저 시-비 리- 경 지 2.0 한민

는 아래 조건 르는 경 에 한하여 게

l 저 물 복제, 포, 전송, 전시, 공연 송할 수 습니다.

다 과 같 조건 라야 합니다:

l 하는, 저 물 나 포 경 , 저 물에 적 된 허락조건 명확하게 나타내어야 합니다.

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비 리. 하는 저 물 리 목적 할 수 없습니다.

경 지. 하는 저 물 개 , 형 또는 가공할 수 없습니다.

HMGB1 처리에 한

NLRP3 플라마

연 학 학원

과학과

수

HMGB1 처리에 한

NLRP3 플라마

지도 수 신 수

문 사학 문 함

2015 12 월

연 학 학원

과학과

수

감사

사 학 무사 마 수 도 아 없 도 주시고 원해주신

많 들께 마 감사 마 합니다.

실험실에 처 들어 업할 지 항상 변함없 격 움

주시고 상 아갈 수 도 도움 주신 신 수

수님께 진심 감사 말씀 합니다. 신 에 연 에

심 갖고 언해주신 수님, 수한 수님께 감사 드립니다.

그리고 항상 많 가 주신 미생물학 실 상래, 한, ,

, 재 , 상 , 신 재, 수님께 감사 드립니다.

슬픈 함께 공 하 억 물해 실험실 식 들께

감사 드립니다. 실험에 한 언 아 없 해 주시고 항상 뜻한

마 보듬어주시 과 같 곽만 사님, 폭 지식

많 것 가 쳐 주시 사님, 편안한 실험실 생 할 수

도 쾌한 만들어주시 규 사님, 2 동안 곁에

큰 어주고 실험에 한 언 아 지 않았 스승

아람 , 언 고 습 주변사람 게 하 라 ,

실험실에 묵묵 하 신 꿈 향해 아가 훈 ,

막내 가 어 많 웃 수, 그리고 업생

빈 숙 에게 감사 마 합니다.

마지막 지 지 항상 믿어주시고 원해주시 함 없

지원해주신 아 지 훈, 어 니 연 그리고 언 내 편 어

언니 수 경하고 사랑합니다.

수 씀

차

문 약··············································································· 1

Ⅰ. ················································································ 3

Ⅱ. 재료 ·································································7

1. 재료 ····································································7

2. 포 양 플라마 도 ···········································7

3. 마우스 BMDM 포 생 ···············································8

4. Western blot analysis·····················································9

5. Enzyme linked Immunsorbent assay (ELISA) ························9

6. Immunoprecipitation ··························································11

7. ROS ····························································11

8. 마우스 에 플라마 도 tolerance ··········12

9. siRNA transfection ···············································12

10. 통계 ····································································12

Ⅲ. 결과 ····································································13

1. HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance 과 ···············13

2. HMGB1 처리에 한 NLRP3 특 플라마 tolerance

과 ················································································15

3. HMGB1 처리에 한 플라마 ···········20

4. LTbR HMGB1 결합 ···········································24

5. LTbR HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance

과 ····································································26

6. TRIM30a에 한 ROS 과·········································29

7. 마우스 에 HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance

과···································································31

Ⅳ. 고찰···············································································34

Ⅴ. 결 ···············································································40

참고문헌··············································································41

Abstract ···············································································48

