Kasmera 41(2): 115 - 126, julio-diciembre 2013ISSN 00755222 / Depósito legal 196202ZU39

Eva lua ción de mé to dos fe no tí pi cos para la de tec ciónde me ta lo be ta lac ta ma sas en ais la dos clí ni cosde Pseu do mo nas ae ru gi no sa

Assessment of Phenotypic Methods for MetalobetalactamaseDetection in Clinical Isolates of Pseudomonas aeruginosa

Ar min do José Pe ro zo Me na1,Ma ri bel Jo se fi na Cas te lla no Gon zá lez2,

Tu ta ya Chá vez Kathyuska3,Elia na Ling To le do4,

Nai let Arraiz5

1Es cue la de Bioa ná li sis. Fa cul tad de Me di ci na. Uni ver si dad del Zu lia.Cen tro de Re fe ren cia Bac te rio ló gi ca. Ser vi cio Au tó no mo Hos pi tal

Uni ver si ta rio de Ma ra cai bo. Di rec ción Pos tal: Edi fi cio Cien cia y Sa lud,Plan ta Baja La bo ra to rio de Bac te rio lo gía. ape ro zo me na@cantv.net;

ape ro zo me na@in ter link.net.ve.2Es cue la de Bioa ná li sis. Fa cul tad de Me di ci na. Uni ver si dad del Zu lia.

ma ri bel cast@in ter link.net.ve; ma ri bel jo@cantv.net.3, 4Cen tro de Re fe ren cia Bac te rio ló gi ca. Ser vi cio Au tó no mo Hos pi tal

Uni ver si ta rio de Ma ra cai bo.5Es cue la de Bioa ná li sis. Fa cul tad de Me di ci na. Uni ver si dad del Zu lia.

La bo ra to rio de Bio lo gía Mo le cu lar. Cen tro de In ves ti ga cio nesEn do cri no Me ta bó li cas Dr. Fe liz Gó mez.

Re su men

Pseu do mo nas ae ru gi no sa es con si de ra do uno de los pa tó ge nos no so co mia les más im por tan-tes, sien do co mún su ais la mien to en pa cien tes de uni da des de cui da dos in ten si vos, en quie nes ade-más sue le pre sen tar mul ti rre sis ten cia, esto li mi ta enor me men te las op cio nes te ra péu ti cas para eltra ta mien to del pa cien te, lo que cons ti tu ye un pro ble ma ya que no se dis po nen de dro gas efec ti vaspara el tra ta mien to. El pre sen te tra ba jo tie ne como ob je ti vo eva luar cua tro mé to dos fe no tí pi cospara la de tec ción de me ta lo- be ta- lac ta ma sas (mé to do de si ner gia del do ble dis co con EDTA, mé to-

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Re ci bi do: 07- 10- 13 / Acep ta do: 21-11- 13

do del dis co com bi na do de imi pe nem y me ro pe nem con EDTA, mé to do de E- Test- MBL y el méto-do de Ho dge mo di fi ca do), con un mé to do de re fe ren cia (PCR), para de ter mi nar el mé to do fe no tí-pi co o com bi na ción de es tos que sea más va li do y se gu ro para su im ple men ta ción en los la bo ra to-rios de bac te rio lo gía de ru ti na. La sen si bi li dad y es pe ci fi ci dad de los mé to dos fe no tí pi cos em plea-dos fue bue na (más de 90%), de los mé to dos em plea dos, el test de Ho dge mo di fi ca do fue el quepro por cio nó me jo res re sul ta dos en la de tec ción de ais la dos de P. ae ru gi no sa pro duc to res de MBL(me nor tasa de fal sos po si ti vos y ne ga ti vos), al ana li zar los di fe ren tes mé to dos com bi na dos parade ter mi nar cuál es la aso cia ción con ma yor sen si bi li dad y es pe ci fi ci dad, el mé to do del do ble dis coaso cia do con el test de Ho dge mo di fi ca do re u nie ron es tas ca rac te rís ti cas, es tos re sul ta dos su gie renque es tos dos mé to dos se de ben em plear de ru ti na en un la bo ra to rio de Bac te rio lo gía, por ser fá ci-les de rea li zar, eco nó mi cos, sen si bles y es pe cí fi cos.

