Expresion Genetica de La Metanogenesis

8/17/2019 Expresion Genetica de La Metanogenesis

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2011 Volumen 3, No. 6 Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila

http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/divulgacionAQM.html

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EXPRESIÓN GENÉTICA EN LA DIGESTIÓN ANAEROBIA: UN PASOADELANTE EN LA COMPRENSIÓN DE LAS INTERACCIONES TRÓFICAS

DE ESTA BIOTECNOLOGÍA

Almeida, A1

., Nafarrate-Rivera, E1

., Alvarado, A1

., Cervantes-Ovalle A1

., Luevanos,M.P.E1., Oropeza R2., Balagurusamy, N1*

1 Laboratorio de Biorremediación de la Escuela de Ciencias Biológicas de la Universidad Autónoma de

Coahuila. Carretera Torreón-Matamoros km 7.5, Torreón, Coahuila.2 Instituto de Biotecnología/ UNAM, Cuernavaca, Morelos.

* [email protected]

RESUMEN

La digestión anaerobia es una estrategia promisoria para la generación de compuestos de valor agregado a partir demateriales de desecho, principalmente metano. En este proceso se conoce la participación e interacción de almenos 11 grupos microbianos. Sin embargo, el potencial de estos microorganismos involucrados en la degradaciónanaerobia aún no se ha entendido completamente. Aunque existen varios reportes en el potencial de la

biometanización de la biomasa y la relación entre los factores ambientales que afectan a los microorganismos,detalles de su diversidad, sus capacidades metabólicas e interacciones no han sido revelados satisfactoriamente.Los recientes avances en ecología molecular aún buscan esclarecer estos cruciales detalles. Estudios sobreexpresión genética de las especies presentes en los reactores anaerobios revelan importantes datos sobre losmecanismos que detrás de las respuestas de los organismos a las diferentes condiciones de estrés. Este trabajotrata sobre los grupos de microorganismos anaerobios involucrados en la generación de metano a partir debiomasa, su metabolismo, dinámica, interacciones y la relación con la expresión genética de los mismos. Unconocimiento profundo de los principios y funciones que controlan en última instancia las respuestas a la inhibiciónayudarán a entender el proceso y modificarlo a fin de incrementar los rendimientos. Además, se demuestra que losestudios de expresión genética pueden empelarse como indicadores confiables del estado general de los reactoresy procesos anaerobios.

INTRODUCCIÓN

Las conversiones anaerobias están entre los más viejos procesos biológicos empleados por la humanidad,inicialmente, para obtener alimentos y bebidas; sin embargo, la necesidad de la sociedad actual de desarrollarprocesos sustentables y ecológicamente responsables, está incrementando la aplicación de los procesosanaerobios basándose en dos características primordiales de éstos: el tratamiento de los residuos orgánicos y larecuperación de energía. El tratamiento de los desechos provee un beneficio económico y ambiental. Además, elmetano, presente en el biogas producido por los sistemas anaerobios, puede ser recuperado y aprovechado para lageneración de energía, reduciendo el consumo de combustibles fósiles e impactando de manera positiva sobre lareducción de las emisiones de gases de efecto invernadero (Kansal y col., 2004).

Nagamani y Ramasamy (1999) señalan tres puntos básicos en el proceso de digestión anaerobia:a) que las bacterias más importantes involucradas en el proceso de producción de biogas son anaerobias y tienenun crecimiento lento;b) que se observa un alto grado de especialización metabólica en estos microorganismos anaerobios; yc) que la mayoría de la energía libre presente en el sustrato se encuentra en el producto final metano.

Debido a que la digestión anaerobia no es una tecnología mecánica sino biológica que involucra una complejacomunidad microbiana íntimamente relacionada que metaboliza productos generados entre los diversos grupos, esnecesario un constante monitoreo para dar un buen rendimiento del proceso. Las interacciones que se dan entre losgrupos tróficos dependen de los genes que los organismos en la comunidad expresan durante el proceso dedigestión. Tecnología para estudiar la expresión diferencial de genes puede ser utilizada para elucidar redesmetabólicas en comunidades microbianas. Una profunda comprensión de la regulación metabólica bajo diferentesfactores puede ayudar a mejorar el rendimiento de metano en digestores anaerobios. En el siguiente artículo derevisión, se cubre de manera profunda la comunidad microbiana de la digestión anaerobia, compuestos que causan


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inhibición de grupos tróficos y los estudios de expresión genética en los organismos presentes en digestoresanaerobios

1. Interacción Microbiana en la Digestión Anaerobia

La digestión anaerobia es una serie de procesos únicos, en los cuales diversos grupos de microorganismosinteractúan entre sí en una dinámica metabólica compleja, siendo parte importante de los ciclos biogeoquímicos delCarbono, Nitrógeno y Azufre. Además, éste procesos posee relevantes aplicaciones directas para las sociedadesmodernas como lo son el tratamiento de efluentes y la producción de energía.

El proceso de degradación anaerobia ha sido básicamente restringido a tan sólo 3 grupos o etapas principales parasu estudio (Pavlostathis y Giraldo-Gómez, 1991; Siegris y col., 1993), 1) hidrólisis y fermentación, 2) acetogénesis y3) metanogénesis; donde la primera etapa del proceso involucra la hidrólisis de sólidos insolubles, es decirpartículas orgánicas (como celulosa o hemicelulosa) o coloides orgánicos (como proteínas), en compuestos solublessimples que pueden ser absorbidos a través de la pared celular, para que posteriormente, dichas moléculashidrolizadas sean catabolizadas por bacterias fermentativas en alcoholes y ácidos grasos, teniendo como resultadode este proceso, la producción de hidrógeno y dióxido de carbono. Durante la acetogénesis, se produce ácidoacético a través de la oxidación de ácidos grasos de cadena corta o alcoholes (Schink, 1997), ó a través de lareducción del CO2, usando hidrógeno como donador de electrones para la reacción (Fischer y col., 1932). En el

último paso, la metanogénesis, es llevada a cabo por arqueas las cuales obtienen su energía de la conversión de unnúmero restringido de sustratos a metano (Gujer y Zehnder, 1983; Pavlostathis y Giraldo-Gomez, 1991; Hedderich yWhitman, 2006).

A pesar de ser agrupadas en tan sólo 3 etapas, la digestión anaerobia es una serie de procedimientos y reaccionesespecíficas en las que intervienen o interactúan por lo menos 11 grupos microbianos (Figura 1), los cuales serándescritos a detalle en este trabajo, a través de las etapas de la digestión anaerobia.

NITRATOS Y

SULFATOS

POLÍMEROS COMPLEJOS(Polis acáridos, proteínas, lípidos)

MONÓMEROS(azúcares, aminoácidos)

ALCOHOLES(metanol, etanol)

ÁCIDOS GRASOS DE

CADENA LARGA(láurico, mi rístico, palmítico)

ÁCIDOS GRASOS VOLÁTILES

PropionatoButirato eIsobutirato

Acetato

Valeriato eIsovaleriato

Caproato

3

HIDRÓGENO Y DIÓXIDO

DE CARBONO

H2 CO2

Metano

4

SO2NO3

H2SN2NH3

10 9 8

1

1. Bacter ias Hidrolít icas

2. Bacterias Fermentativas

3. Bacterias Sintróficas Productoras Obligadas

de Hidrógeno

4. Bacterias Homoacetogénicas

5. Bacterias Sintróficas Oxidadoras de Acetato

6. Arqueas Metanogénicas Acetoclásticas

7. Arqueas Metanogénicas Hidrogenotróficas

8. Bacterias Sulfato Reductoras

9. Bacterias Denit ri f icantes

10. Bacterias Disimiladoras Reductoras de

Nitratos

11. Metanótrofos Anaerobios

5

2

7

11

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Fig. 1. Interacciones microbianas en el proceso de degradación anaerobia.


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1.1. Primera Etapa: Hidrólisis y Fermentación

La primera etapa de la digestión anaerobia es algunas veces limitante en el funcionamiento de un digestoranaerobio, ya que a través de la hidrólisis las partículas complejas son solubilizadas para primeramente hacerlasaccesibles al interior de la membrana celular de los microorganismos, posteriormente en la etapa de fermentación,

la materia orgánica disuelta, proveniente de la hidrólisis es degradada a ácidos orgánicos de cadena corta yalcoholes por una población microbiana heterogénea (Gavala y col., 2003).

1.1.1. Hidrólisis, la solubilización de los compuestos orgánicos

La hidrólisis se define tanto como la solubilización de partículas o coloides insolubles, como la descomposiciónbiológica de polímeros orgánicos a monómeros y dímeros, los cuales son capaces de a travesar la membranacelular (Gavala y col., 2003). La hidrólisis de biopolímeros es llevada a cabo regularmente por enzimasextracelulares (hidrolasas) las cuales se encargan de romper enlaces específicos con ayuda de moléculas de aguapara obtener moléculas de polímero más pequeñas, dicho proceso ha sido descrito por McCarty y Mosey (como unacinética de primer orden [Ec. (1)].

r s = Kh · S (1)

donde r s es la velocidad de consumo del sustrato, S es la concentración de sustrato y Kh es la constante dehidrólisis.

La solubilización de sustratos insolubles es un proceso complejo que depende de diferentes parámetros tales comoel tamaño de partícula, el pH (Veeken, et al., 2000), la temperatura (Veeken y Hamelers, 1999), producción deenzimas, la difusión y adsorción de las enzimas a las partículas.

Los primeros datos obtenidos sobre la hidrólisis de polímeros orgánicos provienen de estudios de ecologíamicrobiana en el rumen. Sin embargo, un amplio número de constantes de velocidad de hidrólisis concernientes a ladegradación de carbohidratos, proteínas y lípidos han sido reportadas asumiendo cinéticas de primer orden, tal es elcaso del trabajo elaborado por Christ y co l. (2000) (Tabla 1).

Tabla 1. Constantes cinéticas (d-1) para la hidrólisis anaeróbica de

carbohidratos, proteínas y lípidos. Sustrato Constante hidrolítica (d-1)

Carbohidratos 0.025-0.200Proteínas 0.015-0.075Lípidos 0.005-0.010

Gavala y col., 2003

La importancia de este grupo de bacterias radica en la velocidad con la que estas solubilizan la materia particulada yse ha comprobado que dicha velocidad de hidrólisis del sustrato depende tanto del tipo, origen y de la previaadaptación del inóculo anaerobio (Doyle y col., 1983; Gavala y Lyberatos, 2001), y a su vez, la naturaleza delsustrato determina el tipo y grado de bacterias hidrolíticas presentes. Preeti Rao y col., (1993), observaron quemientras digestores alimentados con estiércol de vaca soportan mayor cantidad de microorganismos amilolíticos, losdigestores alimentados con desechos de aves de corral mostraron mayores poblaciones proteolíticas. Ramasamy y

col. (1991), reportaron la diferencia existente en las especies de bacterias celulolíticas presentes en el rumen y enun biodigestor; mientras que en el rumen, Ruminococcus sp. representan aproximadamente el 60% del total de estetipo de bacterias, en el biodigestor las especies de los géneros Bacteroides y Clostridium fueron las predominantes.Se ha comprobado que la mayoría de este tipo de bacterias está adherida al sustrato antes de la hidrólisisextensiva.