그림차

그림 1. 마우스 식 포에 HMGB1 처리 후 LPS ATP

극에 한 IL-1β 비 ····················15

그림 2. 마우스 BMDM 포에 HMGB1 처리 후 LPS

nigericin, alum, poly(dA:dT) 극에 한 IL-1β

비 ·········································17

그림 3. HMGB1 처리 후 플라마

····················································22

그림 4. LTbR HMGB1 결합 ························25

그림 5. LTbR 결 마우스 BMDM에 HMGB1 처리에

한 플라마 tolerance 과 ···············27

그림 6. TRIM30a에 한 ROS 과 ·············30

그림 7. 마우스 에 HMGB1 처리에 한 플라

마 tolerance 과 ··························32

그림 8. HMGB1 처리에 한 LTbR LPS

tolerance 과 ··············································33

약

AIM2 absent in melanoma 2

ASC apoptosis-associated speck-like protein containing a carboxy-

terminal CARD

ATP adenosine triphosphate

BMDM bone marrow derived macrophage

CARD caspase activation and recruitment domain

DAMP danger-associated molecular patterns

HMGB1 high mobility group box 1 protein

IL Interleukin

LPS lipopolysaccharide

LTa1b2 lymphotoxin a1b2

LTbR lymphotoxin b receptor

NLRP3 NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3

LRR leucine-rich repeat

PAMPs pathogen-associated molecular patterns

PRR pattern-recognition receptor

Poly(dA:dT) poly(deoxyadenylic-deoxythymidylic)

Poly(I:C) polyriboinosinic:polyribocytidylic acid

PYD pyrin domain

RAGE receptor for advanced glycation end product

ROS reactive oxygen species

TLR toll-like receptor

TNF-α tumor necrosis factor-α

TRIM30α tripartite-motif protein 30

1

문 약

HMGB1 처리에 한

NLRP3 플라마

플라마 천 역 병원 물질 또 상

포 식하여 역 도하고 숙주 생

가시킨다. 하지만, 러한 역 지 않

가 역질 또 역질 수 문에

플라마 신 달 엄격하게 어야 한다. 그러

아직 지 플라마 에 해 많 진 가 없다.

HMGB1 핵 내에 재하 핵단 DNA 지

사 에 여한다. LPS 같 스트 스 또 endo-

toxemia sepsis 에 식 포 비

HMGB1 후 매개체 TLR9 ligand CpG‐ODN, TLR4

ligand LPS 복합체 하여 염 사 생

진시켜 염 악 시키 것 알 다. 그러 근

HMGB1 처리에 해 ischemia-reperfusion injury 감 시켜

LPS tolerance 킬 수 다 들 보고 었다. 하지만,

HMGB1 처리에 한 immune tolerance 과 TLR 에 한 NF-

κB 신 에만 한 어 inflammasome tolerance 에 해

연 가 많 진행 어 지 않다. 본 연 에 재 합 HMGB1

단 질 마우스 식 포에 처리 하 플라마

tolerance 가 도 것 찰하 다. 재 합 HMGB1

처리한 후 플라마 시켰 NLRP3 플라마

2

특 IL-1β IL-18 비가 감 하 HMGB1 처리 시

플라마 TRIM30α 가 는 것

하 다. TRIM30α 도하는 lymphotoxin β receptor (LTβR)

HMGB1 결합 역침강 과 ELISA 하 LTβR

agonistic antibody 처리 통해 플라마 tolerance 과가

하 다. 하고 LTβR 결 마우스

BMDM 포에 HMGB1 처리 시 플라마 tolerance 가

감 하여 HMGB1 처리에 한 플라마

tolerance 는 LTβR 하 다. 또한

HMGB1 처리 하 TRIM30α ROS level

감 함 하 마우스 에 도 HMGB1 처리에

한 플라마 tolerance 가 도 찰하 다.

본 연 통하여 처리 HMGB1 LTβR 결합하여

TRIM30α 도함 NLRP3 플라마

억 시킬 수 새 게 시하는 다.

핵심 말: HMGB1, NLRP3, inflammasome, Tolerance, Lymphotoxin b

receptor, TRIM30a

3

HMGB1 처리에 한

NLRP3 플라마

<지도 수 신 수>

연 학 학원 과학과

수

Ⅰ.