Pa la bras cla ve: P. ae ru gi no sa, me ta lo- be ta- lac ta ma sas, de tec ción, MBL, blaIMP, blaVIM.

Abs tract

Pseu do mo nas ae rugi nosa is con sid ered one of the most im por tant no so comial patho gens. Itsiso la tion is com monin in ten sive care unit pa tients who also usu ally have multi-resis tance. Thisgreatly lim its thera peu tic op tions, since no ef fec tive drugs are avail able for treat ment. The studyaims to evalu ate four phe no typic meth ods for de tecting metallo- beta- lactamases. The dou ble discsyn ergy with EDTA method, com bined imipe nem and mero pe nem disk with EDTA method, theE- Test- MBL method and the modi fied Hodge method, along with a ref er ence method (PCR), areused to de ter mine the phe no typic method or a com bi na tion of these is used that is more valid andsafe for im ple men ta tion in rou tine bac te ri ol ogy labo ra to ries. The sen si tiv ity and speci fic ity of thephe no typic meth ods used was good (over 90%); the modi fied Hodge test ob tained the best re sultsin de tecting MBL-pro ducing P. ae rugi nosa iso lates (lower rate of false posi tive and nega tive). Onana lyz ing the dif fer ent com bined meth ods for de ter min ing the as so cia tion with greater sen si tiv ityand speci fic ity, the dou ble disc method as so ci ated with the modi fied Hodge test met these char ac-ter is tics. Results sug gest that these two meth ods should be rou tinely used in a bac te ri ol ogy labo ra-tory, since they are easy to per form, sen si tive, spe cific and eco nomical.

Key words: P. aeruginosa, metalo-beta-lactamase, detection, MBL, blaIMP, blaVIM.

In tro duc ción

Pseu do mo nas ae ru gi no sa es un mi cro-or ga nis mo que ha sido ais la do de múl ti plesam bien tes y su per fi cies, así como de in di vi-duos sa nos como par te de la mi cro flo ra nor-mal (1, 2). Es con si de ra do un pa tó ge no pri-ma ria men te no so co mial, sien do co mún suais la mien to en pa cien tes de Uni da des de Cui-da dos In ten si vos, en quie nes ade más pre sen-ta una mar ca da mul ti re sis ten cia, que in cre-men ta la mor ta li dad aso cia da (2-4).

Su pa pel eco ló gi co como efi caz pa tó ge-no opor tu nis ta ra di ca en la su per vi ven cia du-ran te lar gos pe río dos de tiem po en fó mi tescon es ca sas fuen tes ali men ti cias como ai resacon di cio na dos, ven ti la do res, so lu cio nes delim pie za, ja bo nes lí qui dos, agua, an ti sép ti cosy equi pos mé di cos como fi bro bron cos co pios(5, 6). Es tos mí ni mos re que ri mien tos nu tri-cio na les, se com ple men tan con una alta re-sis ten cia in trín se ca a los agen tes an ti mi cro-bia nos, esta se debe a la baja per mea bi li dadde su mem bra na ex ter na, aco pla da con me-

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ca nis mos de re sis ten cia se cun da rios comobom bas de eflu jo ac ti vo de an ti bió ti cos y ce-fa los po ri na sas in du ci bles, los cua les to manven ta ja de esta baja per mea bi li dad, por loque, pe que ños cam bios en la sus cep ti bi li dada un an ti bió ti co pue den re sul tar en un in cre-men to de la Con cen tra ción Inhi bi to ria Mí ni-ma (CIM) de la dro ga a un ni vel su pe rior alal can za do de ma ne ra te ra péu ti ca, lo que re-sul ta en la re sis ten cia del mi cro or ga nis mo aese an ti bió ti co (7).

