360 ----------------------------------------------------------------mU AO-5

254 nm

300

225

150

75 I

1 L 30

min

00 10 20 3 O 40 50 60 70 BO 9_0 100

FIGURA A (a) Cromatograma del test de HPLC de fase inversa Tomado como

test de partida

325 ~~--------------------------------------------------------~ mU AO-5300 254 nm

225

150

75

~u U V

25 +----------------------______---____---____---____-----____---______r--m~in~ 00 10 20 30 40 50 60 70 BO 90 10 O

FIGURA A (b) Cromatograma del test de verificacioacuten de instrumentos Disentildeado

en este trabajo

11 paso siguiente es la detemlillacioacuten de las condiciones cromatograacuteficas a las cuales se

aplica Ja mezcla de prueba estas se establecen de la siguiente manera

bull Se escoge el Crnmatoacutegrafo liacuteqllido 111-1050 para efectlar con eacutel las pruebas

referentes al estudio de las condiiexcliones cromatograacuteficas para aplicar la mezcla de prueba y

de la sensibilidad de la misma esta eleccioacuten se basa en el hecho (fe que el HP-1050 es nn

modelo modular compacto y de faacutecil manejo

bull El bucle de inyeccioacuten es de 20 11L lo que asegura una buena eficacia cromatograacutefica y en el clIal se inyecta con una jerlnga de vidrio para HPLC de 100 lL

bull oIDO ya se mencion( la detcccioacutelI de Jos picos es por UltTaVioleta a W1a longitud de

onda de 254 nm

bull La colW1ma usada en la aplicacioacuten de la mezcla de prueba es Ima C-18 (fase inversa)

soacutelo dedicada a este propoacutesito en este trabajo se usa lma columna Merck Licluospher 100

RP-l~ (5 lm) (125 x4 mm)

bull La temperatura de tTabajo de la columna es de 35degC con el fm de evitar las

oscilaciones propias de la temperatura ambiente

bull La fltlse moacutevil tiene Ilna composicioacuten de AcetonitTilo-Agua (70-30 vv) IIsando

dos liacuteneas del cromatoacutegpfo en modo isocraacutetico el Acetonitrilo es grado HPLC y el Agua es

calidad M illi Q (que se cambia cada diacutea) y ambos deben desgasifiacutecarse

bull El Oujo de Ja fase moacutevil es de 100 mUmin

bull La presioacuten debe estar alrededor de los 55 Uars para una columna nueva

Con relacioacuten al sistema ele tratamiento de los datos cromatograacuteficos se pmeba

inicialmente con integradores pequentildeos compactos y faacuteciles de transportar de un equipo a

otro como es el caso del HP 1()2 A en este tipo de integradores es necesario fijar los

siluientes paraacutemetros

I

Zero N ivel del cero de la sei1a1

AH 2i Grado de atenuacioacuten de los picos

CH SP Velocidad del papel del registro

IK VD Andl1Jra miacutenima de los picos para poder ser integrados

THRSH Umbral de pico relacionado con la atenuacioacuten

AR REJ Aacuterea miacutenima de los picos para que sean incluidos en el inrorme

Tambieacuten es aconsejable programar la inhibicioacuten de la integracioacuten en los pnmeros

minutos del cromatograma y nn stop time para la finalizacioacuten del mismo

Jas desventajas ~e este tipo de sistema de tratamiento de datos son flrndamentalmente

la imposibilidad de recalcnlar el cromatograma ClliacuteUldo se modifican algllnas variables de

deteccioacuten yo ~ltegracioacuten y tal vez la maacutes importante que no sllmillistra valores de eficacia

ni de resolucioacuten trnmatogrMica c()ITI0 N y Rbull

Otro sistema de batamiento de datos que se pmeba en el presente trabajo es el

integrador Merck-Hiacutetachi 1) 2000 Chromato-lntegrator este sistema es similar al anterior

con la diferencia de que permite recalcular el cromatograrna sin necesidad de lilla nueva

inyeccioacuten pero al igual que elHP 3392 A no suministra valores de eficacia cromatograacutefica

ni de resolucioacuten

Finalmente se opta por el uso de un software de registro e integracioacuten de los picos

cromatograacuteficos El Ciynkosoft ( Chromatographie Daten System) Este software estaacute

estTIlctmado por archivos relacionados a manera de aacuterbol asiacute

La raiacutez Archivo SMP

Los troncos Archivos PUM SlO lUJD

Las ramas Archivos DE TAE y PRM

las hojas Archivos de datos sin procesar

1 1

S M P Informacioacuten de la mUlstra (Hon1nre volumen de inyeccioacuten etc ) bull

PUM Condiciones cromatograacutefic(ls

Sllti COl1stitlliclo por los archivos I)[T y TAH

RPI) Constituido por el archivo PRM

DET Criterios de deteccioacuten de pico definicioacuten de liacutenea base etc

TAB Tablas de componentes nombres de pico tiempos de retencioacuten etc

PRM Composicilm ltIel informe

Este softwarltiexcl permite In tratamiento amplio del aomatograrna una vez obtenido y

genera un infonne que ademaacutes del cromatograma incluye valores para las siguientes

varianles de cada pico

NU del pico

Nombre del pico

Tipo de pico seguacuten la integracioacuten

Tiempo de retencioacutell (m ill)

Aacuterea de pico (mvrnin)

Altura de pico (mv)

Anchura a la mitad de la altura (min)

Platos teoacutericos

Resolucioacuten

Asimetria de pico

11ay dos caracteriacutesticas principales requeridas para el procesamiento de datos

cromatogriacuteficos La digitalizacioacuten prccisa de la sentildeal analoacutegica del detector y un software

para la deteccioacuten de los pICOS correccioacuten de la deriva de la liacutenea base caacutelculo de aacutereas de

pico tiempos de retencioacuten concentracioacuten de los componentes llsando factores de respllesta

dcl detcctl)r almacenados y la produccioacuten del informe lt1naliacutetico finaL II)J

12

11 paso siguiente es la detemlillacioacuten de las condiciones cromatograacuteficas a las cuales se

aplica Ja mezcla de prueba estas se establecen de la siguiente manera

bull Se escoge el Crnmatoacutegrafo liacuteqllido 111-1050 para efectlar con eacutel las pruebas

referentes al estudio de las condiiexcliones cromatograacuteficas para aplicar la mezcla de prueba y

de la sensibilidad de la misma esta eleccioacuten se basa en el hecho (fe que el HP-1050 es nn

modelo modular compacto y de faacutecil manejo

bull El bucle de inyeccioacuten es de 20 11L lo que asegura una buena eficacia cromatograacutefica y en el clIal se inyecta con una jerlnga de vidrio para HPLC de 100 lL

bull oIDO ya se mencion( la detcccioacutelI de Jos picos es por UltTaVioleta a W1a longitud de

onda de 254 nm

bull La colW1ma usada en la aplicacioacuten de la mezcla de prueba es Ima C-18 (fase inversa)

soacutelo dedicada a este propoacutesito en este trabajo se usa lma columna Merck Licluospher 100

RP-l~ (5 lm) (125 x4 mm)

bull La temperatura de tTabajo de la columna es de 35degC con el fm de evitar las

oscilaciones propias de la temperatura ambiente

bull La fltlse moacutevil tiene Ilna composicioacuten de AcetonitTilo-Agua (70-30 vv) IIsando

dos liacuteneas del cromatoacutegpfo en modo isocraacutetico el Acetonitrilo es grado HPLC y el Agua es

calidad M illi Q (que se cambia cada diacutea) y ambos deben desgasifiacutecarse

bull El Oujo de Ja fase moacutevil es de 100 mUmin

bull La presioacuten debe estar alrededor de los 55 Uars para una columna nueva

Con relacioacuten al sistema ele tratamiento de los datos cromatograacuteficos se pmeba

inicialmente con integradores pequentildeos compactos y faacuteciles de transportar de un equipo a

otro como es el caso del HP 1()2 A en este tipo de integradores es necesario fijar los

siluientes paraacutemetros

I

Zero N ivel del cero de la sei1a1

AH 2i Grado de atenuacioacuten de los picos

CH SP Velocidad del papel del registro

IK VD Andl1Jra miacutenima de los picos para poder ser integrados

THRSH Umbral de pico relacionado con la atenuacioacuten

AR REJ Aacuterea miacutenima de los picos para que sean incluidos en el inrorme

Tambieacuten es aconsejable programar la inhibicioacuten de la integracioacuten en los pnmeros

minutos del cromatograma y nn stop time para la finalizacioacuten del mismo

Jas desventajas ~e este tipo de sistema de tratamiento de datos son flrndamentalmente

la imposibilidad de recalcnlar el cromatograma ClliacuteUldo se modifican algllnas variables de

deteccioacuten yo ~ltegracioacuten y tal vez la maacutes importante que no sllmillistra valores de eficacia

ni de resolucioacuten trnmatogrMica c()ITI0 N y Rbull

Otro sistema de batamiento de datos que se pmeba en el presente trabajo es el

integrador Merck-Hiacutetachi 1) 2000 Chromato-lntegrator este sistema es similar al anterior

con la diferencia de que permite recalcular el cromatograrna sin necesidad de lilla nueva

inyeccioacuten pero al igual que elHP 3392 A no suministra valores de eficacia cromatograacutefica

ni de resolucioacuten

Finalmente se opta por el uso de un software de registro e integracioacuten de los picos

cromatograacuteficos El Ciynkosoft ( Chromatographie Daten System) Este software estaacute

estTIlctmado por archivos relacionados a manera de aacuterbol asiacute

La raiacutez Archivo SMP

Los troncos Archivos PUM SlO lUJD

Las ramas Archivos DE TAE y PRM

las hojas Archivos de datos sin procesar

1 1

S M P Informacioacuten de la mUlstra (Hon1nre volumen de inyeccioacuten etc ) bull

PUM Condiciones cromatograacutefic(ls

Sllti COl1stitlliclo por los archivos I)[T y TAH

RPI) Constituido por el archivo PRM

DET Criterios de deteccioacuten de pico definicioacuten de liacutenea base etc

TAB Tablas de componentes nombres de pico tiempos de retencioacuten etc

PRM Composicilm ltIel informe

Este softwarltiexcl permite In tratamiento amplio del aomatograrna una vez obtenido y

genera un infonne que ademaacutes del cromatograma incluye valores para las siguientes

varianles de cada pico

NU del pico

Nombre del pico

Tipo de pico seguacuten la integracioacuten

Tiempo de retencioacutell (m ill)

Aacuterea de pico (mvrnin)

Altura de pico (mv)

Anchura a la mitad de la altura (min)

Platos teoacutericos

Resolucioacuten

Asimetria de pico

11ay dos caracteriacutesticas principales requeridas para el procesamiento de datos

cromatogriacuteficos La digitalizacioacuten prccisa de la sentildeal analoacutegica del detector y un software

para la deteccioacuten de los pICOS correccioacuten de la deriva de la liacutenea base caacutelculo de aacutereas de

pico tiempos de retencioacuten concentracioacuten de los componentes llsando factores de respllesta

dcl detcctl)r almacenados y la produccioacuten del informe lt1naliacutetico finaL II)J

12

I

Zero N ivel del cero de la sei1a1

AH 2i Grado de atenuacioacuten de los picos

CH SP Velocidad del papel del registro

IK VD Andl1Jra miacutenima de los picos para poder ser integrados

THRSH Umbral de pico relacionado con la atenuacioacuten

AR REJ Aacuterea miacutenima de los picos para que sean incluidos en el inrorme

Tambieacuten es aconsejable programar la inhibicioacuten de la integracioacuten en los pnmeros

minutos del cromatograma y nn stop time para la finalizacioacuten del mismo

Jas desventajas ~e este tipo de sistema de tratamiento de datos son flrndamentalmente

la imposibilidad de recalcnlar el cromatograma ClliacuteUldo se modifican algllnas variables de

deteccioacuten yo ~ltegracioacuten y tal vez la maacutes importante que no sllmillistra valores de eficacia

ni de resolucioacuten trnmatogrMica c()ITI0 N y Rbull

Otro sistema de batamiento de datos que se pmeba en el presente trabajo es el

integrador Merck-Hiacutetachi 1) 2000 Chromato-lntegrator este sistema es similar al anterior

con la diferencia de que permite recalcular el cromatograrna sin necesidad de lilla nueva

inyeccioacuten pero al igual que elHP 3392 A no suministra valores de eficacia cromatograacutefica

ni de resolucioacuten

Finalmente se opta por el uso de un software de registro e integracioacuten de los picos

cromatograacuteficos El Ciynkosoft ( Chromatographie Daten System) Este software estaacute

estTIlctmado por archivos relacionados a manera de aacuterbol asiacute

La raiacutez Archivo SMP

Los troncos Archivos PUM SlO lUJD

Las ramas Archivos DE TAE y PRM

las hojas Archivos de datos sin procesar

1 1

S M P Informacioacuten de la mUlstra (Hon1nre volumen de inyeccioacuten etc ) bull

PUM Condiciones cromatograacutefic(ls

Sllti COl1stitlliclo por los archivos I)[T y TAH

RPI) Constituido por el archivo PRM

DET Criterios de deteccioacuten de pico definicioacuten de liacutenea base etc

TAB Tablas de componentes nombres de pico tiempos de retencioacuten etc

PRM Composicilm ltIel informe

Este softwarltiexcl permite In tratamiento amplio del aomatograrna una vez obtenido y

genera un infonne que ademaacutes del cromatograma incluye valores para las siguientes

varianles de cada pico

NU del pico

Nombre del pico

Tipo de pico seguacuten la integracioacuten

Tiempo de retencioacutell (m ill)

Aacuterea de pico (mvrnin)

Altura de pico (mv)

Anchura a la mitad de la altura (min)

Platos teoacutericos

Resolucioacuten

Asimetria de pico

11ay dos caracteriacutesticas principales requeridas para el procesamiento de datos

cromatogriacuteficos La digitalizacioacuten prccisa de la sentildeal analoacutegica del detector y un software

para la deteccioacuten de los pICOS correccioacuten de la deriva de la liacutenea base caacutelculo de aacutereas de

pico tiempos de retencioacuten concentracioacuten de los componentes llsando factores de respllesta

dcl detcctl)r almacenados y la produccioacuten del informe lt1naliacutetico finaL II)J

12

S M P Informacioacuten de la mUlstra (Hon1nre volumen de inyeccioacuten etc ) bull

PUM Condiciones cromatograacutefic(ls

Sllti COl1stitlliclo por los archivos I)[T y TAH

RPI) Constituido por el archivo PRM

DET Criterios de deteccioacuten de pico definicioacuten de liacutenea base etc

TAB Tablas de componentes nombres de pico tiempos de retencioacuten etc

PRM Composicilm ltIel informe

Este softwarltiexcl permite In tratamiento amplio del aomatograrna una vez obtenido y

genera un infonne que ademaacutes del cromatograma incluye valores para las siguientes

varianles de cada pico

NU del pico

Nombre del pico

Tipo de pico seguacuten la integracioacuten

Tiempo de retencioacutell (m ill)

Aacuterea de pico (mvrnin)

Altura de pico (mv)

Anchura a la mitad de la altura (min)

Platos teoacutericos

Resolucioacuten

Asimetria de pico

11ay dos caracteriacutesticas principales requeridas para el procesamiento de datos

cromatogriacuteficos La digitalizacioacuten prccisa de la sentildeal analoacutegica del detector y un software

para la deteccioacuten de los pICOS correccioacuten de la deriva de la liacutenea base caacutelculo de aacutereas de

pico tiempos de retencioacuten concentracioacuten de los componentes llsando factores de respllesta

dcl detcctl)r almacenados y la produccioacuten del informe lt1naliacutetico finaL II)J

12

22 Aplicacioacuten del test de equipos a cromatoacutegrafos de HPLC

El test de equipos para cromatoacutegrafos de HPLC estaacute pensado para ser aplicado en dos

niveles Un test sencillo y lID test completo de verificacioacuten de instrumentos

221 ApJicacioacuten del test sencillo de verificacioacuten de instrumentos a equipos de

HPLC

En este nivel lo que se pretende es aplicar la mezcla de pmeba en las condiciones

especificadas en el PNT-A-xxxx anexo ndeg 1 de tal manera que se consiga comprobar el

funcionamiento del crontaloacutegralo de 1-11gtLC en un momento detenninado esta comprobacioacuten

se basa fundamentalm6nte en la comparacioacuten del perfil del cromatograma obtenido en ese

mOnlcnto con aquel 4ue se ticne tOIHO estaacutendar para ese equipo ademaacutes en el taacute1culo de la

relacioacuten sentildeaVmido para cada pico del cromatograma a fin de verificar que estaacute dentro de los

liacutemites previstos y fmahnente en la observacioacuten de los valores del informe baacutesicamente los

que hacen referencia a la eficacia la resolucioacuten y la altimeumiddotiacutea de pico valores que a su vez

deben concordar con aquellos esperados para el instrumento

En este caso se efectuacutean dos (2) inyecciones replicadas de la mezcla de pmeba y el

infomle se genera por medio del Gynkosoft tal como se establecioacute en la seccioacuten anterior Se

mide tambieacuten el nivel de mido producido por la liacutenea base del instmrnento y se calcula la

relacioacuten sentildeaVmido a efectos de comparacioacuten como se describe en el anexo nOI

13

222 Aplicaci(n del test completo de verificacioacuten de instrumentos a equipos de

HPLC

En este nivel se pFetende aplicar la mezcla de prueba en las condiciones consignadas

en el PNT-A-xxxx anexo n2 oe tal fonna que se lonsiga ademaacutes de lo especificado en el

apartado anterior la caraacutecterizacioacuten global del funcionamiento del instnunento para ello es

necesario establecer los siguielltes paraacutemetros adicionales

Repetibilidad del equipo

Linealidad (factores de respuesta)

L iacutemites de oetecci~n

Liacutemites de cuan1 ificacioacuten

Se aplica la mezcla de pllIeba a este nivel al illstrumento que se desea estudiar

teniendo en cuenta las siguientes consideraciones

bull Para efectos de calcular la repelibilidad del equipo se realizan como miacutenimo seis (6)

inyecciones replicadas de la mezcla de prueba bajo las mismas condiciones en una misma

jornada de trabajo y se determinan los coeficientes de variacioacuten de las siguientes variables

(para todos los picos del cruumlmatograma)

Tiempo de retencioacuten

Aacuterea de pico

Altura de pico

Nuacutemero de platos

Resolucioacuten

14

bull Es bien sabido que la respllesta de los detectores no es lineal sobre el rango total de

concentracioacuten y la mayoriacutea de los investigadores han intentado calibrar el detector usando la

porcioacuten maacutes lineal de la ClITva de respuesta Conocer esta linealidad es de vital importancia

debido a qle una respuesta lineal del detector puede simplificar los procedimientos de

calibracioacuten y el caacutelculo de las concentraciones a pa11ir de las aacutereas o de las alturas de los

picos

Para establecer la linealidad del cromatoacutegrafo se determina la recta de regresioacuten (de las

aacutereas) calculada aplicando el l1Iaodo ltle miacutenimos cuadrados a los resultados obtenidos al

imalizar solllciones con varias concentraciones de los solutos de prueba L10 j Para ello se

parte de una mezcla de prueba cuya composicioacuten es la sigliente

Naftaleno 500 mgL

Hifenilo 125 rngL

lluoreno 150 mgL

Fenantreno 50 mglL

Antraceno 25 mgl

A partir de la mezcla anterior se hacen diluciones sucesivas (ver anexo nU 2) que se

inyectan en el cromatoacutegrafo hasta lograr un perfil en el que los picos de Jos solutos se

confundan con el mido del instrumento

La linealidad se expresa por medio de las graacuteficas de linealidad (aacuterea frente a masa)

que van acompafiacuteadas oe la ecuacioacuten de regresioacuten respectiva y del valor de ri (graacuteficas ndeg 1

a ndeg 42 del anexo n04)

Otra forma para establecer el rango lineal en cada equipo es inyectar varias soluciones

estaacutendar Los factores de respnesta obtenidos altura o aacuterea por lmirlad de masa inyectada se

representan frente a la mlSil inyectada en cada instante A pm1ir de esas curvas se pueden

obteller los liacutemites inl(liol y suplrior del rallgo lineal para cada compnesto de la mezcla de

pnwba en todos los llJlI ipos exam iexclliados 11 1J

15

Lo anterior qlliere decir que un modo muy conveniente de indicar la linealidad es por

medio de los factores de respuesta (F) que se representan frente a la masa inyectada para

calcular los liacutemites que permiten obtener el rango lineal a partir de la graacutefica ltFgtplusmnO 1ltF)

es ne(esario desalTollar los siguientes pasos

- En primer lugar se calculan los factores de respuesta para cada cantidad de soluto

inyectado

- A continuacioacuten se obtiellc el valor medio de los factores de respuesta calculados este

valor medio se calcula con aquellos factores de respuesta que quedan despueacutes de la

elinuumlnacioacuten de datos aberrantes

Para eliminar los datos aberrantes se aplica el criterio de Box and Whisker Plot

Este es un meacutetodo de Gaacutelculo robusto basado en los siguientes pasos

bull Ordenar los resllltados bull Determinar ]os liacutemites percentiles Q 25 YQ 75 (valores por debajo de los cuales quedan

respectivamente e] 25 y el 75 de los datos)

bull Calcular la distancia entre estos dos liacutemites (d = Q 75 - Q 25)

Esta distancia per~nite definir el criterio que sentildeala los valores aberrantes

bull calcular los liacutemites de confianza inferior y superior

Liacutemite inferior = Q 2) - l) d ([l)

Liacutemite superior = Q 75 + 15 d (LS)