Los principales constituyentes de la biomasa típica alimentada a un digestor anaerobio (estiércol de ganado lecheroo engorda, desechos de frutas y verduras, desechos de jardinería), son la celulosa, hemicelulosa y lignina,polímeros distribuidos en una matriz lignocelulósica, en la cual, la lignina juega un papel importante en su


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degradación, ya que por sí sólo este compuesto recalcitrante no tiende a la degradación anaerobia, además que sucontenido afecta la degradación de los polímeros de celulosa y hemicelulosa. Se conoce como celulasas, alconjunto de enzimas encargadas de la hidrólisis de la celulosa, los tres principales tipos de celulasas son conocidoscomo: endocelulasas (encargadas de romper los enlaces 1,4-β glucosídicos internos del polímero de celulosa enpolímeros de menor tamaño), exocelulasas (encargadas de romper los enlaces 1,4-β glucosídicos de los polímeros

reducidos por las endocelulasas, obteniendo tetrámeros o dímeros de glucosa, como la celobiosa) y la celobiasas oβ-glucosidasas (las cuales hidrolizan la celobiosa en dos moléculas de glucosa).La degradación de proteínas (50% de la masa seca celular es proteína), no ha sido estudiada a fondo, sin embargo,se sabe que estas configuraciones tridimensionales de aminoácidos, que pueden o no estar conjugadas a gruposorgánicos o inorgánicos, son degradadas por un conjunto de enzimas proteolíticas, conocidas también comoproteasas, las cuales han sido estudiadas tanto en rumen, como en digestores, hallando que las bacteriasproteolíticas ruminales predominantes en el rumen de ganado fueron unos bacilos Gram-negativos pertenecientes algénero Bacteroides (Hazelwood y Nugent, 1978) en contraste con las bacterias proteolíticas predominantes en losdigestores anaerobios, donde se hallaron Clostridium spp. (Siebert y Torien, 1969).

1.1.2. Fermentación o acidogenesis

La fermentación es definida como una etapa crucial en la digestión anaerobia, ya que el material orgánico soluble,

proveniente de la hidrólisis es convertido principalmente a acetato, ácidos grasos de cadena corta, alcoholes,hidrógeno y dióxido de carbono, es por eso que esta etapa es conocida también como acidogénesis. Una de lasprincipales características de esta etapa de la digestión, es la producción de hidrógeno, debido a que parte de loselectrones generados y que no son transferidos a bases de piridinas, son dispuestos vía reducción de protones,formando éste hidrógeno molecular. La disminución del pH en el sistema, es otra característica de la fermentación, yesta se debe a la acumulación de los ácidos orgánicos.

Aunque la especie dominante en la digestión anaerobia sean bacterias, se han reportado pequeñas poblaciones deprotozoos, hongos y levaduras (Toerien y Hattingh, 1969). Las bacterias anaerobias obligadas y facultativas son lasprincipales que llevan a cabo la fermentación de los sustratos hidrolizados.

Las bacterias fermentativas son bacterias anaerobias que utilizan en un inicio las rutas catabólicas de polisacáridos(celulosa, hemicelulosa, fructosa, pectina, sacarosa y almidón), aminoácidos y el glicerol para producir glucosa,posteriormente esta glucosa es transformada vía glucólisis o vía Entner-Doudoroff en piruvato, para seguir alguna

de las rutas de la fermentación alcohólica, láctica y acética. Como resultado de esta fermentación, son obtenidosalcoholes, ácidos grasos de cadena corta, adicionalmente, son generados como parte de esta transformaciónhidrógeno y dióxido de carbono (Tabla 2).


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Tabla 2. Productos Metabólicos liberados durante la fermentación anaerobia de diferentes polisacáridos por cepaspuras de bacterias anaerobias

Organismo Fuente Sustrato Productos*

Bacteroides succinogenes Rumen Celulosa F, A, S

Bacteroides fibrisolvens RumenCelulosaHemicelulosaPectina

F, L, H2, CO2 F, B, L, H2, CO2 F, A, B, L, M, H2, CO2

Bacteroides ruminicola RumenHemicelulosaPectina

F, A, P, SF, A, P, B, L, S

Ruminococcus flavefaciens Rumen Celulosa F, A, S, H2, CO2 Neocallimastix frontalis Rumen Celulosa F, A, L, E, CO2 Rumen spirochetes Rumen Pectina F, A, L, S, MRumen treponemes Rumen Pectina F, A, S, MLachnospira multiparus Rumen Pectina F, A, L, M, E, H2, CO2 Acetivibrio cellulolyticus Digestor Celulosa A, E, H2, CO2 Clostridium thermocellum Digestor Celulosa A, E, H2, CO2

Clostridium papyrosolvensSedimentos de

estuarioPectina F, A, L, E

Clostridium butyricum Sedimentos de lago Pectina A, B, M, E, H2, CO2 *F = formato, A = acetato, P = propionato, B = butirato, S = sucinato, L = lactato, M = metanol, E = etanol.

Chynoweth e Isaacson, 1987

Algunos otros microorganismos fermentativos predominantes en el rumen son Clostridium cellobioparum,Ruminococcus albus (Godbole y col., 1981), y en los digestores de estiércol de vaca, Eubacterium cellulosolvens,Clostridium cellulosolvens, Clostridium cellulovorans y Bacteroides cellulosolvens (Ramasamy, 1997).

A pesar de la gran variedad de productos derivados de la fermentación bacteriana, los ácidos grasos volátiles (AGV)son uno de los principales productos de la fermentación de carbohidratos, tanto en digestores como en el rumen. Elmetabolismo de los carbohidratos puede verse influenciado por la presión parcial de hidrógeno derivado de estamisma fermentación (McInerney y Bryant, 1981), inclusive afectar la posterior oxidación de los ácidos orgánicosproducidos en acetato. Sin embargo, la presión parcial de hidrógeno puede ser mantenida por medio de las arqueasmetanógenas hidrogenotróficas, las bacterias homoacetogénicas y las bacterias sulfato reductoras. Lin (2003)demostró que otro factor que influye sobre la acidogénesis son los metales pesados. Los efectos tóxicos relativossobre la producción de acetato y butirato fueron Cu > Zn > Cr > Cd > Pb > Ni y Cu > Zn > Cr > Cd > Ni > Pb,respectivamente. Siendo el cobre el metal más tóxico y el plomo el menos tóxico para los microorganismosproductores de ácidos grasos volátiles.

Los AGV son importantes intermediarios en para la producción de metano, y sus concentraciones afectan laeficiencia tanto de la fermentación, como de la metanogénesis. Wang y col., (2009), estudiaron los efectos dedistintos productos de la fermentación en la producción y rendimiento del metano. Cuando se usaron lasconcentraciones más altas de etanol, ácido acético y ácido butírico (2400, 2400 y 1800 mg/l, respectivamente) nohubo inhibición significativa sobre la actividad de los metanógenos, sin embargo, cuando la concentración de ácidopropiónico se incrementó a 900 mg/l, sí se observó una inhibición ya que la concentración microbiana disminuyó de6 × 107 a 0.6–1 × 107 ml−1. La máxima producción acumulada de metano se obtuvo a una concentración de etanol,ácido acético, ácido propiónico, y ácido butírico de 1600, 1600, 300 y 1800 mg/l, respectivamente, teniendo una

concentración máxima de metanógenos de 7.3 × 108 ml−1.

Los ácidos grasos se pueden presentar tanto en su forma ionizada, como en la no-ionizada, siendo las formas no-ionizadas del acetato, propionato y butirato las más tóxicas para las arqueas metanógenicas (Van Lier y col., 1993).

La acumulación de AGV conlleva a la disminución del pH en el sistema, dicha caída de pH afecta la metanogénesis.Van Kessel y Russell (1996) no detectaron la formación de metano en una vaca fistulada con un fluido ruminalcuando el pH era menor a 6.


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1.2. Segunda Etapa: Acetogénesis

Durante la segunda etapa de la digestión anaerobia, la acetogénesis, el ácido acético es producido por cualquierade los dos diferentes mecanismos acetogénicos, la acetogénesis por hidrogenación y la acetogénesis pordeshidrogenación (Tabla 3). La acetogénesis por hidrogenación es el mecanismo por el cual se produce acetato

como un único producto final de la reducción del dióxido de carbono más hidrógeno, debido a su analogía con lahomofermentación láctica, esta vía también es conocida como homoacetogénesis. En digestión anaerobia la etapade acetogénesis suele referirse a la acetogénesis por deshidrogenación, y específicamente, a la oxidaciónanaerobia de ácidos grasos de cadena larga y corta (volátiles), las bacterias encargadas de esta vía son lasconocidas como bacterias reductoras obligadas de protones o productoras obligadas de hidrógeno. Ellas soninhibidas inclusive por una pequeña presión parcial de hidrógeno, por lo cual sólo pueden sobrevivir en asociacionessintróficas con microorganismos que consumen hidrógeno, como los metanógenos acetoclásticos ehidrogenotróficos, las bacterias homoacetogénicas y bacterias sulfato reductoras.