El tra ta mien to de las in fec cio nes cau sa-das por este agen te sue le ser di fí cil, ya queade más de su am plia re sis ten cia na tu ral, P.ae ru gi no sa pue de ad qui rir me ca nis mos dere sis ten cia para prác ti ca men te la to ta li dad delos an ti mi cro bia nos dis po ni bles para su tra ta-mien to (8, 9). En res pues ta a esto, es cada vezmás fre cuen te y ne ce sa rio en las ins ti tu cio neshos pi ta la rias el em pleo de los car ba pe ne mas,lo que ha com pli ca do aún más el pa no ra ma,ya que, el uso de es tos an ti mi cro bia nos traecon si go la se lec ción de re sis ten cia, de bi do a lapro duc ción de en zi mas car ba pe ne ma sas (10,11), por lo que en la ac tua li dad ha au men ta doel nú me ro de ce pas de P. ae ru gi no sa pro duc-to ras de es tas en zi mas, lo que deja prác ti ca-men te al pa cien te sin op cio nes te ra péu ti cas,ya que la pre sen cia de este me ca nis mo de re-sis ten cia inha bi li ta el uso de to dos los an ti bió-ti cos del gru po de los be ta lac tá mi cos.

Las MBL de P. ae ru gi no sa re pre sen tanva rios gru pos: IMP, VIM, SPM, GIM y SIM;de ellos los de ma yor im por tan cia son IMP yVIM (12, 13). Es tas MBL son trans fe ri blespues to que su gran ma yo ría se en cuen tran enge nes cas set tes lo ca li za dos prin ci pal men teen in te gro nes tipo 1 y, en al gu nas oca sio nes,se han en con tra do en plás mi dos o trans po so-nes. De esta ma ne ra se aso cian a otros ge nesde re sis ten cia ubi ca dos en los mis mos ge nesca se tes lo cual les con fie re a las ce pas por ta-do ras, re sis ten cia a múl ti ples an ti bió ti cos.

Las MBLs se ca rac te ri zan por ge ne rarre sis ten cia a los be ta lac tá mi cos (oxi mi no ce-fa los po ri nas, ce fa mi ci nas, car ba pe nemas), ypor pre sen tar sen si bi li dad va ria ble al az treo-nam. Ac tual men te, Las MBL es tán am plia-men te di se mi na das en una gran va rie dad dees pe cies, aun que se ha llan más co mún men teen P. ae ru gi no sa y A. bau mannii, sien do de-tec ta das en los paí ses de los 5 con ti nen tes (3,13, 14).

Para la de tec ción de me ta lo- be ta lac ta-ma sas (MBL) en ce pas de P. ae ru gi no sa elmé to do de re fe ren cia lo cons ti tu ye la reac ciónen ca de na de la po li me ra sa (PCR), esta prue baes ca paz de de tec tar los ge nes res pon sa bles deeste me ca nis mo de re sis ten cia, sin em bar go,la ma yo ría de los la bo ra to rios de bac te rio lo gíaclí ni ca de ru ti na no po seen la ca pa ci dad pararea li zar es tas prue bas mo le cu la res. Exis tenpo cos mé to dos fe no tí pi cos para la de tec ciónde MBL en ce pas de P. ae ru gi no sa (15), adi-cio nal men te se co no ce poco acer ca de la sen si-bi li dad y es pe ci fi ci dad de es tos, por lo que estees tu dio pre ten de pro bar los di fe ren tes mé to-dos fe no tí pi cos dis po ni bles y com pa rar los conla prue ba de re fe ren cia (PCR), para de ter mi-nar cuál de los mé to dos, o com bi na ción demé to dos, pue den uti li zar se de ma ne ra se gu ray efec ti va en un la bo ra to rio de bac te rio lo gíade ru ti na, per mi tien do en ton ces la de tec ciónde este im por tan te me ca nis mo de re sis ten cia,lo que re per cu ti rá di rec ta men te en el be ne fi-cio del pa cien te y la co mu ni dad.

Ma te ria les y Mé to dos

En este es tu dio se ana li za ron 294 ce pasde P. ae ru gi no sa ais la das de los cul ti vos deru ti na prac ti ca dos con fi nes diag nós ti cos alos pa cien tes que asis ten al Cen tro de Re fe-ren cia Bac te rio ló gi ca del Ser vi cio Au tó no moHos pi tal Uni ver si ta rio de Ma ra cai bo (CRB- SAHUM).