Se consideran aberrantes los datos cuyo valor se encuentre fuera del intervalo acotado

por los valores maacutes proacutexilflos por exceso y por defecto respectivamente a LI y LS [12]

- Finalmente se representan todos los factores de respuesta incluidos los que fueron

eliminados para el caacutelculo de la media de Fiexcl frente a la masa inyectada junto con el valor

medio de Fiexcl y los liacutemiles del lOJ mencionados alTiba

Sobre la graacutefica anterior se detennina el rango de linealidad que corresponde al margeacuten

de masas cuyos valores de Fiexcl esl ))) comprendidos denlTO de los liacutemites de la graacutefica

16

En la figura U aparecen las graacuteficas de la linealidad y de los factores de respuesta para

el Bifenilo en el cromatoacutegrafo liquido JI 1-1 050

Las grMicas de los factores de respuesta (Fiexcl ) que van acompantildeadas de los limites de

deteccioacuten y de cllalltilicacioacuten son las cOITespondientes a las nU 43 a nU B4 del anexo nU 4

bull La informacioacuten de los liacutemites de deteccioacuten puede ser valiosa para estimar siacute I1n

instnunento dado estaacute en capacidad de suministrar una sensibilidad adecuada es decir sirve

para evaluar el rango de concentraciones en el cual se puede usar el equipo El liacutemite de

cualltificacioacuten representa la cantidad maacutes baja de 50hllO cuya aacuterea se puede medir con IIn

coeficiente de variacioacuten aceptable por debajo del limite de cuantificacioacuten se detecta pero no

se cuantifica L13 j

El limite de deteccioacuten (LD) y el liacutemite de cuantificacioacuten (Le) se calculan usando los

cromatogramas finales (correspondientes a las soluciones maacutes diluidas) de la serie de Ia

liucalidad seguacuten las foacutennulas expuestas en el anexo nU 2 Ambos se expresan en ng de

soluto inyectado (teniendo en cuenta el volumen inyectado de la solucioacuten de la mezcla de

prueba)

223 Equipos a los cuales se aplica el test de verificacioacuten

La tabla 1 muestra los equipos de HPLC de la seccioacuten de cromatografiacutea del

depariamento de anaacutelisis del IQS de los cuales se tienen datos obtenidos al aplicarles la

mezcla de pmeba del test de verificacioacuten de instrumentos

17

LINEALIDAD

aacuterea (mv mln) 70 60 50 40 30 20 10

r-- ~--

~ ---shy~

~ ~

00 200 400 600 800 1000 masa (ng)

CromatOgrafo Uquldo HP-1050 aacuterea = 025940 + 005222(rnasa) r cuadrado = 099990

FACTORES DE RESPUESTA Blfenllo

n044 factores de respuesta 04 r--------------______---

03

02

01 1111 -a=middotII bullbull IK= ~~ ----- ---aiexcl

O~~-~~~~~~-~~~~~---~~~~ 10 100 1000

mua (ng) CromatOgrafo Uquldo HP-10SO Hmite deteccioacuten = 0423 ng limite cuantificacioacuten = 1411 ng

FIGURA B Graacuteficas de linealidad y factores de respuesta para el Bifenilo

Tahla 1 Ef(uipos J]LC de la seccioacuten de cromatografIa

CROMATOacuteGRAFO nf4TECTOR DESGASIFICADOR

HP-I050 SERIES 1050 SI

HP-I090 1040 A f)AD SI

PE-SERIES 2 PE-Le 75 NO

KNK-500-A WATERS 440 SI

PE-SERIES2 AB 757 Af) NO

KNK-500-A AB 757 AD SI

HP-l090 AB 757 AD SI

Algunas caracteriacutesticas generales de las bombas ele los instmmentos de la tahla I son

las siguientes

bull EL cromatoacutegrafo liacutequido HP-I050 cuenta con cuatro liacuteneas de solvente y con un

desgasiftcador a vaciacuteo realiza la mezcla a baja presioacuten con una vaacutelvula proporcional de alta

velocidad Posee lUla bomba de dos pistones duales en serie y esto le permite hacer mezclas

en modo isocraacutetico y en gradieute

bull El cromatoacutegrafo liacutequido HP-I090 tiene dos canales activos (A y B) de suministro de

solvente La desgasiftcacioacuten se efectuacutea con Helio Cada canal comprende un recipiente de

solvente y illa bomba de jeringa dual con Wla vaacutelvula rotatoria los dos eluyentes se mezclan

a presioacuten media antes de ser bomheados a alta presioacuten por medio de lUla bomba de

membrana a traveacutes del inyector y hacia la cohunna Estaacute capacitado para trahajo en modo

isocraacutetico yen gradiente

bull El cromatoacutegrafo liacutequido PE-Series 2 cuenla con dos liacuteneas de solventes y no posee

desgasiftcador incorporado Tieue dos bombas cada una de ellas con desplazamiento I

positivo reciacuteproco de cabeza dllal ( cada una de las dos bomhas del eqllipo ntilizl pistones

dualcmiddots de zafiro) La mezcla se rlaliil a alta presioacuten con un mezclador dinaacuternilto

18

bull El ltromatoacutegraJo liacutequido KNK-SOO Series A posee cuatro liacuteneas de suministro de

solvente con desgasificador inc(Hvorado (usando Helio) Tiene lIDa vaacutelvula proporcional en

la que se neva a cabo la mezcla a baja presioacuten y una bomba que trabaja con dos pistones

duales en serie

La tabla II resume los aspectos maacutes relevantes de los detectores UV usados en la

realizacioacuten de este trabajo

Tabla 11 detectores de los cromatoacutegrafos HP Le

DETECTOR Rango (nm) anchul

banda (nm)

volumen

celda (uL)

presioacuten (maacutex)

celda (Bars)

camino

(mm)

oacuteptico

1040 A DAD 190-600 4-40() 45 40 6

Selies 1050 190-600 65 14 40 8

AB 757-AD 190-700 5 12 --shy 8

Waters 440 254 --shy --shy 70 10

~C-75 190-600 39 8 140 10

Todos los detectores de la tabla II poseen lIDa laacutempara de Deuterio con excepcioacuten del

Waters 440 que cuenta con 1ma de Mercurio

Los detectores Series 1050 AB 757-AD Y LC-75 son de A variable con red de

difraccioacuten como elemento monoltromador

El detector 1040 A DAD es un detector de matriz de diodos (red de difraccioacuten

holograacutefica)

El detector Waters 440 puede trabajar a vanas As con filtros como sistema

monocromador

19

Cada cromatoacutegrafo estaacute equipado con un inyector manual tipo Rheodyne con un bucle

dI 20llL y tiene la posihilidac1 de tennostatar la columna a 35u C (temperahlra de aplicacioacuten

de la mezcla de prueba)

A todos los eqUipos listados en la tabla 1 se les aplicoacute el test de verificacioacuten de

instrumentos Todos los cromatogramas tmto de la mezcla de prueba como del ruido de

los equipos examinados estaacuten al final del presente trabajo y constituyen el anexo nU 5 al

igual que los cromatogramas con los que se calculm los liacutemites de cuantificacioacuten para cada

instrumento I

Los resultados de repetihilidad obtenidos al aplicar la mezcla de prueba a los equipos

evaluados se presentan en la tabla de reswnen general que constituye el anexo nU 6 asiacute como

tambieacuten los resultados de la reproducibilidad de la mezcla de prueba en el cromatoacutegrafo

Iiacuteq1lido JI 1gt-1 0)0 S~ incluyen ademaacutes olros resultados generales de lodos los equipos

23 Sensibilidad lid t(St de vuifkacioacuten de instrumentos

Esta sensibilidad es lID criterio de suma importancia que hay que considerar y se refiere

a los cambios que se observan al aplicar la mezcla de prueba cuando suceden pequentildeas

variaciones en las condiciones crOlnatograacuteficas del instrumento

Con el fin de caracterizar esta sensibilidad se cuantifican los cambios experimentados

por los valores de algunas variables como por ejemplo el tiempo de retencioacuten el aacuterea de

pico la altura del pico la anchura a media banda el nuacutemero de platos teoacutericos y la

resolucioacuten Estas variaciones se deben a su vez a cambios provocados deliberadamente en

algunos paraacutemetros cromatograacutelicos como son la composicioacuten de la fac moacutevil el lujo de la

fase moacutevil la tcmperatnra de la colmnna el volumen de inyeccioacuten y la longitud de onda de

deteccioacuten

20

Con eslo se pcr~lglle no soacutelo cuantificar la magnitud del cambio y determinar que

variables cromatograacuteficas inllllyen maacutes sobre los resultados finales del test sino tambieacuten

decidir ante un cambio imprevisto en la respuesta del equipo cual puede ser la posible causa

de la illomaliacutea es decir es lUla manera de diagnosticar la causas de un mal funcionamiento

en un cromatoacutegrafo liacutequido de HPLe En resumen se trata de establecer la capacidad que

tiene el test para detectar peqllcilas variaciones en las condiciones cromatograacuteficas del

instrumento

Es necesario considerar la estabilidad del tiempo de retencioacuten ya que afecta

directamente a la identificacioacuten de los compuestos Se necesita que el equipo sea capaz de

suministrar tiempos de retencioacuten absolutos reproducibles para reducir las incertezas

asociadas con la identificacioacuten del analito

La estabilidad del factor de rcspucsla ( como aacuterea o altma de pico) inlluye sobre los

resultados cuantitativos del anaacutelisis

De otro lado la estabilidad de los paraacutemetros de separacioacuten (anchura a media banda

nuacutemero de platos teoacutericos y resolllcioacuten) garantiza la calidad de la cromatogratla como

teacutecnica separativa

Finalmente es indispensable considerar la sensibilidad frente a cambios en la longitud

de onda lo que asegllfa la buena marcha del proceso de deteccioacuten de los picos

cromatograacuteficos

La tabla 11 [ muestra los paraacutemetJmiddotos que se toman en el presente trabajo para llevar a

cabo el estudio de la sensibilidad del test de verifiacutecacioacuten se consigna en la tabla el

paraacutemetro cromatograacutefiacuteco y las variaciones que se efectuacutean alrededor de Sil valor nominal

Tabla lJI Jlsludio de In sensibilidad del test de veriticacioacuten

iexclPARAacuteMETRO

Volumen de inyeccioacuten

Composicioacuten fase moacutevil

Flujo fase moacutevil

Temperatura de columna

iexclLongitud de onda deteccioacuten

VALOR NOIHNAL

20 nL

CH 3 CNH 2 O (7030 vv)

100 rnJmin

254 run

VARIACIOacuteN

10 50 Y 100 uL

de 65 a 75 de CH 3 CN

de 090 a 110 rnJmin

de 251 a 258 run

Se observan los cambios experimentados por las variables relacionadas con los picos

cromatograficos (tiempo de retencioacuten etc) y se representan esos valores frente a las

variaciones hechas a propoacutesito en las condiciones cromatograacuteficas estas graacuteficas van desde

la nU ~5 a la ndeg 1O~ del anexo nU 4

24 Cartas de control ele la mezcla de prueba del test de verificacioacuten

Las cartas de control de la calidad estadiacutestica son una herramienta simple pero

poderosa para verificar la calidad de lm procedimiento analiacutetico Conceptualmente son muy

sencillas Se mide regularmente un material estaacutendar y se representan las respuestas

analiacuteticas sobre un eje de tiempos en lna carta siacute la carta muestra variaciones alrededor del

resultado esperado diferentes a las del azar ello sugiere que algtma cosa ha ido mal en el

proceso de medida Para ayudar a decidir si esto ha sucedido se marcan sobre la carta

liacutemites de control Se espera qlle las respuestas pennanezcan dentro de esos liacutemites

Si un sistema de medida es estable de tal manera que muestra UJ1a variacioacuten aleatoria

alrededor de lm valor de referencia dado y el tamantildeo de esa variacioacuten (medido como la

desviacioacuten estaacutendar) pennanece constante se puede decir que el sistema estaacute en control

estadiacutestico o simplemclltc en control El objetivo al usar canas de control es lograr y

mantener ese estado de cOlllrol estadiacutestico 114J

Las cartas de control se pueden usar como una especie de base de dalos del laboratorio

donde se almacena una infonnacioacuten que puede ser oe gran utilidad para disentildear futuros

esludios experimentales

La liacutenea central en las cartas de control se torna como el valor medio alrededor del cual

estaacuten variando las medidas los limiles de control se colocan tres veces la desviacioacuten

estaacutendar por encima y por debajo de la liacutenea central ademaacutes hay un segundo grupo de

liacutemites de control llamados liacutemites oe advertencia a una distancia de dos veces la

desviacioacuten estaacutendar a ambos lados de la liacutenea central

No hay UB acueroo universal sobre como usar las cartas oe control Compantildeiacuteas

diferentes usan reglas diferentes IJ na sugerencia es que se requiere una accioacuten siacute se detecta

algo de lo que sigue

i) Cualquier plUlto fucra de los liacutemites de control

ii) Siete puntos todos por encima o por debajo de la linea central

iii) Siete intclvalos hacia arriba o hacia abajo (es decir ocho puntos consecutivos

ascendentes o descendentes)

iv) Cualquier otro patroacuten obviamente no aleatorio

25 Resultarlo~ y rlis~usioacuten

251 Lincnlidnd y factores de r(spuesta

ULas graacuteficas nUl a n 42 (anexo n4) muestran las rectas de regresioacuten lineal (aacuterea en

mVmin frente a la masa inyeclada en ng) para todos los picos de la mezcla de prueba en

todas y cada lma de las siete (7) configuraciones de HPLC estudiadas en estc trabajo Junto

a cada graacutefica aparece la cuacioacuten de regresioacuten y el valor de r 2 (coeficienle de

detcrminacioacuteu)

I

Los valores de r 2 se resumen luego en una tabla que aparece despueacutes de la cinco

graacuteficas correspondientes a la linealidad de todos los solutos de la mezcla de prueba para

cada equipo

Para todas las graacuteficas los valores de r 2 son aceptables y aproximadamente iguales

esto significa que en todos los casos existe una relacioacuten lineal entre las dos variables

representadas (como era de esperarse)

Estas graacuteficas no aportan mucha informacioacuten con respecto a la linealidad del sistema y

menos en las zonas de bajas concentraciones donde se pierde la linealidad del mismo y

tampoco permiten efectuar comparaciones entre equipos ya que todas ellas son praacutecticamente

equivalentes

En las graacuteficas n043 a la nU~4 (anexo n04) aparecen los factores de respuesta para todos

los picos de la mezcla de prueba en todos los cromatoacutegrafos ensayados (Factor de

respuesta Areamasa inyectada frente a la masa inyectada en ng) Ver tambieacuten la figura B

Cada graacutefica va acompantildeada por los valores del liacutemite de deteccioacuten y del liacutemite de

cuantificacioacuten ambos en ng para el so luto correspondiente Finalmente aparece (cada cinco

graacuteficas) una tabla con el rango lineal y la relacioacuten sentildealruido tambieacuten para cada soluto el

rango lineal es el cociente entre la masa mayor y la masa menor de la porcioacuten lineal de la

cwva y la relacioacuten sentildealmido resulta de dividir la altura del pico cromatograacutefico de un

soJuto en la mezcla de lpmeba (en mv) entre la altura del ruido (en mv)

En estas graacuteficas se puede visualizar cual es el liacutemite inferior del rango lineal es decir

a partir de que cantidad de sohuo inyectado el sistema deja de ser lineal (este liacutemite no

coincide necesariamente con el liacutemite de cuantificacioacuten) tambieacuten se observa una tendencia a

la peacuterdida de la linealidad en la zona de altas conceutraciones En consecuencia este tipo de

graacutefico suministra mayor informacioacuten que el graacutefico de regresioacuten y permite ef~ctuar

comparaciones

24

222 Aplicaci(n del test completo de verificacioacuten de instrumentos a equipos de

HPLC

En este nivel se pFetende aplicar la mezcla de prueba en las condiciones consignadas

en el PNT-A-xxxx anexo n2 oe tal fonna que se lonsiga ademaacutes de lo especificado en el

apartado anterior la caraacutecterizacioacuten global del funcionamiento del instnunento para ello es

necesario establecer los siguielltes paraacutemetros adicionales

Repetibilidad del equipo

Linealidad (factores de respuesta)

L iacutemites de oetecci~n

Liacutemites de cuan1 ificacioacuten

Se aplica la mezcla de pllIeba a este nivel al illstrumento que se desea estudiar

teniendo en cuenta las siguientes consideraciones

bull Para efectos de calcular la repelibilidad del equipo se realizan como miacutenimo seis (6)

inyecciones replicadas de la mezcla de prueba bajo las mismas condiciones en una misma

jornada de trabajo y se determinan los coeficientes de variacioacuten de las siguientes variables

(para todos los picos del cruumlmatograma)

Tiempo de retencioacuten

Aacuterea de pico

Altura de pico

Nuacutemero de platos

Resolucioacuten

14

bull Es bien sabido que la respllesta de los detectores no es lineal sobre el rango total de

concentracioacuten y la mayoriacutea de los investigadores han intentado calibrar el detector usando la

porcioacuten maacutes lineal de la ClITva de respuesta Conocer esta linealidad es de vital importancia

debido a qle una respuesta lineal del detector puede simplificar los procedimientos de

calibracioacuten y el caacutelculo de las concentraciones a pa11ir de las aacutereas o de las alturas de los

picos

Para establecer la linealidad del cromatoacutegrafo se determina la recta de regresioacuten (de las

aacutereas) calculada aplicando el l1Iaodo ltle miacutenimos cuadrados a los resultados obtenidos al

imalizar solllciones con varias concentraciones de los solutos de prueba L10 j Para ello se

parte de una mezcla de prueba cuya composicioacuten es la sigliente

Naftaleno 500 mgL

Hifenilo 125 rngL

lluoreno 150 mgL

Fenantreno 50 mglL

Antraceno 25 mgl

A partir de la mezcla anterior se hacen diluciones sucesivas (ver anexo nU 2) que se

inyectan en el cromatoacutegrafo hasta lograr un perfil en el que los picos de Jos solutos se

confundan con el mido del instrumento

La linealidad se expresa por medio de las graacuteficas de linealidad (aacuterea frente a masa)

que van acompafiacuteadas oe la ecuacioacuten de regresioacuten respectiva y del valor de ri (graacuteficas ndeg 1

a ndeg 42 del anexo n04)

Otra forma para establecer el rango lineal en cada equipo es inyectar varias soluciones

estaacutendar Los factores de respnesta obtenidos altura o aacuterea por lmirlad de masa inyectada se

representan frente a la mlSil inyectada en cada instante A pm1ir de esas curvas se pueden

obteller los liacutemites inl(liol y suplrior del rallgo lineal para cada compnesto de la mezcla de

pnwba en todos los llJlI ipos exam iexclliados 11 1J

15

Lo anterior qlliere decir que un modo muy conveniente de indicar la linealidad es por

medio de los factores de respuesta (F) que se representan frente a la masa inyectada para

calcular los liacutemites que permiten obtener el rango lineal a partir de la graacutefica ltFgtplusmnO 1ltF)

es ne(esario desalTollar los siguientes pasos

- En primer lugar se calculan los factores de respuesta para cada cantidad de soluto

inyectado

- A continuacioacuten se obtiellc el valor medio de los factores de respuesta calculados este

valor medio se calcula con aquellos factores de respuesta que quedan despueacutes de la

elinuumlnacioacuten de datos aberrantes

Para eliminar los datos aberrantes se aplica el criterio de Box and Whisker Plot

Este es un meacutetodo de Gaacutelculo robusto basado en los siguientes pasos

bull Ordenar los resllltados bull Determinar ]os liacutemites percentiles Q 25 YQ 75 (valores por debajo de los cuales quedan

respectivamente e] 25 y el 75 de los datos)

bull Calcular la distancia entre estos dos liacutemites (d = Q 75 - Q 25)

Esta distancia per~nite definir el criterio que sentildeala los valores aberrantes

bull calcular los liacutemites de confianza inferior y superior

Liacutemite inferior = Q 2) - l) d ([l)

Liacutemite superior = Q 75 + 15 d (LS)

Se consideran aberrantes los datos cuyo valor se encuentre fuera del intervalo acotado

por los valores maacutes proacutexilflos por exceso y por defecto respectivamente a LI y LS [12]

- Finalmente se representan todos los factores de respuesta incluidos los que fueron

eliminados para el caacutelculo de la media de Fiexcl frente a la masa inyectada junto con el valor

medio de Fiexcl y los liacutemiles del lOJ mencionados alTiba

Sobre la graacutefica anterior se detennina el rango de linealidad que corresponde al margeacuten

de masas cuyos valores de Fiexcl esl ))) comprendidos denlTO de los liacutemites de la graacutefica

16

En la figura U aparecen las graacuteficas de la linealidad y de los factores de respuesta para

el Bifenilo en el cromatoacutegrafo liquido JI 1-1 050

Las grMicas de los factores de respuesta (Fiexcl ) que van acompantildeadas de los limites de

deteccioacuten y de cllalltilicacioacuten son las cOITespondientes a las nU 43 a nU B4 del anexo nU 4

bull La informacioacuten de los liacutemites de deteccioacuten puede ser valiosa para estimar siacute I1n

instnunento dado estaacute en capacidad de suministrar una sensibilidad adecuada es decir sirve

para evaluar el rango de concentraciones en el cual se puede usar el equipo El liacutemite de

cualltificacioacuten representa la cantidad maacutes baja de 50hllO cuya aacuterea se puede medir con IIn

coeficiente de variacioacuten aceptable por debajo del limite de cuantificacioacuten se detecta pero no

se cuantifica L13 j

El limite de deteccioacuten (LD) y el liacutemite de cuantificacioacuten (Le) se calculan usando los

cromatogramas finales (correspondientes a las soluciones maacutes diluidas) de la serie de Ia

liucalidad seguacuten las foacutennulas expuestas en el anexo nU 2 Ambos se expresan en ng de

soluto inyectado (teniendo en cuenta el volumen inyectado de la solucioacuten de la mezcla de

prueba)