역체계 병원체 숙주 보 하 역할 수행하 척

동물 경우 천 역과 역 갖 다.1 역 포 포 에

pathogen-associated molecular pattern (PAMP) 식하 pattern recognition

receptor (PRR) 갖고 미생물 갖 공통 핵산, 포

벽, 비물 등 식할 뿐만 아니라 상 가 포 비

uric acid, adenosine triphosphate (ATP), heat shock protein70 (HSP70)과 같

damage-associated molecular pattern (DAMP) 식하여 역 도한

다.2,3 천 역에 여하 PRR 에 라 크게 가지 다.

첫 째 Toll-like receptors (TLRs) 같 포막 (transmembrane) 또

4

endosome에 재하 PRR 에 하 , 째 RIG-I-like receptor

(RLR), AIM2-like receptor (ALR), nucleotide-binding domain and leucine-rich

repeat-containing (NLR) 단 질과 같 포질에 재하 수 체가 에

한다. 에 NLR과 ALR 플라마 (inflammasome) 복합체

하 별 어체계 갖 다.2-4 플라마 러스, 균감염,

포 상, 사 균 등과 같 건에 천 역에 여하

한 할 뿐만 아니라 역 에도 여한다.

플라마 식 수 체 apoptosis-associated speck-like protein containing a

carboxy-terminal CARD (ASC), caspase-1 함께 합체 루어 염

사 interleukin (IL)-1β, IL-18 시켜 포 비

하거 pyroptosis 도하여 포 사 에도 여한다.5,6 NLRP3 플라마

상 동하지 않 가 역질 , 2 당뇨, 동맥경

등 다양한 질병 하 문에 엄격 어야 한다.7

High mobility group box 1 (HMGB1) 포핵 내에 매우 하게 재하

는 단 질 포핵뿐만 아니라 포안과 에 다양한 생물학 에

여한다.8 HMGB1 215개 아미 산 루어 DNA

minor groove에 결합하는 티프 A box (aa 28-44) B box (aa 179-185)

가지 말단에는 루탐산과 아스 트산 acidic tail

루어 다.9-12 HMGB1 주 핵 내에 치하여 DNA 스 단

질에 결합하여 뉴클 안 시키고 DNA 사

5

한다.13 단핵 또는 식 포 핵 내에 치하는 HMGB1 균 감염,

포 상, lipopolysaccharide (LPS)에 해 아 틸 , 산 , 당 같

사 후 역과 거쳐 포질과 포 능동 동 거나

상 포에 수동 비 어 험신 염

에 여한다.14-18 포 비 HMGB1 DAMP 하여 단

독 천 역 시킬 뿐만 아니라 tumor necrosis factor-α (TNF-α)

같 염 사 카 또는 상 포 비 단 질과

복합체 루어 역 킨다.13 포 에 재하는 HMGB1

TLR2, TLR4, TLR9, receptor for advanced glycation endproducts (RAGE)

결합한다고 알 , DNA 결합 룬 HMGB1 경우 RAGE

결합하여 가포식 매개하여 포독 물질에 한 항 갖는

다.14,19-22 그러나 지 지 보고 HMGB1 염 능과는

HMGB1 처리 하 는 LPS에 한 ischemia-reperfusion injury 감

시켜 LPS tolerance 킬 수 다는 연 가 근에 보고 고 다.23-

26 하지만 재 지 HMGB1 처리에 해 나타나는 immune tolerance

과는 NF-κB 신 달 체계에만 한 어 그 과가 연 었 플라

마 과 계는 아직 지 보고 가 없다.

Tripartite-motif (TRIM) RING domain, B-box, coiled-coil (RBCC)