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Mé to dos fe no tí pi cos para la de tec ción de me ta lo be ta lac ta ma sas en ais la dos clí nicos de P. ae ru gi no sa 117

Ais la mien to e Iden ti fi ca ción de ce-pas de P. ae ru gi no sa

El ais la mien to e iden ti fi ca ción de las ce-pas de P. ae ru gi no sa a par tir de las di fe ren tesmues tras clí ni cas fue rea li za do por el per so-nal del CRB- SAHUM, para ello se uti li za ronlas téc ni cas de ais la mien to con ven cio na lesdes cri tas en el Ma nual de Mi cro bio lo gía Clí-ni ca (16), para la iden ti fi ca ción se uti li zó elequi po au to ma ti za do VI TEK 2C (Bio me-rieux®) y las tar je tas de iden ti fi ca ción paraGram ne ga ti vos GN; es tas tar je tas per mi tenla iden ti fi ca ción de la ma yor par te de los ba-ci los Gram ne ga ti vos de in te rés clí ni co en untiem po má xi mo de 7 ho ras.

De tec ción Fe no tí pi ca de la Pro-duc ción de MBL

En la ac tua li dad, no exis te es tan da ri za-ción ni con sen so so bre el tipo de téc ni cas másefi ca ces para la de tec ción fe no tí pi ca de las ce-pas pro duc to ras de MBL, por lo que una veziden ti fi ca das las ce pas de P. ae ru gi no sa, fue-ron so me ti das a cua tro prue bas fe no tí pi casin di vi dua les para de ter mi nar la pro duc ciónde MBL; mé to do del do ble dis co con EDTA(DD), mé to do del dis co com bi na do conEDTA (DC), mé to do de E- Test MBL (ET) y eltest de Ho dge mo di fi ca do (HM).

De tec ción de MBL por el Mé to dodel Do ble Dis co con EDTA (DD)

Este mé to do fue des cri to por Ara wa ka ycols. (15), y se basa en que las MBL ne ce si tan

como co fac tor en la reac ción io nes me tá li coscomo el Zn+2, el EDTA es un agen te que lan teque po see la ca pa ci dad de atra par es tos io nesme tá li cos y por con si guien te de inhi bir la ac-ción de la en zi ma, por lo que en esta prue ba seuti li za el EDTA como inhi bi dor de MBL. Laprue ba se rea li zó uti li zan do una pla ca de agarMüe ller- Hin ton (MH), esta pla ca es sem bra dacon un inó cu lo es tan da ri za do (0,5 McFar-land) y se co lo ca ron los dis cos de an ti bió ti cos,en este caso se co lo có un dis co de pa pel What-man Nº 6 con un diá me tro de 6mm en la pla cay se im preg nó con 10µl de EDTA (0,5M pH8,0), para ob te ner una con cen tra ción fi nal enel dis co de 750µg/ml de EDTA, lue go se co lo cóa cada lado del dis co de EDTA un dis co de imi-pe nem y me ro pe nem res pec ti va men te, a unadis tan cia de 15 mm cen tro- cen tro, se in cu bó a35ºC de 18 a 24 ho ras en aer obio sis, lue go dela in cu ba ción, se rea li zó la lec tu ra de la prue-ba, esta se con si de ró po si ti va cuan do se ob ser-vó una am plia ción o dis tor sión (efec to si nér gi-co) en tre los dis cos de imi pe nem y me ro pe-nem y el dis co de EDTA (Fi gu ra 1).

De tec ción de MBL por el Mé to dodel Dis co Com bi na do con EDTA (DC)

Este mé to do fue des cri to ini cial men tepor Yong y cols. (17), se basa tam bién en laca pa ci dad del EDTA de inhi bir a las MBL,pero a di fe ren cia del mé to do del do ble dis co,en este se uti li za un dis co de an ti bió ti co queadi cio nal men te posee EDTA (750µg). Para

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118 Pe ro zo Me na A.J. et al.

Fi gu ra 1. Prue ba del do ble dis co po si ti va para la de tec ción de MBL.

esta prue ba se ino culó una pla ca de agar MHcon una sus pen sión es tan da ri za da del mi cro-or ga nis mo (como se rea li zó en el mé to do an-te rior), lue go se co lo ca ron dos dis cos de imi-pe nem (10µg), a uno de los dis cos se le co lo-ca ron 10µl de EDTA, pos te rior men te se in cu-bó a 35ºC de 18 a 24h, para la lec tu ra, se com-pa ra ron los ta ma ños de los ha los de in hi bi-ción en tre los dis cos de imi pe nem e imi pe-nem/EDTA, si la di fe ren cia de ta ma ño en treel dis co de imi pe nem y el dis co de imi pe-nem/EDTA re sul tó 7mm, se con si de ró laprue ba po si ti va, es de cir, la cepa es pro duc to-ra de MBL (Fi gu ra 2).