223 Equipos a los cuales se aplica el test de verificacioacuten

La tabla 1 muestra los equipos de HPLC de la seccioacuten de cromatografiacutea del

depariamento de anaacutelisis del IQS de los cuales se tienen datos obtenidos al aplicarles la

mezcla de pmeba del test de verificacioacuten de instrumentos

17

LINEALIDAD

aacuterea (mv mln) 70 60 50 40 30 20 10

r-- ~--

~ ---shy~

~ ~

00 200 400 600 800 1000 masa (ng)

CromatOgrafo Uquldo HP-1050 aacuterea = 025940 + 005222(rnasa) r cuadrado = 099990

FACTORES DE RESPUESTA Blfenllo

n044 factores de respuesta 04 r--------------______---

03

02

01 1111 -a=middotII bullbull IK= ~~ ----- ---aiexcl

O~~-~~~~~~-~~~~~---~~~~ 10 100 1000

mua (ng) CromatOgrafo Uquldo HP-10SO Hmite deteccioacuten = 0423 ng limite cuantificacioacuten = 1411 ng

FIGURA B Graacuteficas de linealidad y factores de respuesta para el Bifenilo

Tahla 1 Ef(uipos J]LC de la seccioacuten de cromatografIa

CROMATOacuteGRAFO nf4TECTOR DESGASIFICADOR

HP-I050 SERIES 1050 SI

HP-I090 1040 A f)AD SI

PE-SERIES 2 PE-Le 75 NO

KNK-500-A WATERS 440 SI

PE-SERIES2 AB 757 Af) NO

KNK-500-A AB 757 AD SI

HP-l090 AB 757 AD SI

Algunas caracteriacutesticas generales de las bombas ele los instmmentos de la tahla I son

las siguientes

bull EL cromatoacutegrafo liacutequido HP-I050 cuenta con cuatro liacuteneas de solvente y con un

desgasiftcador a vaciacuteo realiza la mezcla a baja presioacuten con una vaacutelvula proporcional de alta

velocidad Posee lUla bomba de dos pistones duales en serie y esto le permite hacer mezclas

en modo isocraacutetico y en gradieute

bull El cromatoacutegrafo liacutequido HP-I090 tiene dos canales activos (A y B) de suministro de

solvente La desgasiftcacioacuten se efectuacutea con Helio Cada canal comprende un recipiente de

solvente y illa bomba de jeringa dual con Wla vaacutelvula rotatoria los dos eluyentes se mezclan

a presioacuten media antes de ser bomheados a alta presioacuten por medio de lUla bomba de

membrana a traveacutes del inyector y hacia la cohunna Estaacute capacitado para trahajo en modo

isocraacutetico yen gradiente

bull El cromatoacutegrafo liacutequido PE-Series 2 cuenla con dos liacuteneas de solventes y no posee

desgasiftcador incorporado Tieue dos bombas cada una de ellas con desplazamiento I

positivo reciacuteproco de cabeza dllal ( cada una de las dos bomhas del eqllipo ntilizl pistones

dualcmiddots de zafiro) La mezcla se rlaliil a alta presioacuten con un mezclador dinaacuternilto

18

bull El ltromatoacutegraJo liacutequido KNK-SOO Series A posee cuatro liacuteneas de suministro de

solvente con desgasificador inc(Hvorado (usando Helio) Tiene lIDa vaacutelvula proporcional en

la que se neva a cabo la mezcla a baja presioacuten y una bomba que trabaja con dos pistones

duales en serie

La tabla II resume los aspectos maacutes relevantes de los detectores UV usados en la

realizacioacuten de este trabajo

Tabla 11 detectores de los cromatoacutegrafos HP Le

DETECTOR Rango (nm) anchul

banda (nm)

volumen

celda (uL)

presioacuten (maacutex)

celda (Bars)

camino

(mm)

oacuteptico

1040 A DAD 190-600 4-40() 45 40 6

Selies 1050 190-600 65 14 40 8

AB 757-AD 190-700 5 12 --shy 8

Waters 440 254 --shy --shy 70 10

~C-75 190-600 39 8 140 10

Todos los detectores de la tabla II poseen lIDa laacutempara de Deuterio con excepcioacuten del

Waters 440 que cuenta con 1ma de Mercurio

Los detectores Series 1050 AB 757-AD Y LC-75 son de A variable con red de

difraccioacuten como elemento monoltromador

El detector 1040 A DAD es un detector de matriz de diodos (red de difraccioacuten

holograacutefica)

El detector Waters 440 puede trabajar a vanas As con filtros como sistema

monocromador

19

Cada cromatoacutegrafo estaacute equipado con un inyector manual tipo Rheodyne con un bucle

dI 20llL y tiene la posihilidac1 de tennostatar la columna a 35u C (temperahlra de aplicacioacuten

de la mezcla de prueba)

A todos los eqUipos listados en la tabla 1 se les aplicoacute el test de verificacioacuten de

instrumentos Todos los cromatogramas tmto de la mezcla de prueba como del ruido de

los equipos examinados estaacuten al final del presente trabajo y constituyen el anexo nU 5 al

igual que los cromatogramas con los que se calculm los liacutemites de cuantificacioacuten para cada

instrumento I

Los resultados de repetihilidad obtenidos al aplicar la mezcla de prueba a los equipos

evaluados se presentan en la tabla de reswnen general que constituye el anexo nU 6 asiacute como

tambieacuten los resultados de la reproducibilidad de la mezcla de prueba en el cromatoacutegrafo

Iiacuteq1lido JI 1gt-1 0)0 S~ incluyen ademaacutes olros resultados generales de lodos los equipos

23 Sensibilidad lid t(St de vuifkacioacuten de instrumentos

Esta sensibilidad es lID criterio de suma importancia que hay que considerar y se refiere

a los cambios que se observan al aplicar la mezcla de prueba cuando suceden pequentildeas

variaciones en las condiciones crOlnatograacuteficas del instrumento

Con el fin de caracterizar esta sensibilidad se cuantifican los cambios experimentados

por los valores de algunas variables como por ejemplo el tiempo de retencioacuten el aacuterea de

pico la altura del pico la anchura a media banda el nuacutemero de platos teoacutericos y la

resolucioacuten Estas variaciones se deben a su vez a cambios provocados deliberadamente en

algunos paraacutemetros cromatograacutelicos como son la composicioacuten de la fac moacutevil el lujo de la

fase moacutevil la tcmperatnra de la colmnna el volumen de inyeccioacuten y la longitud de onda de

deteccioacuten

20

Con eslo se pcr~lglle no soacutelo cuantificar la magnitud del cambio y determinar que

variables cromatograacuteficas inllllyen maacutes sobre los resultados finales del test sino tambieacuten

decidir ante un cambio imprevisto en la respuesta del equipo cual puede ser la posible causa

de la illomaliacutea es decir es lUla manera de diagnosticar la causas de un mal funcionamiento

en un cromatoacutegrafo liacutequido de HPLe En resumen se trata de establecer la capacidad que

tiene el test para detectar peqllcilas variaciones en las condiciones cromatograacuteficas del

instrumento

Es necesario considerar la estabilidad del tiempo de retencioacuten ya que afecta

directamente a la identificacioacuten de los compuestos Se necesita que el equipo sea capaz de

suministrar tiempos de retencioacuten absolutos reproducibles para reducir las incertezas

asociadas con la identificacioacuten del analito

La estabilidad del factor de rcspucsla ( como aacuterea o altma de pico) inlluye sobre los

resultados cuantitativos del anaacutelisis

De otro lado la estabilidad de los paraacutemetros de separacioacuten (anchura a media banda

nuacutemero de platos teoacutericos y resolllcioacuten) garantiza la calidad de la cromatogratla como

teacutecnica separativa

Finalmente es indispensable considerar la sensibilidad frente a cambios en la longitud

de onda lo que asegllfa la buena marcha del proceso de deteccioacuten de los picos

cromatograacuteficos

La tabla 11 [ muestra los paraacutemetJmiddotos que se toman en el presente trabajo para llevar a

cabo el estudio de la sensibilidad del test de verifiacutecacioacuten se consigna en la tabla el

paraacutemetro cromatograacutefiacuteco y las variaciones que se efectuacutean alrededor de Sil valor nominal

Tabla lJI Jlsludio de In sensibilidad del test de veriticacioacuten

iexclPARAacuteMETRO

Volumen de inyeccioacuten

Composicioacuten fase moacutevil

Flujo fase moacutevil

Temperatura de columna

iexclLongitud de onda deteccioacuten

VALOR NOIHNAL

20 nL

CH 3 CNH 2 O (7030 vv)

100 rnJmin

254 run

VARIACIOacuteN

10 50 Y 100 uL

de 65 a 75 de CH 3 CN

de 090 a 110 rnJmin

de 251 a 258 run

Se observan los cambios experimentados por las variables relacionadas con los picos

cromatograficos (tiempo de retencioacuten etc) y se representan esos valores frente a las

variaciones hechas a propoacutesito en las condiciones cromatograacuteficas estas graacuteficas van desde

la nU ~5 a la ndeg 1O~ del anexo nU 4

24 Cartas de control ele la mezcla de prueba del test de verificacioacuten

Las cartas de control de la calidad estadiacutestica son una herramienta simple pero

poderosa para verificar la calidad de lm procedimiento analiacutetico Conceptualmente son muy

sencillas Se mide regularmente un material estaacutendar y se representan las respuestas

analiacuteticas sobre un eje de tiempos en lna carta siacute la carta muestra variaciones alrededor del

resultado esperado diferentes a las del azar ello sugiere que algtma cosa ha ido mal en el

proceso de medida Para ayudar a decidir si esto ha sucedido se marcan sobre la carta

liacutemites de control Se espera qlle las respuestas pennanezcan dentro de esos liacutemites

Si un sistema de medida es estable de tal manera que muestra UJ1a variacioacuten aleatoria

alrededor de lm valor de referencia dado y el tamantildeo de esa variacioacuten (medido como la

desviacioacuten estaacutendar) pennanece constante se puede decir que el sistema estaacute en control

estadiacutestico o simplemclltc en control El objetivo al usar canas de control es lograr y

mantener ese estado de cOlllrol estadiacutestico 114J

Las cartas de control se pueden usar como una especie de base de dalos del laboratorio

donde se almacena una infonnacioacuten que puede ser oe gran utilidad para disentildear futuros

esludios experimentales

La liacutenea central en las cartas de control se torna como el valor medio alrededor del cual

estaacuten variando las medidas los limiles de control se colocan tres veces la desviacioacuten

estaacutendar por encima y por debajo de la liacutenea central ademaacutes hay un segundo grupo de

liacutemites de control llamados liacutemites oe advertencia a una distancia de dos veces la

desviacioacuten estaacutendar a ambos lados de la liacutenea central

No hay UB acueroo universal sobre como usar las cartas oe control Compantildeiacuteas

diferentes usan reglas diferentes IJ na sugerencia es que se requiere una accioacuten siacute se detecta

algo de lo que sigue

i) Cualquier plUlto fucra de los liacutemites de control

ii) Siete puntos todos por encima o por debajo de la linea central

iii) Siete intclvalos hacia arriba o hacia abajo (es decir ocho puntos consecutivos

ascendentes o descendentes)

iv) Cualquier otro patroacuten obviamente no aleatorio

25 Resultarlo~ y rlis~usioacuten

251 Lincnlidnd y factores de r(spuesta

ULas graacuteficas nUl a n 42 (anexo n4) muestran las rectas de regresioacuten lineal (aacuterea en

mVmin frente a la masa inyeclada en ng) para todos los picos de la mezcla de prueba en

todas y cada lma de las siete (7) configuraciones de HPLC estudiadas en estc trabajo Junto

a cada graacutefica aparece la cuacioacuten de regresioacuten y el valor de r 2 (coeficienle de

detcrminacioacuteu)

I

Los valores de r 2 se resumen luego en una tabla que aparece despueacutes de la cinco

graacuteficas correspondientes a la linealidad de todos los solutos de la mezcla de prueba para

cada equipo

Para todas las graacuteficas los valores de r 2 son aceptables y aproximadamente iguales

esto significa que en todos los casos existe una relacioacuten lineal entre las dos variables

representadas (como era de esperarse)

Estas graacuteficas no aportan mucha informacioacuten con respecto a la linealidad del sistema y

menos en las zonas de bajas concentraciones donde se pierde la linealidad del mismo y

tampoco permiten efectuar comparaciones entre equipos ya que todas ellas son praacutecticamente

equivalentes

En las graacuteficas n043 a la nU~4 (anexo n04) aparecen los factores de respuesta para todos

los picos de la mezcla de prueba en todos los cromatoacutegrafos ensayados (Factor de

respuesta Areamasa inyectada frente a la masa inyectada en ng) Ver tambieacuten la figura B

Cada graacutefica va acompantildeada por los valores del liacutemite de deteccioacuten y del liacutemite de

cuantificacioacuten ambos en ng para el so luto correspondiente Finalmente aparece (cada cinco

graacuteficas) una tabla con el rango lineal y la relacioacuten sentildealruido tambieacuten para cada soluto el

rango lineal es el cociente entre la masa mayor y la masa menor de la porcioacuten lineal de la

cwva y la relacioacuten sentildealmido resulta de dividir la altura del pico cromatograacutefico de un

soJuto en la mezcla de lpmeba (en mv) entre la altura del ruido (en mv)

En estas graacuteficas se puede visualizar cual es el liacutemite inferior del rango lineal es decir

a partir de que cantidad de sohuo inyectado el sistema deja de ser lineal (este liacutemite no

coincide necesariamente con el liacutemite de cuantificacioacuten) tambieacuten se observa una tendencia a

la peacuterdida de la linealidad en la zona de altas conceutraciones En consecuencia este tipo de

graacutefico suministra mayor informacioacuten que el graacutefico de regresioacuten y permite ef~ctuar

comparaciones

24

bull Es bien sabido que la respllesta de los detectores no es lineal sobre el rango total de

concentracioacuten y la mayoriacutea de los investigadores han intentado calibrar el detector usando la

porcioacuten maacutes lineal de la ClITva de respuesta Conocer esta linealidad es de vital importancia

debido a qle una respuesta lineal del detector puede simplificar los procedimientos de

calibracioacuten y el caacutelculo de las concentraciones a pa11ir de las aacutereas o de las alturas de los

picos

Para establecer la linealidad del cromatoacutegrafo se determina la recta de regresioacuten (de las

aacutereas) calculada aplicando el l1Iaodo ltle miacutenimos cuadrados a los resultados obtenidos al

imalizar solllciones con varias concentraciones de los solutos de prueba L10 j Para ello se

parte de una mezcla de prueba cuya composicioacuten es la sigliente

Naftaleno 500 mgL

Hifenilo 125 rngL

lluoreno 150 mgL

Fenantreno 50 mglL

Antraceno 25 mgl

A partir de la mezcla anterior se hacen diluciones sucesivas (ver anexo nU 2) que se

inyectan en el cromatoacutegrafo hasta lograr un perfil en el que los picos de Jos solutos se

confundan con el mido del instrumento

La linealidad se expresa por medio de las graacuteficas de linealidad (aacuterea frente a masa)

que van acompafiacuteadas oe la ecuacioacuten de regresioacuten respectiva y del valor de ri (graacuteficas ndeg 1

a ndeg 42 del anexo n04)

Otra forma para establecer el rango lineal en cada equipo es inyectar varias soluciones

estaacutendar Los factores de respnesta obtenidos altura o aacuterea por lmirlad de masa inyectada se

representan frente a la mlSil inyectada en cada instante A pm1ir de esas curvas se pueden

obteller los liacutemites inl(liol y suplrior del rallgo lineal para cada compnesto de la mezcla de

pnwba en todos los llJlI ipos exam iexclliados 11 1J

15

Lo anterior qlliere decir que un modo muy conveniente de indicar la linealidad es por

medio de los factores de respuesta (F) que se representan frente a la masa inyectada para

calcular los liacutemites que permiten obtener el rango lineal a partir de la graacutefica ltFgtplusmnO 1ltF)

es ne(esario desalTollar los siguientes pasos

- En primer lugar se calculan los factores de respuesta para cada cantidad de soluto

inyectado

- A continuacioacuten se obtiellc el valor medio de los factores de respuesta calculados este

valor medio se calcula con aquellos factores de respuesta que quedan despueacutes de la

elinuumlnacioacuten de datos aberrantes

Para eliminar los datos aberrantes se aplica el criterio de Box and Whisker Plot

Este es un meacutetodo de Gaacutelculo robusto basado en los siguientes pasos

bull Ordenar los resllltados bull Determinar ]os liacutemites percentiles Q 25 YQ 75 (valores por debajo de los cuales quedan

respectivamente e] 25 y el 75 de los datos)

bull Calcular la distancia entre estos dos liacutemites (d = Q 75 - Q 25)

Esta distancia per~nite definir el criterio que sentildeala los valores aberrantes

bull calcular los liacutemites de confianza inferior y superior

Liacutemite inferior = Q 2) - l) d ([l)

Liacutemite superior = Q 75 + 15 d (LS)

Se consideran aberrantes los datos cuyo valor se encuentre fuera del intervalo acotado

por los valores maacutes proacutexilflos por exceso y por defecto respectivamente a LI y LS [12]

- Finalmente se representan todos los factores de respuesta incluidos los que fueron

eliminados para el caacutelculo de la media de Fiexcl frente a la masa inyectada junto con el valor

medio de Fiexcl y los liacutemiles del lOJ mencionados alTiba

Sobre la graacutefica anterior se detennina el rango de linealidad que corresponde al margeacuten

de masas cuyos valores de Fiexcl esl ))) comprendidos denlTO de los liacutemites de la graacutefica

16

En la figura U aparecen las graacuteficas de la linealidad y de los factores de respuesta para

el Bifenilo en el cromatoacutegrafo liquido JI 1-1 050

Las grMicas de los factores de respuesta (Fiexcl ) que van acompantildeadas de los limites de

deteccioacuten y de cllalltilicacioacuten son las cOITespondientes a las nU 43 a nU B4 del anexo nU 4

bull La informacioacuten de los liacutemites de deteccioacuten puede ser valiosa para estimar siacute I1n

instnunento dado estaacute en capacidad de suministrar una sensibilidad adecuada es decir sirve

para evaluar el rango de concentraciones en el cual se puede usar el equipo El liacutemite de

cualltificacioacuten representa la cantidad maacutes baja de 50hllO cuya aacuterea se puede medir con IIn

coeficiente de variacioacuten aceptable por debajo del limite de cuantificacioacuten se detecta pero no

se cuantifica L13 j

El limite de deteccioacuten (LD) y el liacutemite de cuantificacioacuten (Le) se calculan usando los

cromatogramas finales (correspondientes a las soluciones maacutes diluidas) de la serie de Ia

liucalidad seguacuten las foacutennulas expuestas en el anexo nU 2 Ambos se expresan en ng de

soluto inyectado (teniendo en cuenta el volumen inyectado de la solucioacuten de la mezcla de

prueba)

223 Equipos a los cuales se aplica el test de verificacioacuten

La tabla 1 muestra los equipos de HPLC de la seccioacuten de cromatografiacutea del

depariamento de anaacutelisis del IQS de los cuales se tienen datos obtenidos al aplicarles la

mezcla de pmeba del test de verificacioacuten de instrumentos

17

LINEALIDAD

aacuterea (mv mln) 70 60 50 40 30 20 10

r-- ~--

~ ---shy~

~ ~

00 200 400 600 800 1000 masa (ng)

CromatOgrafo Uquldo HP-1050 aacuterea = 025940 + 005222(rnasa) r cuadrado = 099990

FACTORES DE RESPUESTA Blfenllo

n044 factores de respuesta 04 r--------------______---

03

02

01 1111 -a=middotII bullbull IK= ~~ ----- ---aiexcl

O~~-~~~~~~-~~~~~---~~~~ 10 100 1000

mua (ng) CromatOgrafo Uquldo HP-10SO Hmite deteccioacuten = 0423 ng limite cuantificacioacuten = 1411 ng

FIGURA B Graacuteficas de linealidad y factores de respuesta para el Bifenilo

Tahla 1 Ef(uipos J]LC de la seccioacuten de cromatografIa

CROMATOacuteGRAFO nf4TECTOR DESGASIFICADOR

HP-I050 SERIES 1050 SI

HP-I090 1040 A f)AD SI

PE-SERIES 2 PE-Le 75 NO

KNK-500-A WATERS 440 SI

PE-SERIES2 AB 757 Af) NO

KNK-500-A AB 757 AD SI

HP-l090 AB 757 AD SI

Algunas caracteriacutesticas generales de las bombas ele los instmmentos de la tahla I son

las siguientes

bull EL cromatoacutegrafo liacutequido HP-I050 cuenta con cuatro liacuteneas de solvente y con un

desgasiftcador a vaciacuteo realiza la mezcla a baja presioacuten con una vaacutelvula proporcional de alta

velocidad Posee lUla bomba de dos pistones duales en serie y esto le permite hacer mezclas

en modo isocraacutetico y en gradieute

bull El cromatoacutegrafo liacutequido HP-I090 tiene dos canales activos (A y B) de suministro de

solvente La desgasiftcacioacuten se efectuacutea con Helio Cada canal comprende un recipiente de

solvente y illa bomba de jeringa dual con Wla vaacutelvula rotatoria los dos eluyentes se mezclan

a presioacuten media antes de ser bomheados a alta presioacuten por medio de lUla bomba de

membrana a traveacutes del inyector y hacia la cohunna Estaacute capacitado para trahajo en modo

isocraacutetico yen gradiente

bull El cromatoacutegrafo liacutequido PE-Series 2 cuenla con dos liacuteneas de solventes y no posee

desgasiftcador incorporado Tieue dos bombas cada una de ellas con desplazamiento I

positivo reciacuteproco de cabeza dllal ( cada una de las dos bomhas del eqllipo ntilizl pistones

dualcmiddots de zafiro) La mezcla se rlaliil a alta presioacuten con un mezclador dinaacuternilto

