Estudo do metabolismo peroxissomal no fungo Moniliophthora perniciosa e seu

possível papel na vassoura-de-bruxa do cacaueiro.

Aluno: Bruno Vaz de OliveiraOrientador: Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães PereiraCo-orientadora: Dra. Johana Rincones Pérez

• Introdução– Produção de oxalato pelo Fungo Moniliophthora

perniciosa – Degradação da pectina da parede vegetal– Metabolismo de metanol em fungos– Relação entre os metabolismos de pectina e metanol

• Objetivos

• Resultados

• Próximas etapas

Sumário

Introdução

Produção de oxalato pelo Fungo Moniliophthora perniciosa

Do Rio et al (2008)

Introdução

• Cristais secretados são realmente compostos por oxalato de cálcio

Do Rio et al (2008)

Introdução

• Oxaloacetato acetilhyrolase (Mp_oah) no genoma e expresso no micélio biotrophic-like

Do Rio et al (2008)

Introdução

• OAH: enzima relacionada à produção de oxalato em vários fungos

• Han et al (2007)

– Disrrupção do gene oah em Botryotinia fuckeliana: não produz oxalato

– Complementação de linhagem mutante de A. niger oah- com o gene de B. fuckeliana: restauração do fenótipo

Introdução

Introdução

Degradação da pectina da parede vegetal

Metabolismo de metanol em fungos

• Metabolismo peroxissomal

• Enzimas envolvidas: álcool oxidase e catalase

Introdução

• Organismos metilotróficos: Hansenula, Pichia e Candida

• Cladosporium fulvum: AO é um fator de patogenicidade

Segers et al (2001)

Introdução

• Em M. perniciosa– Crescimento do micélio necrotrófico em metanol como

única fonte de carbono

– Identificação de uma AO putativa– Identificação de duas CAT putativas– Metabolismo peroxissomal ???

Introdução

Relação entre pectina e metanol

• Nagawaka et al (2005)

– Pichia methanolica: MOD1 e MOD2

– Crescimento em pectina e ácido poligalacturônico

Nagawaka et al (2005)

Introdução

• P. methanolica é capaz de utilizar o metanol proveniente das pectinas através do metabolismo peroxissomal.

• Resultados semelhantes para Candida biodinni

Nagawaka et al (2005)

Introdução

• Plantas produzem metanol em seu metabolismo.

• Obendorf et al (1990): os radicais metil das pectinas são a principal fonte de metanol em sementes de soja.

• O processo de remoção dos radicais metil ocorre durante o crescimento e senescência de células vegetais.

• Gaffe et al (1994): processo pode ser aumentado devido à ação da enzima pectina metilesterase de organismos patogênicos

Introdução

Foto: M. C. S. do RIO

• Em M. perniciosa– Crescimento em pectina cítrica

– Identificação no genoma pectinases (poligalacturonidases, pectato liases e pectina metilesterase)

Introdução

• Evidências

– Secreção de oxalato

– Crescimento do micélio em meio contento metanol ou pectina como fontes únicas de carbono

– Evidências de degradação da parede vegetal na presença de hifas do fungo

– Identificação de uma AO putativa

– Identificação de duas CAT putativas

– Identificação de uma PME putativa

Introdução

Pectina-Ca+2 Pectina Poligalacturonato + metanol

Parede celular vegetal

Oxalato

(OAH)

PME

Peroxissomo

Ca+2

Ca+2

Metanol AOH2O2

CATH2O + O2

Formaldeído+

H2O2H2O + O2

CAT

Hifa de M. perniciosaHipótese

• Os objetivos do presente projeto são:– a caracterização das enzimas álcool oxidase e catalase,

provavelmente relacionadas ao metabolismo de metanol, as quais podem caracterizar um metabolismo peroxissomal no fungo M. perniciosa, durante sua interação com Theobroma cacao no desenvolvimento da Vassoura-de-bruxa.

– a caracterização de outras possíveis catalases, que poderiam ser importantes na degradação de peróxido de hidrogênio liberado pela planta na tentativa de conter a infecção pelo fungo.