공통 갖 단 질 러한 다양한 생물 에 보 어

다.27 재 지 진 TRIM 단 질 포 열, ,

6

포사 , 양 , 항 러스 등 천 역에 매우

한 한다.27-29 TRIM family 하 TRIM30α 마우스에

재하 TLR 또 lymphotoxin β receptor (LTβR)에 해 도 어 NF-κB

신 에 여하 TAB2/3 해하여 억 할 뿐만 아니라

NLRP3 플라마 reactive oxygen species (ROS) 생 감 시켜

염 질 시킨다.28,30 그러 마우스 TRIM30α 가 가 운 상

동 계 갖 사람 TRIM5 천 역 시키 가지고

어 역할 수행한다.31,32

LTβR 림프 , NK 포, B 포 비 TNF subfamily

LTα1β2, LIGHT 리간드 식하여 , 상피 포, 질 포, 그

리고 골수 포 다.33,34 에 LTβR 2차 림프 달

과 지, 수지상 포 통한 역 항상 에 주 연 어

다.35-38 그러 근 보고에 TLR4 TLR9 극 후 LTβR

염 사 생 억 시키고, 마우스 에 dextran

sodium sulfate (DSS) 매개 한 염 생 시 TRIM30α 통해 염

할 수 것 라 가 시하 다.39,40

라 본 연 에 HMGB1 처리에 해 플라마 tolerance가

도 것 하고, HMGB1 처리에 해 도 플라마

tolerance에 TRIM30α가 미 향 하고 한다. 아가 플라

마 tolerance에 TRIM30α가 하 에 해 연 하고 하 다.

7

Ⅱ. 재료

1. 재료

재 합 사람 LTbR-Fc 단 질 mGM-CSF (R&D system, Mineapolis, MN),

poly(I:C), LPS (L5293), ATP, nigericin (Sigma Aldrich, St Louis, MO), Inject Alum

poly(dA:dT) (Inviviogen, San Diego, CA) 매하여 사 하 , 항체

anti-HMGB1 (ab18256), anti-TRIM30a (Abcam, Cambidge, UK), anti-A20

(Cell Signaling, Cambrodge, MA), anti-IL-1β (R&D system), anti-caspase-1

(Adipogen, San Diego, CA), anti-peroxiredoxin (Prx) I (Abfrontier, Seoul, Korea),

anti-LC3 (Novus, San Diego, CA) 사 하 다. 마우스 TNF-a ELISA

Ready-SET-Go (e-Bioscience, Sandiego, CA), 마우스 IL-1β ELISA (R&D

system), 마우스 IL-18 ELISA (e-Bioscience, Atlanta, GA) 사 하여 마우스

TNF-a, IL-1β, IL-18 양 하 다.

2. 포 양 플라마 도

마우스 식 포 J774 포주 마우스 골수 래 식 포(bone

marrow-derived macrophage, BMDM) 하 다. J774 포주 포 양액

2 mM L-glutamine과 10% 우태아 청 (fetal bovine serum, FBS)(Gibco,

Rockville, MD) 포함 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640

하여 5% CO2, 37°C 건에 양하 다.

플라마 시키 해 마우스 BMDM 포 J774 포주에

8

HMGB1 20 μg/ml 처리하여 24시간 동안 5% CO2, 37°C 건에 양

후 LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 2.5 mM 30 간 시켰다. 플라마

건에 라 각각 nigericin 10 μM 30 , alum 250 μg/ml 6시간 처리하고

poly(dA:dT) 1 μg/ml transfection 한 후 6시간 동안 양하 다.

3. 마우스 BMDM 포 생

C57BL/6 마우스 BMDM 포 하여 HMGB1 처리에 한

플라마 과 하 다. 마우스 다리 뼈 강 뼈

리한 후 골수 포 RPMI1640 지 한 26G 주사 하

다. 다 상 지 통과시킨 후 cell strainer 하여 단 포

리하 다. 해 액 ammonium-chloride-potassium

(Sigma Aldrich) 1 ml 상 에 5 간 시킨 후 FBS free RPMI 1640

3 척 하 다. 마우스 골수 래 식 포 10% FBS가 포

함 RPMI1640 지에 20 ng/ml mGM-CSF 첨가한 후 5% CO2, 37°C

건에 7~10 동안 시킨 하 다.