18

bull El ltromatoacutegraJo liacutequido KNK-SOO Series A posee cuatro liacuteneas de suministro de

solvente con desgasificador inc(Hvorado (usando Helio) Tiene lIDa vaacutelvula proporcional en

la que se neva a cabo la mezcla a baja presioacuten y una bomba que trabaja con dos pistones

duales en serie

La tabla II resume los aspectos maacutes relevantes de los detectores UV usados en la

realizacioacuten de este trabajo

Tabla 11 detectores de los cromatoacutegrafos HP Le

DETECTOR Rango (nm) anchul

banda (nm)

volumen

celda (uL)

presioacuten (maacutex)

celda (Bars)

camino

(mm)

oacuteptico

1040 A DAD 190-600 4-40() 45 40 6

Selies 1050 190-600 65 14 40 8

AB 757-AD 190-700 5 12 --shy 8

Waters 440 254 --shy --shy 70 10

~C-75 190-600 39 8 140 10

Todos los detectores de la tabla II poseen lIDa laacutempara de Deuterio con excepcioacuten del

Waters 440 que cuenta con 1ma de Mercurio

Los detectores Series 1050 AB 757-AD Y LC-75 son de A variable con red de

difraccioacuten como elemento monoltromador

El detector 1040 A DAD es un detector de matriz de diodos (red de difraccioacuten

holograacutefica)

El detector Waters 440 puede trabajar a vanas As con filtros como sistema

monocromador

19

Cada cromatoacutegrafo estaacute equipado con un inyector manual tipo Rheodyne con un bucle

dI 20llL y tiene la posihilidac1 de tennostatar la columna a 35u C (temperahlra de aplicacioacuten

de la mezcla de prueba)

A todos los eqUipos listados en la tabla 1 se les aplicoacute el test de verificacioacuten de

instrumentos Todos los cromatogramas tmto de la mezcla de prueba como del ruido de

los equipos examinados estaacuten al final del presente trabajo y constituyen el anexo nU 5 al

igual que los cromatogramas con los que se calculm los liacutemites de cuantificacioacuten para cada

instrumento I

Los resultados de repetihilidad obtenidos al aplicar la mezcla de prueba a los equipos

evaluados se presentan en la tabla de reswnen general que constituye el anexo nU 6 asiacute como

tambieacuten los resultados de la reproducibilidad de la mezcla de prueba en el cromatoacutegrafo

Iiacuteq1lido JI 1gt-1 0)0 S~ incluyen ademaacutes olros resultados generales de lodos los equipos

23 Sensibilidad lid t(St de vuifkacioacuten de instrumentos

Esta sensibilidad es lID criterio de suma importancia que hay que considerar y se refiere

a los cambios que se observan al aplicar la mezcla de prueba cuando suceden pequentildeas

variaciones en las condiciones crOlnatograacuteficas del instrumento

Con el fin de caracterizar esta sensibilidad se cuantifican los cambios experimentados

por los valores de algunas variables como por ejemplo el tiempo de retencioacuten el aacuterea de

pico la altura del pico la anchura a media banda el nuacutemero de platos teoacutericos y la

resolucioacuten Estas variaciones se deben a su vez a cambios provocados deliberadamente en

algunos paraacutemetros cromatograacutelicos como son la composicioacuten de la fac moacutevil el lujo de la

fase moacutevil la tcmperatnra de la colmnna el volumen de inyeccioacuten y la longitud de onda de

deteccioacuten

20

Con eslo se pcr~lglle no soacutelo cuantificar la magnitud del cambio y determinar que

variables cromatograacuteficas inllllyen maacutes sobre los resultados finales del test sino tambieacuten

decidir ante un cambio imprevisto en la respuesta del equipo cual puede ser la posible causa

de la illomaliacutea es decir es lUla manera de diagnosticar la causas de un mal funcionamiento

en un cromatoacutegrafo liacutequido de HPLe En resumen se trata de establecer la capacidad que

tiene el test para detectar peqllcilas variaciones en las condiciones cromatograacuteficas del

instrumento

Es necesario considerar la estabilidad del tiempo de retencioacuten ya que afecta

directamente a la identificacioacuten de los compuestos Se necesita que el equipo sea capaz de

suministrar tiempos de retencioacuten absolutos reproducibles para reducir las incertezas

asociadas con la identificacioacuten del analito

La estabilidad del factor de rcspucsla ( como aacuterea o altma de pico) inlluye sobre los

resultados cuantitativos del anaacutelisis

De otro lado la estabilidad de los paraacutemetros de separacioacuten (anchura a media banda

nuacutemero de platos teoacutericos y resolllcioacuten) garantiza la calidad de la cromatogratla como

teacutecnica separativa

Finalmente es indispensable considerar la sensibilidad frente a cambios en la longitud

de onda lo que asegllfa la buena marcha del proceso de deteccioacuten de los picos

cromatograacuteficos

La tabla 11 [ muestra los paraacutemetJmiddotos que se toman en el presente trabajo para llevar a

cabo el estudio de la sensibilidad del test de verifiacutecacioacuten se consigna en la tabla el

paraacutemetro cromatograacutefiacuteco y las variaciones que se efectuacutean alrededor de Sil valor nominal

Tabla lJI Jlsludio de In sensibilidad del test de veriticacioacuten

iexclPARAacuteMETRO

Volumen de inyeccioacuten

Composicioacuten fase moacutevil

Flujo fase moacutevil

Temperatura de columna

iexclLongitud de onda deteccioacuten

VALOR NOIHNAL

20 nL

CH 3 CNH 2 O (7030 vv)

100 rnJmin

254 run

VARIACIOacuteN

10 50 Y 100 uL

de 65 a 75 de CH 3 CN

de 090 a 110 rnJmin

de 251 a 258 run

Se observan los cambios experimentados por las variables relacionadas con los picos

cromatograficos (tiempo de retencioacuten etc) y se representan esos valores frente a las

variaciones hechas a propoacutesito en las condiciones cromatograacuteficas estas graacuteficas van desde

la nU ~5 a la ndeg 1O~ del anexo nU 4

24 Cartas de control ele la mezcla de prueba del test de verificacioacuten

Las cartas de control de la calidad estadiacutestica son una herramienta simple pero

poderosa para verificar la calidad de lm procedimiento analiacutetico Conceptualmente son muy

sencillas Se mide regularmente un material estaacutendar y se representan las respuestas

analiacuteticas sobre un eje de tiempos en lna carta siacute la carta muestra variaciones alrededor del

resultado esperado diferentes a las del azar ello sugiere que algtma cosa ha ido mal en el

proceso de medida Para ayudar a decidir si esto ha sucedido se marcan sobre la carta

liacutemites de control Se espera qlle las respuestas pennanezcan dentro de esos liacutemites

Si un sistema de medida es estable de tal manera que muestra UJ1a variacioacuten aleatoria

alrededor de lm valor de referencia dado y el tamantildeo de esa variacioacuten (medido como la

desviacioacuten estaacutendar) pennanece constante se puede decir que el sistema estaacute en control

estadiacutestico o simplemclltc en control El objetivo al usar canas de control es lograr y

mantener ese estado de cOlllrol estadiacutestico 114J

Las cartas de control se pueden usar como una especie de base de dalos del laboratorio

donde se almacena una infonnacioacuten que puede ser oe gran utilidad para disentildear futuros

esludios experimentales

La liacutenea central en las cartas de control se torna como el valor medio alrededor del cual

estaacuten variando las medidas los limiles de control se colocan tres veces la desviacioacuten

estaacutendar por encima y por debajo de la liacutenea central ademaacutes hay un segundo grupo de

liacutemites de control llamados liacutemites oe advertencia a una distancia de dos veces la

desviacioacuten estaacutendar a ambos lados de la liacutenea central

No hay UB acueroo universal sobre como usar las cartas oe control Compantildeiacuteas

diferentes usan reglas diferentes IJ na sugerencia es que se requiere una accioacuten siacute se detecta

algo de lo que sigue

i) Cualquier plUlto fucra de los liacutemites de control

ii) Siete puntos todos por encima o por debajo de la linea central

iii) Siete intclvalos hacia arriba o hacia abajo (es decir ocho puntos consecutivos

ascendentes o descendentes)

iv) Cualquier otro patroacuten obviamente no aleatorio

25 Resultarlo~ y rlis~usioacuten

251 Lincnlidnd y factores de r(spuesta

ULas graacuteficas nUl a n 42 (anexo n4) muestran las rectas de regresioacuten lineal (aacuterea en

mVmin frente a la masa inyeclada en ng) para todos los picos de la mezcla de prueba en

todas y cada lma de las siete (7) configuraciones de HPLC estudiadas en estc trabajo Junto

a cada graacutefica aparece la cuacioacuten de regresioacuten y el valor de r 2 (coeficienle de

detcrminacioacuteu)

I

Los valores de r 2 se resumen luego en una tabla que aparece despueacutes de la cinco

graacuteficas correspondientes a la linealidad de todos los solutos de la mezcla de prueba para

cada equipo

Para todas las graacuteficas los valores de r 2 son aceptables y aproximadamente iguales

esto significa que en todos los casos existe una relacioacuten lineal entre las dos variables

representadas (como era de esperarse)

Estas graacuteficas no aportan mucha informacioacuten con respecto a la linealidad del sistema y

menos en las zonas de bajas concentraciones donde se pierde la linealidad del mismo y

tampoco permiten efectuar comparaciones entre equipos ya que todas ellas son praacutecticamente

equivalentes

En las graacuteficas n043 a la nU~4 (anexo n04) aparecen los factores de respuesta para todos

los picos de la mezcla de prueba en todos los cromatoacutegrafos ensayados (Factor de

respuesta Areamasa inyectada frente a la masa inyectada en ng) Ver tambieacuten la figura B

Cada graacutefica va acompantildeada por los valores del liacutemite de deteccioacuten y del liacutemite de

cuantificacioacuten ambos en ng para el so luto correspondiente Finalmente aparece (cada cinco

graacuteficas) una tabla con el rango lineal y la relacioacuten sentildealruido tambieacuten para cada soluto el

rango lineal es el cociente entre la masa mayor y la masa menor de la porcioacuten lineal de la

cwva y la relacioacuten sentildealmido resulta de dividir la altura del pico cromatograacutefico de un

soJuto en la mezcla de lpmeba (en mv) entre la altura del ruido (en mv)

En estas graacuteficas se puede visualizar cual es el liacutemite inferior del rango lineal es decir

a partir de que cantidad de sohuo inyectado el sistema deja de ser lineal (este liacutemite no

coincide necesariamente con el liacutemite de cuantificacioacuten) tambieacuten se observa una tendencia a

la peacuterdida de la linealidad en la zona de altas conceutraciones En consecuencia este tipo de

graacutefico suministra mayor informacioacuten que el graacutefico de regresioacuten y permite ef~ctuar

comparaciones

24

Lo anterior qlliere decir que un modo muy conveniente de indicar la linealidad es por

medio de los factores de respuesta (F) que se representan frente a la masa inyectada para

calcular los liacutemites que permiten obtener el rango lineal a partir de la graacutefica ltFgtplusmnO 1ltF)

es ne(esario desalTollar los siguientes pasos

- En primer lugar se calculan los factores de respuesta para cada cantidad de soluto

inyectado

- A continuacioacuten se obtiellc el valor medio de los factores de respuesta calculados este

valor medio se calcula con aquellos factores de respuesta que quedan despueacutes de la

elinuumlnacioacuten de datos aberrantes

Para eliminar los datos aberrantes se aplica el criterio de Box and Whisker Plot

Este es un meacutetodo de Gaacutelculo robusto basado en los siguientes pasos

bull Ordenar los resllltados bull Determinar ]os liacutemites percentiles Q 25 YQ 75 (valores por debajo de los cuales quedan

respectivamente e] 25 y el 75 de los datos)

bull Calcular la distancia entre estos dos liacutemites (d = Q 75 - Q 25)

Esta distancia per~nite definir el criterio que sentildeala los valores aberrantes

bull calcular los liacutemites de confianza inferior y superior

Liacutemite inferior = Q 2) - l) d ([l)

Liacutemite superior = Q 75 + 15 d (LS)

Se consideran aberrantes los datos cuyo valor se encuentre fuera del intervalo acotado

por los valores maacutes proacutexilflos por exceso y por defecto respectivamente a LI y LS [12]

- Finalmente se representan todos los factores de respuesta incluidos los que fueron

eliminados para el caacutelculo de la media de Fiexcl frente a la masa inyectada junto con el valor

medio de Fiexcl y los liacutemiles del lOJ mencionados alTiba

Sobre la graacutefica anterior se detennina el rango de linealidad que corresponde al margeacuten

de masas cuyos valores de Fiexcl esl ))) comprendidos denlTO de los liacutemites de la graacutefica

16

En la figura U aparecen las graacuteficas de la linealidad y de los factores de respuesta para

el Bifenilo en el cromatoacutegrafo liquido JI 1-1 050

Las grMicas de los factores de respuesta (Fiexcl ) que van acompantildeadas de los limites de

deteccioacuten y de cllalltilicacioacuten son las cOITespondientes a las nU 43 a nU B4 del anexo nU 4

bull La informacioacuten de los liacutemites de deteccioacuten puede ser valiosa para estimar siacute I1n

instnunento dado estaacute en capacidad de suministrar una sensibilidad adecuada es decir sirve

para evaluar el rango de concentraciones en el cual se puede usar el equipo El liacutemite de

cualltificacioacuten representa la cantidad maacutes baja de 50hllO cuya aacuterea se puede medir con IIn

coeficiente de variacioacuten aceptable por debajo del limite de cuantificacioacuten se detecta pero no

se cuantifica L13 j

El limite de deteccioacuten (LD) y el liacutemite de cuantificacioacuten (Le) se calculan usando los

cromatogramas finales (correspondientes a las soluciones maacutes diluidas) de la serie de Ia

liucalidad seguacuten las foacutennulas expuestas en el anexo nU 2 Ambos se expresan en ng de

soluto inyectado (teniendo en cuenta el volumen inyectado de la solucioacuten de la mezcla de

prueba)

223 Equipos a los cuales se aplica el test de verificacioacuten

La tabla 1 muestra los equipos de HPLC de la seccioacuten de cromatografiacutea del

depariamento de anaacutelisis del IQS de los cuales se tienen datos obtenidos al aplicarles la

mezcla de pmeba del test de verificacioacuten de instrumentos

17

LINEALIDAD

aacuterea (mv mln) 70 60 50 40 30 20 10

r-- ~--

~ ---shy~

~ ~

00 200 400 600 800 1000 masa (ng)

CromatOgrafo Uquldo HP-1050 aacuterea = 025940 + 005222(rnasa) r cuadrado = 099990

FACTORES DE RESPUESTA Blfenllo

n044 factores de respuesta 04 r--------------______---

03

02

01 1111 -a=middotII bullbull IK= ~~ ----- ---aiexcl

O~~-~~~~~~-~~~~~---~~~~ 10 100 1000

mua (ng) CromatOgrafo Uquldo HP-10SO Hmite deteccioacuten = 0423 ng limite cuantificacioacuten = 1411 ng

FIGURA B Graacuteficas de linealidad y factores de respuesta para el Bifenilo

Tahla 1 Ef(uipos J]LC de la seccioacuten de cromatografIa

CROMATOacuteGRAFO nf4TECTOR DESGASIFICADOR

HP-I050 SERIES 1050 SI

HP-I090 1040 A f)AD SI

PE-SERIES 2 PE-Le 75 NO

KNK-500-A WATERS 440 SI

PE-SERIES2 AB 757 Af) NO

KNK-500-A AB 757 AD SI

HP-l090 AB 757 AD SI

Algunas caracteriacutesticas generales de las bombas ele los instmmentos de la tahla I son

las siguientes

bull EL cromatoacutegrafo liacutequido HP-I050 cuenta con cuatro liacuteneas de solvente y con un

desgasiftcador a vaciacuteo realiza la mezcla a baja presioacuten con una vaacutelvula proporcional de alta

velocidad Posee lUla bomba de dos pistones duales en serie y esto le permite hacer mezclas

en modo isocraacutetico y en gradieute

bull El cromatoacutegrafo liacutequido HP-I090 tiene dos canales activos (A y B) de suministro de

solvente La desgasiftcacioacuten se efectuacutea con Helio Cada canal comprende un recipiente de

solvente y illa bomba de jeringa dual con Wla vaacutelvula rotatoria los dos eluyentes se mezclan

a presioacuten media antes de ser bomheados a alta presioacuten por medio de lUla bomba de

membrana a traveacutes del inyector y hacia la cohunna Estaacute capacitado para trahajo en modo

isocraacutetico yen gradiente

bull El cromatoacutegrafo liacutequido PE-Series 2 cuenla con dos liacuteneas de solventes y no posee

desgasiftcador incorporado Tieue dos bombas cada una de ellas con desplazamiento I

positivo reciacuteproco de cabeza dllal ( cada una de las dos bomhas del eqllipo ntilizl pistones

dualcmiddots de zafiro) La mezcla se rlaliil a alta presioacuten con un mezclador dinaacuternilto

18

bull El ltromatoacutegraJo liacutequido KNK-SOO Series A posee cuatro liacuteneas de suministro de

solvente con desgasificador inc(Hvorado (usando Helio) Tiene lIDa vaacutelvula proporcional en

la que se neva a cabo la mezcla a baja presioacuten y una bomba que trabaja con dos pistones

duales en serie

La tabla II resume los aspectos maacutes relevantes de los detectores UV usados en la

realizacioacuten de este trabajo

Tabla 11 detectores de los cromatoacutegrafos HP Le

DETECTOR Rango (nm) anchul

banda (nm)

volumen

celda (uL)

presioacuten (maacutex)

celda (Bars)

camino

(mm)

oacuteptico

1040 A DAD 190-600 4-40() 45 40 6

Selies 1050 190-600 65 14 40 8

AB 757-AD 190-700 5 12 --shy 8

Waters 440 254 --shy --shy 70 10

~C-75 190-600 39 8 140 10

Todos los detectores de la tabla II poseen lIDa laacutempara de Deuterio con excepcioacuten del

Waters 440 que cuenta con 1ma de Mercurio

Los detectores Series 1050 AB 757-AD Y LC-75 son de A variable con red de

difraccioacuten como elemento monoltromador

El detector 1040 A DAD es un detector de matriz de diodos (red de difraccioacuten

holograacutefica)

El detector Waters 440 puede trabajar a vanas As con filtros como sistema

monocromador

19

Cada cromatoacutegrafo estaacute equipado con un inyector manual tipo Rheodyne con un bucle

dI 20llL y tiene la posihilidac1 de tennostatar la columna a 35u C (temperahlra de aplicacioacuten

de la mezcla de prueba)

A todos los eqUipos listados en la tabla 1 se les aplicoacute el test de verificacioacuten de

instrumentos Todos los cromatogramas tmto de la mezcla de prueba como del ruido de

los equipos examinados estaacuten al final del presente trabajo y constituyen el anexo nU 5 al

igual que los cromatogramas con los que se calculm los liacutemites de cuantificacioacuten para cada

instrumento I

Los resultados de repetihilidad obtenidos al aplicar la mezcla de prueba a los equipos

evaluados se presentan en la tabla de reswnen general que constituye el anexo nU 6 asiacute como

tambieacuten los resultados de la reproducibilidad de la mezcla de prueba en el cromatoacutegrafo

Iiacuteq1lido JI 1gt-1 0)0 S~ incluyen ademaacutes olros resultados generales de lodos los equipos

23 Sensibilidad lid t(St de vuifkacioacuten de instrumentos

Esta sensibilidad es lID criterio de suma importancia que hay que considerar y se refiere

a los cambios que se observan al aplicar la mezcla de prueba cuando suceden pequentildeas

variaciones en las condiciones crOlnatograacuteficas del instrumento

Con el fin de caracterizar esta sensibilidad se cuantifican los cambios experimentados

por los valores de algunas variables como por ejemplo el tiempo de retencioacuten el aacuterea de

pico la altura del pico la anchura a media banda el nuacutemero de platos teoacutericos y la

resolucioacuten Estas variaciones se deben a su vez a cambios provocados deliberadamente en

algunos paraacutemetros cromatograacutelicos como son la composicioacuten de la fac moacutevil el lujo de la

fase moacutevil la tcmperatnra de la colmnna el volumen de inyeccioacuten y la longitud de onda de

deteccioacuten

20

Con eslo se pcr~lglle no soacutelo cuantificar la magnitud del cambio y determinar que

variables cromatograacuteficas inllllyen maacutes sobre los resultados finales del test sino tambieacuten

decidir ante un cambio imprevisto en la respuesta del equipo cual puede ser la posible causa

de la illomaliacutea es decir es lUla manera de diagnosticar la causas de un mal funcionamiento

en un cromatoacutegrafo liacutequido de HPLe En resumen se trata de establecer la capacidad que

tiene el test para detectar peqllcilas variaciones en las condiciones cromatograacuteficas del

instrumento

Es necesario considerar la estabilidad del tiempo de retencioacuten ya que afecta

directamente a la identificacioacuten de los compuestos Se necesita que el equipo sea capaz de

suministrar tiempos de retencioacuten absolutos reproducibles para reducir las incertezas

asociadas con la identificacioacuten del analito

La estabilidad del factor de rcspucsla ( como aacuterea o altma de pico) inlluye sobre los

resultados cuantitativos del anaacutelisis

De otro lado la estabilidad de los paraacutemetros de separacioacuten (anchura a media banda

nuacutemero de platos teoacutericos y resolllcioacuten) garantiza la calidad de la cromatogratla como

teacutecnica separativa

Finalmente es indispensable considerar la sensibilidad frente a cambios en la longitud

de onda lo que asegllfa la buena marcha del proceso de deteccioacuten de los picos

cromatograacuteficos

La tabla 11 [ muestra los paraacutemetJmiddotos que se toman en el presente trabajo para llevar a

cabo el estudio de la sensibilidad del test de verifiacutecacioacuten se consigna en la tabla el

paraacutemetro cromatograacutefiacuteco y las variaciones que se efectuacutean alrededor de Sil valor nominal

