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Protein Expression

Expression, homolog oder heterolog?

• Heterologe Expression in anderem Host• Kompartment• Codon usage• Posttranslationale Modifikationen• Kofaktoren• Chaperone

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lacPromoter

Lac OperonlaclacRepressorRepressor

genomische DNA

LacI laclacOperatorOperator

Gen Gen zurzurExpressionExpression

laclacOperatorOperator

laclacRepressorRepressor

laclacPromoterPromoter

Polymerase

Zielprotein

lac promoter Expressionssystem

Polymerase

Non-leaky Expression• Ein Expressionsytem soll möglichst “dicht”- non-leaky sein.

• Grund: Proteine, die exprimiert werden sollen, können toxisch sein.

• Das kann zur Folge haben, dass sich der Expressionshost gar nicht transformieren lässt, da die transformierten Zellen sofort sterben.

• Stirbt der Expressionshost nicht, kann aber das Zielprotein, dasdurch leaky Expression produziert wird, eine negative Selektion gut exprimierender Zellen bewirken. Erklärung: Gut exprimierende Zellen produzieren viel Zielprotein, aber weniger eigene Proteine, d.h. wachsen schlechter. Die gut exprimierendensind nach einigen Verdopplungsrunden fast nicht mehr vorhanden. Man selektioniert also auf schlecht exprimierende Zellen.

• Das pET System von Studier für Expression in E.coli ist extrem “dicht” aufgrund verschiedener Vorkehrungen.

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lacPromoter

GenT7 PolymeraselaclacRepressorRepressor

genomische DNA

LacI laclacOperatorOperator

Gen Gen zurzurExpressionExpression



T7 T7 PromoterPromoter

T7 Polymerase

Zielprotein



T7 T7 Promoter

Promoter



T7 T7 Promoter

Promoter laclacOperatorOperator


T7 T7 Promoter

Promoter

E.coli BL21 (DE3)- pET Expressionssystem

High copy plasmid

T7 T7 PolymerasePolymeraselaclac

OperatorOperator



Lac Lac PromoterPromoter

Keine Expression ohne Induktion

• da lac-Repressor Protein auf Operatorregion sitzt und Bindung der E.coli Polymeraseverhindert, d.h es wird keine T7 Polymerasesynthetisiert.

• Ohne T7 Polymerase keine Expression des Zielproteins.

• Als zusätzliche Sicherung sitzt auch beim T7 Promoter noch eine lac Operatorregion. Sollten T7 Polymerase dennoch in geringen Mengen synthetisiert worden sein, kann das Gen trotzdem nicht abgelsen werden.

• Zusätzliche Kopien des Lac Repressors sind Plamid kodiert. So wird genügend lac Repressorsynthetisiert.

Gen Gen zurzurExpressionExpressionlaclac

OperatorOperator


T7 T7 PromoterPromoter

E.c

oliG

enom

Pla

smid

E.coli Polymerase

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OperatorOperator



Zusätzliche Sicherung

• Eine weitere Absicherung gegen T7 Polymerase, die in geringen Mengen synthetisiert wurde, ist die Co-Expression von Lysozym, welches auch als Inhibitor der T7 Polymerase wirkt. Die T7-Polymerase wird abgefangen, bevor die Expression des Zielgensstattfindet. • Das Lysozym wird auf einem zweiten Vektor kodiert.

LysozymLysozym

E.c

oliG

enom

E.coli Polymerase


OperatorOperator


T7 T7 PromoterPromoterP

lasm

id


OperatorOperator

laclac RepressorRepressorINAKTIVINAKTIV



Expression erst nach Induktion

• da lac-Repressor von Operator (Genom) abfällt

• E.coli Polymerase liest Gen für T7 Polymeraseab.

• lac Repressor von Operator (Plasmid) fällt ab.

• T7 Polymerase liest Gen für Zielprotein ab.