LTbR, TLR4, RAGE HMGB1에 한 수 체 한다. 라

HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance에 어 한 수 체가 여하

지 알아보 해 각각 LTbR, TLR4, RAGE 결 마우스 BMDM

얻어 시킨 후 실험에 하 다. LTbR, TLR4, RAGE 결 마우스

각각 학 강 식 수님, 연 학 신 재 수님, 연 학

9

하 수님 연 실 공 아 사 하 다.

4. Western blot analysis

HMGB1 처리에 한 플라마 과 단 질 수 에

하 다. J774 포주 마우스 BMDM 포에 insect 포 리

HMGB1 20 μg/ml 24시간 동안 처리 후 LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 2.5

mM 30 처리하여 극한 후 상 액 얻고 다시 whole cell lysate (WCL)

리하여 SDS-PAGE 실시하 다. WCL 1% protease inhibitor가 첨가

RIPA buffer lysis하여 15,000xg 원심 리 한 후 상 액 BCA assay

량 후 하 고, 상 액 경우 원심 리하여 cell debris 거 후

methanol-chloroform 하여 하 다. 플라마 건에 HMGB1

처리에 한 과 하 해 nitrocellulose membrane

(Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) 후 caspase-1, IL-1β 도

하 다.

HMGB1에 한 TRIM30α 수 찰하 해 마우스 BMDM

포 또 J774 포주에 재 합 HMGB1 20 μg/ml 단독 처리하여 cell

lysate SDS-PAGE 진행하 다. Nitrocellulose membrane 후

TRIM30α 항체 검 하 다.

5. Enzyme linked Immunsorbent assay (ELISA)

10

HMGB1 처리에 한 플라마 과 찰하고 염 사

IL-1β TNF-α 도 ELISA 통해 하 다. J774

포주 마우스 BMDM 포에 HMGB1 20 μg/ml 처리 후 LPS 500 ng/ml 4

시간, ATP 2.5 mM 30 처리하여 극한 후 상 액 리하여 하 다.

Anti-IL-1β capture antibody 60x PBS 1x가 도 한 후 새도

ELISA plate (Corning Costa, Tewksbury MA)에 immobilization 시키고 0.05%

Tween-20가 포함 PBST 척하 다. 1% BSA가 포함 PBS

고 1시간 시켜 blocking 하 다. 포 양한 상 액 1:10

도 1% BSA-PBS 하여 2시간 시켰다. 결합하지 않 단 질

0.05% PBST 차 척한 anti-IL-1β detection antibody 2시간

후 streptavidin-HRP 20 시켰다. 결합 루어지지 않 것

0.05% PBST 척하여 거한 후에 TMB 질 (KPL, Gaithersbury, MD)과

시켜 색 도 450 nm 에 spectrophotometer OD 값 통하

여 하 다.

TNF-α ELISA 경우 10% FBS가 포함 PBS (10% FBS-PBS) 1시간 동

안 blocking한 후 상 액 1:10 하여 2시간 시켰다. 결합하

지 않 단 질 0.05% PBST 차 척한 anti-TNF-α detection

antibody 1시간 후 streptavidin-HRP 40 시켰다. 결합

루어지지 않 것 0.05% PBST 척하여 거한 후에 TMB 액과

시켜 색 도 OD 값 통하여 하 다.

11

HMGB1과 LTβR 상 하 해 HMGB1 2 μg/ml

coating buffer에 하여 ELISA plate에 immobilization시켰다. 10% FBS-PBS

1시간 동안 blocking한 후 재 합 단 질 LTβR-Fc 5 μg/ml 도

serial dilution하여 2시간 시켰다. 0.05% PBST 차 척 한 3

μg/ml anti-human IgG HRP 시켰다. 결합 루어지지 않 것

0.05% PBST 척하여 거한 후에 TMB 액과 시켜 색 도

하 다.

6. Immunoprecipitation

Protein G beads(Invitrogen, Carlsbad, CA) LTβR-Fc 단 질 100 ng 고

37°C에 2시간 시켰다. Protein G beads-LTβR-Fc에 HMGB1 100 ng

고 4°C에 새도 시킨 후 결합한 단 질 하 해

anti-HMGB1 anti- LTβR 항체 사 하여 Western blot 통해 하 다.