Tabla lJI Jlsludio de In sensibilidad del test de veriticacioacuten

iexclPARAacuteMETRO

Volumen de inyeccioacuten

Composicioacuten fase moacutevil

Flujo fase moacutevil

Temperatura de columna

iexclLongitud de onda deteccioacuten

VALOR NOIHNAL

20 nL

CH 3 CNH 2 O (7030 vv)

100 rnJmin

254 run

VARIACIOacuteN

10 50 Y 100 uL

de 65 a 75 de CH 3 CN

de 090 a 110 rnJmin

de 251 a 258 run

Se observan los cambios experimentados por las variables relacionadas con los picos

cromatograficos (tiempo de retencioacuten etc) y se representan esos valores frente a las

variaciones hechas a propoacutesito en las condiciones cromatograacuteficas estas graacuteficas van desde

la nU ~5 a la ndeg 1O~ del anexo nU 4

24 Cartas de control ele la mezcla de prueba del test de verificacioacuten

Las cartas de control de la calidad estadiacutestica son una herramienta simple pero

poderosa para verificar la calidad de lm procedimiento analiacutetico Conceptualmente son muy

sencillas Se mide regularmente un material estaacutendar y se representan las respuestas

analiacuteticas sobre un eje de tiempos en lna carta siacute la carta muestra variaciones alrededor del

resultado esperado diferentes a las del azar ello sugiere que algtma cosa ha ido mal en el

proceso de medida Para ayudar a decidir si esto ha sucedido se marcan sobre la carta

liacutemites de control Se espera qlle las respuestas pennanezcan dentro de esos liacutemites

Si un sistema de medida es estable de tal manera que muestra UJ1a variacioacuten aleatoria

alrededor de lm valor de referencia dado y el tamantildeo de esa variacioacuten (medido como la

desviacioacuten estaacutendar) pennanece constante se puede decir que el sistema estaacute en control

estadiacutestico o simplemclltc en control El objetivo al usar canas de control es lograr y

mantener ese estado de cOlllrol estadiacutestico 114J

Las cartas de control se pueden usar como una especie de base de dalos del laboratorio

donde se almacena una infonnacioacuten que puede ser oe gran utilidad para disentildear futuros

esludios experimentales

La liacutenea central en las cartas de control se torna como el valor medio alrededor del cual

estaacuten variando las medidas los limiles de control se colocan tres veces la desviacioacuten

estaacutendar por encima y por debajo de la liacutenea central ademaacutes hay un segundo grupo de

liacutemites de control llamados liacutemites oe advertencia a una distancia de dos veces la

desviacioacuten estaacutendar a ambos lados de la liacutenea central

No hay UB acueroo universal sobre como usar las cartas oe control Compantildeiacuteas

diferentes usan reglas diferentes IJ na sugerencia es que se requiere una accioacuten siacute se detecta

algo de lo que sigue

i) Cualquier plUlto fucra de los liacutemites de control

ii) Siete puntos todos por encima o por debajo de la linea central

iii) Siete intclvalos hacia arriba o hacia abajo (es decir ocho puntos consecutivos

ascendentes o descendentes)

iv) Cualquier otro patroacuten obviamente no aleatorio

25 Resultarlo~ y rlis~usioacuten

251 Lincnlidnd y factores de r(spuesta

ULas graacuteficas nUl a n 42 (anexo n4) muestran las rectas de regresioacuten lineal (aacuterea en

mVmin frente a la masa inyeclada en ng) para todos los picos de la mezcla de prueba en

todas y cada lma de las siete (7) configuraciones de HPLC estudiadas en estc trabajo Junto

a cada graacutefica aparece la cuacioacuten de regresioacuten y el valor de r 2 (coeficienle de

detcrminacioacuteu)

I

Los valores de r 2 se resumen luego en una tabla que aparece despueacutes de la cinco

graacuteficas correspondientes a la linealidad de todos los solutos de la mezcla de prueba para

cada equipo

Para todas las graacuteficas los valores de r 2 son aceptables y aproximadamente iguales

esto significa que en todos los casos existe una relacioacuten lineal entre las dos variables

representadas (como era de esperarse)

Estas graacuteficas no aportan mucha informacioacuten con respecto a la linealidad del sistema y

menos en las zonas de bajas concentraciones donde se pierde la linealidad del mismo y

tampoco permiten efectuar comparaciones entre equipos ya que todas ellas son praacutecticamente

equivalentes

En las graacuteficas n043 a la nU~4 (anexo n04) aparecen los factores de respuesta para todos

los picos de la mezcla de prueba en todos los cromatoacutegrafos ensayados (Factor de

respuesta Areamasa inyectada frente a la masa inyectada en ng) Ver tambieacuten la figura B

Cada graacutefica va acompantildeada por los valores del liacutemite de deteccioacuten y del liacutemite de

cuantificacioacuten ambos en ng para el so luto correspondiente Finalmente aparece (cada cinco

graacuteficas) una tabla con el rango lineal y la relacioacuten sentildealruido tambieacuten para cada soluto el

rango lineal es el cociente entre la masa mayor y la masa menor de la porcioacuten lineal de la

cwva y la relacioacuten sentildealmido resulta de dividir la altura del pico cromatograacutefico de un

soJuto en la mezcla de lpmeba (en mv) entre la altura del ruido (en mv)

En estas graacuteficas se puede visualizar cual es el liacutemite inferior del rango lineal es decir

a partir de que cantidad de sohuo inyectado el sistema deja de ser lineal (este liacutemite no

coincide necesariamente con el liacutemite de cuantificacioacuten) tambieacuten se observa una tendencia a

la peacuterdida de la linealidad en la zona de altas conceutraciones En consecuencia este tipo de

graacutefico suministra mayor informacioacuten que el graacutefico de regresioacuten y permite ef~ctuar

comparaciones

24

En la figura U aparecen las graacuteficas de la linealidad y de los factores de respuesta para

el Bifenilo en el cromatoacutegrafo liquido JI 1-1 050

Las grMicas de los factores de respuesta (Fiexcl ) que van acompantildeadas de los limites de

deteccioacuten y de cllalltilicacioacuten son las cOITespondientes a las nU 43 a nU B4 del anexo nU 4

bull La informacioacuten de los liacutemites de deteccioacuten puede ser valiosa para estimar siacute I1n

instnunento dado estaacute en capacidad de suministrar una sensibilidad adecuada es decir sirve

para evaluar el rango de concentraciones en el cual se puede usar el equipo El liacutemite de

cualltificacioacuten representa la cantidad maacutes baja de 50hllO cuya aacuterea se puede medir con IIn

coeficiente de variacioacuten aceptable por debajo del limite de cuantificacioacuten se detecta pero no

se cuantifica L13 j

El limite de deteccioacuten (LD) y el liacutemite de cuantificacioacuten (Le) se calculan usando los

cromatogramas finales (correspondientes a las soluciones maacutes diluidas) de la serie de Ia

liucalidad seguacuten las foacutennulas expuestas en el anexo nU 2 Ambos se expresan en ng de

soluto inyectado (teniendo en cuenta el volumen inyectado de la solucioacuten de la mezcla de

prueba)

223 Equipos a los cuales se aplica el test de verificacioacuten

La tabla 1 muestra los equipos de HPLC de la seccioacuten de cromatografiacutea del

depariamento de anaacutelisis del IQS de los cuales se tienen datos obtenidos al aplicarles la

mezcla de pmeba del test de verificacioacuten de instrumentos

17

LINEALIDAD

aacuterea (mv mln) 70 60 50 40 30 20 10

r-- ~--

~ ---shy~

~ ~

00 200 400 600 800 1000 masa (ng)

CromatOgrafo Uquldo HP-1050 aacuterea = 025940 + 005222(rnasa) r cuadrado = 099990

FACTORES DE RESPUESTA Blfenllo

n044 factores de respuesta 04 r--------------______---

03

02

01 1111 -a=middotII bullbull IK= ~~ ----- ---aiexcl

O~~-~~~~~~-~~~~~---~~~~ 10 100 1000

mua (ng) CromatOgrafo Uquldo HP-10SO Hmite deteccioacuten = 0423 ng limite cuantificacioacuten = 1411 ng

FIGURA B Graacuteficas de linealidad y factores de respuesta para el Bifenilo

Tahla 1 Ef(uipos J]LC de la seccioacuten de cromatografIa

CROMATOacuteGRAFO nf4TECTOR DESGASIFICADOR

HP-I050 SERIES 1050 SI

HP-I090 1040 A f)AD SI

PE-SERIES 2 PE-Le 75 NO

KNK-500-A WATERS 440 SI

PE-SERIES2 AB 757 Af) NO

KNK-500-A AB 757 AD SI

HP-l090 AB 757 AD SI

Algunas caracteriacutesticas generales de las bombas ele los instmmentos de la tahla I son

las siguientes

bull EL cromatoacutegrafo liacutequido HP-I050 cuenta con cuatro liacuteneas de solvente y con un

desgasiftcador a vaciacuteo realiza la mezcla a baja presioacuten con una vaacutelvula proporcional de alta

velocidad Posee lUla bomba de dos pistones duales en serie y esto le permite hacer mezclas

en modo isocraacutetico y en gradieute

bull El cromatoacutegrafo liacutequido HP-I090 tiene dos canales activos (A y B) de suministro de

solvente La desgasiftcacioacuten se efectuacutea con Helio Cada canal comprende un recipiente de

solvente y illa bomba de jeringa dual con Wla vaacutelvula rotatoria los dos eluyentes se mezclan

a presioacuten media antes de ser bomheados a alta presioacuten por medio de lUla bomba de

membrana a traveacutes del inyector y hacia la cohunna Estaacute capacitado para trahajo en modo

isocraacutetico yen gradiente

bull El cromatoacutegrafo liacutequido PE-Series 2 cuenla con dos liacuteneas de solventes y no posee

desgasiftcador incorporado Tieue dos bombas cada una de ellas con desplazamiento I

positivo reciacuteproco de cabeza dllal ( cada una de las dos bomhas del eqllipo ntilizl pistones

dualcmiddots de zafiro) La mezcla se rlaliil a alta presioacuten con un mezclador dinaacuternilto

18

bull El ltromatoacutegraJo liacutequido KNK-SOO Series A posee cuatro liacuteneas de suministro de

solvente con desgasificador inc(Hvorado (usando Helio) Tiene lIDa vaacutelvula proporcional en

la que se neva a cabo la mezcla a baja presioacuten y una bomba que trabaja con dos pistones

duales en serie

La tabla II resume los aspectos maacutes relevantes de los detectores UV usados en la

realizacioacuten de este trabajo

Tabla 11 detectores de los cromatoacutegrafos HP Le

DETECTOR Rango (nm) anchul

banda (nm)

volumen

celda (uL)

presioacuten (maacutex)

celda (Bars)

camino

(mm)

oacuteptico

1040 A DAD 190-600 4-40() 45 40 6

Selies 1050 190-600 65 14 40 8

AB 757-AD 190-700 5 12 --shy 8

Waters 440 254 --shy --shy 70 10

~C-75 190-600 39 8 140 10

Todos los detectores de la tabla II poseen lIDa laacutempara de Deuterio con excepcioacuten del

Waters 440 que cuenta con 1ma de Mercurio

Los detectores Series 1050 AB 757-AD Y LC-75 son de A variable con red de

difraccioacuten como elemento monoltromador

El detector 1040 A DAD es un detector de matriz de diodos (red de difraccioacuten

holograacutefica)

El detector Waters 440 puede trabajar a vanas As con filtros como sistema

monocromador

19

Cada cromatoacutegrafo estaacute equipado con un inyector manual tipo Rheodyne con un bucle

dI 20llL y tiene la posihilidac1 de tennostatar la columna a 35u C (temperahlra de aplicacioacuten

de la mezcla de prueba)

A todos los eqUipos listados en la tabla 1 se les aplicoacute el test de verificacioacuten de

instrumentos Todos los cromatogramas tmto de la mezcla de prueba como del ruido de

los equipos examinados estaacuten al final del presente trabajo y constituyen el anexo nU 5 al

igual que los cromatogramas con los que se calculm los liacutemites de cuantificacioacuten para cada

instrumento I

Los resultados de repetihilidad obtenidos al aplicar la mezcla de prueba a los equipos

evaluados se presentan en la tabla de reswnen general que constituye el anexo nU 6 asiacute como

tambieacuten los resultados de la reproducibilidad de la mezcla de prueba en el cromatoacutegrafo

Iiacuteq1lido JI 1gt-1 0)0 S~ incluyen ademaacutes olros resultados generales de lodos los equipos

23 Sensibilidad lid t(St de vuifkacioacuten de instrumentos

Esta sensibilidad es lID criterio de suma importancia que hay que considerar y se refiere

a los cambios que se observan al aplicar la mezcla de prueba cuando suceden pequentildeas

variaciones en las condiciones crOlnatograacuteficas del instrumento

Con el fin de caracterizar esta sensibilidad se cuantifican los cambios experimentados

por los valores de algunas variables como por ejemplo el tiempo de retencioacuten el aacuterea de

pico la altura del pico la anchura a media banda el nuacutemero de platos teoacutericos y la

resolucioacuten Estas variaciones se deben a su vez a cambios provocados deliberadamente en

algunos paraacutemetros cromatograacutelicos como son la composicioacuten de la fac moacutevil el lujo de la

fase moacutevil la tcmperatnra de la colmnna el volumen de inyeccioacuten y la longitud de onda de

deteccioacuten

20

Con eslo se pcr~lglle no soacutelo cuantificar la magnitud del cambio y determinar que

variables cromatograacuteficas inllllyen maacutes sobre los resultados finales del test sino tambieacuten

decidir ante un cambio imprevisto en la respuesta del equipo cual puede ser la posible causa

de la illomaliacutea es decir es lUla manera de diagnosticar la causas de un mal funcionamiento

en un cromatoacutegrafo liacutequido de HPLe En resumen se trata de establecer la capacidad que

tiene el test para detectar peqllcilas variaciones en las condiciones cromatograacuteficas del

instrumento

Es necesario considerar la estabilidad del tiempo de retencioacuten ya que afecta

directamente a la identificacioacuten de los compuestos Se necesita que el equipo sea capaz de

suministrar tiempos de retencioacuten absolutos reproducibles para reducir las incertezas

asociadas con la identificacioacuten del analito

La estabilidad del factor de rcspucsla ( como aacuterea o altma de pico) inlluye sobre los

resultados cuantitativos del anaacutelisis

De otro lado la estabilidad de los paraacutemetros de separacioacuten (anchura a media banda

nuacutemero de platos teoacutericos y resolllcioacuten) garantiza la calidad de la cromatogratla como

teacutecnica separativa

Finalmente es indispensable considerar la sensibilidad frente a cambios en la longitud

de onda lo que asegllfa la buena marcha del proceso de deteccioacuten de los picos

cromatograacuteficos

La tabla 11 [ muestra los paraacutemetJmiddotos que se toman en el presente trabajo para llevar a

cabo el estudio de la sensibilidad del test de verifiacutecacioacuten se consigna en la tabla el

paraacutemetro cromatograacutefiacuteco y las variaciones que se efectuacutean alrededor de Sil valor nominal

Tabla lJI Jlsludio de In sensibilidad del test de veriticacioacuten

iexclPARAacuteMETRO

Volumen de inyeccioacuten

Composicioacuten fase moacutevil

Flujo fase moacutevil

Temperatura de columna

iexclLongitud de onda deteccioacuten

VALOR NOIHNAL

20 nL

CH 3 CNH 2 O (7030 vv)

100 rnJmin

254 run

VARIACIOacuteN

10 50 Y 100 uL

de 65 a 75 de CH 3 CN

de 090 a 110 rnJmin

de 251 a 258 run

Se observan los cambios experimentados por las variables relacionadas con los picos

cromatograficos (tiempo de retencioacuten etc) y se representan esos valores frente a las

variaciones hechas a propoacutesito en las condiciones cromatograacuteficas estas graacuteficas van desde

la nU ~5 a la ndeg 1O~ del anexo nU 4

24 Cartas de control ele la mezcla de prueba del test de verificacioacuten

Las cartas de control de la calidad estadiacutestica son una herramienta simple pero

poderosa para verificar la calidad de lm procedimiento analiacutetico Conceptualmente son muy

sencillas Se mide regularmente un material estaacutendar y se representan las respuestas

analiacuteticas sobre un eje de tiempos en lna carta siacute la carta muestra variaciones alrededor del

resultado esperado diferentes a las del azar ello sugiere que algtma cosa ha ido mal en el

proceso de medida Para ayudar a decidir si esto ha sucedido se marcan sobre la carta

liacutemites de control Se espera qlle las respuestas pennanezcan dentro de esos liacutemites

Si un sistema de medida es estable de tal manera que muestra UJ1a variacioacuten aleatoria

alrededor de lm valor de referencia dado y el tamantildeo de esa variacioacuten (medido como la

desviacioacuten estaacutendar) pennanece constante se puede decir que el sistema estaacute en control

estadiacutestico o simplemclltc en control El objetivo al usar canas de control es lograr y

mantener ese estado de cOlllrol estadiacutestico 114J

Las cartas de control se pueden usar como una especie de base de dalos del laboratorio

donde se almacena una infonnacioacuten que puede ser oe gran utilidad para disentildear futuros

esludios experimentales

La liacutenea central en las cartas de control se torna como el valor medio alrededor del cual

estaacuten variando las medidas los limiles de control se colocan tres veces la desviacioacuten

estaacutendar por encima y por debajo de la liacutenea central ademaacutes hay un segundo grupo de

liacutemites de control llamados liacutemites oe advertencia a una distancia de dos veces la

desviacioacuten estaacutendar a ambos lados de la liacutenea central

No hay UB acueroo universal sobre como usar las cartas oe control Compantildeiacuteas

diferentes usan reglas diferentes IJ na sugerencia es que se requiere una accioacuten siacute se detecta

algo de lo que sigue

i) Cualquier plUlto fucra de los liacutemites de control

ii) Siete puntos todos por encima o por debajo de la linea central

iii) Siete intclvalos hacia arriba o hacia abajo (es decir ocho puntos consecutivos

ascendentes o descendentes)

iv) Cualquier otro patroacuten obviamente no aleatorio

25 Resultarlo~ y rlis~usioacuten

251 Lincnlidnd y factores de r(spuesta

ULas graacuteficas nUl a n 42 (anexo n4) muestran las rectas de regresioacuten lineal (aacuterea en

mVmin frente a la masa inyeclada en ng) para todos los picos de la mezcla de prueba en

todas y cada lma de las siete (7) configuraciones de HPLC estudiadas en estc trabajo Junto

a cada graacutefica aparece la cuacioacuten de regresioacuten y el valor de r 2 (coeficienle de

detcrminacioacuteu)

I

Los valores de r 2 se resumen luego en una tabla que aparece despueacutes de la cinco

graacuteficas correspondientes a la linealidad de todos los solutos de la mezcla de prueba para

cada equipo

Para todas las graacuteficas los valores de r 2 son aceptables y aproximadamente iguales

esto significa que en todos los casos existe una relacioacuten lineal entre las dos variables

representadas (como era de esperarse)

Estas graacuteficas no aportan mucha informacioacuten con respecto a la linealidad del sistema y

menos en las zonas de bajas concentraciones donde se pierde la linealidad del mismo y

tampoco permiten efectuar comparaciones entre equipos ya que todas ellas son praacutecticamente

equivalentes

En las graacuteficas n043 a la nU~4 (anexo n04) aparecen los factores de respuesta para todos

los picos de la mezcla de prueba en todos los cromatoacutegrafos ensayados (Factor de

respuesta Areamasa inyectada frente a la masa inyectada en ng) Ver tambieacuten la figura B

Cada graacutefica va acompantildeada por los valores del liacutemite de deteccioacuten y del liacutemite de

cuantificacioacuten ambos en ng para el so luto correspondiente Finalmente aparece (cada cinco

graacuteficas) una tabla con el rango lineal y la relacioacuten sentildealruido tambieacuten para cada soluto el

rango lineal es el cociente entre la masa mayor y la masa menor de la porcioacuten lineal de la

cwva y la relacioacuten sentildealmido resulta de dividir la altura del pico cromatograacutefico de un

soJuto en la mezcla de lpmeba (en mv) entre la altura del ruido (en mv)

En estas graacuteficas se puede visualizar cual es el liacutemite inferior del rango lineal es decir

a partir de que cantidad de sohuo inyectado el sistema deja de ser lineal (este liacutemite no

coincide necesariamente con el liacutemite de cuantificacioacuten) tambieacuten se observa una tendencia a

la peacuterdida de la linealidad en la zona de altas conceutraciones En consecuencia este tipo de

graacutefico suministra mayor informacioacuten que el graacutefico de regresioacuten y permite ef~ctuar

comparaciones

24

LINEALIDAD

aacuterea (mv mln) 70 60 50 40 30 20 10

r-- ~--

~ ---shy~

~ ~

00 200 400 600 800 1000 masa (ng)

