adipocytes contribute to doxorubicin resistance: Potential role of a MVP/vesicle dependent mechanism and amplification by obesity

Camille Lehuédé1,2,3, Xia Li1,2,3, Stéphanie Dauvillier1,2, Victor Laurent1,2, Ikrame Lazar1,2, Emily

Clement1,2, Sophie Le Gonidec1,3, Philippe Valet1,3, Laurence Nieto1,2, Frédérique Fallone1,2 and

Catherine Muller1,2 *

1 Université de Toulouse, UPS, F-31077 Toulouse, France.

2 CNRS ; Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale F-31077 Toulouse, France.

3 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, INSERM U1048, F-31432 Toulouse,

France.

Running title:

Key words: Adipocytes - Breast cancer – Doxorubicin – Multidrug resistance - Obesity

MANUSCRIPT IN PREPARATION

2

Abstract

Emerging evidence demonstrates that tumor-surrounding adipocytes are key players in breast cancer

progression, particularly through promotion of the invasive properties of tumor cells. This effect could

be amplified in obesity, which is a negative prognosis factor in breast cancer. Clinical studies

suggested that obesity, in addition to favoring the occurrence of aggressive tumors, is associated with

a decrease in the efficacy of chemotherapy. The mechanism(s) linking tumor-surrounding adipocytes

to drug resistance remain elusive. The anthracycline Doxorubicin (DOX) is one of the major drugs

used in the treatment of breast cancer. Using a 2D coculture system, we demonstrated that adipocytes

promote DOX resistance in a large panel of human and murine breast cancer cell lines, independently

of their subtypes. Cocultivated cells exhibit a multidrug resistance (MDR) phenotype with cross-

resistance to paclitaxel and 5-fluorouracil. We further demonstrated that DOX resistance was due to an

increased nuclear and extracellular efflux in cells cocultivated with adipocytes. These processes were

mediated by an original pathway implicating the MVP (Major Vault Protein), followed by the release

of extracellular vesicles-containing DOX. Finally, using a 3D coculture system, we demonstrated that

adipocyte-induced chemoresistance is amplified by obesity. This study may explain, at least in part,

the poor prognosis of obese patients suffering from breast cancer.

3

Introduction

Cancer is now considered a complex tissue comprised not of only malignant but also stromal cells,

including fibroblasts, infiltrating immune cells and endothelial cells, all contained within the

extracellular matrix (ECM) [1]. Tumor and stromal cells establish a constant bidirectional crosstalk,

which can promote tumor progression. Among the different cell types present in the tumor

microenvironment, recently increasing interest has been given to adipocytes, which have long been

overlooked as an active component of tumor stroma [2]. Mature adipocytes, first thought of only as

energy-storing cells, have emerged this last decade as highly endocrine cells which are able to secrete

hormones, growth factors, chemokines and pro-inflammatory molecules: a heterogeneous group of

molecules termed «adipokines» [3] [4]. Studying the multifaceted role of adipocytes in cancer, and

particularly in breast cancer, is of major clinical importance. Indeed, obesity, where the normal

balance of adipose tissue secretions is perturbed, is a negative prognosis factor for breast cancer

independently of menopause status (for review see [5] [3]). There is now clear evidence that host

factors contribute to the occurrence, in obese women, of tumors exhibiting an aggressive phenotype at

diagnosis defined by an increase in lymph node involvement and a higher propensity to distant

metastasis (reviewed in [3]). In the largest retrospective clinical study published on this subject to

date, Ewertz et al. report that obesity is an independent prognosis factor for the development of distant

metastasis and death after diagnosis of breast cancer [6]. We have previously demonstrated in vitro

and in vivo, that tumor surrounding adipocytes in breast cancer exhibit a decrease in lipid content, a

decreased expression of adipocyte markers and an activated state characterized predominantly by the

overexpression of pro-inflammatory cytokines, ECM and ECM-related molecules [7]. We named

these cells “Cancer-Associated Adipocytes” (CAAs) [7] [8] [3]. Upon prolonged exposure to tumor

cells, adipocytes adopt a highly elongated fibroblast-like morphology, highlighting that a subset of

Cancer-Associated Fibroblasts (CAFs) are in fact derived from adipocytes [9]. One of the major

hallmarks of the adipocyte/cancer crosstalk appears to involve an increase in the invasive properties of

tumor cells. In fact, CAAs increase breast tumor cell invasion in vitro, as well as the number and size

of lung metastasis in vivo [7]. This process implies pro-inflammatory cytokines, such as interleukin-6,

as well as extensive extracellular matrix remodeling [3] [10] [11]. One probably underestimated effect

of the adipocyte/cancer crosstalk is its role in the response to antitumor therapy. At clinical levels, it

has been consistently demonstrated that obesity is associated with a decrease in response to adjuvant

and neoadjuvant chemotherapies [12] [13]. Limited data exist at laboratory levels to explain these

effects. We have shown that CAAs contribute to the occurrence of a radioresistant phenotype in breast

tumor cells through an increased activation of the effector kinase Chk1 [14]. In a different tumor

model (i.e. acute lymphoblastic leukemia), it has been demonstrated that adipocytes impair leukemia

treatment by Vinca alkaloids both in vitro and in vivo [15]. In this model, adipocytes prevented

chemotherapy-induced apoptosis, therefore contributing to resistance to various chemotherapeutic

4

agents, and this was associated with increased expression of the two pro-survival proteins Bcl-2 and

Pim-2 [15]. In vivo, De Angel et al. reported that obesity induced a chemoresistance to gemcitabine,

using ovarietomized diet-induced obese mice with transplanted mammary tumors (MMTV-Wnt1

model) [16], but the mechanisms underlying obesity-induced chemoresistance remain poorly

identified.

Chemotherapy remains the basic treatment for an aggressive or metastatic breast cancer [17]. Since its

multiple mechanisms of action lead to DNA damage and tumor cell death, doxorubicin (DOX)

(anthracycline family) is considered to be among the most effective agents for the treatment of breast

cancer [18] [19] [20]. Despite extensive clinical utilization, intrinsic or acquired resistance to this drug

is frequent and represents one of the major obstacles in breast cancer treatment. Resistance to DOX

implies multiple mechanisms including quantitative and qualitative modifications of its intracellular

target, Topo-isomerase II [21]. However, DOX-resistant cancer cells frequently exhibit cross-

resistance to multiple unrelated classes of anticancer drugs. This mechanism is known as multidrug

resistance (MDR) and represents an important cause of therapeutic failure [22]. One of most

predominant processes underlying MDR is an increase of drug efflux, leading to a decrease of drug

accumulation at intracellular targets. In this process, the role of the ABC (ATP-binding proteins)

transporter family has been extensively studied. This family of proteins can extrude several substrates

from cells in an ATP dependent manner against a concentration gradient [23] [24] [25]. Among all

human ABC transporters, three of them are highly involved in the MDR process: ABCB1 (P-gp for P-

glycoprotein), ABCC1 (MRP-1 for Multidrug Resistance related protein 1) and ABCG2 (BCRP for

Breast cancer resistance protein) [22]. In addition to ABC transporters, other mechanisms may exist

which prevent drugs from reaching intracellular targets, thereby conferring MDR [26]. More recently,

overexpression of a protein, termed LRP (Lung resistance protein) has been identified in a number of

tumor cells that exhibit a MDR phenotype, especially P-gp negative cells [27] [28]. Subsequently LRP

was identified as the human MVP (Major Vault Protein), which is the main component of vault

particles [26] [29]. Vaults exhibit a hollow barrel-like structure and are localized mainly in the

cytoplasm and associated with the nucleus [30] [31]. Despite some controversy, the overexpression of

MVP has been correlated with drug resistance in cells, the aggressiveness of tumors and worse

prognosis for cancer treatment for several drugs including DOX [26] [32].

In the present study, we demonstrated for the first time that adipocytes promote DOX resistance in a

large panel of human and murine breast tumor cell lines. DOX resistance was associated with a MDR

phenotype, with cross-resistance to other chemotherapeutic agents used in the treatment of breast

cancer. We further decipher the molecular mechanisms involved by showing that adipocytes stimulate

an increase of nuclear and extracellular efflux of DOX mediated by an original pathway dependent on

the MVP protein followed by release of extracellular vesicles-containing DOX. Of importance, using

an original 3D coculture system, we demonstrated that this pathway is amplified in obesity. This study

could provide unique opportunities to set up specific strategies for the treatment of obese patients

5

exhibiting aggressive breast cancer.

6

Materials and methods

Antibodies, probes and chemical reagents: The mouse monoclonal antibody against MVP was

purchased from BD Biosciences (San Jose, CA USA) and used for Western Blot and

immunofluorescence experiments. The rabbit polyclonal antibody against BCRP (H-70) was obtained

from SantaCruz biotechnology (Dallas, TE, USA) and were used for Western Blot experiments. The

monoclonal antibody anti-P-gp (C219) and the monoclonal antibody anti-β Tubulin (DM1A) were

respectively purchased from GeneTex (Irvine, CA, USA) and NeoMarkers (Fremont, CA, USA) and

used for Western Blot experiments. Doxorubicin, Paclitaxel and 5-Fluorouracil (5-FU) were purchased

from Sigma (Saint-Louis, MO, USA) and were used at final concentrations of 0.5 to 2.5 µg/mL for

Doxorubicin (DOX), 100 to 250 nM for Paclitaxel and 2 to 20 µg/mL for 5-Fluorouracil (5-FU). The

P-gp inhibitors Verapamil (Vp) (used at a final concentration of 40 µM) [33] and Tariquidar (Tar)

(used at a final concentration of 75 nM) [34] were respectively purchased from Sigma (Saint-Louis,

MO, USA) and Selleckchem (Houston, TX, UA). The MRPs family inhibitor, MK-571 (MK) [35],

and the BCRP inhibitor, Fumitremorgin-C (FTC) [36], were purchased from Sigma (Saint-Louis, MO,

USA) and used at a final concentration of 30 µM. All the reagents were diluted in DMSO (except

DOX, which was diluted in water) and used within the efficient pharmacological range of doses

described in the literature. MTT assays were performed to ensure that the used doses were non-toxic

for cells. The Bodipy lipid probe coupled to Alexa Fluor 488 (used at 1 µg/ml) and DAPI were

obtained from Life Technologies (Grand Island, NY, USA). For immunofluorescence experiments, a

goat anti-mouse secondary antibody (IgG F(ab’)2 fragment conjugated to Alexa Fluor 488) obtained

from Invitrogen (Auckland, NZ) was used.

Cell culture: The human breast cancer cell lines T47D and MDA-MB231 (provided by Pr K.

Bystricky, LBME, Toulouse, France), as well as MDA-MB453 and BT-474 (provided by Pr C.

Dumontet, CRCL, Lyon, France) were cultured in RPMI 1640 medium (Invitrogen, Auckland, NZ).

The human breast cancer cell line MDA-MB436 (provided by Dr I. Martin Padura, IEO, Milan, Italy)

was cultured in DMEM/F-12 (1:1) medium (Invitrogen, Auckland, NZ). The murine breast cancer cell

lines M-Wnt [37] (provided by Pr S. Hursting, Austin, Texas, USA) and E0771 [38] (provided by Dr

J. Nunes, CRCM, Marseille, France) were cultured in RPMI 1640 medium (supplemented with 10 mM

of HEPES buffer for the E0771 cell line). All cell lines were cultured in media supplemented with

10% Fetal Calf Serum (FCS) and antibiotics (125 mg/mL streptomycin and 125 UI/mL penicillin)

(Invitrogen, Auckland, NZ) and were grown in a humid atmosphere with 5% CO2. NIH3T3-MDR-

G185 (positive for P-gp) and HEK-ABCG2 (positive for BCRP) (provided by L. Payen, CRCL, Lyon,

France) were cultured in DMEM medium, supplemented with 10% FCS. Cells were transfected as

previously described [39]. All cell lines were used within 1 to 2 months after resuscitation of frozen

aliquots and were authenticated based on viability, recovery, growth and morphology. The murine

3T3-F442A preadipocyte cell line was grown in DMEM medium and differentiated into mature

7

adipocytes as previously described [7]. The term “adipocyte” represents cells that have been

differentiated for 10 to 14 days (with 80 to 100% of lipid droplets).

Coculture system: Co-culture between tumor cells and adipocytes, was performed using a Transwell

culture system (0.4 µm pore size, Millipore). Murine or human breast tumor cells were seeded in the

upper chamber of the Transwell system in the same culture medium as adipocytes and were then co-

cultivated or not with adipocytes (grown in 2D for 3T3-F442A mature adipocytes or in 3D for primary

isolated adipocytes) for the indicated times (3 to 6 days). Adipocytes or tumor cells cultivated alone in

similar conditions served as controls.

Drug treatment and viability determination: Breast tumor cells were seeded in the upper chamber

of a Transwell culture system with or without adipocytes during 3 days (preincubation period). After

this period, tumor cells were incubated with medium containing DOX, paclitaxel or 5-FU for 4 hours.

Then, the treatment medium was removed and cells were washed with fresh medium once and

incubated with adipocytes for 3 days (postincubation period). Cell survival after treatment was

estimated by Toluidine Blue staining as follows. Briefly the Transwell chamber containing tumor cells

was fixed with methanol, then immediately incubated with Toluidine Blue 1% in 0.1 M borax (Sigma,

Saint-Louis, MO, USA). After washing, the remaining cells were therefore stained blue. The

Transwell chamber membranes were then placed in a lysis buffer (Tris-Hcl 6.25 mM (pH 6.8), 10%

glycerol, 2% SDS, 5% β- mercaptoethanol) and the absorbance of the obtained solution was measured

at 570 nm (MicroQuant from Biotek Instrument Inc, Winooski, VT, USA). For the experiments, the

term of “viability” was used to estimate the survival of cells, because we have previously shown that

coculture with adipocytes does not influence the tumor cell proliferation [7].

Mice: Mice were handled in accordance with National Institute of Medical Research (INSERM)

principles and guidelines. C57Bl6/J male mice were obtained from Janvier (Le Genest St Isle, France).

Mice were housed conventionally in an animal room at constant temperature (20–22°C) and humidity

(50–60%), and with a 12h light–dark cycle. All the mice had free access to food and water throughout

the experiment. The C57Bl6/J mice were assigned to a normal diet (ND) (PicoLab Rodent Diet 20,

Purina Mills Inc., Brentwood, MO, USA) or high-fat diet (HFD) (Research Diets Inc., New

Brunswick, New Jersey, USA). The energy contents of the diets were as follows: 16 % protein, 81 %

carbohydrate, and 4 % fat for the ND; and 20 % protein, 20 % carbohydrate, and 60 % fat for the

HFD. C57Bl6/J mice (initially 10 weeks old) were fed a ND or a HFD for 12 to 15 weeks. This

previous described period of HFD is used to mimic the development of obesity in humans associated

with the onset of insulin resistance and low grade inflammation [40] [41]. At 25 weeks, mice were

sacrificed by cervical dislocation to collect perigonadal adipose tissue (VAT).

8

Murine adipose tissue digestion, isolation of primary adipocytes and 3D culture: VAT was

dissected immediately after sacrifice and weighed. Then 1g of tissue was immediately placed in 5 mL

of DMEM (Invitrogen, Auckland, NZ) supplemented with 1% BSA (Sigma, Saint-Louis, MO, USA).

The adipocytes and SVF cells were isolated from whole VAT as previously described [42]. Briefly, 25

µg/mL of liberase (Roche Applied Science, Meylan, France) was added and the tissue was incubated

for 30 minutes at 37°C under shaking. After digestion, FCS at a final concentration of 10% was added

to inhibit the liberase. The samples were then centrifuged (3 min, RT, 200 rpm) to separate adipocytes

(floating cells) from the SVF (pellet and supernatant). Primary adipocytes were embedded in a three-

dimensional collagen gel matrix. The collagen gel culture system was prepared as follows: type I

collagen (final concentration of 2 mg/mL) (Nitta Gelatin Co Ltd, Osaka, Japan) was mixed with

DMEM 10X (final concentration 1X), FCS (final concentration 10%) and with reconstruction buffer

(final dilution 10%). This collagen gel solution was mixed with primary adipocytes. A total of 1.5 ml

of collagen gel solution (containing 6 x 105 adipocytes) was poured into 6 wells plates or 300 µL (1 x

105 cells) for 24 wells plates. The culture dish was immediately warmed at 37°C to allow the gel to

form. The gel was further covered with 1.5 mL per dish of DMEM containing 10% FCS and insulin.

Western blot analysis: Whole-cell extracts were prepared as follows: cells were harvested with

trypsin and after centrifugation pellets were lysed on ice for 20 minutes in Tris-HCl (10 mM, pH 7.5)

containing 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% Triton X-100 and proteases and phosphatases inhibitors

(Sigma, Saint-Louis, MO, USA). Insoluble material was removed by centrifugation (16,000g for 20

minutes at 4°C) and the supernatant was collected and stored at -80°C [43]. Proteins were then

electrophoresed on SDS-polyacrylamide gels and transferred onto polyvinyl difluoride (PVDF)

membranes. After being blocked with 5% skimmed milk in PBS1X, the membranes were incubated

with appropriate primary antibodies. Then, the membranes were washed with 0.1% PBS-tween and

incubated with HRP-conjugated secondary antibodies. The immunoreactive protein bands were

detected by ECL.