7. ROS

J774 포주에 HMGB1 20 μg/ml 처리 후 LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 2.5

mM 30 처리하여 극한 후 포 양액 거하고 PBS 3 척하

다. PBS에 ROS detection reagent H2DCFDA (Invitrogen, Waltham, MA)

10 μM 한 후 5% CO2, 37°C 건에 포 15 간 시켰다.

PBS 3 척 후 마지막에 200 μl PBS 어 flow cytometry (BD

12

FACSVerse) 하여 하 다.

8. 마우스 에 플라마 도 tolerance

7-8주 C57BL/6 마우스에 HMGB1 1 mg/kg 24시간 간격 복강내

1 또 2 주 하고 24시간 후에 LPS 10 mg/kg 주 하 다. 2시간 후

에 alum 25 mg/kg 복강 내 여하 다. Alum 여 4시간 후 마우스

액 채취하여 4°C에 2,000xg 10 간 원심 리 후 청 리하

다. cytokine ELISA 하여 하 고, 청 1:20

하여 사 하 다.

9. siRNA transfection

J774 포주 40-50% confluence가 도 6 well plate에 24시간 도

양하 다. TRIM30α siRNA duplex 50 nM 12μl INTERFERin

transfection reagent 400μl OPTI-MEM에 어 진탕하고 상 에

15 간 시킨 후 포에 48~72시간 동안 transfection하 다. 양액

새 운 10% FBS-RPMI1640 지 한 후 실험에 사 하 다.

10. 통계

실험 상 복 수행하 , 평균 값 그래프 하 다.

Error bar SD 하 다. P-value 값 one-way ANOVA 한 후

13

Bonferroni 보 하여 하 다.

14

Ⅲ. 결과

1. HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance 과

HMGB1 처리에 플라마 tolerance 과 찰하 해

해 J774 포주 마우스 BMDM 포에 HMGB1 처리 한 후 LPS

ATP 처리함 비 IL-1β TNF-α 도 ELISA 하

여 하 다. J774 포주에 HMGB1 20 μg/ml 24시간 동안 처리한

후 LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 2.5 mM 30 처리하 다. 후 포 양액

얻어 TNF-α IL-1β ELISA 하 다. 그 결과, J774 포주에

HMGB1 처리에 해 IL-1β TNF-α 비가 감 함 하 다 (그

림 1A). 플라마 tolerance 과가 마우스 BMDM 포에 도 동 하게

찰 지 하 해 HMGB1 처리하 시간과 도 다 게

한 후 LPS 4시간, ATP 30 처리하여 비 는 IL-1β 도 측 하

다. 그 결과 HMGB1 처리 시간과 도가 가할수 비 는 IL-1β

양 감 하는 것 찰하 다 (그림 1B).

15

그림 1. 마우스 식 포에 HMGB1 처리 후 LPS ATP 극에 한

IL-1β 비 . (A) J774 포주에 HMGB1 10 mg/ml 24시간 처리하고

LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 30 처리 한 후 포 양액 얻어 IL-1β,

TNF-a 생 양 ELISA 함 (B) 마우스 BMDM 포에

HMGB1 10 mg/ml 8, 16, 24시간 처리하거 , HMGB1 0.1, 1, 10, 20 mg/ml

24시간 처리하고 LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 30 처리 한 후 포 양

액 얻어 IL-1β 생 양 ELISA 함 (*P<0.001, **P<0.0001).