CromatOgrafo Uquldo HP-1050 aacuterea = 025940 + 005222(rnasa) r cuadrado = 099990

FACTORES DE RESPUESTA Blfenllo

n044 factores de respuesta 04 r--------------______---

03

02

01 1111 -a=middotII bullbull IK= ~~ ----- ---aiexcl

O~~-~~~~~~-~~~~~---~~~~ 10 100 1000

mua (ng) CromatOgrafo Uquldo HP-10SO Hmite deteccioacuten = 0423 ng limite cuantificacioacuten = 1411 ng

FIGURA B Graacuteficas de linealidad y factores de respuesta para el Bifenilo

Tahla 1 Ef(uipos J]LC de la seccioacuten de cromatografIa

CROMATOacuteGRAFO nf4TECTOR DESGASIFICADOR

HP-I050 SERIES 1050 SI

HP-I090 1040 A f)AD SI

PE-SERIES 2 PE-Le 75 NO

KNK-500-A WATERS 440 SI

PE-SERIES2 AB 757 Af) NO

KNK-500-A AB 757 AD SI

HP-l090 AB 757 AD SI

Algunas caracteriacutesticas generales de las bombas ele los instmmentos de la tahla I son

las siguientes

bull EL cromatoacutegrafo liacutequido HP-I050 cuenta con cuatro liacuteneas de solvente y con un

desgasiftcador a vaciacuteo realiza la mezcla a baja presioacuten con una vaacutelvula proporcional de alta

velocidad Posee lUla bomba de dos pistones duales en serie y esto le permite hacer mezclas

en modo isocraacutetico y en gradieute

bull El cromatoacutegrafo liacutequido HP-I090 tiene dos canales activos (A y B) de suministro de

solvente La desgasiftcacioacuten se efectuacutea con Helio Cada canal comprende un recipiente de

solvente y illa bomba de jeringa dual con Wla vaacutelvula rotatoria los dos eluyentes se mezclan

a presioacuten media antes de ser bomheados a alta presioacuten por medio de lUla bomba de

membrana a traveacutes del inyector y hacia la cohunna Estaacute capacitado para trahajo en modo

isocraacutetico yen gradiente

bull El cromatoacutegrafo liacutequido PE-Series 2 cuenla con dos liacuteneas de solventes y no posee

desgasiftcador incorporado Tieue dos bombas cada una de ellas con desplazamiento I

positivo reciacuteproco de cabeza dllal ( cada una de las dos bomhas del eqllipo ntilizl pistones

dualcmiddots de zafiro) La mezcla se rlaliil a alta presioacuten con un mezclador dinaacuternilto

18

bull El ltromatoacutegraJo liacutequido KNK-SOO Series A posee cuatro liacuteneas de suministro de

solvente con desgasificador inc(Hvorado (usando Helio) Tiene lIDa vaacutelvula proporcional en

la que se neva a cabo la mezcla a baja presioacuten y una bomba que trabaja con dos pistones

duales en serie

La tabla II resume los aspectos maacutes relevantes de los detectores UV usados en la

realizacioacuten de este trabajo

Tabla 11 detectores de los cromatoacutegrafos HP Le

DETECTOR Rango (nm) anchul

banda (nm)

volumen

celda (uL)

presioacuten (maacutex)

celda (Bars)

camino

(mm)

oacuteptico

1040 A DAD 190-600 4-40() 45 40 6

Selies 1050 190-600 65 14 40 8

AB 757-AD 190-700 5 12 --shy 8

Waters 440 254 --shy --shy 70 10

~C-75 190-600 39 8 140 10

Todos los detectores de la tabla II poseen lIDa laacutempara de Deuterio con excepcioacuten del

Waters 440 que cuenta con 1ma de Mercurio

Los detectores Series 1050 AB 757-AD Y LC-75 son de A variable con red de

difraccioacuten como elemento monoltromador

El detector 1040 A DAD es un detector de matriz de diodos (red de difraccioacuten

holograacutefica)

El detector Waters 440 puede trabajar a vanas As con filtros como sistema

monocromador

19

Cada cromatoacutegrafo estaacute equipado con un inyector manual tipo Rheodyne con un bucle

dI 20llL y tiene la posihilidac1 de tennostatar la columna a 35u C (temperahlra de aplicacioacuten

de la mezcla de prueba)

A todos los eqUipos listados en la tabla 1 se les aplicoacute el test de verificacioacuten de

instrumentos Todos los cromatogramas tmto de la mezcla de prueba como del ruido de

los equipos examinados estaacuten al final del presente trabajo y constituyen el anexo nU 5 al

igual que los cromatogramas con los que se calculm los liacutemites de cuantificacioacuten para cada

instrumento I

Los resultados de repetihilidad obtenidos al aplicar la mezcla de prueba a los equipos

evaluados se presentan en la tabla de reswnen general que constituye el anexo nU 6 asiacute como

tambieacuten los resultados de la reproducibilidad de la mezcla de prueba en el cromatoacutegrafo

Iiacuteq1lido JI 1gt-1 0)0 S~ incluyen ademaacutes olros resultados generales de lodos los equipos

23 Sensibilidad lid t(St de vuifkacioacuten de instrumentos

Esta sensibilidad es lID criterio de suma importancia que hay que considerar y se refiere

a los cambios que se observan al aplicar la mezcla de prueba cuando suceden pequentildeas

variaciones en las condiciones crOlnatograacuteficas del instrumento

Con el fin de caracterizar esta sensibilidad se cuantifican los cambios experimentados

por los valores de algunas variables como por ejemplo el tiempo de retencioacuten el aacuterea de

pico la altura del pico la anchura a media banda el nuacutemero de platos teoacutericos y la

resolucioacuten Estas variaciones se deben a su vez a cambios provocados deliberadamente en

algunos paraacutemetros cromatograacutelicos como son la composicioacuten de la fac moacutevil el lujo de la

fase moacutevil la tcmperatnra de la colmnna el volumen de inyeccioacuten y la longitud de onda de

deteccioacuten

20

Con eslo se pcr~lglle no soacutelo cuantificar la magnitud del cambio y determinar que

variables cromatograacuteficas inllllyen maacutes sobre los resultados finales del test sino tambieacuten

decidir ante un cambio imprevisto en la respuesta del equipo cual puede ser la posible causa

de la illomaliacutea es decir es lUla manera de diagnosticar la causas de un mal funcionamiento

en un cromatoacutegrafo liacutequido de HPLe En resumen se trata de establecer la capacidad que

tiene el test para detectar peqllcilas variaciones en las condiciones cromatograacuteficas del

instrumento

Es necesario considerar la estabilidad del tiempo de retencioacuten ya que afecta

directamente a la identificacioacuten de los compuestos Se necesita que el equipo sea capaz de

suministrar tiempos de retencioacuten absolutos reproducibles para reducir las incertezas

asociadas con la identificacioacuten del analito

La estabilidad del factor de rcspucsla ( como aacuterea o altma de pico) inlluye sobre los

resultados cuantitativos del anaacutelisis

De otro lado la estabilidad de los paraacutemetros de separacioacuten (anchura a media banda

nuacutemero de platos teoacutericos y resolllcioacuten) garantiza la calidad de la cromatogratla como

teacutecnica separativa

Finalmente es indispensable considerar la sensibilidad frente a cambios en la longitud

de onda lo que asegllfa la buena marcha del proceso de deteccioacuten de los picos

cromatograacuteficos

La tabla 11 [ muestra los paraacutemetJmiddotos que se toman en el presente trabajo para llevar a

cabo el estudio de la sensibilidad del test de verifiacutecacioacuten se consigna en la tabla el

paraacutemetro cromatograacutefiacuteco y las variaciones que se efectuacutean alrededor de Sil valor nominal

Tabla lJI Jlsludio de In sensibilidad del test de veriticacioacuten

iexclPARAacuteMETRO

Volumen de inyeccioacuten

Composicioacuten fase moacutevil

Flujo fase moacutevil

Temperatura de columna

iexclLongitud de onda deteccioacuten

VALOR NOIHNAL

20 nL

CH 3 CNH 2 O (7030 vv)

100 rnJmin

254 run

VARIACIOacuteN

10 50 Y 100 uL

de 65 a 75 de CH 3 CN

de 090 a 110 rnJmin

de 251 a 258 run

Se observan los cambios experimentados por las variables relacionadas con los picos

cromatograficos (tiempo de retencioacuten etc) y se representan esos valores frente a las

variaciones hechas a propoacutesito en las condiciones cromatograacuteficas estas graacuteficas van desde

la nU ~5 a la ndeg 1O~ del anexo nU 4

24 Cartas de control ele la mezcla de prueba del test de verificacioacuten

Las cartas de control de la calidad estadiacutestica son una herramienta simple pero

poderosa para verificar la calidad de lm procedimiento analiacutetico Conceptualmente son muy

sencillas Se mide regularmente un material estaacutendar y se representan las respuestas

analiacuteticas sobre un eje de tiempos en lna carta siacute la carta muestra variaciones alrededor del

resultado esperado diferentes a las del azar ello sugiere que algtma cosa ha ido mal en el

proceso de medida Para ayudar a decidir si esto ha sucedido se marcan sobre la carta

liacutemites de control Se espera qlle las respuestas pennanezcan dentro de esos liacutemites

Si un sistema de medida es estable de tal manera que muestra UJ1a variacioacuten aleatoria

alrededor de lm valor de referencia dado y el tamantildeo de esa variacioacuten (medido como la

desviacioacuten estaacutendar) pennanece constante se puede decir que el sistema estaacute en control

estadiacutestico o simplemclltc en control El objetivo al usar canas de control es lograr y

mantener ese estado de cOlllrol estadiacutestico 114J

Las cartas de control se pueden usar como una especie de base de dalos del laboratorio

donde se almacena una infonnacioacuten que puede ser oe gran utilidad para disentildear futuros

esludios experimentales

La liacutenea central en las cartas de control se torna como el valor medio alrededor del cual

estaacuten variando las medidas los limiles de control se colocan tres veces la desviacioacuten

estaacutendar por encima y por debajo de la liacutenea central ademaacutes hay un segundo grupo de

liacutemites de control llamados liacutemites oe advertencia a una distancia de dos veces la

desviacioacuten estaacutendar a ambos lados de la liacutenea central

No hay UB acueroo universal sobre como usar las cartas oe control Compantildeiacuteas

diferentes usan reglas diferentes IJ na sugerencia es que se requiere una accioacuten siacute se detecta

algo de lo que sigue

i) Cualquier plUlto fucra de los liacutemites de control

ii) Siete puntos todos por encima o por debajo de la linea central

iii) Siete intclvalos hacia arriba o hacia abajo (es decir ocho puntos consecutivos

ascendentes o descendentes)

iv) Cualquier otro patroacuten obviamente no aleatorio

25 Resultarlo~ y rlis~usioacuten

251 Lincnlidnd y factores de r(spuesta

ULas graacuteficas nUl a n 42 (anexo n4) muestran las rectas de regresioacuten lineal (aacuterea en

mVmin frente a la masa inyeclada en ng) para todos los picos de la mezcla de prueba en

todas y cada lma de las siete (7) configuraciones de HPLC estudiadas en estc trabajo Junto

a cada graacutefica aparece la cuacioacuten de regresioacuten y el valor de r 2 (coeficienle de

detcrminacioacuteu)

I

Los valores de r 2 se resumen luego en una tabla que aparece despueacutes de la cinco

graacuteficas correspondientes a la linealidad de todos los solutos de la mezcla de prueba para

cada equipo

Para todas las graacuteficas los valores de r 2 son aceptables y aproximadamente iguales

esto significa que en todos los casos existe una relacioacuten lineal entre las dos variables

representadas (como era de esperarse)

Estas graacuteficas no aportan mucha informacioacuten con respecto a la linealidad del sistema y

menos en las zonas de bajas concentraciones donde se pierde la linealidad del mismo y

tampoco permiten efectuar comparaciones entre equipos ya que todas ellas son praacutecticamente

equivalentes

En las graacuteficas n043 a la nU~4 (anexo n04) aparecen los factores de respuesta para todos

los picos de la mezcla de prueba en todos los cromatoacutegrafos ensayados (Factor de

respuesta Areamasa inyectada frente a la masa inyectada en ng) Ver tambieacuten la figura B

Cada graacutefica va acompantildeada por los valores del liacutemite de deteccioacuten y del liacutemite de

cuantificacioacuten ambos en ng para el so luto correspondiente Finalmente aparece (cada cinco

graacuteficas) una tabla con el rango lineal y la relacioacuten sentildealruido tambieacuten para cada soluto el

rango lineal es el cociente entre la masa mayor y la masa menor de la porcioacuten lineal de la

cwva y la relacioacuten sentildealmido resulta de dividir la altura del pico cromatograacutefico de un

soJuto en la mezcla de lpmeba (en mv) entre la altura del ruido (en mv)

En estas graacuteficas se puede visualizar cual es el liacutemite inferior del rango lineal es decir

a partir de que cantidad de sohuo inyectado el sistema deja de ser lineal (este liacutemite no

coincide necesariamente con el liacutemite de cuantificacioacuten) tambieacuten se observa una tendencia a

la peacuterdida de la linealidad en la zona de altas conceutraciones En consecuencia este tipo de

graacutefico suministra mayor informacioacuten que el graacutefico de regresioacuten y permite ef~ctuar

comparaciones

24

Tahla 1 Ef(uipos J]LC de la seccioacuten de cromatografIa

CROMATOacuteGRAFO nf4TECTOR DESGASIFICADOR

HP-I050 SERIES 1050 SI

HP-I090 1040 A f)AD SI

PE-SERIES 2 PE-Le 75 NO

KNK-500-A WATERS 440 SI

PE-SERIES2 AB 757 Af) NO

KNK-500-A AB 757 AD SI

HP-l090 AB 757 AD SI

Algunas caracteriacutesticas generales de las bombas ele los instmmentos de la tahla I son

las siguientes

bull EL cromatoacutegrafo liacutequido HP-I050 cuenta con cuatro liacuteneas de solvente y con un

desgasiftcador a vaciacuteo realiza la mezcla a baja presioacuten con una vaacutelvula proporcional de alta

velocidad Posee lUla bomba de dos pistones duales en serie y esto le permite hacer mezclas

en modo isocraacutetico y en gradieute

bull El cromatoacutegrafo liacutequido HP-I090 tiene dos canales activos (A y B) de suministro de

solvente La desgasiftcacioacuten se efectuacutea con Helio Cada canal comprende un recipiente de

solvente y illa bomba de jeringa dual con Wla vaacutelvula rotatoria los dos eluyentes se mezclan

a presioacuten media antes de ser bomheados a alta presioacuten por medio de lUla bomba de

membrana a traveacutes del inyector y hacia la cohunna Estaacute capacitado para trahajo en modo

isocraacutetico yen gradiente

bull El cromatoacutegrafo liacutequido PE-Series 2 cuenla con dos liacuteneas de solventes y no posee

desgasiftcador incorporado Tieue dos bombas cada una de ellas con desplazamiento I

positivo reciacuteproco de cabeza dllal ( cada una de las dos bomhas del eqllipo ntilizl pistones

dualcmiddots de zafiro) La mezcla se rlaliil a alta presioacuten con un mezclador dinaacuternilto

18

bull El ltromatoacutegraJo liacutequido KNK-SOO Series A posee cuatro liacuteneas de suministro de

solvente con desgasificador inc(Hvorado (usando Helio) Tiene lIDa vaacutelvula proporcional en

la que se neva a cabo la mezcla a baja presioacuten y una bomba que trabaja con dos pistones

duales en serie

La tabla II resume los aspectos maacutes relevantes de los detectores UV usados en la

realizacioacuten de este trabajo

Tabla 11 detectores de los cromatoacutegrafos HP Le

DETECTOR Rango (nm) anchul

banda (nm)

volumen

celda (uL)

presioacuten (maacutex)

celda (Bars)

camino

(mm)

oacuteptico

1040 A DAD 190-600 4-40() 45 40 6

Selies 1050 190-600 65 14 40 8

AB 757-AD 190-700 5 12 --shy 8

Waters 440 254 --shy --shy 70 10

~C-75 190-600 39 8 140 10

Todos los detectores de la tabla II poseen lIDa laacutempara de Deuterio con excepcioacuten del

Waters 440 que cuenta con 1ma de Mercurio

Los detectores Series 1050 AB 757-AD Y LC-75 son de A variable con red de

difraccioacuten como elemento monoltromador

El detector 1040 A DAD es un detector de matriz de diodos (red de difraccioacuten

holograacutefica)

El detector Waters 440 puede trabajar a vanas As con filtros como sistema

monocromador

19

Cada cromatoacutegrafo estaacute equipado con un inyector manual tipo Rheodyne con un bucle

dI 20llL y tiene la posihilidac1 de tennostatar la columna a 35u C (temperahlra de aplicacioacuten

de la mezcla de prueba)

A todos los eqUipos listados en la tabla 1 se les aplicoacute el test de verificacioacuten de

instrumentos Todos los cromatogramas tmto de la mezcla de prueba como del ruido de

los equipos examinados estaacuten al final del presente trabajo y constituyen el anexo nU 5 al

igual que los cromatogramas con los que se calculm los liacutemites de cuantificacioacuten para cada

instrumento I

Los resultados de repetihilidad obtenidos al aplicar la mezcla de prueba a los equipos

evaluados se presentan en la tabla de reswnen general que constituye el anexo nU 6 asiacute como

tambieacuten los resultados de la reproducibilidad de la mezcla de prueba en el cromatoacutegrafo

Iiacuteq1lido JI 1gt-1 0)0 S~ incluyen ademaacutes olros resultados generales de lodos los equipos

23 Sensibilidad lid t(St de vuifkacioacuten de instrumentos

Esta sensibilidad es lID criterio de suma importancia que hay que considerar y se refiere

a los cambios que se observan al aplicar la mezcla de prueba cuando suceden pequentildeas

variaciones en las condiciones crOlnatograacuteficas del instrumento

Con el fin de caracterizar esta sensibilidad se cuantifican los cambios experimentados

por los valores de algunas variables como por ejemplo el tiempo de retencioacuten el aacuterea de

pico la altura del pico la anchura a media banda el nuacutemero de platos teoacutericos y la

resolucioacuten Estas variaciones se deben a su vez a cambios provocados deliberadamente en

algunos paraacutemetros cromatograacutelicos como son la composicioacuten de la fac moacutevil el lujo de la

fase moacutevil la tcmperatnra de la colmnna el volumen de inyeccioacuten y la longitud de onda de

deteccioacuten

20

Con eslo se pcr~lglle no soacutelo cuantificar la magnitud del cambio y determinar que

variables cromatograacuteficas inllllyen maacutes sobre los resultados finales del test sino tambieacuten

decidir ante un cambio imprevisto en la respuesta del equipo cual puede ser la posible causa

de la illomaliacutea es decir es lUla manera de diagnosticar la causas de un mal funcionamiento

en un cromatoacutegrafo liacutequido de HPLe En resumen se trata de establecer la capacidad que

tiene el test para detectar peqllcilas variaciones en las condiciones cromatograacuteficas del

instrumento

Es necesario considerar la estabilidad del tiempo de retencioacuten ya que afecta

directamente a la identificacioacuten de los compuestos Se necesita que el equipo sea capaz de

suministrar tiempos de retencioacuten absolutos reproducibles para reducir las incertezas

asociadas con la identificacioacuten del analito

La estabilidad del factor de rcspucsla ( como aacuterea o altma de pico) inlluye sobre los

resultados cuantitativos del anaacutelisis

De otro lado la estabilidad de los paraacutemetros de separacioacuten (anchura a media banda

nuacutemero de platos teoacutericos y resolllcioacuten) garantiza la calidad de la cromatogratla como

teacutecnica separativa

Finalmente es indispensable considerar la sensibilidad frente a cambios en la longitud

de onda lo que asegllfa la buena marcha del proceso de deteccioacuten de los picos

cromatograacuteficos

La tabla 11 [ muestra los paraacutemetJmiddotos que se toman en el presente trabajo para llevar a

cabo el estudio de la sensibilidad del test de verifiacutecacioacuten se consigna en la tabla el

paraacutemetro cromatograacutefiacuteco y las variaciones que se efectuacutean alrededor de Sil valor nominal

Tabla lJI Jlsludio de In sensibilidad del test de veriticacioacuten

iexclPARAacuteMETRO

Volumen de inyeccioacuten

Composicioacuten fase moacutevil

Flujo fase moacutevil

Temperatura de columna

iexclLongitud de onda deteccioacuten

VALOR NOIHNAL

20 nL

CH 3 CNH 2 O (7030 vv)

100 rnJmin

254 run

VARIACIOacuteN

10 50 Y 100 uL

de 65 a 75 de CH 3 CN

de 090 a 110 rnJmin

de 251 a 258 run

Se observan los cambios experimentados por las variables relacionadas con los picos

cromatograficos (tiempo de retencioacuten etc) y se representan esos valores frente a las

variaciones hechas a propoacutesito en las condiciones cromatograacuteficas estas graacuteficas van desde

la nU ~5 a la ndeg 1O~ del anexo nU 4

24 Cartas de control ele la mezcla de prueba del test de verificacioacuten

Las cartas de control de la calidad estadiacutestica son una herramienta simple pero

poderosa para verificar la calidad de lm procedimiento analiacutetico Conceptualmente son muy

sencillas Se mide regularmente un material estaacutendar y se representan las respuestas

analiacuteticas sobre un eje de tiempos en lna carta siacute la carta muestra variaciones alrededor del

resultado esperado diferentes a las del azar ello sugiere que algtma cosa ha ido mal en el

proceso de medida Para ayudar a decidir si esto ha sucedido se marcan sobre la carta

liacutemites de control Se espera qlle las respuestas pennanezcan dentro de esos liacutemites