DOX extracellular efflux by Flow Cytometry Assay: To estimate DOX extracellular efflux, after 3

days of coculture with adipocytes or incubation with Adipocyte-conditioned medium (AdCM), tumor

cells were incubated with medium containing DOX at a final concentration of 2 µg/mL during 4 hours

at 37°C. AdCM was obtained as follows: mature 3T3-F442A adipocytes were cultivated overnight

with DMEM medium supplemented with 1% BSA. Then medium was collected and centrifuged at

3,000 g for 30 minutes (to eliminate cell debris contamination) and stored at –80°C before use. After

incubation, cells were washed once with DMEM supplemented with 10% FCS. Then, fresh medium

was added and cells were left to recover for the indicated times allowing DOX efflux from cells. In

indicated experiments, cocultivated and non-cocultivated cells were treated or not with ABC

transporter inhibitors after drug exposure for 24h. At the end of the incubation, cells were harvested

with trypsin, washed with PBS and analyzed with FACScalibur (Becton Dickinson, Rutherford, NJ,

9

USA) using a 488 nm excitation and 670 nm long-pass filter (FL3-H). Mean fluorescence intensity

was quantified by CellQuest software (Becton Dickinson, Rutherford, NJ, USA). For each analysis

20,000 events were collected.

DOX nuclear efflux assays: To estimate nuclear efflux of DOX, cells were seeded on glass coverslips

and treated with DOX, as above. Then, cells were fixed with a 3.7% paraformaldehyde (PFA) solution

for 20 minutes at room temperature. PFA was quenched with 50 mM NH4Cl and cells were incubated

with DAPI for 5 minutes. After washing twice with PBS, cells were mounted in Vectashield medium

(Abcys). Fluorescence images were acquired with a confocal laser microscopy system with 60X oil

PLAPON OSC objective (Confocal TIRF Olympus FV1000). The intensity of staining in the nuclei

was quantified on original images using Fiji software. Images were processed to filter the noise with

Fiji software and a similar filter was used to analyze all acquisitions for the experiments.

Immunofluorescence experiments: After fixation (3.7% PFA) cells were permeabilized with PBS

0.2% TritonX-100 for 5 minutes. After blocking with PBS, 10% FCS, 2% BSA for 60 minutes, cells

were incubated with the anti-MVP monoclonal antibody for 12 hours at 4°C or with Bodipy for 30

minutes at RT and washed twice. For MVP visualization, cells were then incubated with the

appropriate secondary antibody for 30 minutes at RT. Then, cells were stained with DAPI and

mounted in Vectashield medium. Images acquisition and quantification were performed as above.

siRNA transfection: Transient transfection of breast tumor cells (MDA-MB436) was performed with

Lipofectamine siRNAIMAX (Life Technologies) according to the manufacter’s instructions. In brief,

transfection was performed in 6-well plates containing 50% confluent cells, in 1.8 ml DMEM, 5%

FCS to which 200µL of the transfection mix was added for a final concentration of 100 nM of siRNA

in the medium. Five hours after transfection, either medium was refreshed with DMEM 10% FCS or

with AdCM during 48 hours. siMVP’s sequence is UAGGAGUCACCAUGGCAAC and the negative

control nontargeting siRNA’s sequence is UUCUCCGAACGUGUCACGU. For the DOX

accumulation experiments, cells were incubated with siRNA (for 5h) then treated with DOX 24h after

transfection (for 4h). Immunofluorescence or FACS experiments were performed as described below

24h after DOX exposure (and therefore 48h after transfection).

Tumor cell exosome and microvesicle preparation: Tumor cells were incubated for 48h in complete

DMEM medium without phenol red (Invitrogen, Auckland, NZ) (to avoid fluorescence contamination)

previously depleted in contaminating bovine vesicles by overnight centrifugation at 100,000g. This

tumor cell conditioned medium was then collected and stored at -80°C. For vesicle purification:

conditioned medium was centrifuged once at 3,000g for 30 min to remove cell debris contamination.

The resulting supernatant was further centrifuged for 30 min at 10,000g to isolate microvesicles. The

pellet of microvesicles was suspended in PBS and again centrifuged for washing. The exosomes

contained in the 10,000g supernatant were pelleted by ultracentrifugation at 100,000g for 90 min. The

10

pellet of exosomes was washed in PBS and again ultracentrifuged. The resulting pellets containing

either exosomes or microvesicles were finally suspended in PBS for quantification by NanoSight and

functional analysis. All steps were carried out at 4°C.

Adipocyte exosome, microvesicle and soluble factor preparation: The adipocyte conditioned

medium (AdCM) was prepared as follows: mature 3T3-F442A adipocytes were cultivated for 72h

with complete DMEM medium previously depleted of contaminating bovine vesicles by overnight

centrifugation at 100,000g. Then medium was collected and centrifuged at 3,000 g for 30 minutes (to

eliminate cell debris contamination) and stored at –80°C before use. For purification: AdCM was

centrifuged for 60 minutes at 10,000 g, the obtained pellet being composed of microvesicles (MV) and

the supernatant containing exosomes and soluble factors. This supernatant was ultracentrifuged at

100,000g 90 minutes to isolate exosomes (pellet) and soluble factors (supernatant). Pellets of

exosomes and MV were suspended in DMEM medium. The different conditions (AdCM, MV,

exosomes, soluble factors and exosomes plus soluble factors) were diluted to half in DMEM complete

medium and incubated with the tumor cells.

NanoSight analysis: Exosome and MV concentration and size distribution were analyzed with a

NanoSight LM10-HS (Malvern, Orsay, France), equipped with a 405 nm laser. The assays were

performed according to the recommended protocols of the machine's manufacturer. Briefly, three

independent replicates of diluted exosome preparations (about 109 particles/mL) in PBS were injected

into the NanoSight chamber. The specimens were tracked and measured at room temperature for 60s.

Shutter and gain were manually adjusted for optimal detection and were kept at this setting for all

samples. The data were captured and analyzed with NTA Build 127 software (version 2.2). Three

measurements of the same sample were performed.

FACS analysis of DOX in vesicles: To determine the intensity of fluorescence of DOX in vesicles,

purified tumor cell microvesicles and exosomes were coated onto aldehyde/sulfate latex beads (Life

Technologies, Grand Island, NY, USA). Briefly, vesicles were incubated with 4 µm-diameter

aldehyde/sulfate latex beads diluted in PBS (final volume 600-1000µL) for 15 minutes at RT under

gentle agitation, followed by overnight incubation at 4°C. The number of beads was proportional to

the number of vesicles previously determined by NanoSight analysis (1600 vesicles per bead). Then,

these vesicle-coated beads were analyzed with FACScalibur (Becton Dickinson, Rutherford, NJ,

USA). Mean fluorescence intensity was quantified by CellQuest software (Becton Dickinson,

Rutherford, NJ, USA). For each analysis 20,000 events were collected.

Statistical analysis: The statistical significance of differences (at least three independent experiments)

was evaluated using ANOVA or Student t-tests in Prism (GraphPad Inc.). P values below 0.05(*),

<0.01 (**), <0.001 (***) and <0.0001 (****) were deemed as significant while “NS” stands for not

significant.

11

Results and discussion

Coculture with mature adipocytes promotes a MDR phenotype in a wide panel of human and

murine breast cancer cell lines. To characterize the potential effect of mature adipocytes on the

response of breast tumor cells to doxorubicin (DOX) exposure, we used a coculture system previously

set up in our team [7]. In this experimental model, which reproduces the phenotypical changes

observed in human tumors [7] [9], the two populations are separated by an insert, which allows the

diffusion of secretions from both cell types. As shown in fig. 1A, tumor cells were grown for 3 days

on Transwells in the presence or not of mature adipocytes (obtained after in vitro differentiation of the

murine preadipocyte cell line, 3T3-F442A [44]). After 3 days of coculture (preincubation period),

tumor cells were treated with DOX at indicated concentrations and incubated again with (C) or

without (NC) adipocytes for 3 days (postincubation period). At the end of the postincubation period,

the viability of tumor cells was determined. These experiments were performed in a panel of human

and murine cell lines representative of the different subtypes of breast cancer (ER+, HER2+, triple

negative [TN]) (see fig. 1B and 1C). As shown in fig. 1C, for all the studied cell lines, the viability

after DOX exposure of cocultivated tumor cells was significantly higher than the control cells grown

alone. The amplitude of the effect was close for all the tested models (between 1.3 and 2.4-fold

increase in cell viability), except for the murine ER+ E0771 cell line that exhibits higher resistance (6-

fold increase in cell viability). For the following experiments, we selected two human cell lines, the

poorly aggressive well-differentiated ER+ T47D cell line and the aggressive TN cell line MDA-

MB436. Using similar coculture experiments, we found that adipocytes induce a MDR phenotype in

tumor cells. In fact, cocultivated tumor cells exhibit significant resistance (around 1.5-fold) to the

microtubule inhibitor, paclitaxel [45], as well as to the pyrimidine analog 5-Fluorouracil (5-FU) [46]

as compared to control cells grown alone (fig. 1D). Having described the effects of adipocytes on

DOX-induced cytotoxicity in tumor cells, we sought to further understand this chemoresistance using

our in vitro coculture system. We first investigated whether coculture with adipocytes before exposure

to the drug was sufficient to promote the chemoresistant phenotype (preincubation period). As shown

in fig. 2A, no differences in cell viability were observed in cocultivated cells as compared to control.

On the contrary, the presence of adipocytes only during the postincubation period recapitulated the

chemoresistant phenotype (fig. 2B), although to a lesser extent than when adipocytes were present at

all steps (preincubation and postincubation, fig. 2C). These results highlight that the presence of

adipocytes after exposure to the drug during the cell damage response is important for the

chemoresistant phenotype oberved. We previously demonstrated that coculture with adipocytes

confers a radioresistant phenotype in breast cancer and this radioprotective effect is fully conferred by

the changes induced in tumor cells during the coculture period prior to irradiation [14]. Therefore, the

protective mechanisms conferred by adipocytes towards cytotoxic strategies possess specificities.

Concerning chemotherapy, our results demonstrate that adipocyte-dependent modifications induced in

12

tumor cells “educate” them to resist to the drug to a certain extent but that the regulation of the cell

damage response is a key event in the appearance of a chemoresistant phenotype.

Adipocytes decrease intracellular DOX accumulation independently of major ABC transporters.

Since the predominant mechanism underlying MDR is associated with drug efflux, we next

investigated if DOX intracellular accumulation is altered by the presence of adipocytes. For this, we

took advantage of the intrinsic fluorescent properties of DOX, allowing the detection of its

intracellular accumulation by flow cytometry. Previously cocultivated or non-cocultivated breast

tumor cells were incubated with DOX for 4h and, after washing, cells were left to recover in the

presence or not of adipocytes in DOX-free medium for up 72 hours. DOX accumulation was evaluated

by flow cytometry at different time points. As shown on fig. 3A, no significant differences in initial

DOX uptake were observed between cocultivated and non-cocultivated cells (0h). As expected, the

intracellular fluorescence of DOX decreased in a time-dependent manner in both conditions, but this

effect was significantly increased in cocultivated cells as compared to tumor cells grown alone for

both cell lines used (fig. 3A). These data suggest that adipocytes promote DOX extracellular efflux

independently of the cell lines used, leading to reduced drug toxicity that we observed (fig. 1). This

process is often due to the overexpression of ABC transporters [22]. As DOX is a well-known

substrate of some ABC transporters, such as P-gp and BCRP, the expression of these efflux pumps

was studied by Western Blot in non-cocultivated and cocultivated cells, treated or not with DOX. As

shown in fig. 3B, the expression of P-gp and BCRP was weak and not affected by coculture in T47D

cells, compared to cells overexpressing P-gp or BCRP, which were used as positive controls. We next

investigated if the activity of these major ABC transporters could be affected by adipocytes, despite

the low levels of expression in these cell lines and the absence of their regulation by coculture, using

pharmacological inhibitors. The activity of P-gp was first investigated using verapamil (Vp), a calcium

channel blocker and the first P-gp chemosensitizer described [47]. As shown in fig. 3C, Vp was able to

inhibit drug extracellular efflux in both cell lines used, but the difference in drug accumulation was

still present between cocultivated and non-cocultivated cells in both cell lines (fig. 3C). Because it has

been described that Vp lacks specificity [48], we also used tariquidar (Tar), which is a highly specific

inhibitor of P-gp [34]. A slight but significant effect was observed in MDA-MB436 drug accumulation

in the presence of Tar, in opposition to the T47D cell line. However in both cases, the differences in

DOX accumulation between non-cocultivated and cocultivated cells remained effective in the

presence of the inhibitor. Taken together, these results suggest that P-gp participates in DOX efflux

especially in MDA-MB436 cells, despite a very low level of expression. Such dissociation between

expression and function of P-gp has been previously described in leukemia cell lines [49].

Nevertheless, the differences in drug extracellular efflux between cocultivated and non-cocultivated

cells cannot be explained by an increase in P-gp function induced by adipocytes. Similar results were

13

obtained using MRP family inhibitor (MK-571) and BCRP inhibitor (Fumitremorgin-C) in both cell

lines (fig. 3D and 3E). Despite a slight increase in DOX accumulation, indicating that these pumps

could be functional in both cell lines, the differences between non-cocultivated and cocultivated cells

persist in the presence of these inhibitors. Collectively, these results show that despite the inhibition of

major ABC transporters, cocultivated cells continue to release DOX at higher rates than non-

cocultivated cells. These surprising results strongly indicate that other mechanisms are responsible for

adipocyte-induced chemoresistance. We have demonstrated that resistance to DOX mediated by

adipocytes correlated with resistance to paclitaxel and 5-fluorouracil (fig. 1D). Paclitaxel is also a

well-known substrate of P-gp transporter, but not, or to a much lesser extent, of MRP-1 and BCRP

[50] [22] [23] [51]. Moreover, 5-fluorouracil is not transported by P-gp, MRP-1 and weakly by BCRP

[52] [50] [53]. Therefore, this pattern of cross-resistance is not in favor of the involvement of P-gp,

MRP or BCRP in DOX resistance and is in accordance with the results of our efflux studies in the

presence of inhibitors of these different transporters. Other ABC transporters exist that could induce

DOX extracellular efflux, such as ABCA3, ABCB4, ABCB5 and ABCD8 but their role in

chemoresistance remains poorly known and their implication in adipocyte-induced chemoresistance

was not evaluated in the present study [54] [55].

An original mechanism implicating MVP and vesicles is potentially involved in the increased

DOX efflux mediated by adipocytes. As stated in the introduction, in addition to ABC transporters,

other mechanisms exist, that can prevent DOX from reaching its intracellular target, DNA, thereby

conferring MDR phenotype to tumor cells [26]. Accordingly, the intracellular localization of DOX in

cocultivated and non-cocultivated cells was investigated by confocal microscopy. At the end of the 4h

incubation period with the drug (0h), DOX showed a strong nuclear staining (fig. 4A for T47D and 4B

for MDA-MB436 cell lines). This nuclear staining decreased over time, with no visible staining in the

cytoplasm in these conditions of cell fixation. Interestingly, a stronger decrease of DOX intranuclear

accumulation was observed in cocultivated, compared to non-cocultivated cells, from 12 hours after

drug exposure (fig. 4A and 4B, see right panels for quantification of nuclear fluorescence). These data

suggest that coculture with adipocytes induces an important nuclear efflux. The protein MVP is the

major component of vault particles, implicated in the nucleocytoplasmic transport of drugs. As its

overexpression has been shown to be correlated with DOX chemoresistance [56] [57] [58] [26], we

studied MVP expression in our coculture experiments. As shown in fig. 4C, overexpression of MVP

was observed in non-cocultivated cells after drug exposure, compared to non-treated cells, suggesting

that DOX treatment itself upregulates MVP expression, potentially contributing to the cell damage

response to protect cells against DOX toxicity. Noteworthy, this induction was greater after coculture

with adipocytes in the two cell lines studied (see fig. 4C). Overexpression of MVP in DOX-treated

cells, with an increase of this effect in cocultivated cells was confirmed by preliminary

14

immunofluorescence results (fig. 4D). Surprisingly, MVP was mainly localized in the nucleus of

tumor cells in our conditions of fixing, unlike several studies that have reported the presence of MVP

mainly in the cytoplasm [59] [60] [61]. Further immunofluorescence experiments using different

fixation approaches (acetone, methanol) are therefore required to study the precise subcellular

localization of MVP in cells. To investigate the role of MVP in the observed chemoresistance, a RNA

silencing strategy is mandatory since to our knowledge, no pharmacological inhibitor of this protein is

available. Transfection of cells in coculture inserts is less efficient than in culture wells, possibly

because the transfection solution diffuses into the lower chamber. For this reason, we decided to use

tumor cells incubated with adipocyte conditioned-medium (AdCM). Therefore, we began by

determining if AdCM recapitulated the effects of coculture. As shown on fig. 4E, exposure of tumor

cells to AdCM induced an increase of MVP expression and an increase in nuclear and extracellular

efflux of DOX, as compared to control cells. Using siRNA, we then investigated the effect of MVP

knockdown (fig. 4F), which is considered an equivalent to vault knockdown [61]. Preliminary results

suggest that MVP knockdown increases the nuclear accumulation of DOX, this effect being more

pronounced in cells incubated with AdCM, than in control cells (increase of DOX nuclear

concentration of 1.7 and 1.3-fold respectively at 24h after DOX exposure) (fig. 4G). In the MVP-

depleted cells the differences in DOX nuclear accumulation between control and AdCM exposed cells

was almost abolished (fig. 4G). Taken together, these preliminary results suggest that adipocytes

induce an increase of MVP expression, which may promote a nuclear efflux of DOX, leading to the

chemoresistance observed. Because we also observed an increase in DOX extracellular efflux in

cocultivated cells compared to control cells (fig. 3A), we next investigated whether or not MVP

knockdown inhibits this effect. Preliminary results suggested that downregulation of MVP by siRNA

does not induce changes in DOX extracellular efflux at 24h after drug exposure as investigated by

flow cytometry in MVP-depleted cells compared to control cells (fig. 4H). Other experiments using

different siMVP are needed to confirm these results in order to verify the specificity of the observed

biological effect. Taken together, these data suggest that MVP might induce a nuclear, but not an

extracellular efflux of DOX, indicating that others mechanisms could be needed to expel DOX from

the cells. Similar results were obtained by Herlevesen et al., who demonstrated that the knockdown of

MVP did not influence the extracellular efflux but disrupted the intracellular distribution of DOX,

leading to increased sensitivity of tumor cells to the drug [61]. Further experiments are therefore

needed to confirm these preliminary results and to determine if the knockdown of MVP inhibits the

drug resistance induced by adipocytes in breast tumor cells. It has been suggested that MVP may

mediate a MDR phenotype by transporting the drugs away from their subcellular targets, followed by

their sequestration into exocytotic vesicles to eliminate them from the cells [58]. To test this last

hypothesis, breast tumor cell-conditioned medium (Bc-CM) was prepared. Bc-CM was obtained from

cells previously cocultivated or not with adipocytes and treated or not with DOX. Microvesicles (MV)

and exosomes were then purified from this Bc-CM by successive centrifugations (see Material and

15

Methods). Vesicle number and size distribution were analyzed by NanoSight technology. Our results

confirmed the presence of both MV and exosomes within their characteristic size ranges (around 100

nm for exosomes and heterogeneous size between 0.1 and 1 µm for MV) [62] [63] (fig. 5A and 5B).