Tabla 3. Cambios en la energía libre de Gibbs bajo condiciones estándar en reacciones de hidrogenación ydeshidrogenación y sus potenciales redox correspondientes

Reacción∆G°'

(kJ pormol)

No. depares de

electrones

E°' de las reaccionesredox de liberación de

electrones (mV)

REACCIONES DE HIDROGENACIÓNAlcoholes primariosCH3CH2OH + H2O CH3COO – + H+ + 2H2 +9.6 2 -190, -375

Ácidos grasosCH3 CH2CH2COO – + 2H2O 2CH3COO – 2H+ + 2H2 +48.3 2 -125, -250CH3CH2COO – + 2H2O CH3COO – + CO2 + 3H2 +76.0 3 +30, -176, -470CH3COO – + H+ + 2H2O 2CO2 + 4H2 +94.9 4 -200, -300, -430, -520CH3 CH(CH3)CH2COO – + CO2 + 2H2O3CH3COO – +2H+ +H2 +25.2 1

REACCIONES DE HIDROGENACIÓN 4H2 + 2CO2 CH3COO – + H+ + 2H2O -94.9H2 + S0 H2S -33.94H2 + SO4-2 + H+ HS + 4H2O -151.0

Schink, 1997

1.2.1. Acetogénesis por hidrogenación: Bacterias sintróficas productoras obligadas de hidrógeno.

La sintrofia es un caso especial de cooperación simbiótica entre dos tipos de microorganismos metabólicamentediferentes, los cuales dependen el uno del otro para le degradación de un cierto sustrato, la mayoría de las vecespor razones de conservación de energía. El término fue acuñado para describir la cercana relación simbiótica de lasbacterias fermentadoras oxidadoras de ácidos grasos con metanógenos oxidadores de hidrógeno (Schink, 1997).Sin embargo, también actualmente es empleado para describir la relación de bacterias fermentadoras oxidadoras dealcoholes, como la Thermoanaerobium brockii , la cual oxida etanol (Ben-Bassat et al., 1981) y también se puedenencontrar bacterias oxidadoras de compuestos aromáticos, aminoácidos; Boone y Bryant (1980) aislaronSyntrophobacter wolinii , la cual sólo beta-oxida propionato a acetato. A pesar de ello, un organismo puede tener unaamplia afinidad por distintos sustratos, tal como la Syntrophomonas wolfei , la cual beta-oxida ácidos grasos con untamaño de cadena de 4 a 7 carbonos.

1.2.2. Acetogénesis por deshidrogenación: Bacterias homoacetogénicas.

Las bacterias homoacetogénicas son microorganismos estrictamente anaerobios, los cuales catalizan la formaciónde acetato a partir de hidrógeno y dióxido de carbono, este tipo de acetogénesis fue reportada por primera vez porFischer y col., (1932) cuando trabajaba con cultivos enriquecidos de lodos de una planta de tratamiento de agua. Sinembargo, fue hasta 1936 cuando Wieringa, usando hidrógeno y dióxido de carbono como sustratos, purificó alacetógeno anaerobio Clostridium aceticum.


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En 1942, Fontaine y col. encontraron que cuando se enriquecía un cultivo de Clostridium thermoaceticum conglucosa a 60° C, éste microorganismo producía por cada unidad de glucosa, 3 unidades de acetato como productofinal, llamándosele a este nuevo tipo de fermentación “homoacetogénica” en analogía con la fermentación lácticahomofermentativa, y se sugería que el desdoblamiento de la glucosa formaba 3 unidades de C 2, las cuales eranconvertidas a acetato, o que por lo menos, la síntesis de una molécula de acetato provenía de dos unidades de C 1,

teoría comprobada por Wood en 1952, cuando empleó moléculas de CO2 marcadas con 13C y análisis de masa parael cultivo enriquecido, sus descubrimientos indicaron claramente que el carbono de ambos grupos (carboxil y metil)en una molécula de acetato, pueden ser derivados del CO2. La ruta de formación de acetato a partir de dióxido decarbono fue descrita en su mayoría con el uso de C. thermoaceticum por los grupos de trabajo de Wood (1991) yLjungdahl (1986), es por eso que esta ruta de fijación de CO2 a acetato, donde se utiliza hidrógeno como donador deelectrones, es llamada Wood-Ljungdahl. La ruta Wood-Ljungdahl también es llamada “ruta del acetil CoA” o la “rutadel monóxido de carbono deshidrogenasa”, y el total de la síntesis se encuentra esquematizado en la Figura 2,además el balance general de la reacción se describe de acuerdo a la reacción (2).

4 H2 + 2 CO2 acetato – + H+ + 2 H2O (2)(∆G°' = - 95 kJ/mol)

Algunas de las especies de bacterias homoacetogénicas que han sido mayormente estudiadas son:- Clostridium thermoaceticum

- Acetobacterium woodii- Clostridium formicoaceticum- Peptostreptococcus productos- Eubacterium limosum- Clostridium thermoautotrophicum- Acetogenium kivui

Fig. 2. Síntesis del acetato a partir del CO2 en las bacterias homoacetogénicas. FH4= tetrahidrofolato, CH3-Co-E=proteína corrinoide metilada/Fe-S proteína. (Dieker y Wohlfarth, 1994).

1.3. Tercera Etapa: Metanogénesis y sus dos vías principales, acetoclástica e hidrogenotrófica.

La metanogénesis es la etapa final de la digestión anaerobia. Esta consiste en la formación de metano a partir dedos rutas principales: la acetoclástica y la hidrogenotrófica. Los dos tipos de metanógenos, acetoclásticos ehidrogenotróficos son esenciales para el último paso de la conversión entre materia orgánica y metano, sinembargo, los roles de estas arqueas durante esta fase del proceso son limitados (Demirel y Scherer, 2008).


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Los metanógenos son un grupo especial de microorganismos, pertenecen al dominio Archaea, y entre suscoenzimas únicas pueden citarse la F420 y la F430. En reactores anaerobios el 70% del metano es obtenido por víaacetoclástica (Ferguson y Mah, 1983). Unos de los géneros y especies más conocidas son Methanosarcina barkeri y Methanosaeta thermophila.

Los metanógenos se encuentran en casi todos los ambientes anaerobios concebibles, desde el rumen hasta losintestinos humanos, pasando por el fondo del océano, pantanos, digestores, tiraderos y sedimentos marinos. Losmetanógenos crecen a temperaturas en rangos de 5 a 110° C y a salinidades correspondientes a las aguas dulceshasta la de la salmuera, descubrimientos que han redefinido los límites ambientales de la vida. Estosmicroorganismos son parte de del ciclo global del carbono; cada año aproximadamente 400 toneladas métricas demetano son generadas como productos finales en la degradación materia orgánica en los diversos hábitatsanaerobios. El metano es oxidado a dióxido de carbono (CO2) en zonas aerobias, pero una indeterminada cantidadescapa dentro de la atmósfera superior (Ferry, 1993).

El estudio de los microorganismos de la producción de metano posee un crecimiento sin precedentes en su relativacorta historia. Y este interés se origina del amplio impacto que los metanógenos poseen en el mundo biológico,incluyendo el medio ambiente, la temprana evolución, la bioquímica y la biología molecular.

Los primeros estudios en la producción de metano dieron las pistas para la creación de uno de los más grandestaxones de la vida, los metanógenos. Este grupo es el más y por lo tanto, mejor estudiado del grupo Archaea. Éstedominio es un grupo fenotípicamente diverso de microorganismos que comparten una historia evolutiva común. Loscuatro grupos fenotípicos clásicos incluyen además de a los metanógenos a los halófilos extremos, las arqueassulfato reductoras y a los termofílicos extremos (DeLong, 1992).

Así el estudio de los metanógenos ha permitido encontrar la información para aproximarse a los tempranos orígenesde la evolución de los Archaea. El estudio de los metanógenos también ha contribuido al entendimiento del mundobioquímico. Hay investigaciones que reportan diversos cofactores y metaloenzimas en las rutas de lametanogénesis. Así también, hay avances en el conocimiento de la bioenergía del proceso. Otros estudiosbioquímicos han reportado los aparatos de transcripción y traducción de los metanógenos, aún más detalladamenteque en los casos de Eucaria y Bacteria (Ferry, 1993).

Todas las formas morfológicas de las bacterias (cocos, filamentos, espirilos) se encuentran en los metanógenos.

Las propiedades únicas de los metanógenos, la formación de noveles estructuras, componentes y rutas metabólicasen ciertos organismos permitieron hace años la propuesta del dominio Archaea. Este grupo está claramenteseparado de los demás según las bases de de sus propiedades bioquímicas. Además de los metanógenos, otrosorganismos han sido colocados en el dominio. Como algunos halófilos, Thermoacidophiles con Sulfolobus y elgénero Thermoplasma (Dubach y Bachofen, 1985).

Los metanógenos son anaerobios estrictos que crecen principalmente en sustratos tales como hidrógeno y dióxidode carbono (hidrogenotróficos), y acetato (acetoclásticos). Sin embargo, otros sustratos compuestos metilados(metilotróficos), como las metilaminas son también sustratos para estos microorganismos (Figura 3). Algunas de laspropiedades de estos microorganismos son:

a) el requerimiento de ambientes con bajos potenciales de reducción,b) la presencia de coenzimas únicas, como la coenzima M, factores F420 y F430, 7-metilpterin, metanopterin,

metil-tetrahidrometanopterin, metanofuran,

c)

su16S rRNA es relativamente distante de los otros procariotes,d) hay diferencias en el brazo del tRNA,e) su pared celular contiene o D-amino ácidos o ácido murámico,f) sus lípidos consisten de gliceroles fitanil éter (cíclicos y acíclicos) y escualenos,g) ellos sólo tienen un genoma pequeño (aproximadamente un tercio del de E. coli ),h) no se han encontrado quinonas y los citocromos están presentes en muy pocos casos,

metanofosfagen(ciclo 2,3-difosfoglicerato) está presente como un posible material fosfórico de reserva.

Aún que la formación de metano sin hidrógeno es energéticamente favorable, sólo se genera del 27 al 30% deproducto por esta ruta y 70% por acetato. Se conocen actualmente tres clases de microorganismos acetoclásticos,


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pero ellos tienen de 2 a 4 veces una tasa de crecimiento menor respecto a los hidrogenotróficos. Estas clases deutilizadores de acetato son:

a) Methanosarcina barkeri (morfología: paquete cuadrado de cuatro células)b) Methanosaeta (morfología: baciliar, filamentosa)

c) Methanosarcina mazei (morfología: empaquetados o solos)

Durante la etapa de la metanogénesis, puede ocurrir un fenómeno de oxidación anaerobia del metano por algunasarqueas o bacterias sulfato reductoras (BSR). Alperin y Hoehler (2009) emplearon un modelo de difusión-reacciónen sedimentos marinos para entender la relación sintrófica de los agregados de arqueas y BSR, la termodinámicade la sintrofia, las tasas de reacción, los efectos del agregado en el tamaño y la morfología de las arqueas y lasBSR, encontrando que la relación sintrófica para la oxidación anaerobia del metano era termodinámica y físicamenteposible debido a una amplia variedad de compuestos intermediarios (incluyendo el hidrógeno, formato y acetato), yla relación directa entre arqueas y BSR proveía una modesta ventaja energética comparada con la no asociación.