De tec ción de MBL por el Mé to doE- test- MBL®

El mé to do E- Test- MBL fue des cri to yeva lua do por Walsh y cols. (18), tam bién sebasa en la ca pa ci dad del EDTA como agen teinhi bi dor de MBL. Este mé to do uti li za ti rasde ma te rial plás ti co no po ro so, im preg na dascon dos gra dien tes pre de fi ni dos, de un ladocon tie ne imi pe nem en con cen tra cio nes quevan de 4- 256µg/ml, mien tras que del otro po-see una com bi na ción de imi pe nem en con-cen tra cio nes que van des de 1-64µg/ml, ade-más de ni ve les cons tan tes de EDTA. Al igualque en los mé to dos an te rio res se pre pa ró unasus pen sión bac te ria na y se ino cu ló la su per fi-cie de una pla ca de agar de MH, se gui da men-

te, se co lo có la tira de E- test_MBL con ayu dade una pin za es té ril, se in cu bó a 35°C, en ae-ro bio sis, por 18- 24h, para la lec tu ra de laprue ba, se tomó en cuen ta el pun to don de lazona de in hi bi ción cor ta la es ca la nu mé ri cade la tira de E- test, lo que co rres pon de a laCIM. Para la in ter pre ta ción de los re sul ta dos,se cal cu ló la ra zón de di vi dir la CIM de IPMen tre la CIM ob te ni da por IPM/EDTA, si estara zón es 8, o si la di fe ren cia de las CIM es3 di lu cio nes, la prue ba se con si de ró po si ti-va (Fi gu ra 3).

Test de Ho dge Mo di fi ca do para laDe tec ción de MBL

Este mé to do fue des cri to ini cial men tepor Ho dge y cols. (19), para de tec tar la pre-sen cia de pe ni ci li na sas en ce pas de Neisse riago no rrhoeae, este mé to do de tec ta la pre sen-cia de una en zi ma inac ti va do ra de an ti bió ti-cos en la cepa es tu dia da, la es pe ci fi ci dad delmé to do para dis tin guir dis tin tos ti pos de be-ta lac ta ma sas está dada por el an ti bió ti co quese uti li ce. Lee y cols. (20), mo di fi ca ron el mé-to do ori gi nal cam bian do el mi cro or ga nis moin di ca dor y el an ti bió ti co pro ba do, ha cien doque la prue ba sea bas tan te sen si ble para lade tec ción de MBL.

La prue ba se rea li zó ino cu lan do la su per-fi cie de una pla ca de agar MH, con una sus-pen sión de co lo nias de un cul ti vo dé jo ven Es-

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Mé to dos fe no tí pi cos para la de tec ción de me ta lo be ta lac ta ma sas en ais la dos clí nicos de P. ae ru gi no sa 119

18 mm 26 mm

Fi gu ra 2. Prue ba del dis co com bi na do con EDTA po si ti va para la de tec ción de MBL.

che ri chia coli ATCC 25922, ajus ta da al es tán-dar 0,5 de la es ca la de McFar land, lue go se co-lo có un dis co de imi pe nem (10ug) en el cen trode la pla ca, pos te rior men te, se rea li zó una es-tría des de el bor de del dis co ha cia la pe ri fe riade la pla ca para cada cepa de P. ae ru gi no sasos pe cho sa de la pro duc ción de car ba pe ne-ma sas, se co lo có un má xi mo de cua tros ais la-dos en pla cas de pe tri de 90mm. Las pla cas sein cu ba ron en at mós fe ra ae ro bia por 18- 24h a35°C. La pre sen cia de una zona de dis tor sióndel halo de in hi bi ción al re de dor de la es tríadel mi cro or ga nis mo pro ba do fue in ter pre ta dacomo po si ti va para la pro duc ción de MBL porel mé to do de Ho dge mo di fi ca do (Fi gu ra 4).Para el con trol de ca li dad de los cua tro mé to-dos fe no tí pi cos, se uti li zó una cepa de P. ae ru-gi no sa pro duc to ra de MBL como con trol po si-ti vo (P. ae ru gi no sa CRB 3256- 08) y una nopro duc to ra de MBL como con trol ne ga ti vo (P.ae ru gi no sa ATCC 27853).