We then determined if the vesicles secreted by breast tumor cells in the different conditions were

qualitatively and quantitatively different using NanoSight technology. As shown on fig. 5, very little

variation in the quantity of exosomes and microvesicles secreted by cocultivated cells, as compared to

control cells, was observed in the absence of DOX treatment. However, an important increase in

secreted particles was observed in DOX-treated cells and this effect was more pronounced for both

MV and exosomes in cocultivated, compared to control, cells (increase of 1.9-fold for exosomes and

2.1-fold for microvesicles secreted, p<0.05 for both vesicle types) (fig. 5C). These data are in

accordance with a previous study, which demonstrated that paclitaxel, etoposide, irinotecan and

carboplatin enhance exosomal secretion [64]. Moreover, Shedden et al. have demonstrated that DOX

may be encapsulated in extracellular vesicles, and this process is amplified in chemoresistant cells

[65]. In order to determine if microvesicles and exosomes secreted by breast tumor cells contain DOX,

we set up an experimental system, where vesicles were coated onto aldehyde/sulfate latex beads and

were analyzed by FACS. Our preliminary results suggest that both exosomes and microvesicles

secreted from cells treated with DOX were able to encapsulate this drug (fig. 5D). Further experiments

are now needed to determine if MV and exosomes from cocultivated cells contain more DOX than

control cells. Taken together, our preliminary results suggest that adipocytes may induce a nuclear

efflux of DOX, mediated by MVP. The encapsulated DOX might then be secreted by MV and/or

exosomes into the extracellular medium, this combined mechanism leading to drug resistance.

The adipocyte signal contributing to the nuclear efflux of DOX in cancer cells is mediated by

both exosomes and soluble factors. We then sought to identify the signal emanating from adipocytes

that induces the increase of nuclear efflux of DOX from tumor cells. Although the role of soluble

factors has been extensively studied, greater interest has developed in recent years on the role of

extracellular vesicles in intercellular communication mechanisms in the context of tumor progression

[66]. Accordingly, the different components contained in adipocyte-conditioned medium (AdCM)

were purified according to the experimental protocol shown in fig. 6A. AdCM was separated into

microvesicles (MV), soluble factors and exosomes together, as well as exosomes alone and soluble

factors alone (fig. 6A). The T47D cell line was then incubated with these different isolated fractions

and DOX nuclear efflux as well as MVP expression was analyzed using immunofluorescence

experiments. As shown by the preliminary experiment presented in fig. 6B and 6C, only the fraction

containing both soluble factors and exosomes recapitulated the effect of unfractionated AdCM, by

increasing both DOX nuclear efflux and overexpression of MVP to a similar extent. Very

interestingly, proteomic analysis of adipocyte exosomes performed in the laboratory by another PhD

16

student (Ikrame Lazar) has revealed that MVP is abundantly present in adipocytes exosomes. It is now

well known that exosomes secreted by donor cells can be uptaken by recipient cells [66]. Therefore,

adipocyte exosomes containing large amounts of MVP might be transferred to tumor cells, thereby

leading to an increase of MVP in cocultivated breast tumor cells. This molecular transfer has been

reported in several studies, for example vesicles are able to transfer P-gp or MRP-1 transporters from

drug-resistant cancer cells to drug-sensitive tumor cells, leading to multidrug resistance in various

models [67] [68] [69] [70]. Nevertheless, in our present study, adipocyte exosomes alone did not

induce a nuclear efflux of DOX, suggesting that additional soluble factors present in AdCM are

needed to recapitulate the chemoresistance observed in cocultivated cells. We postulate that soluble

factors could impact some pathways in tumor cells, which can contribute to synergize with the MVP

contained in exosomes, leading to an increase in the nuclear efflux of DOX. Further experiments are

needed to determine if MVP is indeed transferred from adipocytes to tumor cells and which soluble

factor(s) could “activate” MVP. If verified, this mechanism would represent a highly original pathway

of drug resistance conferred by the tumor microenvironment.

Adipocyte-mediated chemoresistance is increased by obesity. Since obesity is associated with a

poor response to chemotherapy in breast cancer, we next investigated if obesity could amplify the

deleterious crosstalk between adipocytes and breast cancer [6]. Murine visceral adipose tissue was

isolated from lean and obese mice, obesity being induced by a high fat diet (HFD). At the time of

euthanasia, high fat diet mice weighed significantly more than normal diet mice (ND) (fig. 7A). After

digestion of adipose tissue by liberase, adipocytes were isolated by flotation as previously described

[41] [7]. It has been formerly demonstrated that isolated adipocytes in suspension in an appropriate

culture medium remain viable for approximatively 24 hours but from then on both survival and

function are profoundly altered [71]. To circumvent this problem, we set up a 3D coculture system in

the lab in which isolated adipocytes are embedded in a collagen I matrix as previously proposed (fig.

7A) [72] [73]. As shown on fig. 7B and 7C, adipocytes embedded in a collagen I matrix retain their

round morphology in culture for up to 6 days, with a significant and long-lasting increase in size of

about 2-fold in adipocytes isolated from HFD mice, compared to ND mice. Moreover, these

adipocytes remain functional, as demonstrated by their ability to respond to a lipolytic signal induced

by Isoproterenol (beta adrenergic agonist) (data not shown). To investigate the effect of obese

adipocytes on drug resistance, cocultures with several breast tumor cell lines were performed with

these adipocytes (fig. 7A). As shown on figure 7D, an increase of viability after DOX exposure was

observed in cells cocultivated with adipocytes as compared to cells grown alone (increase of 1.35 to

1.9-fold) and this effect was amplified when adipocytes were isolated from obese mice (increase of 1.7

to 2.8-fold when compared to control). Similar results were obtained with mammary adipose tissue

(preliminary results, data not shown). The increase of viability after DOX treatment was associated

17

with a parallel decrease in the nuclear accumulation of DOX (fig. 7E). Comparison of MVP

expression in breast tumor cells cocultivated with adipocytes isolated from lean or obese mice as well

as the quantity of vesicles secreted by tumor cells, after drug exposure in these conditions are currently

being investigated. Collectively, these data demonstrate that the chemoresistance conferred by obesity

is dependent on a paracrine mechanism involving a crosstalk between adipocytes and tumor cells. The

fact that the DOX nuclear efflux is further increased by obesity strongly suggests that obesity could

amplify the level of MVP in recipient cells, and probably the vesicle-mediated extracellular efflux.

Moreover, several data obtained in the laboratory by another phD student (Emily Clement)

demonstrated that adipocytes from obese mice secrete a huge quantity of exosomes, compared to

adipocytes from lean mice, potentially conferring more MVP to recipient cells.

Although additional experiments are needed to confirm our main hypothesis, our work reveals an

exciting new role for tumor surrounding adipocytes, which confer a MDR phenotype to breast cancer

cells, and the associated mechanistic pathway, which is summarized in fig. 8. We propose that DOX,

which enters into tumor cells by passive diffusion and accumulates in the nucleus, is transported to the

cytoplasm by MVP, followed by an extracellular efflux of DOX by vesicles that are secreted by tumor

cells. Adipocyte-derived exosomes contain high levels of MVP that, in synergy with soluble factors,

increases nuclear efflux and subsequent vesicle encapsulation of drug, resulting in a chemoresistant

phenotype. In obesity, this mechanism is amplified leading to an increased chemoresistance. These

results account for the poor prognosis observed for obese women with breast cancer, which is due in

part to resistance to chemotherapy [6] [12] [13]. When fully validated in vitro, this original mechanism

would be validated in mice and human tumor samples.

18

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A

B

CER+ TN TN HER2+

ER+ TN

Cell line Origin Characteristics

T47D Human ER+/PR+/HER2-

MDA-MB436 Human ER-/PR-/HER2-

MDA-MB231 Human ER-/PR-/HER2-

MDA-MB453 Human ER-/PR-/HER2+

BT-474 Human ER+/PR+/HER2+

E0771 Murine ER+/PR-/HER2-

M-Wnt Murine ER-/PR-/HER2-

D

HER2+

Human

Murine

Figure 1. Adipocytes promote multidrug resistance in breast cancer cells.(A) Experimental design: breast tumor cells were cocultivated (C) or not (NC) with adipocytes for 3 days (preincubation period)and incubated with drugs for 4 hours. After washing, cells were again cultivated with adipocytes for 3 days (postincubationperiod). Viable cells were then fixed and stained with Toluidine Blue and assessed by measuring absorbance at 570 nm.(B) Genomic characteristics and origins of cell lines used. ER (Estrogen Receptor), PR (Progesterone Receptor), HER2 (HumanEpidermal growth factor Receptor-2).(C) Results of viability assays of various breast tumor cells cocultivated with adipocytes (C) (white bars) or cultivated alone(NC) (black bars), treated or not with DOX (0, 0.5, 1 and 2.5 µg/mL doses).(D) Left panel, viability assays of T47D and MDA-MB436 cell lines cocultivated (C) or not (NC) with adipocytes, treated or notwith paclitaxel (0, 50 and 200 nM doses). Right panel, similar experiments were performed using 5-fluorouracil (0, 2 and 20µg/mL doses).Error bars represent the means ± SEM of 3 independent experiments, statistically significant by ANOVA, * p<0.05, ** p<0.01,*** p<0.001, *** p<0.0001 relative to NC cells.

BA

C

Figure 2. Incubation of cells with adipocytes after DOX exposure is mandatory to observe a chemoresistance.(A) Effects of preincubation with adipocytes on DOX resistance in breast tumor cells. Upper, experimental design: breasttumor cells were cocultivated (C) or not (NC) with adipocytes for 3 days and incubated with DOX. After DOX exposure,both cells were left to recover without adipocytes for 3 days. Lower, viability assays for T47D (left) and MDA-MB436(right) cell lines.(B) Effects of postincubation with adipocytes on DOX resistance. Upper, experimental design: breast tumor cellspreviously treated with DOX were cocultivated (C) or not (NC) with adipocytes for 3 days. Lower, results of viabilityassays for indicated cell lines.(C) Comparison of the different experimental designs. Results were expressed in ratio of C versus NC cells. Black barsrepresent viability results using the preincubation experimental process, grey bars for postincubation alone and white barsfor pre and postincubation. 0, 1 and 2.5 represent doses of DOX used (in µg/mL).Error bars represent the means ± SEM of 3 independent experiments, statistically significant by ANOVA (A, B, C) orstudent’s t-test (D), * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001, ns for not significant.

A

B - 0h 4h 24h

NC C NC C NC C NC C Pgp+

Tubulin

P-gp

C D E

- 0h 4h 24h

NC C NC C NC C NC C BCRP+

Tubulin

BCRP

NC

C

h h

NC

C

Figure 3. Adipocytes decrease intracellular DOX accumulation independently of major ABC transporters.(A) Representative experiments showing the intracellular accumulation of DOX detected by flow cytometry at 12 hours afterDOX exposure for indicated cell lines. Black lines: non-cocultivated cells (NC), red lines: cocultivated cells (C), continuouslines: cells treated with DOX, dotted lines: non-treated cells. Histograms represent the quantification of intracellularfluorescence of DOX for each cell line at indicated times after drug exposure. Black bars for NC and red bars for C cells.(B) Expression of major ABC transporters (P-gp, BCRP), determined by Western blot in T47D cells. NIH3T3-MDR-G185 andHEK-ABCG2 were used as positive controls for each ABC transporter.(C) Quantification of intracellular DOX at indicated times after drug exposure, in presence or not of P-gp inhibitors, Verapamil(Vp) and Tariquidar (Tar), detected by flow cytometry in T47D (upper) and MDA-MB436 (lower) cells.Similar experiments were performed using the MRPs family inhibitor, MK-571 (MK) (D), and the BCRP inhibitor,Fumitremorgin-C (FTC) (E).Error bars represent the means ± SEM of at least 3 independent experiments, statistically significant by Student’s t-test, *p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001, ns for not significant.

0h

NC NC NC CCC

DO

XD

OX

/ D

AP

I

12h 24h

0h

NC NC CC

24h

A

C

Tubulin

NC

NT

C NC C NC C NC C

0h 12h 24h

MVP

NC

NT

C NC C NC C NC C

0h 12h 24h

Tubulin

MVP

0h 12h 24h

NC NC NC CCC

NT

NC C

LRP

/MV

P

DO

X/

MV

P

D

B

DO

XD

OX

DO

X/

DA

PI

MVP

Tubulin

NC AdCM CNT 24h

NC NC AdCMAdCM C C

MV

PD

OX

/ M

VP

DO

X

NC AdCM NC

NT siMVP

DO

X

MVP

Tubulin

NT siMVPsiCtl

F

E

AdCM

MV

P

HG

Figure 4. DOX nuclear efflux is potentially dependent on MVP.(A,B) Left, intracellular localization of DOX visualized by confocal microscopy in non-cocultivated (NC) and cocultivated (C) cells at indicated times after DOX exposure in T47D (A)and MDA-MB436 (B) cells. Nuclei were labeled with DAPI (Scale bars, 10 µm). Right,corresponding quantification of fluorescence intensity (DOX) in the nuclei using Fiji software.Error bars represent the mean ± SEM of 3 independent experiments, statistically significant byANOVA, * p<0.05, ** p<0.01, ns for not significant.(C) Immunoblots for MVP in non-cocultivated (NC) and cocultivated (C) T47D (upper) andMDA-MB436 (lower) cells at indicated times after DOX exposure. Tubulin is shown as acontrol for equal protein loading.(D) Immunofluorescence staining visualized by confocal microscopy of MVP expression inT47D cells at indicated time after DOX treatment (scale bar, 20 µm).(E) Comparison of MVP expression in control T47D cells (NC) and after incubation withAdipocyte-conditioned medium (AdCM) cells after treatment, or not, with DOX as determinedby Western blot (upper, left) and immunofluorescence (right). Quantification of extracellularefflux (lower, right) and nuclear efflux (right, Immunofluorescence of DOX) (scale bar, 20 µm).(F) MVP protein levels were analyzed after transfection with MVP siRNA, control siRNA or innon-transfected cells by Western blot. Tubulin is shown as a control for equal protein loading.(G) Left, DOX labeling using confocal microscopy in MDA-MB436 cultivated alone (NC) orwith AdCM, in presence of siRNA against MVP, compared to non-transfected cells. Right,fluorescence quantification of DOX in the nuclei (scale bar, 20 µm). Error bars represent themean ± SEM of one experiment.(H) MDA-MB436 previously incubated with AdCM or DMEM (NC), transfected with siMVP,siControl or non-transfected were treated with DOX. 24h after DOX exposure, intracellularfluorescence of DOX was analyzed by flow cytometry.

A

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 200 400 600 800 1000

pa

rtic

les

/ m

illi

on

ce

lls

(E8

)

Particles size

NC NT

C NT

NC doxo

C doxo

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 200 400 600 800 1000

Pa

rtic

les

/ m

illi

on

ce

lls

(E8

)

Particles size

NC NT

C NT

NC doxo

C doxo

B

C D

NT

DOX

NT

DOX

Figure 5. Coculture stimulates vesicle secretions by tumor cells and these vesicles contain DOX.T47D cells previously cocultivated with adipocytes (C) or not (NC) were incubated in the presence (DOX) orin absence (NT) of DOX, and were then cultivated in media previously depleted in contaminating vesicles.The microvesicles (MV) and exosomes (Exo) contained in these conditioned media were then isolated bydifferential centrifugations and analyzed using NanoSight technology.(A) Representative analysis of the size distribution of exosomes for indicated conditions.(B) Representative analysis of the size distribution of MV for indicated conditions.(C) Ratio of the number of vesicles of C versus NC cells previously treated with DOX was represented. Errorbars represent the means ± SEM of 3 independent experiments statistically significant by ANOVA, * p<0.05relative to NC cells.(D) Exosomes (left) and MV (right) secreted by T47D cells subjected to DOX or under basal conditions weresubsequently coupled onto latex beads and analyzed by flow cytometry. Red lines represent vesicles fromcells treated with DOX. Black dotted lines represent vesicles from control cells.