Fig. 3. Rutas metabólicas de la metanogénesis: hidrogenotróficas (flechas de líneas dobles), acetoclásticos (flechassólidas) y metilotróficos (flechas de líneas quebradas grises). La ruta hidrogenotrófica puede operar de formato oH2/CO2, obteniéndose un potencial reducido de formato o de H2, respectivamente. La ruta acetoclástica obtieneelectrones de la oxidación de CO producido por la división del acetato. La ruta metalotrófica puede operar en dosvías: (1) los compuestos metilados C-1 son fuente del grupo metil así como de electrones (una molécula oxida aCO2 y provee de electrones por cada tres moléculas que se reducen a metano, flechas verdes punteadas). Y (2), loscompuestos metilados C-1 se reducen a metano usando electrones del H2. Los nombres de las proteínas estudiadasaquí se indican en la ruta. Para la síntesis de cofactores, mptH juega un rol en la biosíntesis del tetrahidrofolato de


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M. jannashii , y mptN está involucrado en la biosíntesis de metanoproteína. Ambos, el tetrahidrofolato y lametaproteína son intermediarios C-1 acarreadores en la metanogénesis. La biosíntesis de las coenzimas F420 estáen las enzimas cof (cofC, cofD, cofE, cofG, cofH ). Las enzimas ask (askA, askD, askE y askF ) participan en lospasos de elongación del 2-oxiácido de la biosíntesis de coenzima B9 y de la coenzima M en el paso final de lametanogénesis. Esta última coenzima es el cofactor orgánico más pequeño conocido, pero es un esencial metil

acarreador terminal en la metanogénesis y es producido por las enzimas com (comA, comB, comC, comD, comE )(Graham and White, 2002).

2. Inhibición en el proceso de degradación anaerobia

Una sustancia puede juzgarse inhibitoria cuando la tasa de crecimiento de alguno o algunos de los gruposmicrobianos involucrados es disminuido o se detiene totalmente, produciéndose un cambio adverso en la poblaciónen general (Chen y col., 2008). La inhibición en los tratamientos de degradación anaerobia es usualmente indicadapor un decremento en la tasa de producción de metano y la acumulación de ácidos orgánicos (Kroeker y col., 1979).

Los microorganismos involucrados en los sistemas de degradación anaerobia trabajan dentro de estrechos nivelesde presión de hidrógeno, temperatura, concentración de sustrato, contenido de sulfato, entre otros. Debe tomarse encuenta que las bacterias formadoras de ácido y los microorganismos productores de metano difieren ampliamenteen términos de fisiología, necesidades nutrimentales, cinética de crecimiento y por lo tanto la sensibilidad que cadauno ofrece a las condiciones ambientales es muy variable. De acuerdo a Demirel y Yenügin (2002) las fallasrelacionadas al balance entre estos dos grupos de organismos son las principales causas de la inestabilidad de losdigestores anaerobios. En este sentido es de suma importancia tomar en consideración las causas de inhibiciónmás comunes, los procesos que desencadenan y las alteraciones que producen.

Entre los compuestos inorgánicos que causan inhibición en la producción de metano se citan con frecuenciaamoniaco, sulfatos y H2S, y algunos metales ligeros (Na, K, Mg, Ca y Al) y pesados (Cr, Fe, Co, Zn, Cd y Zn) (Gradyy col., 1999; Zayed y Winter, 2000; Livera y col., 2011). En cuanto a compuestos orgánicos, se encuentranreportados compuestos bencénicos, fenoles y derivados, otros alcoholes, ácidos de cadena larga y lignina, entreotros (Hwu y Lettinga, 1997; Gavala y Ahring, 2002; Chen y col., 2008; Bekmezci y col., 2011).

Sin embargo, la literatura muestra una amplia variación en los niveles tóxicos para la mayoría de estas sustancias.La razón principal de esto es la complejidad del proceso de digestión anaerobia, donde mecanismos comoantagonismo, sinergismo, aclimatación, etc., pueden presentar efectos sobre la inhibición.

2.1. Inhibición por amoniaco y sulfuro

De entre los compuestos inorgánicos más ampliamente reportados se encuentran el amoniaco y sulfuro. Losdesechos que típicamente contienen altas cargas de proteínas y/o urea y de sulfatos (comúnmente estiércoles),específicamente estimulan la actividad de bacterias proteolíticas y BSR durante la digestión anaerobia de talesdesechos (Aspé y col., 2001). Las actividades de estas bacterias decrecen la eficiencia del proceso debido a laliberación de NH3 y H2S, respectivamente, y ambos compuestos son ampliamente conocidos como inhibitorios de laactividad metanogénica (Sossa y col., 2004).

Investigaciones previas confirman que NH3 posee un poder inhibitorio mayor al del NH4+ sobre la actividad de losmetanógenos (Koster y Koomen, 1988). La toxicidad por amoniaco es controlada por el pH y la temperatura(Speece, 1996). Se ha reportado que concentraciones entre 80 y 100 mg/l de amoniaco inhiben totalmente cultivosmetanogénicos no adaptados creciendo a pH 7.5 y condiciones mesofílicas (Koster y col., 1986; Aspé y col., 2001).Sin embargo, sistemas de alta carga de residuos, inmovilizados, adaptados o granulares pueden lidiar con

concentraciones de amoniaco mayores. Sung y Liu (2003) reportaron la inhibición por amoniaco sobre consorciosmetanogénicos termofílicos acetoclásticos sometidos a diferentes estrategias de adaptación y pH; ellos reportaronvalores pare el 100% de inhibición cuando la cantidad de amoniaco fue de 8000 mg/l a pH cercano a la neutralidad.Zhou y Qiu (2006) reportaron que la actividad metanogénica específica de un inóculo granular se inhibe al 50%cuando la cantidad de amoniaco oscila entre 2350 mg/l. Por su parte, la producción de metano en las comunidadesde filtros anaerobios se han reportado exitosa cuando las concentraciones de amoniaco son de 6000 mg/l (Parkin ycol., 1986) e incluso de 7800 mg/l (De Baere, 1984), y en reactores UASB se reportó actividad favorable de losmetanógenos a valores de amoniaco oscilantes entre 5000 y 7500 mg/l. En estudios de la inhibición del amoniacosobre consorcios metanogénicos inmovilizados se observó una disminución del 50% de la actividad metanogénica


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cuando la concentración de amoniaco era de 365.39 mg/l (Sossa y col., 2004). Éstos resultados soncomparativamente mayores a estudios realizados también sobre consorcios metanogénicos, pero donde no seutilizó inmovilización, los cuales reportan valores de inhibición del 50% de la actividad metanogénica a 100 mg/l deamoniaco (Aspé y col., 2001).

En la búsqueda por entender los efectos del amoniaco sobre la población microbiana en reactores anaerobios y queafectan su rendimiento, los reportes sobre los mecanismos fisiológicos postulan que el amoniaco afecta lametanogénesis en dos maneras;

1) el amoniaco inhibe directamente la síntesis de enzimas necesarias para la producción de metano(Kayhanian, 1999), y

2) la molécula hidrofóbica del amoniaco se difunde pasivamente dentro de la célula, causando undesequilibrio protónico y/o una deficiencia de potasio (Sprott y Patel, 1986).

De entre los diferentes grupos de metanógenos involucrados en el proceso de degradación anaerobia reportesprevios muestran contradicción al determinar cuáles, los metanógenos acetoclásticos o los hidrogenotróficos son losmás sensibles al efecto del amoniaco. Zhou y Qiu (2006) reportaron cepas de metanógenos consumidores deacetato sensibles al amoniaco a concentraciones más bajas en comparación con cepas hidrogenotróficas, la mismaobservación fue hecha previamente por Koster y Lettinga (1984) y Angelidaki y Ahring (1993). Por el contrario,

Zeeman y col., (1985) y Wiegant y Zeeman (1986) demostraron que son los metanógenos hidrogenotróficos los mássensibles.

Otro de los compuestos inorgánicos mayormente reportado como inhibitorio es el H 2S, producto de la reducción desulfato, que puede estar presente naturalmente en el sustrato (estiércoles, desechos industriales, entre otros). Enambientes anaerobios las bacterias sulfato-reductoras (BSR) compiten por los electrones disponibles con otrosanaerobios, incluyendo las bacterias fermentativas, las bacterias acetogénicas productoras de hidrógeno obligadas ylas arques metanogénicas. El rol de los metanógenos, de las bacterias degradadoras de celulosa y las BSR escrítico en la red de la degradación anaerobia, y los pasos catalizados por estos microorganismos son a menudolimitantes del proceso de conversión en general (Raskin, y col., 1996). Para los organismos degradadores decelulosa y para los metanógenos utilizadores de acetato el H2S puede controlar su inhibición. Como no todos losmetanógenos exhiben la misma respuesta a la toxicidad al H 2S (Kroiss y Webnegg, 1983) la literatura muestraniveles de toxicidad muy variados en forma de sulfuro. Además, la toxicidad del sulfuro no siempre puededescribirse en los términos de este compuesto, ya que en inóculos granulares en presencia de sulfatos la toxicidad

es dependiente del pH. En un pH alcalino el efecto del H2S es mayor que a valores de pH ácidos y cercanos a laneutralidad. Pero en caso de tratamientos con inóculos dispersos, el efecto inhibitorio del H 2S puede determinarseen relación a la cantidad de éste (Speece, 1996).

Maillacheruvu y col., (1993) establecieron una inhibición en el 50% de la actividad específica de los metanógenos enfiltros anaerobios con acetato y propionato en presencia de 200 mg/l de sulfuro y entre 60 y 75 mg/l en reactores deagitación continua. Por su parte, Isa y col., (1986), observaron el mismo porcentaje de inhibición en metanógenosacetoclásticos con 1200 mg/l en reactores con una elevada carga orgánica y de sulfato luego de un prolongadoperiodo de adaptación. Sobre metanógenos acetoclásticos también, Koster y col., (1986) observaron una inhibiciónal 50% con 250 mg/l de H2S. Por su parte, Zaid y col., (1992) encontraron que los metanógenos acetoclásticos ehidrogenotróficos se inhibían a partir de 1000 mg/l del sulfuro en biofilmes

2.2. Inhibición por cationes y metales pesados

La biometanización de desechos industriales conlleva el desarrollo y adaptación del proceso de forma que seaposible lidiar con la variada composición de estos materiales y las impurezas que presentan. Para estos desechos,se han reportado numerosos productos químicos causantes de inhibición, dependiendo del tipo de desecho. Porejemplo, para los desechos de la industria alimenticia, a pesar de que la materia orgánica disponible suele serelevada, el tratamiento suele ser obstaculizado por la presencia de cationes y aniones como el Na+ (Feijoo y col.,1995), dependiendo de la naturaleza de los desechos. En el caso de los residuos de pescados y mariscos, elcontenido de sodio puede alcanzar el mismo que el agua de mar (12 g/l) (Rinzema y col., 1988).