– analisar se de fato a produção de oxalato pelo fungo está relacionada à degradação das cadeias pécticas das células vegetais e à liberação de metanol.

Objetivos

• Objetivos específicos

– Finalizar o sequenciamento dos genes que codificam AO e CAT e analisar suas seqüências

– Imunolocalização das enzimas AO e CAT, através da técnica de immunogold.

– Estudo da expressão, in vitro e in planta

– Detecção das atividades AO e CAT in situ.

– Detecção das atividades AO em meio de cultura.

– Expressão heteróloga do gene que codifica AO e caracterização da proteína expressa

Objetivos

Sequenciamento

Ressequenciamento dos clones

Clusterização

Desenho de primers para finalizar o sequenciamento

Resultados

Resultados

Resultados

• Seqüências do 454

– AO completa

– Catalases A e B Completas

– Mais 3 catalases no genoma• C: completamente seqüenciada• D e E: parcialmente seqüenciadas

Resultados

• Álcool oxidase (Mp-ao)– Codifica para uma proteína predita de 631 aa

– Ausência da seqüência sinalizadora PST1 (peroxisome targeting signal) na porção c-terminal: S/A-K/R-L//F

– Ausência da seqüência sinalizadora PST2 na porção N-terminal

M.perniciosa PHAPVPHAPVPTGKPATQQLR- 631G.trabeum PHAPVPHAPVPTGRPATQQPKH 651C.cinerea PHAPVPHAPIPTGKPTTQLVR- 610P.angusta LDMTIPNFRLGT-YEETGLARF 664P.pastoris LDMTVPQFKLGT-YEKTGLARF 663C.fulvum LDMRVPDYQAN--REITGLARL 665

Resultados

• Daniel, Volc et al., 2007

– AO do fungo Gleophylum trabeum

– Secretada para o meio extracelular

Daniel, Volc et al., 2007 Segers et al (2001)

Resultados

M.perniciosa PHAPVPHAPVPTGKPATQQLR- 631G.trabeum PHAPVPHAPVPTGRPATQQPKH 651C.cinerea PHAPVPHAPIPTGKPTTQLVR- 610P.angusta LDMTIPNFRLGT-YEETGLARF 664P.pastoris LDMTVPQFKLGT-YEKTGLARF 663C.fulvum LDMRVPDYQAN--REITGLARL 665

Daniel, Volc et al., 2007

AO de M. perniciosa: secretada???

Resultados

• Catalases– 5 seqüências possivelmente codantes

para catalase– 3 totalmente seqüenciadas: Mp_catA,

Mp_catB e Mp_catC– 2 parcialmente seqüenciadas: Mp_catD e

Mp_catE– Comparação com seqüência se outros

organismos: inferir sobre suas possíveis funções biológicas

Resultados

• Mp_catA– Proteína predita de 731 aa– Domínio GATase1_catalase (cd03132)– Alta similaridade com “spore specific catalases”:

Aspergillus nidulans (CAT A), Neurospora crassa (CAT 1), Cryptococcus neoformans (CAT 2)

• Mp_catB– Proteína predita de 718 aa– Domínio GATase1_catalase (cd03132)– Alta similaridade com catalases envolvidas na

degradação de peróxido exógeno: Aspergillus nidulans (CATB), Neurospora crassa (CAT 2)

– Possivelmente secretada: peptídeo sinal na porção N-terminal

Resultados

• Mp_catC– Proteína predita de 511 aminoácidos– Não possui domínio ligado à oligomerização– Seqüência PST1

– Alta similaridade com catalases peroxissomais de Sclerotinia sclerotiorum e Aspergillus nidulans (CAT C): geralmente envolvidas na degradação de peróxido endógeno

A.capsulatus TEALVAS-----QAQSQSRL----------- 503E.nidulans GKRIEKATEKKAT--------EARARL----------- 501S.Sclerotiorum GSKIEEATEKLAPAPNSKAAGAAQSRL----------- 509M.Perniciosa SDRIAKAVGHSQVKPLQFKPAPEAVRFKANCGAFSKL 511

Resultados

• Mp_CatD e Mp_CatE: parcialmente seqüenciadas• Alta similaridade com Mp_CatB

• Finalização do seu sequenciamento• Parálogos??

