Introduccin

10.EFECTOS DE LA ADMINISTRACIN DE AGENTES ESTROGNICOS DURANTE LA DIFERENCIACIN SEXUAL DEL CEREBRO SOBRE LA EXPRESIN DE LOS RECEPTORES A ESTRGENOS Y PROGESTERONA.

Vctor Ivn Hernndez Molina

Tutor: Dr. Ignacio Camacho Arroyo

Departamento de Biologa

Introduccin

Las hormonas esteroides sexuales son cruciales en la diferenciacin sexual del cerebro. Muchos de los efectos de las hormonas sexuales estn mediados por receptores intracelulares especficos, que funcionan como factores de transcripcin dependientes de ligando (Camacho-Arroyo, 2003).

El proceso de diferenciacin sexual est mediado por los estrgenos en zonas especficas del cerebro. As, se han encontrado una gran cantidad de diferencias morfolgicas y funcionales entre diversos ncleos del hipotlamo, un ejemplo de sto es el ncleo sexualmente dimrfico del rea preptica. Adems, existen diferencias sexuales en el espesor de varias regiones en la corteza cerebral, en el nmero de neuronas en el esplenio del cuerpo calloso, y en la concentracin de neurotransmisores (Kandel, 1991).

Se ha establecido que la exposicin perinatal a estradiol derivada de la aromatizacin de la testosterona es responsable de la organizacin cerebral en machos y hembras (Arnold, 1984).

La presencia de compuestos parecidos a las hormonas sexuales en nuestro ambiente ha causado un incremento en las enfermedades del sistema neuroendcrino asociado a la reproduccin (Kavlock, 1996).

El bisfenol A es uno de los compuestos ambientales ms comunes con actividad endcrina. Se sabe que tiene actividad tanto estrognica como antiandrognica in vitro e in vivo (Sohoni, 1998). El bisfenol A es un xenoestrgeno usado en la manufactura de plsticos policarbonados y resinas epxicas de las cuales una gran variedad de productos son fabricados. Se ha mostrado que una polimerizacin incompleta de estos productos durante la manufactura y/o una despolimerizacin debida al incremento de la temperatura, resulta en la dispersin del compuesto en el medio en concentraciones que son suficientes para inducir la proliferacin de clulas regulada por estrgenos (Biles, 1997).

En animales de laboratorio (ratas y ratones) la exposicin prenatal a bisfenol A ha mostrado una modificacin en la distancia anogenital, aumento en el tamao prosttico, decremento en el peso del epiddimo, alteracin en la ciclicidad estral y de niveles plasmticos de la hormona leutinizante, adems de hiperprolactinemia y alteraciones en la expresin de receptor a estrgenos (Ramos, 2003).

La atrazina por otra parte es un herbicida de uso extensivo en la agricultura. En las plantas el principal modo de accin de la atrazina es a travs de la inhibicin de la fotosntesis. Sin embargo, los efectos en las funciones celulares de especies de mamferos estn pobremente caracterizados. La administracin crnica de atrazina en ratas hembra, causa una senescencia prematura reproductiva, una condicin en la que los ciclos ovricos regulares son reemplazados por una persistente cornificacin vaginal y ovarios polifoliculares que determinan la secrecin continua de estradiol. La atrazina tambin causa una aparicin prematura de tumores mamarios. En dosis elevadas (50300 mg/kg) en ratas Sprague Dawley y Long evans suprime el pico de hormona leutinizante inducido por estrgenos (Cooper, 2000).

Se ha encontrado que la administracin de atrazina disminuye las concentraciones de norepinefrina y aumenta las de dopamina en el hipotlamo de ratas (Cooper, 1999). De manera importante estos cambios en la actividad hipotalmica y en la secrecin hormonal de la pituitaria inducidos por atrazina son observados en ratas Wistar tanto en presencia como en ausencia de estradiol endgeno o exgeno (Stoker, 2002).

Los efectos tanto del bisfenol A como de la atrazina no han sido totalmente caracterizados, por lo que en este trabajo se estudiarn los efectos de la administracin de estas sustancias en el perodo crtico de la diferenciacin sexual del cerebro sobre la expresin de los receptores a estrgenos y progesterona.

Desarrollo

Se utilizaron ratas hembra recin nacidas de la cepa Sprague Dawley (10 g) a las que se les administraron por va subcutnea diferentes dosis de bisfenol A o atrazina (40-80 mg/kg), as como el vehculo (propilenglicol) en el 3 da posnatal.

Las ratas fueron alimentadas por sus madres hasta el destete, posteriormente se separaron a las ratas de sus madres, mantenindose bajo un ciclo luz oscuridad 12:12 horas y agua y comida ad libitum.

Se realizaron frotis vaginales para determinar los efectos de los compuestos sobre el ciclo estral de las ratas. Una vez determinados los efectos sobre el ciclo estral, las ratas se sacrificaron a las 10 semanas de edad ya en la etapa adulta y se extrajeron el cerebro, tero y ovarios.

