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FISH HIBRIDACIÓN IN SITU

FLUORESCENTE

BLGA. ROCÍO M. GONZÁLEZ MORENO

SONDAS para FISH

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TECNOLOGÍA DE MARCADO DIRECTO

COLOCAR LA MUESTRA

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HIBRIDACIÓN

La muestra es hibridizada con

sondas fluorescentes.

Sondas de diferente color

pueden ser usadas sobre

diferentes cromosomas o

genes.

TIPOS DE SONDAS TINCIÓN COMPLETA---

SECUENCIAS

REPETITIVAS---------

SECUENCIA

ÚNICA---------------

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Nombre: Vysis LSI 13 Ubicación de la sonda: 13q14 Fluoróforo: SpectrumGreen

SONDA COPIA ÚNICA

Nombre: Vysis LSI 21 Ubicación de la sonda: 21q22.13-q22.2 Fluoróforo: SpectrumOrange

SONDA COPIA

ÚNICA

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SONDA DE COPIA ÚNICA

TRISOMÍA 21: Patrón 2V3N (dos señales verdes y tres señales de color naranja).

SONDAS DE SECUENCIAS REPETITIVAS

Chromosome enumeration probes (CEP) Nombre: CEP X Ubicación de la Sonda: Xp11.1-q11.1 Alpha Satellite DNA Fluoróforo: SpectrumOrange

Nombre:CEP Y Ubicación de la Sonda: Yq12 Satellite III Fluoróforo: SpectrumGreen

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DNA satélite

SONDAS DE SECUENCIAS REPETITIVAS

SEXO FEMENINO: Patrón 2O (dos señales anaranjadas)

SEXO MASCULINO: 1G1O (Una señal verde, una señal anaranjada)

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SONDA CENTROMÉRICA

Nombre: Vysis CEP 18

Ubicación de la Sonda:18p11.1-q11.1 Alpha Satellite DNA

Fluoróforo: SpectrumAqua

SET de SONDAS 18/X/Y

Tres señales aqua indican tres copias del cromosoma 18, una señal verde indica una copia del cromosoma X y una señal naranja indica una copia del cromosoma Y

SONDAS DE SECUENCIAS REPETITIVAS

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SONDA DE PINTADO PARA EL CROMOSOMA

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Multi-FISH o SKY

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FUNDAMENTO DEL FISH

FISH SE REALIZA EN VARIEDAD DE MUESTRAS

El botón de la muestra puede tener variada procedencia:

Un cultivo de sangre periférica o de médula ósea

Eyaculado de esperma,

Cultivo o células directas de Liquido amniótico

Cortes de muestras de tejido de archivo de patología: ovario, mama

Cualquier tejido ó célula única para realizar diagnóstico genético de preimplantación (DGP).

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PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

PREPARACIÓN DE LA SONDA

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CODESNATURALIZACIÓN E HIBRIDACIÓN

•Colocar las láminas a 73-75 grados centígrados

dejar por 5 minutos.

•Colocar las láminas en cámara de hibridación húmeda

previamente mantenida a 37 grados durante 18-48

horas

LAVADOS

SOLUCIONES Solución A 2xSSC pH 7.0 a

temperatura ambiente.

Solución B, 0.4SSC-0.3% NP40 o

tween 80 o tween 20, pH 7.0

mantenida en baño María a 72-75 °C.

Solución C, 2xSSC 0.1%, NP40 o

tween 80 o tween 20, pH 7.0

Temperatura ambiente.

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LAVADOS

Contratinción

•Hacer una mezcla 1:1 de colorante

de DAPI II y Antidesvanecente.

•Dejar reposar en obscuridad y en

refrigeración (2-8 °C), durante 10-15

minutos

•Observar bajo microscopio de

fluorescencia.

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ANÁLISIS

ANÁLISIS

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FISH EN NUCLEOS INTERFÁSICOS

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LSI D7S486/CEP 7 Dual Color Probe Patrón: 202G SONDAS DE FUSION

LSI MLL Dual Color, Break Apart Patrón: 1O1G1F

SONDAS DE ESCISIÓN

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LSI BCR/ABL Dual Color, Dual FusionTranslocation Probe Patrón: 1O1G2F

SONDAS DE FUSION

NOMENCLATURA DE FISH SEGÚN

EL MANUAL DEL SISTEMA

INTERNACIONAL DE

NOMENCLATURA CROMOSÓMICA

ISCN 2013

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- Ausencia de un cromosoma específico, o secuencia

genómica.

+ Presente en un cromosoma específico o secuencia

genómica.

++ Dos señales de hibridación ó regiones sobre un

cromosoma específico.

X Signo de multiplicación precede el número de señales

vistas.

. Punto, separa observaciones de resultados de

hibridación in situ

SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS

; Punto y coma, separa las sondas en diferentes cromosomas

derivativos

Amp Señal amplificada

Dim Señal disminuida

Enh Intensidad de señal realzada

Fib ish Hibridización in situ en una fibra de cromatina

extendida.

ish Hibridización in situ , cuando se realiza sobre cromosomas

(metafases)

nuc ish Hibridación in situ en núcleos ó en interfase

SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS

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pcp Pintado parcial de cromosomas (hibridación con

mezclas de sondas )

rev ish Hibridación in situ reversa incluyendo CGH con

FISH

sep Señales separadas

subtel Subteloméricas

Wcp Pintado completo del cromosoma

SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS

CUANDO SE REALIZA EL ANÁLISIS

EN NÚCLEOS INTERFÁSICOS

nuc ish 15q11.2(D15S10X1)[300]

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EJEMPLOS EN METAFASE del 22q11

46,XY,ish 22q11.2(TUPLE 1X2)

Cuando se le realiza cariotipo

EJEMPLO EN METAFASE EN EL SÍNDROME DE

PRADER WILLI/ANGELMAN

46,XX, ish del(15)(q11.2q11.2)(D15S10-)

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Ej. CON PINTADO COMPLETO DEL CROMOSOMA

47,XX,+mar[20]. ish (wcp 12+)

-Identifica desórdenes genómicos mediante la detección directa

de los genes involucrados, utilizando sondas de ADN marcadas

con fluorocromos.

- Núcleos interfásicos: permite determinar el número de copias de uno o varios

cromosomas, así como para detectar algunas reorganizaciones específicas que son

características de ciertos tipos de cáncer

- Se pueden estudiar hasta 1000 células.

- No es necesario cultivar

- Células en metafase: para detectar microdeleciones específicas, o para

identificar material extra de origen desconocido.

Para determinar si un cromosoma tiene una deleción simple o si está implicado en

una reorganización sutil o compleja.

VENTAJAS DE FISH

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VENTAJAS DEL DIAGNÓSTICO MOLECULAR

- Alta sensibilidad

- Alta especificidad

- Permite diagnóstico, pronóstico y seguimiento rápido.

- Permite el diagnóstico en casos con cariotipo normal.

- Permite caracterizar los diferentes puntos de ruptura,

asociados a distintos tipos de patologías .