OperatorOperatorT7 T7 PromoterPromoter

E.c

oliG

enom

Pla

smid

Gal

acto

se

/ IP

TG

Gal

acto

se

/ IP

TG

laclac RepressorRepressorINAKTIVINAKTIV

Zielprotein

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Kompartment• Cytosol => Cytosol (E.coli, Hefe, Insektenzellen)

• Membran => Spezieller E.coli Stämme„Walker strains“ C41, C43

• ExtrazellulärExpression in Hefe, Sekretion ins MediumSignalpeptid & Sekretion ins Periplama von E.coliExpression im Cytosol in E.coli Stämmen mit defizienter

Thioredoxin- und Glutathionreduktase

Expression, homolog oder heterolog?

• Heterologous Expression in different Host• Compartment• Codon usage• Posttranslational Modifications• Cofaktors• Chaperone

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Codon usage

• Verschiedene Codon Präferenz • Verschiedene tRNA levels in Organismen• Bei seltenen Codons => Translationsstop

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Rare Codons

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BL21(DE3)Rosetta

BL21(DE3)pLys

BL21(DE3)Nicht induziert

Rare Codons- Expression in Rosetta

• Gensynthese• Zielgen wird synthetisiert optimiert für

codon usage des Hosts• Synthese durch PCR mit überlappenden

Primern

Rare Codons- Synthetische Gene

5‘ 3‘

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• Expression; Inclusion bodies – was nun

• Löslich, aber auch gefaltet?

Inclusion bodies

• Intrazelluläre Aggregate von missgefaltetemProtein

• Bilden sich bei Expression, wenn Protein sich nicht richtig faltet.

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Inclusion bodies, im Mikroskop erkennbar

Inclusion bodiesEM Bild

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Inclusion bodies• Proteine teils gefaltet; oder IB enthalten auch gefaltetes Protein; Bsp

Green Fluorescent Protein GFP, leuchte nur wenn es gefaltet ist. Bild C, E, die Punkte sind Inclusion bodies, die gefaltetes GFP enthalten. Cytoplasmatische Expression als lösliches Protein z.B. in Bild B.

Inclusion BodiesSind also eine Mischung aus ungefaltetem Protein, teilgefaltetemProtein und auch gefaltetem Protein.

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Inclusion bodies vermeiden• Richtiges Expressionskompartiment ?

BspExpression einer Ig Domäne mitessentiellem Disulfid in Origami Stamm(erlaubt Disulfide im Cytoplasma) in Bild A, Gelspur 1, Gesamtzellprotein, Protein wird exprimiert.Gelspur 3, Lösliche Proteine=> Protein ist löslich

In Bild B, Expression in normalen Stämmen: Gelspur 1 und 3 Gesamtzelllprotein, eswird also Zielprotein exprimiert.Aber die Fraktionen mit löslichemProtein in Gelpsur 2 und in 4 zeigen keinZielprotein=> Inclusion bodies

Inclusion bodies vermeiden

Optimierung ExpressionskonstruktVerkürzung / Verlängerung um wenige Aminosäuren kann Faltung extrem beeinflussen

Verminderung Protein de Novo Synthese durch

• Induktionsstärke / Tuner B StrainsErniedrigen der IPTG Konzentration

• ExpressionstemperaturVermindern der Expressionstemperatur auf 30 oder 20 °C

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• Durch Chaperone Induktion

Ethanol 3%Zugabe von EthanolInduziert Expression vonHeat Shock Proteinen=Chaperonen=Faltunsghelfern

Inclusion bodies vermeiden• Chaperone Co-expression seit ca 20 Jahren

bekannt.

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• Chaperone Co-expression

Inclusion bodies vermeiden• Chaperone Co-expression

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• Chaperone Co-expressionKombination von Chaperonenermöglicht auch Expression von “Schwierigen Proteinen”

Refolding

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UnfoldingChaotrope Substanzen – stören die geordnete Wasserstruktur, => vermindern den hydrophoben Effekt. Dadurch wird der hydophobe Corevon Proteinen zerstört, => das Protein entfaltet sich.

Kosmotrope Substanzen – fördern die geordnete Wasserstruktur, => verstärken den hydrophoben Effekt; z.B. Ammoniumsulfatfällung.

Refolding=> Es sollten verschiedene Refoldingpuffer probiert werden. Man kann hier auf eien Reihe von Publikationen zurückgreifen.