Reportes previos señalan diferentes valores de inhibición para algunos cationes, mayormente se reportan Ca2+, K+ yNa+. Los valores inhibitorios reportados son 4600 mg/l, 4800 mg/l y 7400 mg/l, respectivamente (Kulgeman y Chin,


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1970). Sin embargo, luego de 60 días de aclimatación, se reportan valores de inhibición de hasta 20,000 mg/l desodio sobre consorcios metanogénicos alimentados primariamente con acetato. En el caso del potasio, el mayorefecto sucede sobre reducción de la máxima especificidad de utilización de sustrato (kmax) (Speece, 1996).Se hareportado que el K+ es un compuesto inhibitorio para la degradación anaerobia de aguas residuales de la industriadel café, pero que la adición del Ca 2+ puede actuar con un efecto antagónico a este catión (Daoming y Forster,

1993). Incluso se reporta que para el caso de estos elementos (además de magnesio y aluminio) en cantidadesmínimas favorece el proceso de degradación anaerobia (Soto y col., 1993). Por ejemplo, el sodio es esencial a bajasconcentraciones, McCarty (1964) reportó una concentración favorable de sodio para el desarrollo de la degradaciónanaerobia entre 100 y 200 mg/l, mientras que estudios más recientes establecieron que el contenido de sodionecesario para una inhibición en el 50% de la actividad metanogénica es entre 5600 y 8000 mg/l (Vallero y col.,2003). El sodio se reporta más tóxico para los microorganismos metanógenos hidrogenotróficos que para losutilizadores de acetato (Liu y Boone, 1991; Soto y col., 1993).

Por su parte, Jackson-Moss y Duncan (1991) reportaron que el aluminio deja de ser tolerado por los anaerobiosluego de 2500 mg/l sin aclimatación. Y Yu y col., (2001) reporta valores inhibitorios para el caso del calcio de 8000mg/l y superiores. Mientras que para el potasio el 50% de inhibición de la actividad de los metanógenosacetoclásticos se estableció en 28,934 mg/l (McCarty, 1964)

Casos especiales son los desechos de la industria del papel y de la industria textil, las cuales generan aguas

residuales de compleja composición. En estos casos las sustancias inhibitorias más comunes son los sulfatos,tanino, compuestos halogenados, policrilatos o fosfonatos y metales pesados (Ali y Sreekrishnan, 2001; Lee yPavlostathis, 2004). Dentro de los metales pesados que se reportan como los de mayor preocupación al hierro,cobre, zinc, cadmio y niquel (Jin y col., 1998). La toxicidad de los metales pesados es atribuida mayormente a lainterrupción de la función enzimática y a la alteración de la estructura mediante la unión de los metales en losgrupos prostéticos (Ulmanu y col., 2003). Las concentraciones de metales pesados que causan el 50% en ladisminución de la producción de metano durante la degradación anaerobia de suero indicó que los niveles detoxicidad decrecen en este orden, Cu> Zn> Ni (Lin, 1993, Nies, 1999). Mientras que en la degradación anaerobia delodos de depuradora se reportó un decremento en los niveles de toxicidad en este orden, Cr >Ni >Cu >Zn (Wong yCheung, 1995).

2.3. Inhibición por compuestos orgánicos

Una gran variedad de compuestos orgánicos se ha reportado que pueden inhibir los procesos anaerobios. Entre los

compuestos orgánicos que se han reportado tóxicos a este proceso se incluyen alquilbencenos, nitrobencenos,bencenos halogenados, alcoholes y fenoles, alcanos, éteres, aminas, amidas, y también los ácidos grasos decadena larga han reportado efectos adversos en la degradación anaerobia.

Ungerfeld y col., (2004) reportan el efecto de dos alquilbencenos en la actividad metanogénica durante eltratamiento de aguas residuales en rangos termofílicos. En este trabajo se determinó la disminución total de laproducción de metano en una cepa de Methanobrevibacter ruminantium cuando la concentración del 3-bromopropanosulfato ascendió hasta 3.47 mg/l. Entre los hidrocarburos clorados, se reporta un 96% de inhibición enmetanógenos acetoclásticos y 94% en la actividad de hidrogenotróficos a 100 mg/l de cloruro de metileno; con 100mg/l de cloruro de etileno se observó 30% y 88% de inhibición en metanógenos acetoclásticos y utilizadores dehidrógeno mientras que con 100 mg/l se observaron valores de inhibición del 100% y del 72% para los metanógenosutilizadores de acetato y los hidrogenotróficos, respectivamente (Colleran y col., 1992). Generalmente se consideraque los metanógenos acetoclásticos son la clase más sensible. Similares observaciones reportó Freedman (1991)en los ensayos de toxicidad de ácido bromoetano-sulfónico sobre consorcios metanogénicos. Esto es aplicable

también para el ácido benzóico, pues se reporta un 50% de inhibición en acetoclásticos a 4000 mg/l, mientras que elumbral de inhibición para los hidrogenotróficos fue mucho mayor (Golden y col., 1994).

En cuanto al fenol, se reporta el 50% de inhibición de los metanógenos acetoclásticos cuando la concentración esde 1500 mg/l, mientras que para los metanógenos reductores de H 2/CO2, este valor de inhibición se presenta a los2000 mg/l. Para el catecol el 50% de inhibición se obtiene a 1500 mg/l para ambos metanógenos, acetato ehidrógeno utilizadores (Golden y col., 1994).


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En el caso de los ácidos grasos, los de cadena larga se reportan inhibitorios sobre la degradación anaerobia (Hwu yLettinga, 1997). Lalman y Bagley (2001) reportaron efectos inhibitorios del ácido oléico a concentraciones de 30 mg/ly de esteárico a 100 mg/l en la actividad de metanógenos acetoclásticos.

Aunque las comunidades microbiológicas anaerobias se han estudiado ampliamente, el entendimiento que los

investigadores poseen es aún limitado. La cuantificación e identificación de todas las poblaciones contribuyentes entales sistemas, así como una descripción profunda de la relación entre ellas, su estructura, función y condicionesambientales aún no han sido alcanzadas. De acuerdo a Ward y col., (2008), todas las causas de la inhibición puedenser evitadas en primera instancia cuando se consideran los parámetros operacionales y de diseño y su relación y/oefecto con la microbiología del proceso, ya que los factores ambientales internos del reactor se ven fuertementeinfluenciados por las características del mismo. Un control sobre estas variables puede asegurar un procesofavorable.

3. Revisión de la expresión genética en comunidades anaerobias

3.1. Usos de la expresión genética

La expresión genética se relaciona con la funcionalidad de organismos o comunidades biológicas. Así pues, laexpresión genética puede elucidar fenómenos complejos en ecosistemas. Cohlen-Kupiec y col. (1997) fusionaron el

promotor para la enzima fijadora de nitrógeno de M. maripaludis (PnifK ) con el gen lac Z para elucidar la regulaciónde la expresión. En el promotor de nifK existen dos grupos de secuencias palindrómicas que sirven como sitios deunión para represores. Ellos reportaron que una mutación direccionada solo en la primera secuencia palindrómicade PnifK resulto en una clara de-represión en cultivos crecidos en NH4Cl. En otro experimento, fusiones de genesprobaron que la prolil t-RNA sintetasa (ProRS) de Methanococcus jannaschii podía sintetizar ambos, prolina t-RNA ycisteína t-RNA (Stathopoulos y col., 2000). Este resultado fue inesperado, y ayudo a resolver la discrepancia sobrela carencia de homólogos de cysS, genes para enzimas sintetizadoras de cisteina t-RNA en M. jannaschii yMethanobacterium thermautotrophicus.

Por otra parte, análisis de expresión de genes usando Northern blot reveló que el gen 2 pgk de 96 pb es transcrito junto con otros dos marcos de lectura (ORFs) en un solo RNA mensajero de 1600 nucleotidos (Lehmacher y Hensel,1994). El gen 2 pgk codifica la proteína 2-fosfoglicerato quinasa, la cual cataliza el primer paso en la síntesis de 2,3-difosfoglicerato cíclico (cDPG). Se asume que cDPG juega un papel importante en la termo-adaptación demetanógenos hipertermofilos (Hensel y König, 1988), esto se asume debido a las altas concentraciones de estos

compuestos en células de Methanothermus fervidus y Methanopyrus kandleri en sus temperaturas óptimas decrecimiento.

En otra perspectiva, debido a la cercana relación entre expresión genética y funcionalidad del sistema, se han hechointentos para usar expresión diferencial de genes como una herramienta para indicar desbalances en procesos orealizar diagnósticos de procesos. En medicina, Rybaczyk y col. (2008) reportaron que la expresión de monoaminooxidasa-A (MAO-A) es un buen indicador para distinguir entre células cancerígenas y células normales en humanos,roedores y peces usando información extraída de gene expression ómnibus. Ellos encontraron que la expresión deMAO-A disminuye un 95.4% en pacientes humanos y 94.2% en casos de cáncer animal cuando se comparan concontroles no cancerosos de casi todo tipo de cánceres. Sin embargo, en cuanto a digestión anaerobia, Freitag yProsser (2009) mostraron dificultades en relacionar la actividad funcional con la actividad transcriptiva en humus.Ellos concluyeron que la transcripción genética de un solo gen, en su caso Methyl Coenzima M reductasa (mcrA),solo permitió una profundización limitada en la dinámica del proceso. Encontraron una correlación más significativaal relacionar la tasa del proceso con la proporción transcrito/gen en vez de solo la abundancia del transcrito.

De este experimento es posible inferir que más investigación se necesita para relacionar directamente eldesempeño de un proceso con la transcripción de genes. Sin embargo, la expresión diferencial de genes seria másapta para evaluar las necesidades de una comunidad anaerobia, evaluar el estrás que los organismos estánsufriendo y así poder tomar medidas en disminuir el estrés biológico para llegar a mayores rendimientos de metano.Como ejemplo, Spanheimer y col. (2007) observaron un incremento en copias de qRT-PCR de los genes otaA, otaBy otaC debido a estrés osmótico en Methanosarcina mazei Gö1 crecida con 400mM de NaCl comparado con elcontrol de 38.5 mM. El cluster ota codifica las tres subunidades de la enzima transportadora de glicina betaineimpulsada por ATP, Ota. La glicina betaine es un soluto acumulado en metanógenos para combatir estrés osmótico(Rossler y Müller, 2001). Toma de solutos será preferida por metanógenos a síntesis de solutos de novo, como el


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glutamoto y Nε -acetil-β-lisina. El análisis de concentraciones internas en extractos de células mostró que elglutamato y Nε -acetil-β-lisina eran los únicos solutos acumulados en células crecidas en 400 y 800mM de NaCl. Sinembargo, cuando los cultivos eran suplementados con 1mM de Glicina betaine, concentraciones de glutamato y Nε -acetil-β disminuían en las células acopladas a un incremento en glicina betaine, este fenómeno iba a la par de unapequeña disminución en la expresión del cluster ota. Así pues, este tipo de análisis sobre expresión genética puede

ser utilizado para evaluar problemas en reactores anaerobios tratando de aguas residuales de alta salinidad comoaquellas provenientes de industrias procesadoras de comida marina (Soto y col., 1993; Chen y col., 2003). Siperfiles de expresión genética en estos reactores muestran una sobre expresión de proteínassintetizadoras/transportadoras de proteínas entonces inhibición puede ser disminuida adicionando pequeñascantidades de solutos.