A

B DMEM AdCMSoluble

factors ExosomesSoluble factors +

exosomes MV

MV

PD

OX

DO

X/

MV

P

C DOX quantification MVP quantification

Figure 6. Identification of the adipocyte secretions responsible for chemoresistance.(A) Experimental process for AdCM purification: AdCM previously depleted in cell debris was centrifugated at10,000g for 30 minutes to obtain MV (pellets) and soluble factors + exosomes (supernatant). The supernatantobtained was ultracentrifugated at 100,000g for 90 minutes in order to isolate exosomes (pellets) from solublefactors (supernatant).(B) Immunofluorescence staining using confocal microscopy of MVP expression in T47D cells incubated withthe different fractions obtained from AdCM and treated, or not, with DOX (scale bar, 20 µm).(C) Nuclear quantification of the DOX signal (left) and MVP (right) at 24h after DOX exposure, using Fijisoftware. Error bars represent the mean ± SEM of one experiment.

NC ND HFD

B ND HFD

Bo

dip

yT

ran

smis

sio

n

C

C

DO

XD

OX

/ D

AP

I

Viability

Figure 7. Adipocyte-mediated chemoresistance is amplified by obesity.(A) Left, representative weights of lean (ND) and obese (HFD) mice from one representative experiment. Right, experimentaldesign of 3D coculture experiments: Primary adipocytes were isolated from visceral adipose tissue, obtained from either lean(ND) or obese (HFD) mice and subsequently embedded in a collagen I matrix. Then, coculture experiments were performed, inwhich breast tumor cells were seeded in transwells. Breast tumor cells seeded in transwells with collagen I matrix withoutadipocytes, were used as NC cells.(B) Lipid accumulation using bodipy (green) and morphology (transmission) of primary adipocytes embedded in a collagen Imatrix, isolated from ND or HFD mice (scale bar, 100 µm).(C) Mean size of the adipocytes embedded in a collagen I matrix at indicated times, measured using Fiji software.(D) Viability assays after DOX exposure of different breast cancer cell lines cocultivated (C), or not (NC), with adipocytes fromlean (ND) or obese (HFD) mice. Graphs represent the ratio of C versus NC cells.(E) Left, intracellular localization of DOX using confocal microscopy in cells non-cocultivated (NC) or cocultivated (C) withadipocytes from ND or HFD mice at 24h after DOX exposure. Nuclei were labeled with DAPI (Scale bars, 10 µm). Right,corresponding quantification of fluorescence intensity (DOX) in the nuclei using Fiji software.Error bars represent the means± SEM of 3 independent experiments, statistically significant by Student’s t-test, * p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001, indicated p-value.

A

E

D

Figure 8. Schematic representation of the role of tumor surrounding adipocytes in breast cancerresistance to DOX. DOX enters tumor cells by passive diffusion and accumulates in the nucleus. Uponadipocyte stimulation, through both soluble factors and exosomes containing a high level of MVP, vaultparticles may promote a nuclear efflux. This is followed by an extracellular efflux of DOX, possibly mediatedby vesicles encapsulating DOX secreted by tumor cells. This adipocyte-mediated mechanism contributes to aMDR chemoresistance phenotype. In obesity, this mechanism is amplified leading to an increase in thechemoresistance observed.

131

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

133

En dépit de l’amélioration des techniques de dépistage et des progrès de la médecine, le cancer du sein

demeure une cause majeure de décès dans le monde (Fojo and Coley 2007). D’autre part, des données

épidémiologiques convaincantes ont mis en évidence que l’obésité représente un facteur de mauvais

pronostic global pour le cancer du sein, caractérisé notamment par un envahissement local et à

distance plus important, une diminution de la survie globale et de la survie sans maladie, une

augmentation des rechutes et une chimiorésistance (Ewertz et al 2011). Le sein étant composé

majoritairement d’adipocytes, une proximité importante est observée entre les adipocytes et les

cellules tumorales mammaires. Ainsi, au cours de mon doctorat, je me suis intéressée à l’effet de

l’interaction entre ces deux types de cellules dans la progression tumorale mammaire et la

chimiorésistance, ainsi que la régulation de ce dialogue dans un contexte d’obésité. Quand je suis

arrivée au laboratoire, l’équipe du Pr. Muller avait déjà identifié l’existence d’un dialogue

bidirectionnel entre les cellules tumorales et les adipocytes, à l’origine de modifications des deux

types cellulaires, ceci au profit de la tumeur. En effet, les cellules tumorales ont la capacité de modifier

les adipocytes en un nouveau phénotype que nous avons appelé CAAs pour « Cancer-Associated

Adipocytes ». Ces cellules modifiées vont en retour promouvoir l’invasion et la radiorésistance des

cellules tumorales (Dirat et al 2011) (Bochet et al 2011). Ludivine Bochet, alors doctorante dans

l’équipe a, par la suite, poursuivi la caractérisation de l’interaction entre adipocytes et cellules

tumorales. Elle a ainsi mis en évidence qu’une co-culture prolongée entre ces deux types de cellules

donne lieu à des modifications profondes des adipocytes, ceux-ci adoptant une morphologie

fibroblastique et que l’on a nommé ADFs pour « Adipocytes-Derived Fibroblasts ». Dans la continuité

de ces travaux, l’objectif de ma thèse a donc été, dans un premier temps, de participer à la

caractérisation du phénotype ADFs et à son rôle dans la progression tumorale, en m’axant

principalement sur la détermination de la (ou des) sécrétion(s) tumorale(s) responsable(s) de la

réorientation des adipocytes en fibroblastes et également sur l’évaluation de ce phénotype dans les

tumeurs humaines. Dans un deuxième temps, je me suis intéressée au rôle des adipocytes dans la

résistance à la chimiothérapie. J’ai alors étudié (i) l’effet potentiel des adipocytes sur la réponse d’un

large panel de lignées tumorales à différentes chimiothérapies conventionnelles, (ii) les mécanismes

moléculaires impliqués et (iii) la régulation de la chimiorésistance médiée par les adipocytes dans un

contexte d’obésité. L’ensemble de ces résultats montre que les adipocytes représentent des acteurs

importants dans la progression tumorale : ils peuvent, en effet, se réorienter en fibroblastes activés et

participent ainsi à la réaction desmoplasique et ils peuvent également promouvoir la résistance à la

chimiothérapie.

134

Rôle des adipocytes dans la réaction desmoplasique

Un nouveau phénotype d’origine adipocytaire : les ADFs.

Nous avons pu montrer que sous l’influence prolongée des cellules tumorales, les adipocytes adoptent

progressivement un phénotype de CAFs. Ce phénotype, que l’on a appelé ADF est notamment

caractérisé par : une morphologie fibroblastique, la perte importante des marqueurs adipocytaires

(Adipsine, Adiponectine, Ap2, LHS, Glut4), la sécrétion accrue de protéines de la matrice extra-

cellulaire (fibronectine et collagène I) et l’expression de FSP-1 (Fibroblast Specific Protein-1). Par

contre, les ADFs n’expriment pas α-SMA (α-Smooth Muscle Actin), qui représente un marqueur

classique de CAFs. Le fait que les ADFs expriment uniquement FSP-1 et non α-SMA, est en accord

avec l’hypothèse d’une population hétérogène au sein des CAFs et d’une expression de marqueurs

différents en fonction de leur origine cellulaire. Comme nous l’avons vu dans la première partie de

l’introduction de ce manuscrit, l’équipe de R. Kalluri a mis en évidence un différentiel d’expression de

certains marqueurs dans les CAFs, ainsi classés en 2 groupes majoritaires : ceux qui expriment FSP-1

mais qui n’expriment pas NG2, α-SMA et PDGFR-β et ceux qui expriment ces 3 marqueurs mais qui

n’expriment pas FSP-1 (Sugimoto et al 2006). De la même manière, dans un modèle syngénique de

cancer du sein et de l’ovaire, Kidd et al. ont montré que les BMSCs (Bone-Marrow Stem Cells) se

différencient préférentiellement en CAFs, exprimant FSP-1 et FAP et sont majoritairement localisés à

la périphérie de la tumeur. A l’inverse, les ADSCs se différencient en CAFs exprimant α-SMA et NG2

et sont retrouvés à proximité des vaisseaux sanguins (Kidd et al 2012). Il serait maintenant intéressant

de déterminer la proportion relative de CAFs α-SMA-/FSP-1+ par quantification de co-marquages sur

des coupes de tumeurs mammaires et d’identifier leur localisation et leur rôle dans la progression

tumorale. Etant donné l’abondance des adipocytes dans le sein, notre hypothèse est que la proportion

de CAFs α-SMA-/FSP-1+ provenant d’adipocytes serait quantitativement importante. Cette population

cellulaire est d’autant plus intéressante à étudier, que la protéine FSP-1 exerce un rôle important non

seulement dans la motilité cellulaire (qui pourrait expliquer le potentiel migratoire des ADFs) mais

aussi dans l’effet pro-métastatique des CAFs, son expression étant associée à un mauvais pronostic

dans les cancers (Grum-Schwensen et al 2005) (Rasanen and Vaheri 2010). En effet, nous avons pu

mettre en évidence que les ADFs favorisent l’invasion des cellules tumorales in vitro, en 2D ainsi

qu’en 3D (sphéroïdes). Il serait donc intéressant de co-injecter les ADFs avec des cellules tumorales à

des souris, afin de déterminer leurs capacités pro-métastatiques et d’observer leur localisation

intratumorale in vivo. D’autre part, afin de déterminer l’implication de FSP-1 dans l’effet pro-invasif

observé, une approche d’invalidation génique dans les ADFs pourrait être envisagée in vitro

(sphéroïdes mixtes composés de cellules tumorales et d’ADFs) et in vivo (co-injection de cellules

tumorales et d’ADFs). Initialement identifié dans le modèle du cancer du sein, le phénotype CAA a été

retrouvé dans d’autres modèles, tels que les cancers de l’ovaire, de la prostate invasif, du côlon et le

mélanome (Finley et al 2009) (Nieman et al 2013) (Kushiro et al 2012). Tout comme les CAAs, il est

135

probable que les ADFs soient retrouvés dans des cancers autres que celui du sein. Il serait donc

intéressant de les identifier dans d’autres modèles, tels que les cancers de la prostate et du côlon

(connus pour présenter une forte réaction desmoplasique) in vitro, in vivo et sur des coupes de tumeurs

humaines, afin de déterminer s’ils expriment le même phénotype que dans le cancer du sein

(expression de FSP-1+, α-SMA-, propriétés migratoires et invasives, sécrétion de protéines de la

MEC, effet sur les cellules tumorales), ainsi que leur proportion relative dans ces tumeurs.

Sécrétions tumorales à l’origine de la réorientation des adipocytes en ADFs

Nos résultats ont montré que l’apparition du phénotype ADFs dépend de la voie de signalisation

Wnt/β-caténine en réponse au ligand Wnt3a sécrété par les cellules tumorales. Ainsi, le blocage de

cette voie de signalisation par un inhibiteur (ICG-001) ou par un anticorps bloquant dirigé contre

Wnt3a, restaure partiellement l’accumulation de lipides et la morphologie arrondie des adipocytes,

perdues au cours de la co-culture. Ces résultats pourraient être confirmés in vivo sur des coupes de

tumeurs humaines, en étudiant l’expression de la voie Wnt/β-caténine sur les populations

fibroblastiques FSP-1+. D’autre part, nous avons mis en évidence que différentes lignées tumorales

mammaires expriment et sécrètent Wnt3a, suggérant que la réorientation des adipocytes en ADFs est

un mécanisme général. La voie de signalisation Wnt/β-caténine exerce un rôle pivot dans le

développement embryonaire, la migration cellulaire, le maintien du caractère « cellules-souches » et la

transition épithélio-mésenchymateuse (O'Toole et al 2013). Plusieurs études ont mis en évidence que

la dérégulation de cette voie de signalisation dans les tumeurs représente un critère d’agressivité et est

associée à un potentiel métastatique plus important, notamment pour les cancers du sein triple-négatifs

(Dey et al 2013). Il serait intéressant de comparer l’expression et la sécrétion de Wnt3a dans

différentes lignées cellulaires mammaires agressives ou non, afin de déterminer si les cellules

tumorales agressives sécrèteraient plus de Wnt3a et donc participeraient potentiellement plus à la

réorientation des adipocytes en ADFs. Cette hypothèse serait en accord avec le fait que le dialogue

entre cellules tumorales et adipocytes représente un véritable cercle vicieux initié par les cellules

tumorales. L’étude de l’expression et la sécrétion de Wnt3a ainsi que son invalidation dans le système

de co-culture utilisé pourraient également être réalisées dans d’autres modèles que le cancer du sein.

Les ADFs, la fibrose, l’inflammation et l’obésité ?

Nos travaux confirment que la fibrose, associée à la présence de fibroblastes activés (ADFs) sécrétant

des composants de la MEC, est un paramètre important dans la progression tumorale mammaire. A

notre connaissance, aucune étude n’a jusqu’à présent étudié la fibrose dans le TA mammaire de

patientes obèses dans un contexte normal et tumoral. Toutefois, des arguments de la littérature

suggèrent que l’obésité est associée à une fibrose plus importante, au moins dans le TA viscéral.

Concernant le TA mammaire, l’équipe de Philipp Scherer a mis en évidence que l’endotrophine

(fragment de clivage du collagène VI) est augmentée dans la glande mammaire des souris obèses,

136

suggèrant la présence d’une fibrose importante, au même titre que dans le TA viscéral (Park and

Scherer 2012). Au cours de ma thèse, j’ai eu l’opportunité de réaliser des marquages

d’immunohistochimie sur des coupes de tumeurs mammaires murines, provenant de l’injection

orthotopique de cellules murines M-Wnt ou E-Wnt à des souris normopondérales ou obèses (blocs

donnés par Stephen Hursting (Austin, Texas, USA)) (Dunlap et al 2012). Les résultats préliminaires

que j’ai obtenus suggèrent que les tumeurs de souris obèses présentent une fibrose (présence de fibres

de collagène I) plus importante que les tumeurs de souris normopondérales (résultats non montrés).

Ces résultats pourraient être confirmés sur des coupes de tumeurs humaines. La caractérisation

complète du TA mammaire dans un contexte tumoral permettrait de faire le lien entre obésité – fibrose

et progression tumorale. D’autre part, la caractérisation des ADFs dans un contexte d’obésité pourrait

être intéressante. L’étude de l’expression de FSP-1 et d’α-SMA sur des coupes de tumeurs de patientes

présentant des IMC différents permettrait de déterminer la présence et l’éventuelle amplification des

ADFs dans un contexte d’obésité. D’autre part, une étude très récente a mis en évidence que FSP-1 est

associé à une inflammation chronique et pourrait établir un lien entre inflammation et métastases

(Hansen et al 2015). Comme nous l’avons vu dans la deuxième partie de l’introduction, l’obésité est

associée à un état inflammatoire dit de « bas-bruit » dans le TA viscéral et dans le TA mammaire.

Ainsi, FSP-1 pourrait être augmenté dans un contexte d’obésité, ce qui pourrait, en partie, expliquer

les données épidémiologiques observées qui montrent que les femmes obèses présentent un cancer du

sein plus agressif, avec un envahissement local et à distance plus importants (Ewertz et al 2011). Notre

hypothèse est que les adipocytes représentent une source majeure de CAFs dans le cancer du sein,

d’autant plus dans un contexte d’obésité, où une hyperplasie des adipocytes est observée. Cette étude

est actuellement en cours de réalisation par Dr Charlotte Vaysse (chirurgienne à l’Institut Universitaire

du Cancer, affiliée à notre équipe) qui est actuellement en stage d’une année dans l’équipe d’Inger

Thune (Centre anti-cancéreux, Oslo, Norvège). Elle a déjà recensé une collection annotée de tumeurs

mammaires, provenant de femmes d’IMC différents et présentant tous les paramètres métaboliques

connus (30 tumeurs de patientes obèses et 30 tumeurs de patientes de poids normal), qui sont en cours

de caractérisation.

Enfin, au cours de mon doctorat, j’ai participé à la mise en place d’un système de co-culture en 3D

permettant d’étudier l’impact de l’obésité sur le dialogue adipocytes / cellules tumorales in vitro.

L’utilisation de ce système de co-culture permettra d’étudier in vitro les modifications des adipocytes

primaires induites par les cellules tumorales (expression de FSP-1, changements morphologiques,

diminution des marqueurs adipocytaires, activation de la voie Wnt/β-caténine) dans un contexte

normopondéral mais aussi d’obésité.

137

Rôle des adipocytes dans la chimiorésistance

Les adipocytes favorisent la chimiorésistance des cellules tumorales mammaires, via un

mécanisme d’efflux original.

Les résultats obtenus au cours de ma thèse montrent que les adipocytes protègent les cellules

tumorales de la cytotoxicité induite par des chimiothérapies conventionnelles, classiquement utilisées

dans le cancer du sein, telles que la doxorubicine, le paclitaxel et le 5-fluorouracile. Pour compléter

ces travaux, une autre molécule, le cyclophosphamide (très utilisé dans le traitement du cancer du sein)

pourrait également être utilisée. Le cyclophosphamide doit être métabolisé par le foie en mafosfamide

pour exercer son effet cytotoxique (Goldstein et al 1989) (Krasna et al 2003). Ainsi, le traitement au

mafosfamide des cellules tumorales incubées avec des adipocytes avant et après traitement permettrait

d’étendre nos résultats sur le rôle protecteur des adipocytes concernant un large panel de protocoles

cliniquement utilisés dans le traitement des cancers du sein.

Afin de déterminer le mécanisme d’action de la chimiorésistance accrue des cellules tumorales en

présence d’adipocytes, nous nous sommes axés sur la doxorubicine. Cette molécule présente

l’avantage d’avoir des propriétés intrinsèques de fluorescence, facilitant son suivi au sein des cellules.