Mp_catD PGHVVPGIDFSDDPLLQGRLFSYVDTQLNRNMGSPNFEQIPINRPRNGPPHNNNRDGAGQ 260Mp_catE PGHVVPGIDFSDDPLLQGRLFSYVDTQLNRNMGSPNFEQIPINRPRN-SVHNNNRDGAGQ 241Mp_CatB PGHVVPGIDFSDDTLLQGRLLSYVDTQLNRNMGSPNFEQIPINRPHV-PVHNNHRGGAGQ 415 *************.******:************************: . ***:*.****Mp_catD QFIFSNINPYTFNTLNNGFPKPANQTVGNGFFTAPARRIVDARYVREISPTFLDFYSQPR 320Mp_catE QFIHSNTNPYTFNTLNNGYPKPANQTTGNGFFSAPARRIVDAQYVREVSPTFIDYWSQPR 301Mp_CatB QFIHSNIYPYTPNTLNNGSPQPANQTVGNGFFTAPARRITDARYVRELSPTFSDHWSQPR 475 ***.** *** ****** *:*****.*****:******.**:****:**** *.:****Mp_catD LFYNSILPAERQMVINALRFELSHVQSSSVKANFINQINKVDNDLAVRVASAIGVKRPAP 380Mp_catE LFYNSILPEERQMVINALRFELSHVQSSAVKANFINQINKIDNDFAVRVALAINVEAPSP 361Mp_CatB LFWNSILPDEQQMIVNAFRFELARIQSAHVKSNFIAQLNRIDNGLARRVASAVNVQAPEP 535 **:***** *:**::**:****:::**: **:*** *:*::**.:* *** *:.*: * *

Resultados

RT-PCR semi quantitativo

Cultivo do micélio necrotrófico por 7 dias em MYEA

Indução por 24 horas com Metanol, P0 e P90

Extração de RNA e Síntese de cDNA

Amplificações : Mp-pme, Mp-ao, mp-catA e mp-catB

Resultados

Resultados

Resultados

• A partir dos Rt-PCR– PME: controle e P90– AO: controle, metanol e P90– Cat A: controle, metanol e P90– Cat B: nenhuma condição

• Resultado preliminar

• Ensaios futuros– Real Time PCR– Outras condições: ácido oxalacético, P0, P90, metanol,

peróxido de hidrogênio, extrato de cacau, aminotriazole– Micélio biotrophic-like

Resultados

Obtenção de cortes ultrafinos

Cultivo do micélio necrotrófico por 7 dias em MYEA

Paraformaldeído 3% em tampão fosfato pH 7 por 48 horas.

Desidratado em um gradiente crescente de etanol (70 a 100%)

Rresina Lowcryl K4M por 2 dias, polimerização por 5 dias

Trimagem e cortes ultrafinos

Contraste com citrato de chumbo e acetato de uranila

MET

Resultados

Resultados

• Detecção da atividade AO– Meio de cultura e extrato protéico

Provável atividade AO extracelular

Resultados

• Teste de manutenção da fase biotrófica– 50mL/L de glicerol– 2,5 g/L de K2HPO4 – 1 mL/L de trace minerals, – 5 mg/L de cafeína – 10 mg/L de auxina– NaNO3

• Manutenção por aproximadamente 3 meses

Resultados

• Após 6 meses em cultura

Resultados

Resultados

Clamidiospóros: estruturas relacionadas à resistência a estresse

Resultados

• Finalização do sequenciamento dos genes Mp_CatD e Mp_CatE

• Análise filogenética das catalases de M. perniciosa• Imunolocalização das enzimas álcool oxidase e catalase.• Estudo da expressão, in vitro, dos genes OAH, PME, AO e

CAT• .Estudo da expressão, in planta, dos genes OAH, PME, AO e

CAT• Detecção das atividades AO e CAT in situ.• Expressão heteróloga do gene que codifica AO e

caracterização da proteína expressa• Purificação (ou expressão heteróloga) das catalases e sua

caracterização

Próximas etapas