Además, Hendrickson y col. (2007) y Xia y col. (2009) estudiaron la expresión gentica de Methanococcusmaripalidus bajo diferentes limitaciones de nutrientes. Bajo limitación de hidrógeno Hendrickson y col. (2007),reportaron un incremento de 4 a 22 veces en enzimas de la metanogénesis; principalmente aquellas involucradas enla reducción y oxidación de F420, F420- reductora hidrogenasa (fru), metilenetetrahidrometanopterina deshidrogenasa(mtd) y metilenetetrahidrometanopterina reductasa (mer). En contraste, Xia y col. (2009) reportaron solo unincremento de 1.9 veces en la expresión de mtd usando qRT-PCR, pero decremento e incremento en abundanciade otras 59 y 82 proteinas, respectivamente. Un hecho importante fue la marcada disminución en la deshidrogenasade metilenetetrahidrometanopterina dependiente de H2, Hmd. En los metanógenos hidrogenotróficos

metilenetetrahidrometanopterina puede ser reducida usando metilenetetrahidrometanopterina deshidrogenasadependiente de F20 (Mtd) o Hmd. La primera ruta requiere la presencia de la hidrogenasa reductora de F 420 (Fru oFrc) mientras que la última ruta reduce metilenetetrahidrometanopterina directamente utilizando H2. A pesar de queambas rutas están presentes simultáneamente, Hmd es preferida cuando hay abundancia de H 2 en el medio, perodebido a su baja afinidad por el sustrato los metanógenos deben cambiar a la ruta de Fru y Mtd cuando hidrogenomolecular es escaso. De acuerdo con esto, Kato y col. (2008) usando microarreglos en cultimos de M.thermoautotrophicus bajo limitación de H2, encontraron un aumento en la expresión de frh, mtd, mer y fwd genesque involucran la oxidación y reducción de F420. Bonacker y col. (1992) también observaron un preferencia en laexpresión enzimas entre Metil coenzima M reductasa (McrI también conocida como MCRA) y su isoenzima McrIIbajo limitación de hidrogeno. MCRII no se expresó con tasas de gas pequeñas (150ml 80%H2/20%CO2) a 70ºC,mientras que MCRI no se expresó bajo altas tasas de gas (650ml 80%H2/20%CO2) a 55ºC.

Algunos metanógenos son capaces de utilizar alcoholes secundarios como donadores de electrones usando la sec-Alcohol deshidrogenasa (sec-ADH). Widdel y Wolfe (1989) mostraron que sec-ADH se expresa bajo limitaciones de

H2 en M. thermophilum mientras que en otras tres especies, esto es M. organophilum, M. hungatei y M. bryantii ,requerían de la presencia de acetona para expresar sec-ADH. Es de interés medir el efecto sobre el perfil genéticoen digestores anaerobios con limitación de H2 y suplementar con agua residual de Molino de aceite de palma, quees rica en alcoholes secundarios.

3.2. Interacciones de genes en comunidades anaeróbicas

Ecosistemas anaerobios como el rumen pueden ser comprendidos aproximadamente de 1000 unidades taxonimicasoperacionales (Hess y col., 2011). Esto vuelve a los ambientes anaerobios altamente dinámicos con fluctuacionesen niveles de nutrientes, pH y contenido de agua, lo cual provoca un dinamismo en la dominancia entre grupostróficos. Así pues la regulación de redes metabólicas es altamente compleja. La expresión genética puede usarsepara relacionar actividades esenciales con factores ambientales y últimamente con desempeño de proceso. Existendiferentes métodos para estudiar la diversidad funcional como Microarreglos, qRT-PCR, FISH y MAR-FISH. Lange ycol. (2000) desarrollaron un protocolo para transcripción inversa PCR in situ para monitorear la expresión de

Methanosarcina mazei S-6. Concluyeron que técnicas de PCR in situ acopladas con identificación de organismoscon FISH es una manera de determinar los organismos que expresan genes específicos bajo ciertas condiciones.

3.2.1. Expresión dependiente de sustratos

Como se mencionó en la sección 2, el primer paso en la digestión anerobia es la hidrolisis. Doerner y col. (1992)mostraron que al alimentar con celulosa, transcripción diferencial de cel B y celD era regulada, pero no latranscripción de celA y celC (estos últimos dos genes parecen ser constitutivos) en Ruminococcus flavefaciens FD-1. Vercoe y col. (2003) estudiaron después el mecanismo de fosforilacion-defosforilacion de R. flavefaciens FD-1.


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Encontraron que en células cultivadas con celulosa fosforilaban la treonina en proteinas, mientras que célulascultivadass con celubiosa fosforilaban serina. Esta diferencia en aminoácidos fosforilados puodría regular lainducción y coordinación de expresión de genes celulolíticos en R. flavifaciens FD-1.

Después de la hidrólisis de polímeros compuestos muchos productos de fermentación son generados. El propionato

es un importante intermediario en la digestión anaerobia. Ariesyadi y col. (2007) estudiaron la diversidad funcionalde lodos granulares bajo diferentes concentraciones de 14C-propionato viz. 0.5, 2.5, 5 y 15 mM. Análisis con MAR-FISH revelaron que 52-62% de células oxidadoras de propionato eran Smithella sp. SR en todas lasconcentraciones de propionato. Smithella sp. LR componen 42% de las células MAR-positivas en la concentraciónde 0.5mM, pero este porcentaje disminuyo drásticamente en las demás concentraciones. Mientras que células deSyntrophobacter componían solo el 6% de las células MAR-positivas en la concentración 0.5mM de propionato eincrementaron entre 16-31% en el resto de los tratamientos. En este mismo estudio, Methanosaeta fue la únicaarquea que mostró positividad MAR y componían solo del 7-10% de las células MAR-positivas.

Oxidación de propionato por bacterias sintróficas lleva a la producción de H2 y formiato estos compuestos enconcentraciones elevadas pueden inhibir la oxidación de propionato, lo que llevaría a desbalance del proceso. Asípues, bacterias sintróficas necesitan la presencia de organismos hidrogenotróficos cuando se cultivan conpropionato. Sin embargo, aún en la presencia de organismos hidrogenotraficos las concentraciones de formiatopueden elevarse, asi que las bacterias sintróficas expresan deshidrogenasas de formato (FDH), para oxidar

formiato. De Bok y col. (2003) purificaron dos enzimas FDH de Sytrophobacter fumaroxidans que también puedenreducir CO2 en mono y co-cultivos creciendo con fumarato y propionato, respectivamente. Los mismos autorestambién reportaron mayores niveles de ambas enzimas cuando las bacterias sintróficas eran crecidas en lapresencia de M. hungateii .

Esto puede ser debido a que el formiato es un portador de electrones más obvio que el H2 difusivo por su solubilidaden el agua. Así pues ambas enzimas son necesarias para que los organismos crezcan con propionato (de Bok ycol., 2002), una de las FDHs reduce equivalentes de formiato y la otra para fijar CO2 por la vía reversa derompimiento de acetil-coenzima. En efecto, Kato y col. (2009) que probaron con microarreglos registraron una mayorexpresión de FdhII en cultivos de Pelotomaculum thermopropionicum con M. thermautotrophicus creciendo enalcohol y propionato al contrario de monocultivo P. thermopropionicum crecido en fumarato. Adicionalmente,observaron una sobre-regulación en la liasa piruvato:formiato (Pfl) que cataliza la liberación de formiato por laconversión de piruvato a Acetil-CoA en co-cultivos sintróficos. Además, usando cluster jerárquico se mostro unasobre-regulación de 2.4% de los genes y una baja-regulación 1.7% de los clusters de genes en los co-cultivos de

todos los que estaban degradando diferentes sustratos, mientras que los porcentajes de expresión genética variaronentre 10.2% y 33.4% en todos los tratamientos. Así pues, solamente la asociación sintrófica falla en explicar la grandiferencia en perfiles de expresión, sugiriendo que estos cambios en regulación son altamente dependientes delsustrato en vez de influencia sintrófica.

Una ruta principal en la degradación de propionato es la Metil-Malonil-CoA (MMC). Kato y col. (2009) mostraron laexpresión de enzimas pertenecientes a esta ruta (el cluster mmc) en cultivos alimentados con propionato einesperadamente en aquellos alimentados con lactato. Usualmente los organismos sintróficos exhiben fases lagprolongadas, sin embargo se encontró que el lactato estimulaba la expresión de la ruta para la oxidación depropionato, disminuyendo la fase lag exhibida en tratamientos de propionato. Muchas veces fallas en el digestor sondebidas a la acumulación de ácidos grasos, ya que estos inhiben a los metanógenos; el propionato inhibe a losmetanógenos en un mayor nivel. Suplementar lactato podría probarse para remediar problemas como laacumulación de propionato.