Nos résultats ont mis en évidence que les adipocytes entraînent une diminution de la quantité de

doxorubicine dans le noyau et dans la cellule. Cette diminution de doxorubicine pourrait être liée à une

diminution de l’influx, une dégradation plus importante ou une augmentation de l’efflux de la drogue.

Un seul transporteur d’influx a été décrit, capable de prendre en charge la doxorubicine : le SLC22A16

(Huang and Sadee 2006). Cependant de par sa structure lipophile, la doxorubicine rentre

majoritairement dans la cellule par voie passive et les transporteurs d’influx n’exerceraient qu’un rôle

minoritaire dans la résistance observée. D’autre part, nous avons montré dans l’équipe, qu’un transfert

de lipides est observé entre les adipocytes et les cellules tumorales (YuanYuan Wang, résultats non

publiés). Nous pouvons imaginer, que la doxorubicine peut être stockée dans les gouttelettes lipidiques

des cellules tumorales co-cultivées avec les adipocytes, empêchant son action au niveau du noyau. En

réalisant un marquage bodipy (qui marque les lipides neutres) dans les cellules tumorales, j’ai pu

montrer que la doxorubicine n’est pas localisée au niveau de ces gouttelettes, ce qui réfute cette

hypothèse (résultats non montrés). Ainsi, l’hypothèse que les adipocytes favorisent l’efflux de

doxorubine, d’abord du noyau vers le cytoplasme, puis du cytoplasme vers le milieu extra-cellulaire,

reste l’hypothèse la plus convaincante, d’autant plus que l’efflux représente le mécanisme de

chimiorésistance majoritaire de la doxorubicine (Holohan et al 2013). D’autre part, nous avons

retrouvé la présence de doxorubicine dans les vésicules extra-cellulaire (voir chapitre suivant).

Nos résultats préliminaires suggèrent que la protéine MVP/LRP (Major Vault Protein / Lung

Resistance Protein) exercerait un rôle dans l’efflux nucléaire observé. Bien que le mécanisme d’action

de cette protéine ne soit pas bien caractérisé, il a été démontré que MVP favorise le transport nucléo-

138

cytoplasmique de drogues, via les particules voûtes (Scheffer et al 1995) (Scheper et al 1993)

(Izquierdo et al 1996a). Nos résultats ont mis en évidence une augmentation de l’expression de MVP

dans les cellules tumorales co-cultivées avec les adipocytes. De plus, des données préliminaires

suggèrent que l’invalidation de cette protéine (par des ARN interférents) restaure l’accumulation de

doxorubicine dans le noyau et ce processus est d’autant plus marqué dans les cellules incubées avec le

milieu conditionné d’adipocytes. Ces résultats très encourageants sont actuellement en cours de

confirmation. L’analyse de la viabilité des cellules co-cultivées ou non avec des adipocytes et traitées

à la doxorubicine devra également être réalisée après invalidation de MVP, afin de confirmer

l’implication de cette protéine dans la chimiorésistance médiée par les adipocytes. Comme nous

l’avons vu dans la 3ème partie de l’introduction de ce manuscrit, les voûtes sont composées

majoritairement de MVP mais elles contiennent également deux autres sous-unités (VPARP et TEP1)

et des ARNs (Lara et al 2011). Des études ont mis en évidence que les sous-unités VPARP et TEP1

sont également surexprimées dans les cellules présentant un phénotype MDR (Siva et al 2001). Bien

que le rôle de ces sous-unités ne soit pas bien caractérisé, il est possible qu’elles exercent un rôle

important dans le mécanisme observé. Ainsi, l’expression des autres composants des voûtes pourrait

être étudiée dans les cellules tumorales co-cultivées ou non avec les adipocytes, après traitement à la

doxorubicine. De plus, il serait intéressant d’étudier la localisation intra-cellulaire précise des voûtes

par microscopie électronique dans ces conditions. En effet, de manière surprenante, nous observons

une localisation plutôt nucléaire de la protéine MVP en immunofluorescence. Ces résultats sont en

désaccord avec les données de la littérature, qui ont rapporté la présence de MVP majoritairement dans

le cytoplasme (Eichenmuller et al 2003) (van Zon et al 2006) (Herlevsen et al 2007). Des expériences

sont actuellement en cours de réalisation au laboratoire afin de confirmer ces résultats, en comparant

différentes conditions de fixation. Les données relatives aux mécanismes d’action de MVP suggèrent

qu’en plus de favoriser le transport des drogues du noyau vers le cytoplasme, MVP pourrait

promouvoir l’internalisation des drogues dans des vésicules cytoplasmiques, qui expulsent ensuite les

drogues de la cellule par exocytose (Izquierdo et al 1996a) (Kolli et al 2004) (de Moraes et al 2013)

(Meschini et al 2002). Parmi les organelles ayant un rôle dans la résistance aux drogues, un intérêt

croissant a été porté aux lysosomes (Groth-Pedersen and Jaattela 2013). Pendant longtemps considérés

comme de simples organelles à l’origine de la dégradation de macromolécules, ils sont maintenant

décrits comme capables de participer au processus MDR, par séquestration et/ou par efflux des

drogues dans l’espace extra-cellulaire (Groth-Pedersen and Jaattela 2013) (Federici et al 2014). En

effet, les drogues peuvent diffuser dans les vésicules acides, qui peuvent ainsi convertir les drogues en

formes chargées, empêchant leur diffusion à travers les membranes. Dans l’équipe, nous avons montré

que les cellules tumorales co-cultivées avec les adipocytes sont métaboliquement remaniées, à

l’origine d’une augmentation de la production de lactacte et à la diminution du pH (YuanYuan Wang,

résultats non publiés). Parmi les compartiments intra-cytoplasmiques, plusieurs sont connus pour avoir

un pH acide, tels que l’appareil de Golgi (pH 6.2-6.4), les endosomes précoces (pH 6–6.5), les

139

endosomes tardifs (pH 5.2–5.8) et les lysosomes (pH 4.8–5.2) (Larsen et al 2000). De plus, il a été

rapporté que MVP peut favoriser la séquestration des drogues, notamment la doxorubicine, dans les

lysosomes (Herlevsen et al 2007). Ainsi, la doxorubicine pourrait être séquestrée de manière

importante dans des organelles intra-cytoplasmiques (lysosomes, endosomes) des cellules tumorales

co-cultivées avec les adipocytes, empêchant son action au niveau du noyau. Il serait intéressant de

comparer l’expression et la co-localisation de LAMP-1 (Lysosomal-Associated Membrane Protein)

avec la doxorubicine dans les cellules tumorales co-cultivées ou non avec les adipocytes. Dans un

deuxième temps, l’invalidation de MVP pourrait être réalisée dans ces conditions, afin de déterminer

son implication fonctionnelle dans la séquestration de la doxorubicine dans les lysosomes dans nos

conditions expérimentales.

Hormis l’efflux nucléaire observé, les adipocytes induisent également un efflux cellulaire de la drogue.

Nos résultats suggèrent que l’efflux cellulaire médié par les adipocytes semble indépendant des 3

pompes d’efflux majoritairement impliquées dans la chimiorésistance (P-gp, MRP1 et BCRP). Ces

résultats sont en accord avec le fait que MVP est souvent surexprimé dans des lignées qui n’expriment

pas ces transporteurs ABC classiques (Hu et al 2002) (Meschini et al 2002). Cependant, il a été

rapporté dans les mécanismes de résistance de MVP, que cette protéine peut dans certains cas coopérer

avec les transporteurs ABC pour faire augmenter l’efflux des drogues hors de la cellule (Mossink et al

2003). Au cours de nos travaux, nous n’avons étudié que les transporteurs ABC majoritairement

impliqués dans la chimiorésistance. Ainsi, l’expression des autres transporteurs ABC connus pour

exercer un rôle dans la résistance pourrait être évaluée dans les cellules tumorales co-cultivées ou non,

notamment ABCA3, ABCB4, ABCB5 et ABCD8 capables de prendre en charge la doxorubicine (Lal

et al 2010) (Jamieson and Boddy 2011) (Mossink et al 2003).

Toutefois, il semble que l’implication des transporteurs ABC dans l’efflux cellulaire médié par les

adipocytes soit à exclure, car nos résultats préliminaires montrent d’une part une très faible expression

de ces pompes dans nos modèles cellulaires et suggèrent d’autre part un autre mécanisme d’efflux de

la doxorubicine via sa séquestration dans des vésicules extra-cellulaires (VE) (exosomes,

microvésicules). En effet, nous avons pu montrer que les cellules tumorales co-cultivées avec les

adipocytes et traitées à la doxorubicine sécrétaient plus de VE que les cellules non co-cultivées et, de

manière intéressante, les VE sécrétées contiennent de la doxorubicine. Ces résultats confirment que la

doxorubicine est bien effluée de la cellule et non dégradée. La comparaison de la quantité de

doxorubicine contenue dans les VE de cellules co-cultivées ou non est actuellement en cours de

réalisation au laboratoire. Nos résultats préliminaires, basés sur l’étude de la taille des VE et sur les

résultats préalables trouvés dans l’équipe (Ikrame Lazar, résultats non publiés), suggèrent que les deux

types majoritaires de VE, exosomes et microvésicules, seraient impliqués dans l’efflux observé

(augmentation par la co-culture et capacité de stocker la doxorubicine), en accord avec des données de

la littérature. En effet, plusieurs études ont mis en évidence que les MV peuvent contenir de la

140

doxorubicine et ainsi permettre son expulsion de la cellule (Gong et al 2013) (Shedden et al 2003)

(Jorfi and Inal 2013). D’autre part, les exosomes ont également été impliqués dans l’encapsulation et

l’efflux de cisplatine (Azmi et al 2013) (Federici et al 2014). Cependant, des expériences

supplémentaires sont nécessaires afin de confirmer la nature de ces VE (caractérisation de la densité,

de l’expression de marqueurs de ces VE (flotilline-1, tétraspanines, Alix…) et de leur morphologie

(microscopie électronique)). Ces deux types de vésicules sont différenciés par leur taille, leurs

fonctions biologiques et aussi par leur origine cellulaire(S et al 2013)(S et al 2013)(S et al 2013)(S et

al 2013)(S et al 2013) . A l’inverse des MV, qui sont formées par bourgeonnement de la membrane

plasmique, les exosomes proviennent de la voie d’endocytose, libérés par la fusion des endosomes

tardifs multivésiculaires ou MVB (Multivesicular bodies) avec la membrane plasmique (figure 36)

(Kowal et al 2014). Il a été montré que les endosomes peuvent soit fusionner avec la membrane

plasmique soit avec les lysosomes, cependant, les mécanismes impliqués ne sont pas encore bien

caractérisés (Kowal et al 2014). Il est possible, qu’après avoir été expulsée du noyau, la doxorubicine

soit encapsulée dans les endosomes, qui deviendront des MVB et pourront soit fusionner avec la

membrane plasmique, à l’origine de la libération des exosomes dans le milieu extra-cellulaire, soit

fusionner avec les lysosomes (Colombo et al 2014). Peu d’études ont déterminé si la formation de

lysosomes et la sécrétion d’exosomes représentent des mécanismes contradictoires ou s’ils agissaient

en symbiose pour promouvoir la résistance aux drogues (Safaei et al 2005). La biogenèse et la

sécrétion des exosomes (de la formation des vésicules intra-luminales à la libération des exosomes

dans l’espace extra-cellulaire) impliquent plusieurs molécules, telles que le complexe ESCRT

(Endosomal Sorting Complex Required for Transport), les tétraspanines, les RAB GTPases, les

SNAREs (Soluble N-éthylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptors), les ions calcium

et le céramide (figure 36) (Kowal et al 2014) (Raposo and Stoorvogel 2013). L’implication du

céramide dans la biogenèse des exosomes pourrait expliquer pourquoi les cellules traitées à la

doxorubicine libèrent plus d’exosomes que les cellules non traitées (Eytan 2005) (Trajkovic et al

2008). En effet, un des mécanismes d’action de la doxorubicine est de favoriser la production de

céramide, aboutissant à la mort cellulaire (Liu et al 2008).

La biogénèse des MV à partir de la membrane plasmique reste peu caractérisée à ce jour. Il a été

rapporté que ce processus pourrait dépendre de la machinerie Actine-Myosine, de l’action des petites

GTPases, telles qu’ARF6 (ADP-ribosylation factor 6), du complexe ESCRT (Alix) et aussi des ions

calcium ce qui suggère que la libération des exosomes et des MV pourrait dépendre de facteurs

communs. Ainsi, l’inhibition de la libération de la sécrétion des VE pourrait être envisagée, en

bloquant par exemple RAB27a et/ou RAB27b ou les tétraspanines (ARN interférence) dans les

cellules tumorales co-cultivées ou non avec les adipocytes dans le but de chimiosensibiliser les

cellules à la doxorubicine (figure 36) (Azmi et al 2013) (Kowal et al 2014) (Raposo and Stoorvogel

2013) (S et al 2013). Dans un second temps, il serait intéressant de déterminer si la protéine MVP

141

favorise la séquestration des drogues dans ces vésicules, faisant un lien direct entre l’efflux nucléaire

et l’efflux cellulaire observés, en comparant la sécrétion de VE de cellules invalidées pour MVP ou

non dans notre système de co-culture.

Figure 36. Mécanismes de biogenèse et de sécrétions des exosomes et des MV. La biogenèse des exosomes implique la formation des endosomes en MVB, qui pourra libérer les exosomes dans l’espace extra-cellulaire par fusion des MVB avec la membrane plasmique. Ces mécanismes sont dépendants du complexe ESCRT, des protéines RAB et des protéines SNAREs. Les MV sont libérées dans l’espace extra-cellulaire par bourgeonnement de la membrane plasmique (d’après (Kowal et al 2014)).

En conclusion, notre hypothèse est que les adipocytes favorisent la surexpression de MVP dans les

cellules tumorales mammaires, ce qui induit un efflux nucléaire plus important de doxorubicine et puis

sa séquestration dans des compartiments acides. Ces vésicules intra-cytoplasmiques peuvent fusionner

avec la membrane plasmique afin de libérer des VE contenant des quantités importantes de

doxorubicine, à l’origine de l’efflux cellulaire et de la chimiorésistance observés. Ce mécanisme

d’efflux original a déjà été rapporté dans différents modèles pour diverses chimiothérapies (Shedden et

al 2003) (Safaei et al 2005).

Identification des sécrétions adipocytaires responsables de la chimiorésistance.

Nos résultats ont mis en évidence que le milieu conditionné d’adipocytes (AdMC) reproduit les effets

de la co-culture sur la chimiorésistance, en termes de viabilité, d’efflux cellulaire, d’efflux nucléaire de

la doxorubicine et de la surexpression de MVP. Ces résultats suggèrent que ce sont les sécrétions

adipocytaires qui sont directement responsables de l’effet chimioprotecteur des adipocytes et non des

modifications épigénétiques des cellules tumorales induites par les adipocytes co-cultivés. Pour

142

déterminer la nature des sécrétions adipocytaires responsables de la chimiorésistance observée, nous

avons séparé les facteurs solubles, les MV et les exosomes de l’AdMC, avant d’incuber les cellules

tumorales avec ces différentes fractions. Nos résultats préliminaires suggèrent que seule la fraction

contenant les exosomes et les facteurs solubles reproduit l’effet du milieu conditionné sur la

surexpression de MVP et l’efflux nucléaire observé. Des expériences supplémentaires sont nécessaires

afin de confirmer le rôle des exosomes et des facteurs solubles dans la chimiorésistance médiée par les

adipocytes (viabilité et efflux cellulaire par FACS). L'étude de l'exoprotéome adipocytaire par

spectrométrie de masse a permis d'identifier la protéine MVP. En effet, par une approche de "spectral

counting" et sur 5 expériences indépendantes, nous avons montré la présence extrêmement abondante

de cette protéine dans les exosomes sécrétés par les adipocytes (Ikrame Lazar, résultats non publiés). Il

serait donc intéressant de vérifier que MVP contenu dans les exosomes adipocytaire est bien transférée

aux cellules tumorales. Pour cela, une approche SILAC (Stable isotope labeling by amino acid in cell

culture), mise au point dans l’équipe pourrait être intéressante (Ikrame Lazar, résultats non publiés).

Cette technique consiste à marquer les protéines adipocytaires à l’aide d’acides aminés contenant des

isotopes lourds, puis à purifier les exosomes sécrétés par ces adipocytes. Les cellules tumorales,

préalablement incubées avec de la doxorubicine, seraient ensuite traitées par ces vésicules modifiées et

la présence de ces protéines « lourdes » pourra ainsi être analysée dans ces cellules par spectrométrie

de masse. Le fait que les exosomes d’adipocytes seuls n’exercent pas d’effet sur l’efflux nucléaire de

la doxorubicine suggère une action synergique de ces vésicules et des facteurs solubles dans l’effet

observé. Pour le confirmer, différentes cinétiques d’incubation pourraient être réalisées : les cellules

tumorales pourraient être d’abord cultivées avec les exosomes seuls, puis avec les facteurs solubles et

inversement. Il sera intéressant de déterminer quel(s) facteur(s) soluble(s) active la MVP, présente

dans les exosomes d’adipocytes. Certaines modifications post-traductionnelles ont été rapportées,

telles que des phosphorylations et des acétylations (Lara et al 2011) (Kolli et al 2004) (Kim et al

2006). En particulier, sous l’influence de l’EGF, Src peut phosphoryler MVP sur une tyrosine, à

l’origine de son activation (Kolli et al 2004) (Kim et al 2006). Il est fortement probable que de

nombreuses modifications post-traductionnelles de MVP existent, mais ne sont pas encore élucidées.