De tec ción Ge no tí pi ca de la Pro-duc ción de MBL

La téc ni ca que se uti li zó como es tán darde re fe ren cia para com pa rar la sen si bi li dad yes pe ci fi ci dad de los mé to dos fe no tí pi cos fue

la PCR. Esta prue ba es al ta men te sen si ble yes pe cí fi ca, de tec ta de ma ne ra di rec ta la pre-sen cia de los ge nes pro duc to res de MBL y nosu ex pre sión como lo ha cen los mé to dos fe-no tí pi cos. De los di fe ren tes ge nes que co di fi-can la pro duc ción de MBL, solo se in ves ti ga-ron blaIMP y blaVIM, ya que es tos son los queco di fi can la ma yor par te de las MBL re por ta-das en la li te ra tu ra (3,10, 21- 30).

La ex trac ción del ADN del mi cro or ga-nis mo se rea li zó uti li zan do un mé to do de li sisal ca li na de ex trac ción rá pi da (31), para la am-pli fi ca ción de los ge nes blaVIM Y blaIMP, se uti-li za ron los pri mers oli go nu cleó ti dos des cri-tos por Woo dford y cols. (32). Se pre pa ra ron50µl de mez cla de reac ción, con te nien do 1µMde cada pri mer, 200 µm de cada deo xi nu cleo-ti do tri fos fa to, Buffer de reac ción 1X, 1,5mMde Mg2Cl, 2,5U de Go- Taq po li me ra sa (Pro-me ga), y 25 ng del ADN mol de. La am pli fi ca-ción se rea li zó en un ter mo ci cla dor MJ- Re-search PTC- 100, se rea li zó una des na tu ra li-za ción ini cial a 94°C por 2 mi nu tos, lue go 30ci clos de am pli fi ca ción de la si guien te ma ne-ra: des na tu ra li za ción a 94°C por 1 mi nu to,ani lla mien to a 55°C por 1 mi nu to y ex ten sión

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120 Pe ro zo Me na A.J. et al.

12/1,5=8

Razón > 8 Prueba Positiva

Fi gu ra 3. Prue ba de E- Test po si ti va para la de tec ción de MBL.

del ADN a 72°C por 1,5 mi nu tos, des pués delúl ti mo ci clo los pro duc tos fue ron con ser va-dos a 4°C. La de tec ción de am pli fi ca dos serea li zó me dian te una elec tro fo re sis con gel deaga ro sa al 1% en TBE 0,5x. Se co rrió la elec-tro fo re sis con 80 vol tios por 1 hora o has taque el fren te de avan ce de las mues tras lle góal fi nal del gel, lue go se tiñó el gel con bro mu-ro de eti dio (1µg/mL) du ran te 30 mi nu tos.Una vez te ñi do, para la de tec ción de am pli fi-ca dos se vi sua li zó so bre un tran si lu mi na dorul tra vio le ta. La reac ción de am pli fi ca ciónpara blaIMP se con si de ró po si ti va al ob ser varuna ban da úni ca de 587pb. La reac ción deam pli fi ca ción para blaVIM se con si de ra po si ti-va al ob ser var una ban da úni ca de 261pb. Lasen si bi li dad y es pe ci fi ci dad de los pri mersfue eva lua da con ce pas con tro les que po seenel me ca nis mo de re sis ten cia ple na men teiden ti fi ca do, P. ae ru gi no sa ATCC 27853como con trol ne ga ti vo no pro duc tor de MBL,

P. ae ru gi no sa CRB- 55642- 09 cepa pro duc-to ra de blaVIM y P. ae ru gi no sa CRB- 25698- 09 cepa pro duc to ra de blaIMP.