La metanogénesis es considerada el último paso en la digestión anaerobia, llevada a cabo por diferentes grupos dearqueas, denominadas metanógenos. Los metanógenos son susceptibles a cambios externos en el medio. Se hanhecho estudios para relacionar la expresión de gen mcr A con la producción de metano (Freitag y Prosser, 2009).Guo y col. (2008), observaron una disminución del 8% en la producción de metano en la fermentación de rumen aladicionar saponinos de té, mientras que la expresión del gen mcr A disminuyo 76%. Ellos atribuyen esta reduccióndrástica de mcr A a una disminución en la población de protozoarios del 79%, ya que se sabe que los metanógenosrealizan endosimbiosis con protozoarios ciliados. A partir de esto podemos concluir que es difícil encontrar unacorrelación directa entre la expresión de un solo gen con la producción de metano, el cual involucrada múltiplesprocesos en una comunidad microbiana compleja. En el estudio de Guo y col. (2008) también se observó que unareducción en protozoarios llevó a un incremento molar en propionato de 2.6%. Acumulación de propionato en un


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reactor puede llevar a la inhibición de metanógenos, la cual en cambio, disminuye el consumo de hidrogeno, y estollevaría a una inhibición en la oxidación de propionato lo que disminuiría la cantidad de hidrogeno siendo generada,esto causaría también un estrés de limitación de hidrogeno en los metanógenos. Kota y col. (2008) reportaron unasobre-regulación de transcritos de enzimas reductoras y oxidadoras de F420 durante limitación de hidrogeno, bajo pHy condiciones estáticas. Por el contrario, en los metanógenos acetoclásticos, M. mazei Go1, Hovey y col. (2005)

mostraron una disminución en la expresión de estas enzimas reductoras y oxidadoras de F 420. Sin embargo, ellostambién observaron un aumento en la expresión de ferrodoxinas y flavoproteinas no caracterizadas las cuales sepresumen están involucradas como portadoras de electrones en la ruta acetoclastica. Hovey y col. (2005) tambiénmostraron una expresión elevada de enzimas metiltransferasas viz . mtaA1. mtaB1 y mtaC1 cuando las célulasfueron cultivadas con metanol. Estas enzimas están involucradas en la metanogénesis a partir de compuestosmetilados. Shih y Lai (2010) estudiaron la respuesta de estrés hipo e hiperosmotico en Methanohalophilus

portucalensis cultivados con trimetilamina. Ellos observaron un aumento en los transcritos relacionados a laproducción metanogénica a partir de productos metilados. Asi pues, M. portucalensis requiere energía para superarestrés osmótico. Muchos metanogenos también podrían tener similares respuestas.

CONCLUSIÓN

La digestión anaerobia es una biotecnología que ofrece una alternativa prometedora a los problemas energéticos yambientales actuales. Sin embargo, más investigación es requerida para comprender más detalladamente los

mecanismos de interacción entre los grupos microbianos, la producción de metabolitos y los factores ambientales ysu relación como los agentes inhibitorios en orden de incrementar los rendimientos de metano, de forma que lasnecesidades energéticas mundiales puedan ser cubiertas satisfactoriamente. El estudio de la expresión genéticasurge como una respuesta a dicha necesidad, pudiendo alcanzar un mejor entendimiento de las interaccionestróficas de los microorganismos, sus respuestas a varios tipos de estrés y elucidar fenómenos complejos de lascomunidades. Adicionalmente, la expresión genética puede agregar pistas de las necesidades que tienen lascomunidades de un digestor anaerobio y así tomar las mejores decisiones para lidiar con las respuestas al estrés,mejorando así los rendimientos de metano.

REFERENCIAS

Ali M y Sreekrishnan TR. 2001. Aquatic toxicity from pulp and paper mill effluents: a review. Advances inEnvironmental Research. 5: 175-196.

Angelidaki I y Ahring BK. 1993. Thermophilic digestion of livestock waste: the effect of ammonia, AppliedMicrobiology and Biotechnology. 38: 560-564.

Ariesyady HD, Ito T, Yoshiguchi K y Okabe S. 2007. Phylogenetic and functional diversity of propionate-oxidizingbacteria in an anaerobic digester sludge. Applied Microbiology and Biotechnology. 75: 673-683.

Aspé E, Martí MC, Jara A y Roeckel M. Ammonia inhibition in the anaerobic treatment of fishery effluents. 2001.Water Environmental Research. 73: 154–64.

Bekmezci OK, Ucar D, Haksonen AH y Sahinkaya E. 2011. Sulfidogenic biotreatment of synthetic acid minedrainage and sulphide oxidation in anaerobic baffled reactor. Journal of Hazardous Materials. In Press. doi:10.1016/j.jhazmat.2011.01.087.

Ben-Bassat A, Lamed R y Zeikus JG. 1981. Ethanol production by thermophilic bacteria: metabolic control of end

product formation in Thermoanaerobium brockii . Journal of Bacteriology. 146:192–199.

Bonacker LG, Baudner S y Thauer RK. 1992. Differential expression of the two methyl-coenzyme M reductases inMethanobacterium thermoautotrophicum as determined immunochemically via isoenzyme-specific antisera.European Journal of Biochemistry. 206: 87-92,

Boone DR y Bryant MP. 1980. Propionate-degrading bacterium, Syntrophobacter wolinii sp. nov. gen. nov., frommethanogenic ecosystems. Applied and Environmental Microbiology. 40: 626–632.


17/21



30

Chen Y, Cheng JJ y Creamer KS. 2008. Inhibition of anaerobic digestion process: a review. Bioresource Technology.99: 4044-4064.

Cohen-Kupiec R, Blank C y Leigh JA. 1997. Transcriptional regulation in Archaea: in vivo demonstration of arepressor binding site in a methanogen. Proceedings of The National Academy Of Sciences. 94: 1316-1320.

Colleran E, Concannon F, Golden T, Geoghegan F, Crumlish B, Killilea E, Henry M y Coates J. 1992. Use ofmethanogenic activity tests to characterise anaerobic sludges, screen for anaerobic biodegradability and determinetoxicity thresholds against individual trophic groups and species. Water Science and Technology. 25: 31-40.

Daoming S y Forster CF. 1993. An examination of the start up of a thermophilic upflow sludge blanket reactortreating a synthetic coffee waste. Environmental Technology. 14: 9656-972

De Baere L, Devocht M, Assche P y Verstraete W. 1984. Influence of high sodium chloride and ammonium chloridesalt levels on methanogenic association. Water Research. 18: 543-548.

De Bok FAM, Hagedoorn PL, Silva PJ, Hagen WR, Schiltz E, Fritsche K y Stams AJM. 2003. Two W-containingformate dehydrogenases (CO2 reductases) involved in syntrophic propionate oxidation by Syntrophobacterfumaroxidans. European Journal of Biochemistry. 270: 2476-2485

Demirel B y Scherer P. 2008. The roles of acetotrophic and hydrogenotrophic methanogens during anaerobicconversion of biomass to methane: a review. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 7: 173–190.

Demirel B y Yenigün O. 2002. Two-phase anaerobic digestion processes: a review. Journal of Chemical Technologyand Biotechnology. 77: 743-755.

Doyle O, O’Malley J, Clausen E, Gaddy J. 1983. Kinetic improvements in the production of methane from cellulosicresidues. Energy Biomass Wastes. 7: 54561.

Feijoo G, Vidal G, Moreira MT, Mendez R y Lema JM.1995. Degradation of high molecular weight compounds ofkraft pulp mill effluents by a combined treatment with fungi and bacteria. Biotechnology Letters. 17: 1261-1266.

Fischer E, Lieske R y Winzer K. 1932. B iologische Gasreaktiohen, lI. Mitteilung: fiber die Bildung yon Essigsfiure bei

der biologischen Umsetzung von Kohlenoxyd und Kohlensfiure mit Wasserstoff zu Methan. Biochemistry Z. 245: 2-12Freedman DL y Gossett JM. 1991. Biodegradation of dichloromethane and its utilization as growth substrate undermethanogenic conditions. Applied and Environmental Microbiology. 57: 2847-2857

Freitag TE y Prosser JI. 2009. Correlation of methane production and functional gene transcriptional activity in a peatsoil. Applied and Environmental Microbiology. 75: 6679-6687

Gavala H, Yenal U, Skiadas I, Westermann P y Ahring B. 2003. Mesophilic and thermophilic anaerobic digestion ofprimary and secondary sludge. Effect of pre-treatment at elevated temperature. Water Research. 37: 4561-4572.

Gavala HN y Ahring, BK. 2002. Inhibition of the anaerobic digestion process by linear-alkylbenzene sulfonates.Biodegradation. 13: 201–209.

Gavala, H. N. y Lyberatos, G. 2001. Influence of anaerobic culture acclimation on the degradation kinetics of varioussubstrates. Biotechnology and Bioengineering. 74(3): 181-195.

Godbole SH, Gore JA, Ranade DR. 1981. Associative Action of the Various Groups of Microorganisms in theProduction of Biogas. Biovignyanam. 7: 107–113.

Grady Jr CPL, Daigger GT y Lim HC. 1999. Biological Waste Water Treatment. Marcel Dekker, New York.


18/21



31

Guo YQ, Liu JX, Lu Y, Zhu WY, Denman SE y McSweeney CS. 2008. Effect of tea saponin on methanogenesis,microbial community structure and expression of mcrA gene, in cultures of rumen micro-organisms. Letters inApplied Microbiology. 47: 421-426

Hazelwood GP y Nugent JHA. 1978. Leaf fraction 1 protein as a nitrogen source for the growth of a proteolytic rumen

bacterium. Journal of General Microbiology. 106:369-371.

Hendrickson EL, Haydock AK, Moore BC, Whitman WB y Leigh JA. 2007. Functionally distinct genes regulated byhydrogen limitation and growth rate in methanogenic Archaea. Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America. 104: 8930-8934

Hess M, Sczyrba A, Egan R, Kim TW, Chokhawala H, Schroth G, Luo S, Clark DS, Chen F, Zhang T, Mackie RI,Pennacchio LA, Tringe SG, Visel A, Woyke T, Wang Z y Rubin EM. 2011. Metagenomic discovery of biomass-degrading genes and genomes from cow rumen. Science. 331: 463-467.

Hovey R, Lentes S, Ehrenreich A, Salmon K, Saba K, Gottschalk G, Gunsalus RP y Deppenmeier U. 2005. DNAmicroarray analysis of Methanosarcina mazei Gö1 reveals adaptation to different methanogenic substrates.Molecular Genetics and Genomics. 273: 225-39.

Hwu CS y Lettinga G. 1997. Acute toxicity of oleate to acetate-utilizing methanogens in mesophilic and thermophilicanaerobic sludges. Enzyme and Microbiology Technology. 21: 297–301.

Isa Z, Grusenmeyer S. y Verstraete W. 1986. Sulfate reduction relative to methane production in high-rate anaerobicdigestion: microbiological aspects. Applied and Environmental Microbiology. 51: 580-587.

Jin P, Bhattacharya SK, Williama CJ y Zhang H. 1998. Effects of sulfide addition on copper inhibition inmethanogenic systems. Water Research. 32: 977–988.

Kansal A, Rajeshwari KV, Balakrishnan M, Lata K, y Kishore VVN. 2004. Anaerobic digestion technologies forrecovery from industrial waste water- a study in Indian context. TERI Information Monitor on EnvironmentalScience.3: 67-75.