D’autre part, la protéine MVP exerce son effet via les particules voûtes, qui sont composées de

différentes sous-unités. L’analyse protéomique des exosomes d’adipocytes suggère qu’hormis MVP,

la sous-unité TEP-1 (mais pas VPARP) est également retrouvée (Ikrame Lazar, résultats non publiés).

Il serait intéressant de déterminer si la sous-unité VPARP est présente dans les facteurs solubles.

Ainsi, la combinaison exosomes et facteurs solubles permettrait d’apporter tous les composants de la

particule voûte entière, responsable du transport nucléo-cytoplasmique de la doxorubicine. De plus, les

autres sous-unités de la voûte peuvent également être soumises à des régulations post-traductionnelles,

pouvant également jouer un rôle (Szaflarski et al 2013). La formation de la particule voûte requiert

différentes sous-unités de nature différente. Ainsi, la localisation intra-cellulaire des différentes sous-

unités, ainsi que des régulations qui ne sont pas encore identifiées, doivent probablement jouer un rôle

143

important (van Zon et al 2002). Il serait intéressant d’étudier ces régulations dans notre système de co-

culture et de visualiser les différentes sous-unités dans la cellule, par microscopie confocale.

Il existe peu d’études portant sur le rôle des exosomes dans la chimiorésistance. Cependant, un

transfert, via les exosomes de protéines impliquées dans la chimiorésistance (P-gp, MRP1) a déjà été

démontré dans différents modèles (Bebawy et al 2009) (Pokharel et al 2014) (Lu et al 2013). Le rôle

des exosomes du stroma dans la chimiorésistance a récemment été montré. En effet, les résultats

obtenus suggèrent que les exosomes provenant de cellules stromales (fibroblastes activés) peuvent

conférer une chimio et une radiorésistance aux cellules tumorales mammaires (Boelens et al 2014). En

conclusion, les résultats préliminaires que nous avons obtenus suggèrent un rôle important des

exosomes sécrétés par les adipocytes. Une hypothèse originale serait le transfert de MVP par ces

vésicules et qui agirait en synergie avec d’autres partenaires sécrétés par les adipocytes mais non

associés aux VE.

La chimiorésistance observée est amplifiée dans un contexte d’obésité

L’obésité est maintenant reconnue comme étant un facteur de mauvais pronostic dans le cancer du

sein, notamment en termes de chimiorésistance et de rechutes (Ewertz et al 2011). En utilisant un

modèle de co-culture original en 3D comprenant cellules tumorales et adipocytes primaires isolés à

partir du TA périgonadique de souris normopondérales ou obèses, nous avons mis en évidence que

l’effet chimioprotecteur des adipocytes sur les cellules tumorales mammaires est amplifié dans un

contexte d’obésité. Cet effet est dû à une amplification de l’efflux nucléaire de la doxorubicine, ce qui

suggère que le mécanisme de chimiorésistance précédemment identifié est amplifié dans des

conditions d’obésité. Des expériences supplémentaires sont nécessaires afin de confirmer ce

mécanisme, notamment l’étude de la surexpression et de l’invalidation de MVP dans les cellules

tumorales co-cultivées avec les adipocytes provenant de souris obèses. La purification des VE

provenant de cellules tumorales co-cultivées avec des adipocytes primaires de souris normopondérales

et obèses ainsi que leur quantification et la détermination de la quantité de doxorubicine encapsulée

dans ces VE permettrait de comprendre leur rôle dans cet effet. Dans un second temps, l’implication

des VE pourra être confirmée par des tests de chimiosensibilisation des cellules par l’inhibition de la

sécrétion des VE en ciblant par exemple RAB27. Il serait également intéressant de déterminer la

quantité de MVP dans les exosomes purifiés à partir d’adipocytes obèses, en les comparant à des

adipocytes provenant de souris normopondérales et d’évaluer l’effet de la fraction contenant les

exosomes et les facteurs solubles d’adipocytes (obèses ou non) sur l’efflux nucléaire de doxorubicine.

D’autre part, l’étude de l’expression de MVP sur des coupes de tumeurs mammaires de patientes

présentant des IMC différents, pourrait confirmer le mécanisme observé, in vivo. Cette étude est

actuellement en cours de réalisation par Dr. Charlotte Ngo (chirurgienne dans le service de chirurgie

144

mammaire de l’hôpital Georges Pompidou, en collaboration avec le service d’Anatomo-pathologie de

ce même hôpital, Paris).

Dans notre système de co-culture, les adipocytes utilisés sont isolés à partir du TA viscéral de souris

normopondérales ou obèses. Il serait intéressant de reproduire ces expériences en utilisant des

adipocytes provenant du TA mammaire de patientes de poids normal et obèses. D’autre part, Crawford

et Al. ont isolé des CAFs de tumeurs chimiosensibles et à l’inverse, de tumeurs résistantes aux anti-

VEGF. De manière intéressante, ils ont pu montrer qu’à la différence des fibroblastes normaux ou des

CAFs provenant de tumeurs sensibles, les CAFs provenant de tumeurs résistantes pouvaient

promouvoir la croissance in vivo de tumeurs sensibles, même en présence d’anti-VEGF (Crawford et

al 2009). La purification d’adipocytes provenant de patientes obèses, ou non, qui ont présenté une

chimiorésistance ou une chimiosensibilité à un traitement à base d’anthracyclines pourrait permettre

d’étudier le rôle des adipocytes sur le long terme dans la protection à la chimiothérapie.

Conclusion générale

Les travaux effectués lors de mon doctorat ont permis d’identifier des nouvelles fonctions des

adipocytes péri-tumoraux dans la progression tumorale mammaire. D’une part, sous l’action des

sécrétions tumorales, les adipocytes se réorientent progressivement en cellules fibroblastiques,

présentant des caractéristiques de CAFs, telles que des propriétés migratoires et invasives, la sécrétion

de protéines de la MEC et l’expression de FSP-1. L’apparition de ce nouveau phénotype adipocytaire

est liée à la réactivation de la voie Wnt/β-caténine, sous l’influence de la sécrétion tumorale de Wnt3a.

De manière intéressante, les ADFs sont retrouvés dans les tumeurs humaines mammaires et favorisent,

de manière importante, l’invasion des cellules tumorales. Ces résultats suggèrent que les adipocytes

peuvent être une source de CAFs et participent ainsi à la réaction desmoplasique, fréquemment

retrouvée dans les tumeurs humaines mammaires.

D’autre part, nous avons mis en évidence que les adipocytes protègent les cellules tumorales

mammaires de l’action de la chimiothérapie, en favorisant son expulsion hors du noyau puis hors de la

cellule, par un mécanisme original, qui impliquerait la protéine MVP et des vésicules extra-cellulaires.

De manière intéressante, l’induction de ce mécanisme de chimiorésistance semble provenir des

exosomes adipocytaires, qui agiraient en synergie avec des facteurs solubles adipocytaires,

actuellement non identifiés. Enfin, nous avons également montré que la chimiorésistance médiée par

les adipocytes est amplifiée dans un contexte d’obésité.

Ces travaux pourraient expliquer, au moins en partie, le mauvais pronostic des cancers du sein chez les

patientes obèses et ouvrent donc, à plus long terme, des perspectives thérapeutiques intéressantes,

destinées à interrompre le dialogue délétère entre adipocytes et cellules tumorales, en particulier chez

les patientes obèses.

145

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175

ANNEXE

Microenvironment and Immunology

Cancer-Associated Adipose Tissue Promotes Breast CancerProgression by Paracrine Oncostatin M and Jak/STAT3Signaling

Lore Lapeire1, AnHendrix2, Kathleen Lambein3,MiekeVanBockstal3, Geert Braems4, RudyVanDenBroecke4,Ridha Limame5, Pieter Mestdagh6, Jo Vandesompele6, Christian Vanhove7, Dawn Maynard8,Camille Lehu�ed�e9, Catherine Muller9, Philippe Valet10, Christian P. Gespach11, Marc Bracke2,Veronique Cocquyt1, Hannelore Denys1, and Olivier De Wever2

AbstractIncreasing evidence supports the critical roles played by adipose tissue in breast cancer progression. Yet, the

mediators andmechanismsarepoorly understood.Here,we showthatbreast cancer–associatedadipose tissue fromfreshly isolated tumors promotes F-actin remodeling, cellular scattering, invasiveness, and spheroid reorganizationof cultured breast cancer cells. A combination of techniques, including transcriptomics, proteomics, and kinomicsenabled us to identify paracrine secretion of oncostatin M (OSM) by cancer-associated adipose tissue. Specifically,OSM, expressed byCD45þ leucocytes in the stromal vascular fraction, inducedphosphorylationof STAT3 (pSTAT3-)Y705 and S727 in breast cancer cells and transcription of several STAT3-dependent genes, including S100 familymembers S100A7, S100A8, and S100A9. Autocrine activation of STAT3 in MCF-7 cells ectopically expressing OSM-induced cellular scattering and peritumoral neovascularization of orthotopic xenografts. Conversely, selectiveinhibition of OSM by neutralizing antibody and Jak family kinases by tofacitinib inhibited STAT3 signaling,peritumoral angiogenesis, and cellular scattering. Importantly, nuclear staining of pSTAT3-Y705 identified at thetumor invasion front in ductal breast carcinomas correlates with increased lymphovascular invasion. Our workreveals the potential of novel therapeutic strategies targeting the OSM and STAT3 axis in patients with breastcancer harboring nuclear pSTAT3-Y705. Cancer Res; 74(23); 6806–19. �2014 AACR.

IntroductionCancer progression is the result of a complex interaction

between the cancer cells and their microenvironment (1, 2).

Breast tumors are surrounded by type I collagen-rich tissue,including fibroblasts, blood and lymph vessels, and adiposetissue. Insights in the function of adipose tissue have shiftedfrom a static organ for energy storage to a dynamic one,excreting growth factors, cytokines, and hormones, identifyingthe adipose tissue as an active player in the communicationbetween the tumor and its microenvironment (3).

Human adipose tissue–derived adipocytes, stem cells, stro-mal cells, CD34þ progenitor cells, and macrophages stimulategrowth, migration, and invasion of breast cancer cells bysecretion of CCL5 (Rantes), IL6, IL8, and PAI-1 (4–7). A mousemammary cancer model revealed tumor progression throughsecretion of adipocyte-derived type VI collagen (8). Dirat andcolleagues (9) showed that mature adipocytes promote theinvasiveness of estrogen receptor a (ERa)–positive and�negative breast cancer cells. IL6-mediated induction of epi-thelial-to-mesenchymal transition (EMT) was identified as keycomponent of adipocyte-enhanced invasiveness of breast can-cer cells (9). Zhang and colleagues (10) reported stimulation oftumor growth and angiogenesis by recruitment of adiposestromal cells and endothelial cells in a breast cancer mousemodel. All together, the interaction between breast cancer cellsand associated adipose tissue is a multifactorial phenomenondriving breast cancer progression.

STATs are important in cytokine receptor signaling. SeveralSTATs contribute to normal mammary gland development

1Department of Medical Oncology, Ghent University Hospital, Ghent,Belgium. 2Laboratory of Experimental Cancer Research, Department ofRadiation Oncology and Experimental Cancer Research, Ghent UniversityHospital, Ghent, Belgium. 3Department of Pathology, Ghent UniversityHospital, Ghent, Belgium. 4Department of Gynaecology, Ghent UniversityHospital, Ghent, Belgium. 5Center for Oncological Research (CORE),University of Antwerp, Antwerp, Belgium. 6Center for Medical Genetics,Ghent University Hospital, Ghent, Belgium. 7Institute Biomedical Technol-ogy,GhentUniversityHospital, Ghent, Belgium. 8MedicalGeneticsBranch,National HumanGenome Research Institute, Bethesda, Maryland. 9Institutde Pharmacologie et de Biologie Structurale, Universit�e de Toulouse, UPS,Toulouse, France. 10Institut National de la Sant�e et de la RechercheM�edicale, INSERM U1048, Universit�e Paul Sabatier, Toulouse, France.11Institut National de la Sant�e et de la Recherche M�edicale, INSERMU938,Molecular and Clinical Oncology, Universit�e Paris VI Pierre et Marie Curie,Paris, France.

Note: Supplementary data for this article are available at Cancer ResearchOnline (http://cancerres.aacrjournals.org/).

Corresponding Author: Olivier De Wever, Laboratory of ExperimentalCancer Research, Department of Radiation Oncology and ExperimentalCancer Research, Ghent University Hospital, De Pintelaan 185, GHENT,Belgium B-9000 GENT, Belgium. Phone: 32-9-332-3073/3008; Fax: 32-9-332-4991; E-mail: [email protected]

doi: 10.1158/0008-5472.CAN-14-0160

�2014 American Association for Cancer Research.

CancerResearch

Cancer Res; 74(23) December 1, 20146806

on March 26, 2015. © 2014 American Association for Cancer Research. cancerres.aacrjournals.org Downloaded from

Published OnlineFirst September 24, 2014; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-14-0160


and cellular response during pregnancy, lactation, and invo-lution. However, recent studies revealed their seemingly con-tradictory participation in breast cancer progression (11).STAT3 is frequently activated in human breast cancer andcorrelates with poor prognosis (12).

Materials and MethodsCell lines and transfectionsMCF-7, T47D, SKBR3, and MDA MB 231 cell lines were

obtained from the ATCC (http://www.lgcstandards-atcc.org).Cells were maintained in DMEM supplemented with 10% fetalcalf serum, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin(Invitrogen), and 2.5mg/mL fungizone (Bristol-Meyers Squibb).All cell lines have been validated in-house by short tandemrepeat profiling using the Cell ID System (Promega) accordingto the manufacturer's instructions. Upon receipt, cells werepassaged and stored in liquid nitrogen. Every 6 months, a newaliquot of cells was resuscitated and used for experimentation.Every month cell cultures were tested for mycoplasma con-tamination by using the MycoAlert Plus Kit (Lonza).MCF-7 cells secreting turbo green fluorescent protein

(tGFP)–oncostatin M (OSM) fusion protein (MCF-7–OSM)were generated by FugeneTransfection (Promega). tGFP–OSMcDNA was purchased at Origene, Inc.

Antibodies and reagentsPrimary and secondary antibodies are described in Supple-

mentary Materials and Methods. Recombinant human (rh)OSM, (rh)IL6, (rh)IL8, (rh)LIF, (rh)G-CSF and their respectiveneutralizing monoclonal antibodies were from R&D Systems.Tofacitinib citrate was purchased at Bio-Connect Diagnostics.A neutralizing (n)OSM antibody, Akt (GSK2142795) and MEKinhibitors (GSK1120212 or trametinib) were kindly provided byGlaxoSmithKline (13).

Conditioned medium of cancer-associated adiposetissue, isolation of tumor-associated adipocytes, andstromal vascular fractionCAAT (cancer-associated adipose tissue) was obtained from

patientswith breast cancer undergoing amastectomy atGhentUniversity Hospital (Ghent, Belgium) in accordance with thelocal ethics committee (Supplementary Table S1). Preparationof CMCAAT (conditioned medium of cancer-associated adiposetissue) and separation of adipose tissue in tumor-associatedadipocytes (TAA) and stromal vascular fraction (SVF) andisolation of CD45þ and CD31þ fractions from SVF aredescribed in Supplementary Materials and Methods. Supple-mentary Fig. S1 demonstrates the use of CMCAAT throughoutthe article.

Functional assaysExperimental set-up for studying morphologic changes

induced by CAAT or CMCAAT is described in SupplementaryMaterials andMethods. Factor shapewas calculated as (perim-eter)2/(4 � p � area) for quantification.MCF-7, T47D, and MDA MB 231 type I collagen gel invasion

assays are performed and quantified as described in Supple-mentary Materials and Methods and ref. 14.

Matrigel invasion of MDA MB 231 and migration of MCF-7and SKBR3 cells were performed using xCELLigence RTCA DPinstrument (ACEA Biosciences; ref. 15).

Protein analysisSamples for Western blot analysis were prepared, run, and

immunostained as described in ref. 16.Human phospho-kinase antibody array (R&D Systems) was

used to detect relative phosphorylation levels of 44 kinases.OSM concentrations in CMCAAT were measured with a humanOSM ELISA Kit (Sigma-Aldrich). Scanning densitometry wascarried out with the Quantity One Program (Bio-Rad).

Microarray analysisTotal RNA was isolated using the Nucleospin RNA II Kit

(Macherey-Nagel), including DNAse I treatment. Quality con-trol was performed using Agilent 2100 Bioanalyser (AgilentTechnologies). Total RNA (0.5 mg) was processed and analyzedon Human GE Agilent 4 � 44 K microarrays. Four biologicsamples were studied. Data can be found on GEO (GEOaccession number GSE58574).

Quantitative real-time PCRRNA was isolated using the RNeasy Plus Universal Kit

(Qiagen), including DNAse I treatment. cDNA synthesis andSYBR Green I RT-qPCR were carried out as described in ref. 17.Prime PCR assays for S100A7, S100A12, OSM, NTN4, LRG1, LIFR,andGP130were purchased at Bio-Rad. Other primer sequencesare described in Supplementary Table S2. The RNA qualityindex (RQI > 8) was assessed using Experion software (version3.2; Bio-Rad).

Mass spectrometryCMCAAT samples were run on NuPAGE 4% to 20% Bis-Tris

gradient gels (Invitrogen) in denaturating SDS buffer, stainedwith 0.5% Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad) in 40%methanoland 10% acetic acid for 20 minutes, and destained. Gel bandswere processed and analyzed by LS/MS-MS as described inSupplementary Materials and Methods and ref. 16.

Animal studiesAnimal studies were approved by the Local Ethics Commit-

tee of Ghent University Hospital (ECD 09/32). Immunode-ficient mice were orthotopically injected with 1 � 106 cancercells. After 4 weeks, the mice were sacrificed and tumors wereresected for IHC. Details can be found in SupplementaryMaterials and Methods.