Si un sistema de medida es estable de tal manera que muestra UJ1a variacioacuten aleatoria

alrededor de lm valor de referencia dado y el tamantildeo de esa variacioacuten (medido como la

desviacioacuten estaacutendar) pennanece constante se puede decir que el sistema estaacute en control

estadiacutestico o simplemclltc en control El objetivo al usar canas de control es lograr y

mantener ese estado de cOlllrol estadiacutestico 114J

Las cartas de control se pueden usar como una especie de base de dalos del laboratorio

donde se almacena una infonnacioacuten que puede ser oe gran utilidad para disentildear futuros

esludios experimentales

La liacutenea central en las cartas de control se torna como el valor medio alrededor del cual

estaacuten variando las medidas los limiles de control se colocan tres veces la desviacioacuten

estaacutendar por encima y por debajo de la liacutenea central ademaacutes hay un segundo grupo de

liacutemites de control llamados liacutemites oe advertencia a una distancia de dos veces la

desviacioacuten estaacutendar a ambos lados de la liacutenea central

No hay UB acueroo universal sobre como usar las cartas oe control Compantildeiacuteas

diferentes usan reglas diferentes IJ na sugerencia es que se requiere una accioacuten siacute se detecta

algo de lo que sigue

i) Cualquier plUlto fucra de los liacutemites de control

ii) Siete puntos todos por encima o por debajo de la linea central

iii) Siete intclvalos hacia arriba o hacia abajo (es decir ocho puntos consecutivos

ascendentes o descendentes)

iv) Cualquier otro patroacuten obviamente no aleatorio

25 Resultarlo~ y rlis~usioacuten

251 Lincnlidnd y factores de r(spuesta

ULas graacuteficas nUl a n 42 (anexo n4) muestran las rectas de regresioacuten lineal (aacuterea en

mVmin frente a la masa inyeclada en ng) para todos los picos de la mezcla de prueba en

todas y cada lma de las siete (7) configuraciones de HPLC estudiadas en estc trabajo Junto

a cada graacutefica aparece la cuacioacuten de regresioacuten y el valor de r 2 (coeficienle de

detcrminacioacuteu)

I

Los valores de r 2 se resumen luego en una tabla que aparece despueacutes de la cinco

graacuteficas correspondientes a la linealidad de todos los solutos de la mezcla de prueba para

cada equipo

Para todas las graacuteficas los valores de r 2 son aceptables y aproximadamente iguales

esto significa que en todos los casos existe una relacioacuten lineal entre las dos variables

representadas (como era de esperarse)

Estas graacuteficas no aportan mucha informacioacuten con respecto a la linealidad del sistema y

menos en las zonas de bajas concentraciones donde se pierde la linealidad del mismo y

tampoco permiten efectuar comparaciones entre equipos ya que todas ellas son praacutecticamente

equivalentes

En las graacuteficas n043 a la nU~4 (anexo n04) aparecen los factores de respuesta para todos

los picos de la mezcla de prueba en todos los cromatoacutegrafos ensayados (Factor de

respuesta Areamasa inyectada frente a la masa inyectada en ng) Ver tambieacuten la figura B

Cada graacutefica va acompantildeada por los valores del liacutemite de deteccioacuten y del liacutemite de

cuantificacioacuten ambos en ng para el so luto correspondiente Finalmente aparece (cada cinco

graacuteficas) una tabla con el rango lineal y la relacioacuten sentildealruido tambieacuten para cada soluto el

rango lineal es el cociente entre la masa mayor y la masa menor de la porcioacuten lineal de la

cwva y la relacioacuten sentildealmido resulta de dividir la altura del pico cromatograacutefico de un

soJuto en la mezcla de lpmeba (en mv) entre la altura del ruido (en mv)

En estas graacuteficas se puede visualizar cual es el liacutemite inferior del rango lineal es decir

a partir de que cantidad de sohuo inyectado el sistema deja de ser lineal (este liacutemite no

coincide necesariamente con el liacutemite de cuantificacioacuten) tambieacuten se observa una tendencia a

la peacuterdida de la linealidad en la zona de altas conceutraciones En consecuencia este tipo de

graacutefico suministra mayor informacioacuten que el graacutefico de regresioacuten y permite ef~ctuar

comparaciones

24

bull El ltromatoacutegraJo liacutequido KNK-SOO Series A posee cuatro liacuteneas de suministro de

solvente con desgasificador inc(Hvorado (usando Helio) Tiene lIDa vaacutelvula proporcional en

la que se neva a cabo la mezcla a baja presioacuten y una bomba que trabaja con dos pistones

duales en serie

La tabla II resume los aspectos maacutes relevantes de los detectores UV usados en la

realizacioacuten de este trabajo

Tabla 11 detectores de los cromatoacutegrafos HP Le

DETECTOR Rango (nm) anchul

banda (nm)

volumen

celda (uL)

presioacuten (maacutex)

celda (Bars)

camino

(mm)

oacuteptico

1040 A DAD 190-600 4-40() 45 40 6

Selies 1050 190-600 65 14 40 8

AB 757-AD 190-700 5 12 --shy 8

Waters 440 254 --shy --shy 70 10

~C-75 190-600 39 8 140 10

Todos los detectores de la tabla II poseen lIDa laacutempara de Deuterio con excepcioacuten del

Waters 440 que cuenta con 1ma de Mercurio

Los detectores Series 1050 AB 757-AD Y LC-75 son de A variable con red de

difraccioacuten como elemento monoltromador

El detector 1040 A DAD es un detector de matriz de diodos (red de difraccioacuten

holograacutefica)

El detector Waters 440 puede trabajar a vanas As con filtros como sistema

monocromador

19

Cada cromatoacutegrafo estaacute equipado con un inyector manual tipo Rheodyne con un bucle

dI 20llL y tiene la posihilidac1 de tennostatar la columna a 35u C (temperahlra de aplicacioacuten

de la mezcla de prueba)

A todos los eqUipos listados en la tabla 1 se les aplicoacute el test de verificacioacuten de

instrumentos Todos los cromatogramas tmto de la mezcla de prueba como del ruido de

los equipos examinados estaacuten al final del presente trabajo y constituyen el anexo nU 5 al

igual que los cromatogramas con los que se calculm los liacutemites de cuantificacioacuten para cada

instrumento I

Los resultados de repetihilidad obtenidos al aplicar la mezcla de prueba a los equipos

evaluados se presentan en la tabla de reswnen general que constituye el anexo nU 6 asiacute como

tambieacuten los resultados de la reproducibilidad de la mezcla de prueba en el cromatoacutegrafo

Iiacuteq1lido JI 1gt-1 0)0 S~ incluyen ademaacutes olros resultados generales de lodos los equipos

23 Sensibilidad lid t(St de vuifkacioacuten de instrumentos

Esta sensibilidad es lID criterio de suma importancia que hay que considerar y se refiere

a los cambios que se observan al aplicar la mezcla de prueba cuando suceden pequentildeas

variaciones en las condiciones crOlnatograacuteficas del instrumento

Con el fin de caracterizar esta sensibilidad se cuantifican los cambios experimentados

por los valores de algunas variables como por ejemplo el tiempo de retencioacuten el aacuterea de

pico la altura del pico la anchura a media banda el nuacutemero de platos teoacutericos y la

resolucioacuten Estas variaciones se deben a su vez a cambios provocados deliberadamente en

algunos paraacutemetros cromatograacutelicos como son la composicioacuten de la fac moacutevil el lujo de la

fase moacutevil la tcmperatnra de la colmnna el volumen de inyeccioacuten y la longitud de onda de

deteccioacuten

20

Con eslo se pcr~lglle no soacutelo cuantificar la magnitud del cambio y determinar que

variables cromatograacuteficas inllllyen maacutes sobre los resultados finales del test sino tambieacuten

decidir ante un cambio imprevisto en la respuesta del equipo cual puede ser la posible causa

de la illomaliacutea es decir es lUla manera de diagnosticar la causas de un mal funcionamiento

en un cromatoacutegrafo liacutequido de HPLe En resumen se trata de establecer la capacidad que

tiene el test para detectar peqllcilas variaciones en las condiciones cromatograacuteficas del

instrumento

Es necesario considerar la estabilidad del tiempo de retencioacuten ya que afecta

directamente a la identificacioacuten de los compuestos Se necesita que el equipo sea capaz de

suministrar tiempos de retencioacuten absolutos reproducibles para reducir las incertezas

asociadas con la identificacioacuten del analito

La estabilidad del factor de rcspucsla ( como aacuterea o altma de pico) inlluye sobre los

resultados cuantitativos del anaacutelisis

De otro lado la estabilidad de los paraacutemetros de separacioacuten (anchura a media banda

nuacutemero de platos teoacutericos y resolllcioacuten) garantiza la calidad de la cromatogratla como

teacutecnica separativa

Finalmente es indispensable considerar la sensibilidad frente a cambios en la longitud

de onda lo que asegllfa la buena marcha del proceso de deteccioacuten de los picos

cromatograacuteficos

La tabla 11 [ muestra los paraacutemetJmiddotos que se toman en el presente trabajo para llevar a

cabo el estudio de la sensibilidad del test de verifiacutecacioacuten se consigna en la tabla el

paraacutemetro cromatograacutefiacuteco y las variaciones que se efectuacutean alrededor de Sil valor nominal

Tabla lJI Jlsludio de In sensibilidad del test de veriticacioacuten

iexclPARAacuteMETRO

Volumen de inyeccioacuten

Composicioacuten fase moacutevil

Flujo fase moacutevil

Temperatura de columna

iexclLongitud de onda deteccioacuten

VALOR NOIHNAL

20 nL

CH 3 CNH 2 O (7030 vv)

100 rnJmin

254 run

VARIACIOacuteN

10 50 Y 100 uL

de 65 a 75 de CH 3 CN

de 090 a 110 rnJmin

de 251 a 258 run

Se observan los cambios experimentados por las variables relacionadas con los picos

cromatograficos (tiempo de retencioacuten etc) y se representan esos valores frente a las

variaciones hechas a propoacutesito en las condiciones cromatograacuteficas estas graacuteficas van desde

la nU ~5 a la ndeg 1O~ del anexo nU 4

24 Cartas de control ele la mezcla de prueba del test de verificacioacuten

Las cartas de control de la calidad estadiacutestica son una herramienta simple pero

poderosa para verificar la calidad de lm procedimiento analiacutetico Conceptualmente son muy

sencillas Se mide regularmente un material estaacutendar y se representan las respuestas

analiacuteticas sobre un eje de tiempos en lna carta siacute la carta muestra variaciones alrededor del

resultado esperado diferentes a las del azar ello sugiere que algtma cosa ha ido mal en el

proceso de medida Para ayudar a decidir si esto ha sucedido se marcan sobre la carta

liacutemites de control Se espera qlle las respuestas pennanezcan dentro de esos liacutemites

Si un sistema de medida es estable de tal manera que muestra UJ1a variacioacuten aleatoria

alrededor de lm valor de referencia dado y el tamantildeo de esa variacioacuten (medido como la

desviacioacuten estaacutendar) pennanece constante se puede decir que el sistema estaacute en control

estadiacutestico o simplemclltc en control El objetivo al usar canas de control es lograr y

mantener ese estado de cOlllrol estadiacutestico 114J

Las cartas de control se pueden usar como una especie de base de dalos del laboratorio

donde se almacena una infonnacioacuten que puede ser oe gran utilidad para disentildear futuros

esludios experimentales

La liacutenea central en las cartas de control se torna como el valor medio alrededor del cual

estaacuten variando las medidas los limiles de control se colocan tres veces la desviacioacuten

estaacutendar por encima y por debajo de la liacutenea central ademaacutes hay un segundo grupo de

liacutemites de control llamados liacutemites oe advertencia a una distancia de dos veces la

desviacioacuten estaacutendar a ambos lados de la liacutenea central

No hay UB acueroo universal sobre como usar las cartas oe control Compantildeiacuteas

diferentes usan reglas diferentes IJ na sugerencia es que se requiere una accioacuten siacute se detecta

algo de lo que sigue

i) Cualquier plUlto fucra de los liacutemites de control

ii) Siete puntos todos por encima o por debajo de la linea central

iii) Siete intclvalos hacia arriba o hacia abajo (es decir ocho puntos consecutivos

ascendentes o descendentes)

iv) Cualquier otro patroacuten obviamente no aleatorio

25 Resultarlo~ y rlis~usioacuten

251 Lincnlidnd y factores de r(spuesta

ULas graacuteficas nUl a n 42 (anexo n4) muestran las rectas de regresioacuten lineal (aacuterea en

mVmin frente a la masa inyeclada en ng) para todos los picos de la mezcla de prueba en

todas y cada lma de las siete (7) configuraciones de HPLC estudiadas en estc trabajo Junto

a cada graacutefica aparece la cuacioacuten de regresioacuten y el valor de r 2 (coeficienle de

detcrminacioacuteu)

I

Los valores de r 2 se resumen luego en una tabla que aparece despueacutes de la cinco

graacuteficas correspondientes a la linealidad de todos los solutos de la mezcla de prueba para

cada equipo

Para todas las graacuteficas los valores de r 2 son aceptables y aproximadamente iguales

esto significa que en todos los casos existe una relacioacuten lineal entre las dos variables

representadas (como era de esperarse)

Estas graacuteficas no aportan mucha informacioacuten con respecto a la linealidad del sistema y

menos en las zonas de bajas concentraciones donde se pierde la linealidad del mismo y

tampoco permiten efectuar comparaciones entre equipos ya que todas ellas son praacutecticamente

equivalentes

En las graacuteficas n043 a la nU~4 (anexo n04) aparecen los factores de respuesta para todos

los picos de la mezcla de prueba en todos los cromatoacutegrafos ensayados (Factor de

respuesta Areamasa inyectada frente a la masa inyectada en ng) Ver tambieacuten la figura B

Cada graacutefica va acompantildeada por los valores del liacutemite de deteccioacuten y del liacutemite de

cuantificacioacuten ambos en ng para el so luto correspondiente Finalmente aparece (cada cinco

graacuteficas) una tabla con el rango lineal y la relacioacuten sentildealruido tambieacuten para cada soluto el

rango lineal es el cociente entre la masa mayor y la masa menor de la porcioacuten lineal de la

cwva y la relacioacuten sentildealmido resulta de dividir la altura del pico cromatograacutefico de un

soJuto en la mezcla de lpmeba (en mv) entre la altura del ruido (en mv)

En estas graacuteficas se puede visualizar cual es el liacutemite inferior del rango lineal es decir

a partir de que cantidad de sohuo inyectado el sistema deja de ser lineal (este liacutemite no

coincide necesariamente con el liacutemite de cuantificacioacuten) tambieacuten se observa una tendencia a

la peacuterdida de la linealidad en la zona de altas conceutraciones En consecuencia este tipo de

graacutefico suministra mayor informacioacuten que el graacutefico de regresioacuten y permite ef~ctuar

comparaciones

24

Cada cromatoacutegrafo estaacute equipado con un inyector manual tipo Rheodyne con un bucle

dI 20llL y tiene la posihilidac1 de tennostatar la columna a 35u C (temperahlra de aplicacioacuten

de la mezcla de prueba)

A todos los eqUipos listados en la tabla 1 se les aplicoacute el test de verificacioacuten de

instrumentos Todos los cromatogramas tmto de la mezcla de prueba como del ruido de

los equipos examinados estaacuten al final del presente trabajo y constituyen el anexo nU 5 al

igual que los cromatogramas con los que se calculm los liacutemites de cuantificacioacuten para cada

instrumento I

Los resultados de repetihilidad obtenidos al aplicar la mezcla de prueba a los equipos

evaluados se presentan en la tabla de reswnen general que constituye el anexo nU 6 asiacute como

tambieacuten los resultados de la reproducibilidad de la mezcla de prueba en el cromatoacutegrafo

Iiacuteq1lido JI 1gt-1 0)0 S~ incluyen ademaacutes olros resultados generales de lodos los equipos

23 Sensibilidad lid t(St de vuifkacioacuten de instrumentos

Esta sensibilidad es lID criterio de suma importancia que hay que considerar y se refiere

a los cambios que se observan al aplicar la mezcla de prueba cuando suceden pequentildeas

variaciones en las condiciones crOlnatograacuteficas del instrumento

Con el fin de caracterizar esta sensibilidad se cuantifican los cambios experimentados

por los valores de algunas variables como por ejemplo el tiempo de retencioacuten el aacuterea de

pico la altura del pico la anchura a media banda el nuacutemero de platos teoacutericos y la

resolucioacuten Estas variaciones se deben a su vez a cambios provocados deliberadamente en

algunos paraacutemetros cromatograacutelicos como son la composicioacuten de la fac moacutevil el lujo de la

fase moacutevil la tcmperatnra de la colmnna el volumen de inyeccioacuten y la longitud de onda de

deteccioacuten

20

Con eslo se pcr~lglle no soacutelo cuantificar la magnitud del cambio y determinar que

variables cromatograacuteficas inllllyen maacutes sobre los resultados finales del test sino tambieacuten

decidir ante un cambio imprevisto en la respuesta del equipo cual puede ser la posible causa

de la illomaliacutea es decir es lUla manera de diagnosticar la causas de un mal funcionamiento

en un cromatoacutegrafo liacutequido de HPLe En resumen se trata de establecer la capacidad que

tiene el test para detectar peqllcilas variaciones en las condiciones cromatograacuteficas del

instrumento

Es necesario considerar la estabilidad del tiempo de retencioacuten ya que afecta

directamente a la identificacioacuten de los compuestos Se necesita que el equipo sea capaz de

suministrar tiempos de retencioacuten absolutos reproducibles para reducir las incertezas

asociadas con la identificacioacuten del analito

La estabilidad del factor de rcspucsla ( como aacuterea o altma de pico) inlluye sobre los

resultados cuantitativos del anaacutelisis

De otro lado la estabilidad de los paraacutemetros de separacioacuten (anchura a media banda

nuacutemero de platos teoacutericos y resolllcioacuten) garantiza la calidad de la cromatogratla como

teacutecnica separativa

Finalmente es indispensable considerar la sensibilidad frente a cambios en la longitud

de onda lo que asegllfa la buena marcha del proceso de deteccioacuten de los picos

cromatograacuteficos

La tabla 11 [ muestra los paraacutemetJmiddotos que se toman en el presente trabajo para llevar a

cabo el estudio de la sensibilidad del test de verifiacutecacioacuten se consigna en la tabla el

paraacutemetro cromatograacutefiacuteco y las variaciones que se efectuacutean alrededor de Sil valor nominal

Tabla lJI Jlsludio de In sensibilidad del test de veriticacioacuten

iexclPARAacuteMETRO

Volumen de inyeccioacuten

Composicioacuten fase moacutevil

Flujo fase moacutevil

Temperatura de columna

iexclLongitud de onda deteccioacuten

VALOR NOIHNAL

20 nL

CH 3 CNH 2 O (7030 vv)

100 rnJmin

254 run

VARIACIOacuteN

10 50 Y 100 uL

de 65 a 75 de CH 3 CN

de 090 a 110 rnJmin

de 251 a 258 run

Se observan los cambios experimentados por las variables relacionadas con los picos

cromatograficos (tiempo de retencioacuten etc) y se representan esos valores frente a las

variaciones hechas a propoacutesito en las condiciones cromatograacuteficas estas graacuteficas van desde

la nU ~5 a la ndeg 1O~ del anexo nU 4

24 Cartas de control ele la mezcla de prueba del test de verificacioacuten

Las cartas de control de la calidad estadiacutestica son una herramienta simple pero

poderosa para verificar la calidad de lm procedimiento analiacutetico Conceptualmente son muy

sencillas Se mide regularmente un material estaacutendar y se representan las respuestas

analiacuteticas sobre un eje de tiempos en lna carta siacute la carta muestra variaciones alrededor del

resultado esperado diferentes a las del azar ello sugiere que algtma cosa ha ido mal en el

proceso de medida Para ayudar a decidir si esto ha sucedido se marcan sobre la carta

liacutemites de control Se espera qlle las respuestas pennanezcan dentro de esos liacutemites

Si un sistema de medida es estable de tal manera que muestra UJ1a variacioacuten aleatoria

alrededor de lm valor de referencia dado y el tamantildeo de esa variacioacuten (medido como la

desviacioacuten estaacutendar) pennanece constante se puede decir que el sistema estaacute en control

estadiacutestico o simplemclltc en control El objetivo al usar canas de control es lograr y

mantener ese estado de cOlllrol estadiacutestico 114J

Las cartas de control se pueden usar como una especie de base de dalos del laboratorio

donde se almacena una infonnacioacuten que puede ser oe gran utilidad para disentildear futuros

esludios experimentales

La liacutenea central en las cartas de control se torna como el valor medio alrededor del cual

estaacuten variando las medidas los limiles de control se colocan tres veces la desviacioacuten

estaacutendar por encima y por debajo de la liacutenea central ademaacutes hay un segundo grupo de

liacutemites de control llamados liacutemites oe advertencia a una distancia de dos veces la

desviacioacuten estaacutendar a ambos lados de la liacutenea central

No hay UB acueroo universal sobre como usar las cartas oe control Compantildeiacuteas

diferentes usan reglas diferentes IJ na sugerencia es que se requiere una accioacuten siacute se detecta

algo de lo que sigue

i) Cualquier plUlto fucra de los liacutemites de control

ii) Siete puntos todos por encima o por debajo de la linea central

iii) Siete intclvalos hacia arriba o hacia abajo (es decir ocho puntos consecutivos

ascendentes o descendentes)

iv) Cualquier otro patroacuten obviamente no aleatorio

25 Resultarlo~ y rlis~usioacuten

251 Lincnlidnd y factores de r(spuesta

ULas graacuteficas nUl a n 42 (anexo n4) muestran las rectas de regresioacuten lineal (aacuterea en

mVmin frente a la masa inyeclada en ng) para todos los picos de la mezcla de prueba en

todas y cada lma de las siete (7) configuraciones de HPLC estudiadas en estc trabajo Junto

a cada graacutefica aparece la cuacioacuten de regresioacuten y el valor de r 2 (coeficienle de

detcrminacioacuteu)