Kato S, Kosaka T y Watanabe K. 2008. Comparative transcriptome analysis of responses of Methanothermobacter

thermautotrophicus to different environmental stimuli. Environmental Microbiology. 10: 893-905

Kato S, Kosaka T y Watanabe K. 2009. Substrate-dependent transcriptomic shifts in Pelotomaculumthermopropionicum grown in syntrophic co-culture with Methanothermobacter thermautotrophicus. MicrobialBiotechnology. 2: 575-584Kayhanian M., 1999. Ammonia inhibition in high-solids biogasification: an overview and practical solutions.Environmental Technology. 20: 355–365.

Koster IW y Koomen E. 1988. Ammonia inhibition of the maximum growth rate (µm) of hydrogenotrophicmethanogens atvarious pH-levels and temperatures. Applied Microbiology and Biotechnology. 28: 500–505.

Koster IW y Lettinga G. 1984.The influence of ammonium-nitrogen on the specific activity of pelletized methanogenicsludge, Agricultural Wastes. 9: 205-216.

Koster IW, Rinzema A, De Vegt AL y Lettinga G. 1986. Sulfide inhibition of the methanogenic activity of granularsludge at various pH levels. Water Research. 20: 1561–1567.

Kroeker, EJ, Schulte DD, Sparling AB y Lapp HM. 1979. Anaerobic treatment process stability. Journal of the WaterPollution Control Federation. 51: 718-727.

Kroiss H y Plahl-Wabnegg F. 1983. Sulphide toxicity with anaerobic wastewater treatment. EnvironmentalSymposium on Anaerobic Wastewater treatment, The Netherlands, 72-85.


19/21



32

Kugelman IJ y Chin KK. 1971. Toxicity, synergism, and antagonism in anaerobic waste treatment processes. In:Anaerobic Biological Treatment Processes, American Chemical Society Advances in Chemistry Series 105: 55–90.

Lalman J y Bagley DM. 2001. Anaerobic Degradation and Methanogenic Inhibitory Effects of Oleic and Stearic Acids.Water Research. 35: 2975-2983.

Lange M, Tolker-Nielsen T, Molin S y Ahring BK. 2000. In situ reverse transcription-PCR for monitoring geneexpression in individual Methanosarcina mazei S-6 cells. Applied and Environmental Microbiology. 66: 1796-1800.

Lee YH y Pavlostathis SG. 2004. Decolorization and Toxicity of Reactive Anthraquinone Textile Dyes underMethanogenic Conditions. Water Research 38:1838-1852.

Lehmacher A y Hensel R. 1994. Cloning, sequencing and expression of the gene encoding 2-phosphoglyceratekinase from Methanothermus fervidus. Molecular and General Genetics. 242: 163-168.

Lin CY. 1993. Effect of heavy metals on acidogenesis in anaerobic digestion. Water Research. 27: 147–152.

Liu Y y Boone DR. 1991. Effects of salinity on methanogenic decomposition. Bioresource Technology. 35: 271–273.

Livera, J, McLaughlin MJ, Hettiarachchi Kirby JK y Beak D. Cadmium solubility in paddy soils: effects of soiloxidation, metal sulfides and competitive ions. Science of the Total Environment. 409: 1489-1497.

Ljungdahl LG. 1986. The autotrophic pathway of acetate synthesis in acetogenic bacteria. Annual Review ofMicrobiology. 40: 415-450.

Maillacheruvu, KY, Parkin GF, Peng WC, Kuo WC, Oonge ZI y Lebduschka V. 1993. Sulfide toxicity in anaerobicsystems fed sulfate and various organics. Water Environmental Research. 65: 100–109.

McCarty PL. 1964. Anaerobic waste treatment fundamentals III. Public Works. 95: 91-94.

McInerney MJ y B ryant MP. 1981. Anaerobic degradation of lactate by syntrophic associations of Methanosarcinabarkeri and Desulfovibrio and effect of H2 on acetate degradation. Applied and Environmental Microbiology. 41: 346-354.

Nagamani B, y Ramasamy K. 1999. Biogas Technology: An Indian Perspective. Current Science. 77: 44-55.Nies, D.H. 1999. Microbial heavy-metal resistance. Applied Microbiology and Biotechnology. 51: 730–750

Parkin GF y Owen WF. 1986. Fundamental of anaerobic-digestion of wastewater sludge. Journal of EnvironmentalEngineering. 112: 867–920.

Pavlostathis, S.G. and Giraldo-Gomez, E. 1991. Kinetics of anaerobic treatment: a critical review. Critical Reviews inEnvironmental Control. 21: 411–490.

Preeti Rao P, Shivaraj D y Seenayya G. 1993. Succession of microbial population in cow dung and poultry litterwaste digesters during methanogenesis. Indian Journal of Microbiology. 33: 185–189.

Ramasamy K, Nagamani B y Kalaichelvan G. 1991. 31st Annual Conference of AMI held at TNAU, Coimbatore, 96

p.Ramsamy K. 1997. Proceedings of the National Symposium on Community and Institutional Biogas Complexes heldat Punjab Agricultural University, Ludhiana, 4–5 p.

Raskin L, Rittmann BE y Stahl DA. 1996. Competition and coexistance of sulfate-reducing and methanogenicpopulations in anaerobic biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 62: 3847-3857.

Rinzema, A, van Lier J y Lettinga G. 1988. Sodium inhibition of aceticlastic methanogens in granular sludge from aUASB reactor. Enzyme and Microbial Technology. 10: 24–32.


20/21



33

Schink B. 1997. Energetics of syntrophic cooperation in methanogenic degradation. Microbiology and MolecularBiology Reviews. 61(2): 262–280.

Shih CJ y Lai MC. 2010. Differentially expressed genes after hyper- and hypo-salt stress in the halophilic archaeon

Methanohalophilus portucalensis. Canadian Journal of Microbiology. 56: 295-307

Siebert ML y Torien DF. 1969. The proteolytic bacteria present in the anaerobic digestion of raw sewage sludge,Water Research. 3: 241-250.

Sossa K, Alarcón M, Aspé y Urrutia H. 2004. Effect of ammonia on the methanogenic activity of methylaminotrophicmethane producing archaea enriched biofilm. Anaerobe. 10: 13-18.

Soto M, Méndez R y Lema J. Sodium Inhibition and sulfate reduction in the anaerobic treatment of musselprocessing waste. 1993. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 58:1.

Spanheimer R, Hoffmann M, Kögl S, Schmidt S, Pflüger K y Müller V. 2008. Differential regulation of Ota and Otb,two primary glycine betaine transporters in the methanogenic archaeon Methanosarcina mazei Gö1. Journal ofMolecular Microbiology and Biotechnology. 15: 255-263.

Speece RE. 1996. Anaerobic biotechnology for industrial wastewaters. Archae Press, Nashville, Tennessee, USA.

Sprott GD y Patel GB. 1986. Ammonia toxicity in pure cultures of methanogenic bacteria. Systematic and AppliedMicrobiology. 7: 358–363.

Stathopoulos C, Tong L, Longman R, Vothknecht UC, Becker HD, Ibba M y Soll D. 2000. One Polypeptide with TwoAminoacyl-tRNA Synthetase Activities. Science. 287: 479.

Sung S. y Liu T. 2003. Ammonia inhibition on thermophilic digestion. Chemosphere 53: 43–52.

Toeri en DF y Hattingh WHJ. 1969. Anaerobic digestion. 1. The microbiology of anaerobic digestion. WaterResearch. 3:385

Ulmanu M, Maranon, E., Ferna´ndez, Y., Castrillo´n, L., Anger, I., y Dumitriu, D., 2003. Removal of copper andcadmium ions from diluted aqueous solutions by low cost and waste material adsorbents. Water, Air and SoilPollution. 142: 357–373.

Ungerfeld, EM, Rust SR, Boone DR y Liu Y. 2004. Effects of several inhibitors on pure cultures of ruminalmethanogens. Journal of Applied Microbiology. 97: 520-526.

Vallero MVG, Lettinga G. y Lens PNL. 2003. Long-term adaptation of methanol-fed thermophilic (55° C) sulfate-reducing reactors to NaCl. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 30: 375–382.

van Kessela JAS y Russell JB. The effect of pH on ruminal methanogenesis. Microbial Ecology. 20: 205-210

Veeken A y Hamelers B. 1999. Effect of temperature on hydrolysis rate of selected biowise components.BioresourceTechnology. 69: 249–254.

Vercoe PE, Kocherginskaya SA y White BA. 2003. Differential protein phosphorylation–dephosphorylation inresponse to carbon source in Ruminococcus flavefaciens FD-1. Journal of Applied Microbiology. 94: 974-980

Wang Y, Zhang Y, Wanga J y Menga L. 2009. Effects of volatile fatty acid concentrations on methane yield andmethanogenic bacteria. Biomass and Bioenergy. 33: 848-853.

Ward AJ, Hobbs PJ, Holliman PJ y Jones DL. 2008. Optimization of the anaerobic digestion of agricultural resources.Bioresource Technology. 99: 7928-7940.


21/21



Widdel F y Wolfe RS. 1989. Expression of secondary alcohol dehydrogenase in methanogenic bacteria andpurification of the F420-specific enzyme from Methanogenium thermophilum strain TCI. Archives of Microbiology.152: 322-328

Wiegant, WM y Zeeman G. 1986. The mechanisms of ammonia inhibition in the thermophilic digestion of livestock

wastes. Agricultural Wastes. 16: 243-253.

Wieringa, K. T. 1936. Over het verdwijnen van waterstof en koolzuur onder anaerobe voorwarden. Antonie vanLeeuwenhoek Journal of Microbiology and Serology. 3:263-273.

Wong, MH y Cheung YH. 1995. Gas production and digestion efficiency of sewage sludge containing elevated toxicmetals. Bioresource Technology. 54: 261–268.

Wood HG. 1991. Life with CO or CO2 and H2 as a source of carbon and energy. Federation of American Societies forExperimental Biology Journal. 5: 156-163

Xia Q, Wang T, Hendrickson EL, Lie TJ, Hackett M y Leigh JA. 2009. Quantitative proteomics of nutrient limitation inthe hydrogenotrophic methanogen Methanococcus maripaludis. BMC Microbiology. 9: 149

Zayed, G. y Winter, J. 2000. Inhibition of methane production for whey by heavy metals protective effect of sulfide.Applied Microbiology and Biotechnology, 53: 726–731.

Zeeman G, Wiegant WM, Koster-Treffers ME y Lettinga, G., 1985. The influence of the total ammonia concentrationon the thermophilic digestion of cow manure. Agricultural Wastes, 14, 19–35.

Zhou HB y Qiu, GZ. 2006. Inhibition effect of ammonia nitrogen on specific methanogenic activity of anaerobicgranular sludge. Journal of Central South University of Technology, 13, 63-67.

Expresion Genetica de La Metanogenesis

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