Patient samples and IHCClinical data and paraffin-embedded primary breast carci-

noma samples were collected at Ghent University Hospital(Supplementary Table S3). Written informed consent wasobtained according to the recommendations of the local ethicscommittee. To evaluate nuclear pSTAT3-Y705, we consideredan intensity score that was semiquantitative scaled as score 0,weak or absent nuclear staining; score 1, between 5% and 30%nuclear staining; score 2, more than 30% nuclear staining.Three observers quantified independently.

Paracrine Oncostatin M Promotes Breast Cancer Progression

www.aacrjournals.org Cancer Res; 74(23) December 1, 2014 6807




Statistical analysisStatistical analyses were performed using IBM SPSS Statis-

tics 21.0 software. Continuous data were analyzed with theMann–Whitney test (mean � SD) or the Student t test (dif-ference of means and 95% confidence interval) in which

appropriate. Spearman correlation was used to assess correla-tions. Categorical datawere analyzedwith the Fisher exact test.All data are representative of at least three independentexperiments. Statistical tests were two-sided, P values lessthan 0.05 were considered statistically significant.

Figure 1. CAAT stimulates invasion. A, hematoxylin and eosin staining of MCF-7 spheroids cultured in CAAT or collagen and quantification by factor shape.B, phase-contrast images of MCF-7 cells treated with control medium or CMCAAT for 48 hours. Afterwards, CMCAAT was replaced by control mediumfor 48 hours (rescue). Images represent one of 25 experiments. C, confocal images of F-actin stained control- or CMCAAT-treated MCF-7 cells (left;scale bar, 15 mm) and quantification of seven representative cells for each condition by factor shape (right). Data, one of three experiments. D, phase-contrastimages of MCF-7 cells on type I collagen gel; arrows, invasive extensions (left) and quantification (right). Data, one of four experiments. E, graph representingmigration of MCF-7 cells and quantification by calculating the slope increment of three replicates for each condition. Graph, one of three experiments;�, P ¼ 0.021. F, phase-contrast images of control- or CMCAAT-treated T47D cells. Images, one of five experiments. G, T47D cells on type I collagengel; arrows, invasive extensions (left) and quantification (right). Data, one of three experiments. H, phase-contrast images of MDA MB 231 cells treated withcontrolmediumorCMCAAT for 48 hours. Images, one of four experiments. I, hematoxylin and eosin staining ofMDAMB231Transwell collagen invasion assay.Double-head arrows, distance between front of infiltrating cells and bottom of collagen gel. Single-head arrow, single cells reaching bottom of collagen gel(top). Graph, Matrigel invasion of MDAMB 231 cells and quantification by calculating the slope increment of three replicates for each condition; �, P¼ 0.002(bottom). Data, one of three experiments for each.

Lapeire et al.

Cancer Res; 74(23) December 1, 2014 Cancer Research6808




ResultsThe role of CAAT in morphologic reorganization andinvasion of breast cancer cellsCAAT was confronted with MCF-7 aggregates in type I

collagen, the main structural component of the mammarygland. CAAT induced aggregate reorganization resulting ininfiltration of CAAT by MCF-7, engulfing single adipocytes

(Fig. 1A). In contrast, MCF-7 aggregates not confronted withCAAT maintained a round shape up to 14 days of culture. Themean factor shape of CAAT-confronted MCF-7 aggregates was4-fold that of controls (control vs. CAAT; 1.290� 0.095 vs. 4.017,�0.603;P¼0.004;Fig.1A).WenextquestionedwhetherCMCAAT

could mimic the effects induced by direct coculture. Within 48hours, 25 of 27 CMCAAT (93%) induced cellular extensions and

Figure 2. CAAT-secreted factors activate STAT3 signaling. A, phospho kinase array demonstrating the relative phosphorylation levels of 44 kinaseson CMCAAT-treated MCF-7 cells (top, only the upper part of the test with 28 kinases is shown) and measurement of the fold change (bottom). B, Western blotanalysis of pSTAT3-Y705 and pSTAT3-S727 in CMCAAT-treated MCF-7 cells. Duration of treatment is indicated: 50 (5 minutes), 100 (10 minutes),48 hours (2 days). Rescue, 48 hours treatment with CMCAAT, followed by 48 hours with control medium. Total STAT3 and tubulin were loading controls.C, pSTAT3-Y705 staining of paraffin-embeddedMCF-7 pellets treated as indicated (scale bar, 50 mm). D, pie chart for the distribution of at least 5-fold up- ordownregulated genes in CMCAAT-treated MCF-7 cells in comparison with control-treated MCF-7 cells according to their functional category (DAVIDdatabase). E, relative mRNA levels of indicated genes in MCF-7 cells treated for 48 hours with control medium or CMCAAT. F, Western blot analysis of S100proteins in MCF-7 cells treated for 48 hours with control medium, CMCAAT or after rescue.






Lapeire et al.





reduced cell–cell contacts in MCF-7 (Fig. 1B). Rescue experi-ments showed restoration of cobblestone-shaped morphologyand tight cell–cell contacts. F-Actin staining of single cellsrevealed a rounded appearance for control cells and an elon-gated morphology with multiple protrusions upon CMCAAT

treatment (Fig. 1C). The mean factor shape of CMCAAT-treatedMCF-7 cells was 2.5-fold higher than in controls (control vs.CMCAAT;1.221,�0.123vs. 4.070,�1.652;P¼0.002;Fig. 1C).EMTmarkers showednomajor expression changes in control versusCMCAAT treatment (Supplementary Fig. S2). Confocal immu-nocytochemistry revealed a reorganized F-actin cytoskeletonand relocation of E-cadherin and b-catenin from the plasmamembrane to the cytoplasm (Supplementary Fig. S2). CMCAAT

stimulated invasion ofMCF-7 into type I collagen after 24 hours(controlvs.CMCAAT;9.750%,�2.790%vs.46.750%,�2.408%;P¼0.001, Fig. 1D) and increasedmigration ofMCF-7 with a 14-foldslope increment (P ¼ 0.021, Fig. 1E).Similar morphologic changes (Fig. 1F) and stimulation of

type I collagen invasion were seen upon CMCAAT treatment ofT47D (control vs. CMCAAT; 9.340%, � 3.872% vs. 33.880%, �5.065%; P ¼ 0.008, Fig. 1G).Although induction of scattering is hard to assess in MDA

MB 231 given their mesenchymal phenotype (Fig. 1H), CMCAAT

increased type I collagen invasion of MDAMB 231 in a 14 daysassay (Fig. 1I, top). In addition, CMCAAT stimulated Matrigelinvasion of MDA MB 231 with a 4.5-fold slope increment(P ¼ 0.002, Fig. 1I, bottom).

Paracrine activation of STAT3 by CAAT in breast cancercellsPhospho-kinase screening in CMCAAT-treated MCF-7 cells

revealed higher phosphorylation levels of STAT3 (Y705), ERK,JNK, AKT, and CREB (Fig. 2A).Because pSTAT3-Y705 showed the highest relative increase,

we explored CMCAAT-stimulated pSTAT3-Y705 and pSTAT3-S727. Short-term exposure of MCF-7 to CMCAAT increasedpSTAT3-Y705 whereas long-term CMCAAT exposure is neces-sary for pSTAT3-S727 (Fig. 2B).A rescue experiment decreased pSTAT3-Y705 and

pSTAT3-S727 (Fig. 2B). Increased pSTAT3-Y705 was con-firmed in MCF-7 incubated with 9 of 9 CMCAAT. In agree-ment, confrontation of MCF-7 with CMCAAT revealed strongnuclear pSTAT3-Y705 compared with control (Fig. 2C).Because activated STAT3 is a transcriptional regulator, we

performed transcriptomics of MCF-7 cells under control con-ditions or with CMCAAT prepared from 2 patients withbreast cancer. Using expression value cutoff of 5-fold, 67

upregulated genes and 112 downregulated genes were identi-fied and assigned to clusters involving migration, inflamma-tory response, secretion, and angiogenesis (Fig. 2D). A propor-tion of these genes was associated with increased STAT3transcriptional targets such as the most upregulated genesS100A7 (70-fold), S100A8 (40-fold), and S100A9 (23-fold; ref. 18).Downregulated genes belonged to the connective tissuegrowth factor family (19) such as CTGF (40-fold), NOV (13-fold), CYR61 (6-fold), SERPINA1 (20), SERPINA3, and IGFBP5.

Differential expression of STAT3 transcriptional targets wasvalidated through RT-qPCR (Con vs. CMCAAT, P ¼ 0.004 for allreported genes, except SERPINA1 P ¼ 0.002, Fig. 2E). Westernblot analysis confirmed increased expression of S100A7,S100A8, and S100A9 in CMCAAT-treated MCF-7 cells (Fig.2F). A rescue experiment showed restoration of S100A8 andS100A9 levels to basal conditions, whereas S100A7 levels werereduced by 32.5%.

Expression and secretion of OSM by CAATUsing a biotin label–based assay, CMCAAT from 2 patients

revealed the presence of six proteinswith a reported capacity toactivate STAT3 signaling: OSM, IL6, IL8, G-CSF, LIF, and leptin(Supplementary Fig. S3). Addition of rhOSM dose dependentlyincreased Y705 and S727 pSTAT3 in MCF-7 cells. In contrast,only high concentrations of rhIL6 and rhG-CSFphosphorylatedSTAT3Y705 but not STAT3 S727 (Fig. 3A), suggesting a reducedtranscriptional activator capacity (as comparedwith rhOSMorCMCAAT). Moreover, only rhOSM upregulated S100A7 proteinlevels (Fig. 3A). rhIL6, rhIL8, and rhLIF had no effect onmorphology and addition of their neutralizing antibodiesto CMCAAT did not counter CMCAAT-induced morphologicchanges (Supplementary Fig. S3). Only neutralizing (n)IL6antibody partially inhibited CMCAAT-induced phosphorylationof STAT3 Y705 but had no effect on S727 phosphorylation(Supplementary Fig. S3). rhLeptin was not tested because itlacked the capacity to induce cellular scattering (21).

Mass spectrometry of CMCAAT revealed 10 unique OSMpeptides at the expected molecular weight of 25 to 30 kDa with55% sequence coverage (Fig. 3B). Western Blot analysis iden-tifiedOSMprotein in CMCAAT from 3 patients. ELISA of CMCAAT

from 16 patients revealed an OSM concentration between 3.7and 15.7 pg/mL (Fig. 3C). There was no correlation between theOSM concentration in CMCAAT and body mass index (BMI) ofthese patients (P ¼ 0.948, Spearman Rho ¼ �0.115).

To determine the source of OSM production, tumor-associ-ated adipose tissue from 10 patients with breast cancer wasseparated into TAA and the SVF. RT-qPCR revealed a 20-fold

Figure 3. CAAT-derived OSM phosphorylates Y705 and S727 STAT3, upregulates S100A7, and stimulates migration through OSMR. A, Western blotanalysis of pSTAT3-Y705 and pSTAT3-S727 in MCF-7 cells treated with rhOSM, IL6, IL8, and G-CSF (top). Western blot analysis of S100A7 in MCF-7 cellstreated with rhOSM, IL6, or G-CSF (bottom). B, OSM peptides and peptide hits identified by CMCAAT mass spectrometry. C, Western blot analysis of OSM inCMCAAT of 3 patients (P26, P29, and P33). rhOSM (20 ng) served as positive control (top). Scatter plot, OSM concentration in CMCAAT from 16 patientsmeasured by ELISA (bottom). D, scatter plot, relative OSM mRNA levels in TAA and SVF of CAAT from 10 patients with breast cancer (bottom).Western blot analysis of CD45 and OSM in total SVF and in isolated CD45þ, CD31þ and "Rest" fractions of SVF. E, pSTAT3-Y705 staining of breast cancercells and CD163 staining of activated macrophages (scale bar, 300 mm for top and 50 mm for bottom). F, relative mRNA levels of OSMR expression in fourbreast cancer cell lines. G, phase-contrast images of four different breast cancer cells treatedwith controlmediumor rhOSM (1 ng/mL) for 48 hours. H, graphs,migration of MCF-7 and SKBR3 cells treated with control medium or rhOSM at indicated concentrations using xCELLigence migration assay andquantifiedby calculating the slope increment of five replicates of each condition;MCF-7: �,P¼0.071 and ��,P¼ 0.001; SKBR3: �,P¼0.941 and ��,P¼0.422.After the experiment, membranes of control and rhOSM 1 ng/mL were stained with crystal violet, indicating migrated cells.






increased expression of OSM mRNA in the SVF compared withadipocytes (P < 0.001). OSMmRNA levels in TAA and SVF werenot correlated with the BMI of the patients (OSM in TAA, P ¼0.650, Spearman Rho¼ 0.164; OSM in SVF, P¼ 0.235, SpearmanRho ¼ 0.413). OSM protein was found in the CD45þ leucocytefraction and not in the CD31þ endothelial fraction or "Rest"fraction containing CD34þ/CD31� adipocyte progenitor cells(Fig. 3D; ref. 22).

Macrophages are CD45þ and an increased presence oftumor-associated macrophages (TAM) has been associatedwith poor prognosis in human breast cancer. CD163 stainingrevealed an accumulation of TAMs in the adipose tissue at sitesof cancer cells with high nuclear pSTAT3-Y705 infiltrating theadipose tissue (Fig. 3E).

OSM engages heterodimeric receptors involving gp130 andeither the OSM receptor (OSMR) or the leukemia inhibitoryfactor receptor (LIFR). The gp130/OSMR complex is specifi-cally activated by OSM and is implicated in morphologicchanges (23). RT-qPCR revealed the relative expression ofOSMR in MCF-7, T47D, and MDA MB 231 whereas SKBR3show a 60.000-fold lower OSMR expression (Fig. 3F). rhOSMtreatment of these cell lines inducesmorphologic changes in allexcept SKBR3 (Fig. 3G). Moreover, migration ofMCF-7 and notSKBR3 is dose dependently stimulated by rhOSM with a 5-fold(100 pg/mL, P¼ 0.071) and 9.9-fold (1 ng/mL, P¼ 0.001) slopeincrement in MCF-7 compared with 1.4-fold (100 pg/mL, P ¼0.941) and 1.6-fold (1 ng/mL, P ¼ 0.422) slope increment inSKBR3 (Fig. 3H). rhOSM treatment of MCF-7 leads to anincrease of OSMR (2.7-fold) and STAT3 (2.2-fold) expression(P ¼ 0.029 for both genes), suggesting positive feedback. TheOSMR and STAT3mRNA response is not observed in SKBR3. Inboth cell lines, LIFR andGP130mRNA levels are not affected byrhOSM (Supplementary Fig. S4).

Functional role of OSM and STAT3 signaling in CAAT-mediated morphologic changes

To quantify CMCAAT potency on STAT3 phosphorylation,MCF-7 cells were treated with rhOSM. pSTAT3-Y705 wassignificant at 0.01 ng/mL rhOSM, with a STAT3 phosphoryla-tion capacity of CMCAAT equivalent to �0.5 ng/mL rhOSM(Fig. 4A). rhOSM induced a gene signature (Con vs. rhOSM,P ¼ 0.029 for all reported genes except IGFBP5 with P ¼0.200, Fig. 4B) and morphologic changes (Fig. 3G) similar toCMCAAT treatment. Preincubation of rhOSM with nOSM anti-body or addition of the pan-Jak inhibitor tofacitinib abolishedSTAT3 phosphorylation (Fig. 4C). Preincubation of CMCAAT

with nOSM antibody reversed STAT3 activation (Fig. 4C,bottom left) and morphologic responses (Fig. 4D). Tofacitinibblocked CMCAAT-induced STAT3 activation and S100A7expression (Fig. 4C), morphologic responses (Fig. 4D), andnuclear localization (Fig. 4E). The AKT pathway (inhibited byGSK2141795) but not the MEK/ERK pathway (inhibited bytrametinib) is necessary for pSTAT3-S727 and transcriptionalactivity (Supplementary Fig. S5).

We established MCF-7 cells that ectopically secreted OSM(MCF-7–OSM) to examine the impact of constitutive OSMsecretion and signaling in breast cancer progression. MCF-7–OSM cells have a decreased proliferation rate, lost the ability to

form aggregates, and show an increased expression of OSMRcompared with control MCF-7–GFP cells (SupplementaryFig. S6). OSM in the secretome coincided with constitutivepSTAT3-Y705 and increased expression of S100A7 (Fig. 5A).Tofacitinib reduced pSTAT3-Y705 and S100A7 expression(Fig. 5A).

Histology revealed that MCF-7–GFP cells organized intoclusters with a compact pattern separated by Matrigel, where-asMCF-7–OSMxenografts displayed disorganized strands andsingle cells (Fig. 5B). Quantification of cellular organization bycalculating factor shape indicated a statistically significantdeviation (GFP vs. OSM, 1.4 � 0.09 vs. 4 � 1.4, difference, 2.6;95% CI, 1.24–3.95; P ¼ 0.0016). Pan-cytokeratin and vimentinshowed no differential expression between MCF-7–GFP andMCF-7–OSM tumors. However, E-cadherin membrane expres-sion and ERa expression was reduced in OSM-secretingtumors compared with control (Supplementary Fig. S2). Stain-ing of pSTAT3-Y705 showed that 3.3% of MCF-7–GFP ispositive compared with 69.8% ofMCF-7–OSM cells (difference,66.5%; 95% CI, 59%–73%; P < 0.0001; Fig. 5B).