Aná li sis Es ta dís ti co

Para la va li da ción de los mé to dos fe no tí-pi cos en com pa ra ción al PCR se cal cu ló la Sen-si bi li dad y Es pe ci fi ci dad de cada mé to do y delos mé to dos com bi na dos (33,34). Se uti li zó unin ter va lo de con fian za del 95% para el cál cu lo.

Re sul ta dos

Se ana li zó un to tal de 294 ais la dos clí ni-cos de Pseu do mo nas ae ru gi no sa. Del to talde ce pas ana li za das 104 fue ron po si ti vas me-dian te PCR para el gen blaIMP, nin gu no de losais la dos am pli fi có con el gen blaVIM.

La Ta bla 1 mues tra los re sul ta dos de losmé to dos fe no tí pi cos em plea dos con res pec to

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Mé to dos fe no tí pi cos para la de tec ción de me ta lo be ta lac ta ma sas en ais la dos clí nicos de P. ae ru gi no sa 121

D

A

B

C

Fi gu ra 4. Test de Ho dge mo di fi ca do.Test de Ho dge mo di fi ca do (A) ne ga ti vo; B, c y D po si ti vo.

a la prue ba de PCR. La Ta bla 2 mues tra lasen si bi li dad y es pe ci fi ci dad de cada mé to dofe no tí pi co al com pa ra se con el PCR; mien trasque la Ta bla 3 mues tra la sen si bi li dad y es pe-ci fi ci dad de los di fe ren tes mé to dos fe no tí pi-cos com bi na dos, al com pa rar se con la téc ni cade re fe ren cia.

Dis cu sión

Al com pa rar los re sul ta dos de los mé to-dos uti li za dos se pue de con cluir que hubouna alta con cor dan cia en tre los mé to dos fe-no tí pi cos em plea dos, ya que to dos ca rac te ri-za ron de ma ne ra si mi lar a los ais la dos de P.ae ru gi no sa como pro duc to res o no de MBL,cuan do se com pa ra con el mé to do de Re fe-ren cia (PCR).

El 96,15% de los ais la dos de P. ae ru gi-no sa con fir ma dos como pro duc to res de MBLpor PCR fue de tec ta do por el mé to do del DD,DC y ET, mien tras que el 3,85% de las ce paspro duc to ras de MBL fue ron ne ga ti vas por es-tos mé to dos, por lo que se con si de ra ron re-sul ta dos fal so ne ga ti vos. El HM de tec tó el

98,08% de las ce pas pro duc to ras de MBL ysolo apor tó 1,92% de re sul ta dos fal sos ne ga ti-vos (ais la dos PCR po si ti vo HM ne ga ti vo), porlo que fue la prue ba que ob tu vo los me jo resre sul ta dos en la de tec ción del me ca nis mo dere sis ten cia.

Por otra par te, 5,26% de los ais la dos ne-ga ti vos por PCR die ron po si ti vos para los mé-to dos del DD y DC, mien tras que solo 3,15%re sul ta ron po si ti vos por los mé to dos de ET yHM, por lo que es tos re sul ta dos se con si de-ran fal sos po si ti vos. El de sem pe ño del ET y elHM fue su pe rior y ge ne ró una me nor pro por-ción de re sul ta dos fal sos po si ti vos.

Ga la ni y col. (35) re por tan un 99% desen si bi li dad y un 91,9% para la de tec ción deMBL uti li zan do el mé to do del DC, por lo quelo re co mien dan como mé to do de ru ti na parala de tec ción de ce pas pro duc to ras de MBL.Por otra par te Gue va ra y col. (36), en Ve ne-zue la tam bién re por tan una bue na sen si bi li-dad y es pe ci fi ci dad (su pe rior al 95%), uti li-zan do dis cos de IPM con Áci do Eti len dia-mín te tra ce ti co y Tio gli co la to de So dio(EDTA/SMA). Mien tras que Lee y col. (37),

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Ta bla 1. Re sul ta dos de los mé to dos fe no tí pi cos com pa ra do con el PCR

Resultado del MétodoFenotípico

Métodos Fenotípicos PCR

DD DC ET HM

Positivo 100 100 100 102 Positivo

Negativo 4 4 4 2

Positivo 10 10 6 6 Negativo

Negativo 180 180 184 184

Ta bla 2. Sen si bi li dad y Es pe ci fi ci dad de cada mé to do fe no tí pi co com pa ra do con el PCR.