Bsp

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Refolding

Refolding

Während dem Refolding können teils gefalteteIntermediate aggregierenund die vollständige Faltungins Native Protein verhindern.

Abhilfe: Zugabe von Aggregationshemmern, z.B.Arginin, Glycerin

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CD SpectroscopyOptisch aktive Substanzen können polarisiertes Licht drehen

PolarisationsfilterPolarisationsfilterLicht besteht aus E-Vektor und H-vektor.Bei Polarisation werden E-Vektoren ausgeblendet.

Proteine sind optisch akive Substanzen

Jeder Sekundärstrukturtyp hat charakteristisches CD Spektrum.

Aus Kombination von den drei Grundtypen lassen sich CD Spektren von Proteinen fitten => Gehalt an α-Helix, β-Sheet, random coil.

Beispiele

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Overlay and elimination of CD bands => β-sheets diffcult to predict

Co-factors contribute to CD spectrum => wrong prediction

Far UV CD So weit wie möglich

•CD Spektren sollten soweit wie möglich ins kurzwellige UV aufegnommen werden. •Anteile der Spektren mit hohem Anteil and struktureller Informationen befindensich gerade auch zwischen 200 und 180 nm. •Problem: Viele Puffersubstanzen, Salze, etc absorbieren sehr stark ab ca. 210 nm und maskieren so das Spektrum des Peptidbindungen des Proteins.

Bsp. Prion Protein imVergleich zu Mutante: Strukturelle Änderungen erstunter 200 nm im Spektrumdutlich erkennbar.

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CD: Nahes und fernes UV

Fernes UV: Bereich zwischen250 und 180 nm

Nahes UV zwischen 350 und 250 nm.

“Nah”, wegen Nähe zumsichtbaren Bereich (ca 380 -780 nm).

CD Signale im nahen UVvon den Aromaten istFingerprint für gefalteteProteine

FTIR of ProteinsFourier Transformierte InfraRot Spektroskopie

Infrared bands of peptide bond (s) : stretch ; (b): bend; (t): torsion

Band Wavenumber /cm-1 Origin

A 3300 N-H (s)B 3100 N-H (s)I 1690-1600 C=O (s) 80%, N-H (b) 10%, C-N (s) 10%II 1575-1480 N-H (b) 60%, C-N (s) 40%III 1301-1229 C-N (s) 30%, N-H (b) 30%, C=O (s) 10%

O=C-N (b) 10%,

O

NH

(s)

(s)(s)

Bands cm-1 secondary structurein D2O

1620-1635 β-sheet, 310 helix, α-helix,unordered

1648-1657 α-helix

1644 unordered

1659-1683 turn, β-sheet

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FTIR spectra of model peptides

M. Holtzhauer, „Methoden in der Proteinanalytik“ p. 145; p. 150;

IR Absorption of H2O

Wellenzahl / cm-1

Experimental setup

Measurement in H2O => 6-10 µM cell path 10 mg/mlMeasurement in D2O => 100µM (= 0.1 mm) cell path 1 mg/ml-> complete exchange of H2O to D2O-> complete exchange of N-H to N-D-> no H2O in atmosphere (dry N2 chamber)-> time expense ~ like in CD spectroscopy

Advantage of FTIR over CD:

no contribution from cofactors like flavins, heme, Zn2+, other metals ... In region for secondary structure analysis.

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Analyse FTIR

Analyse mittels Fit derKurve durch ein Set vonGausskurven.

Die Lage der Maxima, die im Gesamtspektrumnur als Schulternsichtbar sind, lässt sichdurch die zweiteAbleitung der Spektrenbestimmen.

Analyse FTIR

Je mehr Maxima erkennbar sind, destomehr Gausskurven lassensich fitten. Der Gesamtfirwird dadurch besser und zuverlässiger.

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Analyse FTIR

Bsp. Anwendung von FTIR bei Prion Protein Mutante: Die MutanteΔTM zeigt etwas mehr ß-sheet als der Wildtyp, was zu einerStabilisierung führt. Thaa et al. BBA Mol Cell Res. 1783, 1076-84.

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