All MCF-7–GFP xenografts had poor peritumoral vascu-larization (6/6) whereas MCF-7–OSM tumors developedstrong peritumoral vascularization (11/12) as evidenced bymacroscopic evaluation (Fig. 5B) and contrast-enhancedmicrocomputed tomography (mCT; Fig. 5B). Microarray datarevealed the, respectively, 11- and 7-fold upregulation ofangiogenic factors NTN4 (24) and LRG1 (25) in CMCAAT

-treated MCF-7 cells. rhOSM and ectopic expression of OSMmimicked CMCAAT-induced effects on NTN4 and LRG1 (CONvs. CMCAAT, P < 0.0001; CON vs. rhOSM and CON vs. OSM,P ¼ 0.004; Fig. 5C).

Treatment with nOSM antibody alleviated OSM-inducedperitumoral angiogenesis as demonstrated by reduced numberof mice (1/6) showing peritumoral blood vessels and blocksOSM-induced pSTAT3-Y705 (Fig. 5B), with 21.1% of MCF-7–OSM cells showing a positive nuclear signal (difference com-pared with untreated, 47.9%; 95% CI, 38%–57%; P < 0.0001).Administration of tofacitinib prevented OSM-induced peritu-moral angiogenesis in 4 of 6 mice and reduced pSTAT3-Y705(Fig. 5B)with 20%ofMCF-7–OSMcells showing nuclear STAT3(difference compared with untreated, 49%; 95% CI, 42%–56%;P < 0.0001). Both the nOSM antibody and tofacitinib restoredMCF-7 cluster organization (Fig. 5B). Themean factor shape ofcell clusters from MCF-7–OSM tumors treated with nOSMantibody and tofacitinib was, respectively, 1.78� 0.44 and 1.62� 0.26, indicating compacted organization (difference nOSMantibody vs. untreated, 2.2; 95% CI, 0.8–3.63; P ¼ 0.0058;difference tofacitinib vs. untreated, 2.3; 95% CI, 1.00–3.75;P ¼ 0.0032).

Nuclear expression of pstat3-y705 in invasive ductalbreast cancer

We studied the expression of nuclear pSTAT3-Y705 by IHCin 50 patients with ER-positive invasive ductal carcinoma withhistologically confirmed adipose tissue infiltration. NuclearpSTAT3-Y705 staining was present at sites of adipose tissueinfiltration in 18%of the samples (9/50). Interestingly, pSTAT3-Y705–positive samples showed a statistically significant

Lapeire et al.





Figure 4. Tofacitinib and nOSM antibody inhibit rhOSM- andCMCAAT-induced scattering and STAT3 activation. A,Western blot analysis of pSTAT3-Y705 andpSTAT3-S727 in MCF-7 cells treated with a range of rhOSM or CMCAAT from 3 patients (P36, P40, and P44). pSTAT3-Y705 and pSTAT3-S727 by P36,P40, and P44 equals approximately 0.64, 0.86, and 0.90 ng/mL rhOSM, respectively. B, relative mRNA levels of indicated genes inMCF-7 cells treated for 48hours with rhOSM (2 ng/mL). C, Western blot analysis of pSTAT3-Y705 and pSTAT3-S727 in MCF-7 cells treated for 48 hours with rhOSM (5 ng/mL;top) or CMCAAT (bottom), combined with a range of an nOSM antibody (left) or tofacitinib (right). D, phase-contrast images of MCF-7 cells treated for 48 hourswith control medium, CMCAAT, or CMCAAT combined with nOSM antibody (fromR&DSystems) or tofacitinib at the indicated concentrations. E, pSTAT3-Y705staining of paraffin-embedded MCF-7 cell pellet treated for 48 hours with CMCAAT or CMCAAT combined with tofacitinib (scale bar, 50 mm).






Figure 5. Treatment with nOSM antibody or tofacitinib inhibits OSM-induced effects in MCF-7 xenografts. A, left, validation of MCF-7 cells stably transfectedwith OSM cDNA (MCF-7–OSM) compared with transfection with GFP control plasmid (MCF-7–GFP). Western blot analysis of OSM, pSTAT3-Y705, andpSTAT3-S727, S100A7, S100A8, and S100A9 in cell lysates (LYS) and conditioned medium (CM) of MCF-7–GFP and MCF-7–OSM cells. Total STAT3and tubulin serve as loading control. Right, Western blot analysis of pSTAT3-Y705 and pSTAT3-S727 and S100A7 in MCF-7–OSM cells treated for 48 hourswith control medium or 500 nmol/L tofacitinib. MCF-7–GFP serves as the control cell line. B, Swiss nu/nu mice injected with MCF-7–GFP or MCF-7–OSMcells in the right lowermammary fat pad and treatedwith neutralizingOSMantibody or tofacitinib. First row,macroscopic external viewof tumors (indicated byarrows); second row, macroscopic internal view of tumors; third row, contrast-enhanced mCT images of the blood vessels surrounding the tumor(asterisk, the right hind leg bone; arrow, enhanced peritumoral angiogenesis); fourth and fifth rows, hematoxylin and eosin and pSTAT3-Y705 staining ofresected tumors (scale bar, 50 mm). C, relative mRNA levels of NTN4 and LRG1 expression in MCF-7 cells treated with control medium, CMCAAT, orrhOSM (2 ng/mL) and in MCF-7–OSM cells.

Lapeire et al.





associationwith lymphovascular invasion (LVI; P¼ 0.0032, Fig.6). LVI is a poor prognostic factor in patientswith lymph node–negative IDCA (26).

DiscussionAdipose tissue is an endocrine organ producing effectors

with local and systemic actions. Tumor infiltration into theadjacent fat is a risk factor for breast cancer progression (27).We investigated the impact of CAAT in breast cancer infiltra-tion and progression. OSM is aCAAT-secreted factor activatingSTAT3 and inducing proinflammatory genes, cellular scatter-ing, and peritumoral angiogenesis (Fig. 7).Although adipose tissue has been shown to secrete a number

of cytokines potentially affecting breast cancer cells, ourstudies demonstrate that OSM is the most relevant factorstimulating cancer progression. First, in comparison with IL6,IL8, and G-CSF, OSM is the only inducer of cellular scatteringand the most potent inducer of pSTAT3-Y705. Second,pSTAT3-S727, important for transcription, was only seen uponOSM stimulation. Third, only OSM stimulates S100A7 expres-sion described as poor prognosis marker in breast cancer (28).Fourth, two distinct OSM-neutralizing antibodies (R&D Sys-tems and GSK) abolish CMCAAT-inducedmorphologic changes

and STAT3 activation. Fifth, besides STAT3, CMCAAT activatesdownstream intermediates of OSM such as AKT, JNK, ERK, andCREB (23, 29), and AKT activation is necessary for pSTAT3-S727. Sixth, nIL6, nIL8, and nLIF antibodies do not affectCMCAAT-induced scattering. Seventh, nIL6 antibody partlyinhibits CMCAAT-induced pSTAT3-Y705 but not pSTAT3-S727. nIL8 and nLIF antibodies do not affect CMCAAT-inducedpSTAT3-Y705. Finally, CMCAAT induces OSMR and STAT3 in asimilar fashion as rhOSM. Thesefindings are in agreementwithXiao and colleagues (30) showing a positive feedback loop forfurther amplification of OSM-induced signaling.

OSM and CMCAAT increase expression of S100 proteins. Arescue experiment showed a relative higher S100A7 proteinlevel compared with S100A8/9 after rescue procedure. Allstudied S100 proteins have an intracellular and secreted pool,are associated with the actin cytoskeleton, and contribute toincreased scattering and migration. S100A8/9 proteins areuniquely reported as promigratory. However, S100A7 has adescribed pro- and antimigratory function. This effectmight beconcentration dependent. Higher levels of S100A7 may stim-ulate migration; slightly lower levels support the inhibition oflamellipodia formation and restore the nonmigratory state(31). OSM and CMCAAT shift E-cadherin membrane locali-zation to the cytoplasm but have no impact on vimentin,

Figure 6. pSTAT3-Y705 in breastcancer cells at the invasion front iscorrelated with LVI in patients withbreast cancer. A, pSTAT3-Y705staining of breast cancer cellsinvading surrounding adiposetissue in patients with breastcancer [scale bar, 100 mm (top) and25 mm (bottom)]. B, contingencytable showing association ofpSTAT3-Y705 scores with LVI for50 patients with ERþ IDCA.






fibronectin, or cytokeratin expression. Reduction of cellsurface E-cadherin expression is a prerequisite for cellularscattering (32) and a marker of EMT. In contrast with Guoand colleagues and West and colleagues (33, 34), we do notobserve a full EMT in our set-up. Although all studies usedbreast cancer cells, both West and colleagues and Guo andcolleagues (33, 34) used higher OSM concentrations (100 ng/mL) and longer treatments that stimulate fibronectin, snail,and vimentin expression. In accordance with West andcolleagues, withdrawal of OSM restores the epithelial phe-notype, indicating that OSM does not induce permanentphenotypic changes. Concentrations of OSM provided at theadipose invasion front, a 1.000- to 10.000-fold lower com-pared with West and colleagues and Guo and colleagues,were capable of activating STAT3 and increasing adiposetissue infiltration by reduced cell surface E-cadherin.

Although OSM has been shown to inhibit cellular prolif-eration of MCF-7 and T47D (35, 36) and cell culture experi-ments with MCF-7 constitutively secreting OSM show areduced growth compared with control transfected cells,our xenograft experiments revealed similar tumor sizesbetween control and OSM groups, most probably as a resultof enhanced peritumoral angiogenesis. OSM may directlystimulate angiogenesis (37) and stimulate the secretion ofVEGF by T47D cells (38). We discovered the stimulatory roleof OSM on the expression of NTN4 and LRG1 genes encodingthe proangiogenic factors netrin-4 and LRG1. OSM stimu-lates expression and secretion of S100 proteins, whichpromote angiogenesis by stimulating endothelial cell pro-liferation (31). Whether in the xenograft model, the

increased presence of blood vessels is caused directly byOSM or indirectly by OSM-induced netrin-4, LRG1, S100proteins, or a combination of them, is not known.

OSM mRNA is high in the SVF and immune-isolation ofCD45þ leucocytes revealed the presence of OSM proteincompared with the endothelial and preadipocyte/fibroblastfraction. A study using subcutaneous adipose tissue supportsour findings showing that mature adipocytes are not the mainsource of OSM but derives from cells in SVF, including macro-phages (39). CAAT is infiltrated by CD163þ macrophages andaccumulate at sites of high pSTAT3-Y705 in cancer cells.CD163þ macrophages are defined as TAMs correlated withpoor prognosis in breast cancer (40) potentially by contribu-tion of proinflammatory cytokines stimulating invasion (9).Mature adipocytes express OSMR and OSM provided by infil-trated macrophages may contribute to dedifferentiation ofmature adipocytes (41).

The underlyingmechanisms linking obesity to breast cancerrisk and progression are not yet fully understood. Obesity isinvolved in STAT3 activation by at least twomechanisms. First,high plasma levels of leptin, correlated with obesity, are mainlyimplicated in breast tumorigenesis and growth (42). Second,obesity is associated with a chronic state of low-grade inflam-mation, attracting macrophages, and lymphocytes producingSTAT3-activating cytokines (43, 44). Our data show no clearcontribution of obesity mediated through CMCAAT. First,CMCAAT from 9 patients showed similar STAT3 activation,regardless of their BMI (5 normal, 3 overweight, and 1 obese).Second, CMCAAT from 25 patients with a BMI ranging from 19.1to 41 (2 underweight, 10 normal, 9 overweight, and 4 obese)

Figure 7. Schematic illustrating therole of CAAT-secreted OSM in thetumor microenvironment. Bindingof OSM to its receptor (OSMR) onbreast cancer cells (BCC) recruitsgp130 to form a heterodimer-activating gp130-bound Jak.Activated Jaks lead to pSTAT3-Y705 that form homodimerstranslocating into the nucleus toregulate transcription. OSMphosphorylates STAT3 S727through Akt signaling, potentiatingtranscriptional regulation. OSM-induced Jak/STAT3 signalingstimulates invasion andperitumoral angiogenesis.

Lapeire et al.





induced cellular scattering. Third, from the 9 IDCA sampleswith high pSTAT3-Y705 staining only one was an obese patient(6 normal, 2 overweight, and 1 obese). Fourth, OSM mRNAlevels in SVF from 10 patients with breast cancer were notcorrelated with BMI. Fifth, we found no correlation betweenOSM concentration in CMCAAT from 16 patients and theirrespective BMI. Admittedly, the number of patient samples inour study is low. Therefore, further studies using large series ofbreast CAAT samples from age-matched patients, includingmore detailed fat deposit information and metabolic biomar-kers, will yield more information whether OSM secretion byactivatedmacrophages and pSTAT3-Y705 in infiltrating cancercells is associated with obesity. Alternatively, recruitment ofinflammatory cells is a consistent feature of the local tumorenvironment and an enabling characteristic of cancer progres-sion (45). In agreement with Queen and colleagues (38), localproduction of chemokines by cancer cells may recruit inflam-matory cells at the adipose tissue invasion front leading toincreased secretion of OSM.Nuclear pSTAT3-Y705 at sites of adipose tissue infiltration

revealed an association with LVI, a poor prognosis marker inbreast cancer. Although all investigated CAAT and SVF sam-ples expressed OSM, only one fifth of patients with ER-positivebreast cancer showed pSTAT3-Y705 at invasion front. Thisapparent contradiction may be explained by differentialexpression of OSMR in breast cancer cells. Conflicting dataexist about activated STAT3 as a marker for prognosis. Oneexplanation is the use of tissue microarray cores representingthe bulk of the tumor, not allowing to discriminate cancer cellsat the invasion front (46, 47). We used whole-tissue slidesallowing examination of cancer cell–CAAT interactions. Ourdata are endorsed by recent findings underlining the linkbetween pSTAT3 at the invasion front and tumor progression(48). Second, primary breast tumors displaying tyrosine phos-phorylation of STAT3 and STAT5 are more differentiated anddisplay more favorable prognostic characteristics than thosewith selective STAT3 activation. Indeed, both STATs mediateopposing effects on several key target genes, with STAT5exerting a dominant role (49). In accordance, we observed a2.3-fold higher STAT3 tyrosine phosphorylation comparedwith STAT5 tyrosine phosphorylation by CMCAAT (data notshown).The OSM/STAT3 loop may have therapeutic potential in

breast cancer. CMCAAT activates STAT3 through Jak familykinases as evidenced by tofacitinib. Tofacitinib has receivedFDA approval as treatment of rheumatoid arthritis. Here,STAT3 plays a critical role in survival and proliferation ofsynoviocytes, the main component of the pannus that invadesbone (50). Tofacitinib has been suggested for patients with

natural killer T-cell lymphoma harboring constitutive Jakmutations (51). OSM-neutralizing antibodies have been usedin multiple xenograft models (52, 53). We used a monoclonalOSM-neutralizing antibody that efficiently blocks OSM-induced peritumoral angiogenesis. Further studies shouldindicate the potential impact of OSM and Jak targeting inbreast cancer.

This is the first report demonstrating a paracrine OSM/STAT3 activation loop at the level of adipose tissue versusepithelial interactions in ER-positive breast cancer.

Disclosure of Potential Conflicts of InterestNo potential conflicts of interest were disclosed.

DisclaimerThe study sponsors have no role in the design of the study; the collection,

analysis, and interpretation of the data; the writing of the article; or the decisionto submit the article for publication.

Authors' ContributionsConception and design: L. Lapeire, G. Braems, P. Valet, M. Bracke, V. Cocquyt,H. Denys, O. De WeverDevelopment of methodology: L. Lapeire, K. Lambein, C. Lehu�ed�e, C. Muller,P. Valet, H. Denys, O. De WeverAcquisition of data (provided animals, acquired and managed patients,provided facilities, etc.): A. Hendrix, K. Lambein, R. Van Den Broecke,R. Limame, J. Vandesompele, C. Vanhove, D. Maynard, M. Bracke, H. Denys,O. De WeverAnalysis and interpretation of data (e.g., statistical analysis, biostatistics,computational analysis): A. Hendrix, K. Lambein, M. Van Bockstal, G. Braems,R. Limame, P. Mestdagh, C. Vanhove, C. Gespach, V. Cocquyt, H. Denys,O. De WeverWriting, review, and/or revision of the manuscript: L. Lapeire, A. Hendrix,K. Lambein, M. Van Bockstal, G. Braems, R. Van Den Broecke, R. Limame,J. Vandesompele, C. Vanhove, C. Lehu�ed�e, C. Muller, P. Valet, C. Gespach,M. Bracke, V. Cocquyt, H. Denys, O. De WeverAdministrative, technical, or material support (i.e., reporting or orga-nizing data, constructing databases): K. Lambein, G. BraemsStudy supervision: L. Lapeire, G. Braems, M. Bracke, V. Cocquyt, H. Denys,O. De Wever

AcknowledgmentsThe authors thank G. De Bruyne, M. De Meulemeester, S. Decloedt, K. Van

Wesemael, E. Wauters, S. De Geyter, and S. Jeurissen for excellent technicalassistance. M. Mareel is gratefully appreciated for critical revision of thearticle.

Grant SupportThis research was supported by Fund for Scientific Spearheads of Ghent

University Hospital and Research Council of Ghent University, the NationalCancer Plan (KPC_29_012), a grant from the "Bijzonder Onderzoeksfonds"(BOF) of Ghent University (to H. Denys), a postdoctoral grant (to A. Hendrix),and a travel grant (L. Lapeire) from Fund for Scientific Research-Flanders.

The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment ofpage charges. This article must therefore be hereby marked advertisement inaccordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.

Received January 18, 2014; revised August 29, 2014; accepted September 1,2014; published OnlineFirst September 24, 2014.

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