Métodos Fenotípicos

DD (95%IC) DC(95%IC) ET(95%IC) HM(95%IC)

Sensibilidad 96,15%(89,88%-98,76%)

96,15%(89,88%-98,76%)

96,15%(89,88%-98,76%)

98,08%(92,55%-99,67%

Especificidad 94,74%(90,26%-97,30%)

94,74%(90,26%-97,30%)

96,84%(92,94%-98,71%)

96,84%(92,94%-98,71%)

re por tan una sen si bi li dad y es pe ci fi ci dad del100% para el mé to do del do ble dis co conIPM/EDTA.

Una ma yor pro por ción de ce pas de P. ae-ru gi no sa die ron po si ti vo el HM, es de cir, estemé to do de tec tó ma yor can ti dad de ce pas que elres to de los mé to dos em plea dos, esto pue dede ber se prin ci pal men te a que el HM de tec ta lapre sen cia de cual quier me ca nis mo en zi má ti code re sis ten cia, mien tras que el res to de los mé-to dos em plea dos solo de tec tan la pre sen cia deMBL. En el HM, la es pe ci fi ci dad del mé to doestá dada por el an ti bió ti co uti li za do como sus-tra to en la prue ba, en este caso IPM, por lo queel mé to do de tec ta la pre sen cia de en zi mas quehi dro li zan a los car ba pe ne mas, es de cir, car ba-pe ne ma sas; en nues tro me dio, la re sis ten cia acar ba pe ne mas en Pseu do mo nas spp. se debeprin ci pal men te a la pro duc ción de MBL (38),sin em bar go exis ten otras car ba pe ne ma sas noMBL que pue den con fe rir re sis ten cia a los car-ba pe ne mas como por ejem plo KPC, SME yNDM-1 en tre otras, es tos me ca nis mos en zi má-ti cos de re sis ten cia pue den ser de tec ta dos porel HM pero no por el res to de los mé to dos, loque ex pli ca ría la po si ble di fe ren cia exis ten teen tre los mé to dos uti li za dos. Sin em bar go, esim por tan te des ta car que la fre cuen cia de car-ba pe ne ma sas di fe ren tes a MBL en ais la dos dePseu do mo nas es baja, por lo que no se ve com-pro me ti da la es pe ci fi ci dad del mé to do.

Al ana li zar los re sul ta dos de la com bi na-ción de mé to dos fe no tí pi cos bus can do ele varla sen si bi li dad y es pe ci fi ci dad, se ob ser va quela com bi na ción de los mé to dos DD+DC;DD+ET; DC+ET ob tu vo una sen si bi li dad del96,15% y una es pe ci fi ci dad del 94,74%, mien-tras que las com bi na cio nes DD- HM;DC+HM; ET+HM; DD+DC+ET; DD+DC+HM; DC+ET+HM; DD+DC+ ET+HM tie nenuna sen si bi li dad del 98,08% y una es pe ci fi ci-dad del 94,74% (Ta bla 3).

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Mé to dos fe no tí pi cos para la de tec ción de me ta lo be ta lac ta ma sas en ais la dos clí nicos de P. ae ru gi no sa 123

Di fe ren tes au to res re co mien dan el DD yel HM para la de tec ción de MBL en ais la dosde Pseu do mo nas spp. (20, 36, 37, 39), estees tu dio de mues tra que es tos mé to dos sonuna bue na re co men da ción para la bo ra to riosde ru ti na don de los mé to dos mo le cu la res noes tán dis po ni bles (39, 40). La uti li za ción deam bos mé to dos per mi te de tec tar de ma ne raade cua da la pro duc ción de MBL en ais la dosde Pseu do mo nas spp., in clu so per mi te la de-tec ción de car ba pe ne ma sas no MBL en es tasce pas, lo que re sul ta útil en el la bo ra to riopara di ri gir de ma ne ra óp ti ma la te ra péu ti caapli ca da a los pa cien tes, así como, la ac ti va-ción rá pi da de los pro gra mas de con trol dein fec cio nes no so co mia les, para de esta ma-ne ra evi tar la di se mi na ción de la re sis ten cia.

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