I

Los valores de r 2 se resumen luego en una tabla que aparece despueacutes de la cinco

graacuteficas correspondientes a la linealidad de todos los solutos de la mezcla de prueba para

cada equipo

Para todas las graacuteficas los valores de r 2 son aceptables y aproximadamente iguales

esto significa que en todos los casos existe una relacioacuten lineal entre las dos variables

representadas (como era de esperarse)

Estas graacuteficas no aportan mucha informacioacuten con respecto a la linealidad del sistema y

menos en las zonas de bajas concentraciones donde se pierde la linealidad del mismo y

tampoco permiten efectuar comparaciones entre equipos ya que todas ellas son praacutecticamente

equivalentes

En las graacuteficas n043 a la nU~4 (anexo n04) aparecen los factores de respuesta para todos

los picos de la mezcla de prueba en todos los cromatoacutegrafos ensayados (Factor de

respuesta Areamasa inyectada frente a la masa inyectada en ng) Ver tambieacuten la figura B

Cada graacutefica va acompantildeada por los valores del liacutemite de deteccioacuten y del liacutemite de

cuantificacioacuten ambos en ng para el so luto correspondiente Finalmente aparece (cada cinco

graacuteficas) una tabla con el rango lineal y la relacioacuten sentildealruido tambieacuten para cada soluto el

rango lineal es el cociente entre la masa mayor y la masa menor de la porcioacuten lineal de la

cwva y la relacioacuten sentildealmido resulta de dividir la altura del pico cromatograacutefico de un

soJuto en la mezcla de lpmeba (en mv) entre la altura del ruido (en mv)

En estas graacuteficas se puede visualizar cual es el liacutemite inferior del rango lineal es decir

a partir de que cantidad de sohuo inyectado el sistema deja de ser lineal (este liacutemite no

coincide necesariamente con el liacutemite de cuantificacioacuten) tambieacuten se observa una tendencia a

la peacuterdida de la linealidad en la zona de altas conceutraciones En consecuencia este tipo de

graacutefico suministra mayor informacioacuten que el graacutefico de regresioacuten y permite ef~ctuar

comparaciones

24

Con eslo se pcr~lglle no soacutelo cuantificar la magnitud del cambio y determinar que

variables cromatograacuteficas inllllyen maacutes sobre los resultados finales del test sino tambieacuten

decidir ante un cambio imprevisto en la respuesta del equipo cual puede ser la posible causa

de la illomaliacutea es decir es lUla manera de diagnosticar la causas de un mal funcionamiento

en un cromatoacutegrafo liacutequido de HPLe En resumen se trata de establecer la capacidad que

tiene el test para detectar peqllcilas variaciones en las condiciones cromatograacuteficas del

instrumento

Es necesario considerar la estabilidad del tiempo de retencioacuten ya que afecta

directamente a la identificacioacuten de los compuestos Se necesita que el equipo sea capaz de

suministrar tiempos de retencioacuten absolutos reproducibles para reducir las incertezas

asociadas con la identificacioacuten del analito

La estabilidad del factor de rcspucsla ( como aacuterea o altma de pico) inlluye sobre los

resultados cuantitativos del anaacutelisis

De otro lado la estabilidad de los paraacutemetros de separacioacuten (anchura a media banda

nuacutemero de platos teoacutericos y resolllcioacuten) garantiza la calidad de la cromatogratla como

teacutecnica separativa

Finalmente es indispensable considerar la sensibilidad frente a cambios en la longitud

de onda lo que asegllfa la buena marcha del proceso de deteccioacuten de los picos

cromatograacuteficos

La tabla 11 [ muestra los paraacutemetJmiddotos que se toman en el presente trabajo para llevar a

cabo el estudio de la sensibilidad del test de verifiacutecacioacuten se consigna en la tabla el

paraacutemetro cromatograacutefiacuteco y las variaciones que se efectuacutean alrededor de Sil valor nominal

Tabla lJI Jlsludio de In sensibilidad del test de veriticacioacuten

iexclPARAacuteMETRO

Volumen de inyeccioacuten

Composicioacuten fase moacutevil

Flujo fase moacutevil

Temperatura de columna

iexclLongitud de onda deteccioacuten

VALOR NOIHNAL

20 nL

CH 3 CNH 2 O (7030 vv)

100 rnJmin

254 run

VARIACIOacuteN

10 50 Y 100 uL

de 65 a 75 de CH 3 CN

de 090 a 110 rnJmin

de 251 a 258 run

Se observan los cambios experimentados por las variables relacionadas con los picos

cromatograficos (tiempo de retencioacuten etc) y se representan esos valores frente a las

variaciones hechas a propoacutesito en las condiciones cromatograacuteficas estas graacuteficas van desde

la nU ~5 a la ndeg 1O~ del anexo nU 4

24 Cartas de control ele la mezcla de prueba del test de verificacioacuten

Las cartas de control de la calidad estadiacutestica son una herramienta simple pero

poderosa para verificar la calidad de lm procedimiento analiacutetico Conceptualmente son muy

sencillas Se mide regularmente un material estaacutendar y se representan las respuestas

analiacuteticas sobre un eje de tiempos en lna carta siacute la carta muestra variaciones alrededor del

resultado esperado diferentes a las del azar ello sugiere que algtma cosa ha ido mal en el

proceso de medida Para ayudar a decidir si esto ha sucedido se marcan sobre la carta

liacutemites de control Se espera qlle las respuestas pennanezcan dentro de esos liacutemites

Si un sistema de medida es estable de tal manera que muestra UJ1a variacioacuten aleatoria

alrededor de lm valor de referencia dado y el tamantildeo de esa variacioacuten (medido como la

desviacioacuten estaacutendar) pennanece constante se puede decir que el sistema estaacute en control

estadiacutestico o simplemclltc en control El objetivo al usar canas de control es lograr y

mantener ese estado de cOlllrol estadiacutestico 114J

Las cartas de control se pueden usar como una especie de base de dalos del laboratorio

donde se almacena una infonnacioacuten que puede ser oe gran utilidad para disentildear futuros

esludios experimentales

La liacutenea central en las cartas de control se torna como el valor medio alrededor del cual

estaacuten variando las medidas los limiles de control se colocan tres veces la desviacioacuten

estaacutendar por encima y por debajo de la liacutenea central ademaacutes hay un segundo grupo de

liacutemites de control llamados liacutemites oe advertencia a una distancia de dos veces la

desviacioacuten estaacutendar a ambos lados de la liacutenea central

No hay UB acueroo universal sobre como usar las cartas oe control Compantildeiacuteas

diferentes usan reglas diferentes IJ na sugerencia es que se requiere una accioacuten siacute se detecta

algo de lo que sigue

i) Cualquier plUlto fucra de los liacutemites de control

ii) Siete puntos todos por encima o por debajo de la linea central

iii) Siete intclvalos hacia arriba o hacia abajo (es decir ocho puntos consecutivos

ascendentes o descendentes)

iv) Cualquier otro patroacuten obviamente no aleatorio

25 Resultarlo~ y rlis~usioacuten

251 Lincnlidnd y factores de r(spuesta

ULas graacuteficas nUl a n 42 (anexo n4) muestran las rectas de regresioacuten lineal (aacuterea en

mVmin frente a la masa inyeclada en ng) para todos los picos de la mezcla de prueba en

todas y cada lma de las siete (7) configuraciones de HPLC estudiadas en estc trabajo Junto

a cada graacutefica aparece la cuacioacuten de regresioacuten y el valor de r 2 (coeficienle de

detcrminacioacuteu)

I

Los valores de r 2 se resumen luego en una tabla que aparece despueacutes de la cinco

graacuteficas correspondientes a la linealidad de todos los solutos de la mezcla de prueba para

cada equipo

Para todas las graacuteficas los valores de r 2 son aceptables y aproximadamente iguales

esto significa que en todos los casos existe una relacioacuten lineal entre las dos variables

representadas (como era de esperarse)

Estas graacuteficas no aportan mucha informacioacuten con respecto a la linealidad del sistema y

menos en las zonas de bajas concentraciones donde se pierde la linealidad del mismo y

tampoco permiten efectuar comparaciones entre equipos ya que todas ellas son praacutecticamente

equivalentes

En las graacuteficas n043 a la nU~4 (anexo n04) aparecen los factores de respuesta para todos

los picos de la mezcla de prueba en todos los cromatoacutegrafos ensayados (Factor de

respuesta Areamasa inyectada frente a la masa inyectada en ng) Ver tambieacuten la figura B

Cada graacutefica va acompantildeada por los valores del liacutemite de deteccioacuten y del liacutemite de

cuantificacioacuten ambos en ng para el so luto correspondiente Finalmente aparece (cada cinco

graacuteficas) una tabla con el rango lineal y la relacioacuten sentildealruido tambieacuten para cada soluto el

rango lineal es el cociente entre la masa mayor y la masa menor de la porcioacuten lineal de la

cwva y la relacioacuten sentildealmido resulta de dividir la altura del pico cromatograacutefico de un

soJuto en la mezcla de lpmeba (en mv) entre la altura del ruido (en mv)

En estas graacuteficas se puede visualizar cual es el liacutemite inferior del rango lineal es decir

a partir de que cantidad de sohuo inyectado el sistema deja de ser lineal (este liacutemite no

coincide necesariamente con el liacutemite de cuantificacioacuten) tambieacuten se observa una tendencia a

la peacuterdida de la linealidad en la zona de altas conceutraciones En consecuencia este tipo de

graacutefico suministra mayor informacioacuten que el graacutefico de regresioacuten y permite ef~ctuar

comparaciones

24

Tabla lJI Jlsludio de In sensibilidad del test de veriticacioacuten

iexclPARAacuteMETRO

Volumen de inyeccioacuten

Composicioacuten fase moacutevil

Flujo fase moacutevil

Temperatura de columna

iexclLongitud de onda deteccioacuten

VALOR NOIHNAL

20 nL

CH 3 CNH 2 O (7030 vv)

100 rnJmin

254 run

VARIACIOacuteN

10 50 Y 100 uL

de 65 a 75 de CH 3 CN

de 090 a 110 rnJmin

de 251 a 258 run

Se observan los cambios experimentados por las variables relacionadas con los picos

cromatograficos (tiempo de retencioacuten etc) y se representan esos valores frente a las

variaciones hechas a propoacutesito en las condiciones cromatograacuteficas estas graacuteficas van desde

la nU ~5 a la ndeg 1O~ del anexo nU 4

24 Cartas de control ele la mezcla de prueba del test de verificacioacuten

Las cartas de control de la calidad estadiacutestica son una herramienta simple pero

poderosa para verificar la calidad de lm procedimiento analiacutetico Conceptualmente son muy

sencillas Se mide regularmente un material estaacutendar y se representan las respuestas

analiacuteticas sobre un eje de tiempos en lna carta siacute la carta muestra variaciones alrededor del

resultado esperado diferentes a las del azar ello sugiere que algtma cosa ha ido mal en el

proceso de medida Para ayudar a decidir si esto ha sucedido se marcan sobre la carta

liacutemites de control Se espera qlle las respuestas pennanezcan dentro de esos liacutemites

Si un sistema de medida es estable de tal manera que muestra UJ1a variacioacuten aleatoria

alrededor de lm valor de referencia dado y el tamantildeo de esa variacioacuten (medido como la

desviacioacuten estaacutendar) pennanece constante se puede decir que el sistema estaacute en control

estadiacutestico o simplemclltc en control El objetivo al usar canas de control es lograr y

mantener ese estado de cOlllrol estadiacutestico 114J

Las cartas de control se pueden usar como una especie de base de dalos del laboratorio

donde se almacena una infonnacioacuten que puede ser oe gran utilidad para disentildear futuros

esludios experimentales

La liacutenea central en las cartas de control se torna como el valor medio alrededor del cual

estaacuten variando las medidas los limiles de control se colocan tres veces la desviacioacuten

estaacutendar por encima y por debajo de la liacutenea central ademaacutes hay un segundo grupo de

liacutemites de control llamados liacutemites oe advertencia a una distancia de dos veces la

desviacioacuten estaacutendar a ambos lados de la liacutenea central

No hay UB acueroo universal sobre como usar las cartas oe control Compantildeiacuteas

diferentes usan reglas diferentes IJ na sugerencia es que se requiere una accioacuten siacute se detecta

algo de lo que sigue

i) Cualquier plUlto fucra de los liacutemites de control

ii) Siete puntos todos por encima o por debajo de la linea central

iii) Siete intclvalos hacia arriba o hacia abajo (es decir ocho puntos consecutivos

ascendentes o descendentes)

iv) Cualquier otro patroacuten obviamente no aleatorio

25 Resultarlo~ y rlis~usioacuten

251 Lincnlidnd y factores de r(spuesta

ULas graacuteficas nUl a n 42 (anexo n4) muestran las rectas de regresioacuten lineal (aacuterea en

mVmin frente a la masa inyeclada en ng) para todos los picos de la mezcla de prueba en

todas y cada lma de las siete (7) configuraciones de HPLC estudiadas en estc trabajo Junto

a cada graacutefica aparece la cuacioacuten de regresioacuten y el valor de r 2 (coeficienle de

detcrminacioacuteu)

I

Los valores de r 2 se resumen luego en una tabla que aparece despueacutes de la cinco

graacuteficas correspondientes a la linealidad de todos los solutos de la mezcla de prueba para

cada equipo

Para todas las graacuteficas los valores de r 2 son aceptables y aproximadamente iguales

esto significa que en todos los casos existe una relacioacuten lineal entre las dos variables

representadas (como era de esperarse)

Estas graacuteficas no aportan mucha informacioacuten con respecto a la linealidad del sistema y

menos en las zonas de bajas concentraciones donde se pierde la linealidad del mismo y

tampoco permiten efectuar comparaciones entre equipos ya que todas ellas son praacutecticamente

equivalentes

En las graacuteficas n043 a la nU~4 (anexo n04) aparecen los factores de respuesta para todos

los picos de la mezcla de prueba en todos los cromatoacutegrafos ensayados (Factor de

respuesta Areamasa inyectada frente a la masa inyectada en ng) Ver tambieacuten la figura B

Cada graacutefica va acompantildeada por los valores del liacutemite de deteccioacuten y del liacutemite de

cuantificacioacuten ambos en ng para el so luto correspondiente Finalmente aparece (cada cinco

graacuteficas) una tabla con el rango lineal y la relacioacuten sentildealruido tambieacuten para cada soluto el

rango lineal es el cociente entre la masa mayor y la masa menor de la porcioacuten lineal de la

cwva y la relacioacuten sentildealmido resulta de dividir la altura del pico cromatograacutefico de un

soJuto en la mezcla de lpmeba (en mv) entre la altura del ruido (en mv)

En estas graacuteficas se puede visualizar cual es el liacutemite inferior del rango lineal es decir

a partir de que cantidad de sohuo inyectado el sistema deja de ser lineal (este liacutemite no

coincide necesariamente con el liacutemite de cuantificacioacuten) tambieacuten se observa una tendencia a

la peacuterdida de la linealidad en la zona de altas conceutraciones En consecuencia este tipo de

graacutefico suministra mayor informacioacuten que el graacutefico de regresioacuten y permite ef~ctuar

comparaciones

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Las cartas de control se pueden usar como una especie de base de dalos del laboratorio

donde se almacena una infonnacioacuten que puede ser oe gran utilidad para disentildear futuros

esludios experimentales

La liacutenea central en las cartas de control se torna como el valor medio alrededor del cual

estaacuten variando las medidas los limiles de control se colocan tres veces la desviacioacuten

estaacutendar por encima y por debajo de la liacutenea central ademaacutes hay un segundo grupo de

liacutemites de control llamados liacutemites oe advertencia a una distancia de dos veces la

desviacioacuten estaacutendar a ambos lados de la liacutenea central

No hay UB acueroo universal sobre como usar las cartas oe control Compantildeiacuteas

diferentes usan reglas diferentes IJ na sugerencia es que se requiere una accioacuten siacute se detecta

algo de lo que sigue

i) Cualquier plUlto fucra de los liacutemites de control

ii) Siete puntos todos por encima o por debajo de la linea central

iii) Siete intclvalos hacia arriba o hacia abajo (es decir ocho puntos consecutivos

ascendentes o descendentes)

iv) Cualquier otro patroacuten obviamente no aleatorio

25 Resultarlo~ y rlis~usioacuten

251 Lincnlidnd y factores de r(spuesta

ULas graacuteficas nUl a n 42 (anexo n4) muestran las rectas de regresioacuten lineal (aacuterea en

mVmin frente a la masa inyeclada en ng) para todos los picos de la mezcla de prueba en

todas y cada lma de las siete (7) configuraciones de HPLC estudiadas en estc trabajo Junto

a cada graacutefica aparece la cuacioacuten de regresioacuten y el valor de r 2 (coeficienle de

detcrminacioacuteu)

I

Los valores de r 2 se resumen luego en una tabla que aparece despueacutes de la cinco

graacuteficas correspondientes a la linealidad de todos los solutos de la mezcla de prueba para

cada equipo

Para todas las graacuteficas los valores de r 2 son aceptables y aproximadamente iguales

esto significa que en todos los casos existe una relacioacuten lineal entre las dos variables

representadas (como era de esperarse)

Estas graacuteficas no aportan mucha informacioacuten con respecto a la linealidad del sistema y

menos en las zonas de bajas concentraciones donde se pierde la linealidad del mismo y

tampoco permiten efectuar comparaciones entre equipos ya que todas ellas son praacutecticamente

equivalentes

En las graacuteficas n043 a la nU~4 (anexo n04) aparecen los factores de respuesta para todos

los picos de la mezcla de prueba en todos los cromatoacutegrafos ensayados (Factor de

respuesta Areamasa inyectada frente a la masa inyectada en ng) Ver tambieacuten la figura B

Cada graacutefica va acompantildeada por los valores del liacutemite de deteccioacuten y del liacutemite de

cuantificacioacuten ambos en ng para el so luto correspondiente Finalmente aparece (cada cinco

graacuteficas) una tabla con el rango lineal y la relacioacuten sentildealruido tambieacuten para cada soluto el

rango lineal es el cociente entre la masa mayor y la masa menor de la porcioacuten lineal de la

cwva y la relacioacuten sentildealmido resulta de dividir la altura del pico cromatograacutefico de un

soJuto en la mezcla de lpmeba (en mv) entre la altura del ruido (en mv)

En estas graacuteficas se puede visualizar cual es el liacutemite inferior del rango lineal es decir

a partir de que cantidad de sohuo inyectado el sistema deja de ser lineal (este liacutemite no

coincide necesariamente con el liacutemite de cuantificacioacuten) tambieacuten se observa una tendencia a

la peacuterdida de la linealidad en la zona de altas conceutraciones En consecuencia este tipo de

graacutefico suministra mayor informacioacuten que el graacutefico de regresioacuten y permite ef~ctuar

comparaciones

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I

Los valores de r 2 se resumen luego en una tabla que aparece despueacutes de la cinco

graacuteficas correspondientes a la linealidad de todos los solutos de la mezcla de prueba para

cada equipo

Para todas las graacuteficas los valores de r 2 son aceptables y aproximadamente iguales

esto significa que en todos los casos existe una relacioacuten lineal entre las dos variables

representadas (como era de esperarse)

Estas graacuteficas no aportan mucha informacioacuten con respecto a la linealidad del sistema y

menos en las zonas de bajas concentraciones donde se pierde la linealidad del mismo y

tampoco permiten efectuar comparaciones entre equipos ya que todas ellas son praacutecticamente

equivalentes

En las graacuteficas n043 a la nU~4 (anexo n04) aparecen los factores de respuesta para todos

los picos de la mezcla de prueba en todos los cromatoacutegrafos ensayados (Factor de

respuesta Areamasa inyectada frente a la masa inyectada en ng) Ver tambieacuten la figura B

Cada graacutefica va acompantildeada por los valores del liacutemite de deteccioacuten y del liacutemite de

cuantificacioacuten ambos en ng para el so luto correspondiente Finalmente aparece (cada cinco

graacuteficas) una tabla con el rango lineal y la relacioacuten sentildealruido tambieacuten para cada soluto el

rango lineal es el cociente entre la masa mayor y la masa menor de la porcioacuten lineal de la

cwva y la relacioacuten sentildealmido resulta de dividir la altura del pico cromatograacutefico de un

soJuto en la mezcla de lpmeba (en mv) entre la altura del ruido (en mv)

En estas graacuteficas se puede visualizar cual es el liacutemite inferior del rango lineal es decir

a partir de que cantidad de sohuo inyectado el sistema deja de ser lineal (este liacutemite no

coincide necesariamente con el liacutemite de cuantificacioacuten) tambieacuten se observa una tendencia a

la peacuterdida de la linealidad en la zona de altas conceutraciones En consecuencia este tipo de

graacutefico suministra mayor informacioacuten que el graacutefico de regresioacuten y permite ef~ctuar

comparaciones

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