Se homogenizaron los diferentes tejidos en buffer de lisis con una solucin de inhibidores de proteasas (DTT 1mM, Tris-HCl 10mM, Glicerol, EDTA 1mM, Triton 1%, Leupeptina 4 g/ml, Aprotinina 22.5 g/ml, PMSF 1mM, Ortovanadato 1mM, Azida 15mM).

Una vez obtenidas las protenas se determin su concentracin mediante el mtodo de Bradford.

Las protenas totales de cada regin se separaron por electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) al 7.5% a 80 V durante 2 horas. Cada muestra se prepar con buffer de carga (tris 0.5 M pH 6.8, glicerol al 10%, SDS al 2%, mercaptoetanol al 5%) en un volumen 1:1, las cuales se hirvieron durante 5 min, para posteriormente depositarse en los geles.

Se realiz un anlisis de Western blot utilizando anticuerpos primarios contra el receptor a progesterona (RP), receptor a estrgenos (RE) y tubulina, seguidos de un anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa apropiado y el agente de deteccin ECL (Amersham Pharmacia).

Cada placa fue sometida a un anlisis densitomtrico utilizando el programa Scion Image, para cuantificar el contenido de los receptores, de acuerdo a la intensidad de cada banda. A los datos obtenidos se les aplic un anlisis de varianza (ANOVA) y una prueba de t-Student. Se utiliz el programa Prism 2.01 para este fin.

Resultados

A partir de los tejidos extrados de las ratas se obtuvieron las protenas en buffer de lisis y se cuantificaron mediante el mtodo de Bradford, para estandarizar las tcnicas propuestas. En la Figura 1. se muestra un gel representativo de una electroforesis vertical (SDS-PAGE) del rea preptica para los distintos tratamientos, en donde cada carril corresponde a un tratamiento diferente. El gel se encuentra teido con azul de Coomasie para evidenciar las protenas y por consiguiente la separacin en el medio desnaturalizante.

Vp Ve BE2 M B40p B40e B80p B80e A80p A80e

Figura 1. Gel representativo de una electroforesis de protenas extradas del rea preptica (SDS-PAGE). Vp: vehculo proestro; Ve: vehculo estro; BE2: Estradiol; M: machos; B40p: bisfenol A (40 mg/kg) proestro; B40e: bisfenol A (40 mg/kg) estro; B80p: bisfenol A (80 mg/kg) proestro; B80e: bisfenol A (80 mg/kg) estro; A80p: atrazina (80 mg/kg) proestro; A80e: atrazina (80 mg/kg) estro.

As mismo se realizaron varios experimentos de prueba para estandarizar la tcnica de Western blot modificando el tiempo de corrimiento, perodos de bloqueo, de incubacin de los anticuerpos tanto primario como secundario, lavado y de exposicin autoradiogrfica.

En la figura 2, se muestran dos blots representativos del rea preptica y del hipotlamo para la determinacin de las isoformas del receptor a progesterona y el control de carga tubulina, en donde se pueden apreciar claramente las bandas que corresponden a cada una de las protenas de inters.

Figura 2. Blot representativo de las isoformas del receptor a progesterona en el hipotlamo y el rea preptica. Vp: vehculo proestro; Ve: vehculo estro; BE2: Estradiol; M: machos; B40p: bisfenol A (40 mg/kg) proestro; B40e: bisfenol A (40 mg/kg) estro; B80p: bisfenol A (80 mg/kg) proestro; B80e: bisfenol A (80 mg/kg) estro; A80p: atrazina (80 mg/kg) proestro; A80e: atrazina (80 mg/kg) estro; RP-A: receptor a progesterona isoforma A; RP-B: receptor a progesterona isoforma B.

A partir de la estandarizacin de las tcnicas utilizadas se podr determinar ya el contenido del receptor a progesterona y estrgenos en el cerebro de las ratas tratadas con Bisfenol A y Atrazina.

Referencias

1. Arnold A. & Gorski R. Gonadal Esteroid Induction of Structural Sex Differences in the Central Nervous System. Annual Review of Neurosciences 1984, 7, 413-442.

2. Biles J., McNeal T., Begley T., Hollifield H. Determination of Bisphenol A in Reusable Polycarbonate Food Contact Plastics and Migration to Food Simulating Liquids. Journal of Agricultural Food Chemistry 1997, 45, 3541-3544.

3. Camacho-Arroyo Ignacio, Progesterone Receptor Isoforms Expression and Progesterone Actions in the Brain. Recent Res. Devel. Life Sci. 2003, 1(16), 221-242.

4. Cooper R., Stoker T., Mistich S., & McElroy K. Differential effects of atrazine (ATR) on serum leutinizing hormone (LH) and prolactin (PRL) in Long Evans hooded and Sprague Dawley rats. Toxicologists 1999, 48, 385.

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8. Ramos J., Varayoud J., Kass L., Rodrguez H., Costabel L., Muoz M. & Luque E. Bisphenol A Induces Both Transient and Permanent Histofunctional Alterations on the Hypotalamic-Pituitary-Gonadal Axis in Prenatally Exposed Male Rats. Endocrinology 2003, 144, 3206-3215.

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