16

2. HMGB1 처리에 한 NLRP3 특 플라마 tolerance 과

플라마 여러 가지 극 들에 해 다. LPS 에 한

TLR 하 신 달 후 ATP, nigericin, alum 처리하 NLRP3

플라마 고, poly(dA:dT) 처리하 AIM2 플라마

다. HMGB1 처리에 해 도 플라마 tolerance

과가 다양한 플라마 에 도 지 하 해 마우스

BMDM 포에 LPS 처리 후 각각 ATP, nigericin, alum, poly(dA:dT)

처리하여 하 다. 그 결과, NLRP3 플라마 특 tolerance

과가 ELISA Western blot 하 다. HMGB1 처리 후

LPS ATP, nigericin 또 alum 처리하여 NLRP3 플라마

시켰 IL-1β 비 도가 감 함 하 다 (그림 2A-C). 그러

LPS 처리 후 poly(dA:dT) transfection 한 AIM2 플라마 에

HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance 과가 없 찰하 다

(그림 2D). 또한 Western blot 통해 하 LPS ATP, nigericin,

alum 에 한 NLRP3 플라마 에 IL-1β 비가 감 어

찰하 다 (그림 2A-C). HMGB1 처리에 pro-IL-1β, pro-caspase-1,

NLRP3, ASC 량 변 Western blot 통해 한 결과 차 가

없 찰하 다(그림 2E). 라 , HMGB1 플라마

생 사 IL-1β 비량 감 시킴 tolerance

도하 것 하 다.

17

18

19

그림 2. 마우스 BMDM 포에 HMGB1 처리 후 LPS nigericin,

alum, poly(dA:dT) 극에 한 IL-1β 비 . C57BL/6 마우스 BMDM

포에 HMGB1 20 mg/ml 24시간 처리 한 후, LPS 500 ng/ml 4시간,

(A) ATP 30 , (B) nigericin 30 (C) alum 6시간 (D) poly(dA:dT) transfection 6

시간 처리 후 포 양액 수합해 IL-1β, IL-18 생 양 ELISA 과

western blot 함. One-way ANOVA 한 후, Bonferroni 보 함

(*P<0.001, **P<0.0001). (E) 마우스 BMDM 포 수합해 해한 후 포

해물 Western blot 하여 pro-IL-1β, pro-caspase-1, NLRP3, ASC,

GAPDH 함.

20

3. HMGB1 처리에 한 플라마

플라마 경 여러가지 에 해

T RIM30, A20, nitric oxide, type I IFN, 가포식에 해

다.7,41-44 라 HMGB1 처리에 해 들

가하 지 Western blot 과 ELISA 통해 하 다. J774 포주

마우스 BMDM 포 하여 HMGB1 20 μg/ml 8 시간, 24 시간 처리

후 포 수합해 해한 후 포 해물 Western blot 하 다.

그 결과, 플라마 TRIM30α 8 시간,

24 시간에 도 하 A20, iNOS 도 지 않 것

찰 었다 (그림 3A). Prx I 과 Prx II Prx family 주 포질 내에

재하고 Prx III 과 Prx V 미 콘드리아에 재하여 각각 에

ROS 거하 갖 다. ROS 플라마 에 주

하 문에 본 실험에 HMGB1 처리에 해

플라마 tolerance 가 도 Prx 단 질 여하 지 하

해 마우스 BMDM 포 J774 포주에 HMGB1 처리한 후 포질

내에 재하 Prx I-III, V 량 하 다. 그 결과 HMGB1

처리 Prx I-III, V 량에 아무런 향 미 지 않 것

하 다 (그림 3B, C). 또 다 플라마 알

type I IFN 과 가포식 하 HMGB1 처리에 해

변 가 없 하 다 (그림 3D, E). 가포식 도 실험 시

21

starvation 주 해 Hank's balanced salt solution (HBSS) 처리하여 양

하 다.

22

23

그림 3. HMGB1 처리 후 플라마 . (A) 마우스

BMDM 포에 HMGB1과 LPS 500 ng/ml 각각 8, 24시간 처리 후 포

해하여 Western blot 통해 TRIM30α, A20, iNOS, GAPDH 측 함.

(B) 마우스 BMDM 포 (C) J774 포주에 HMGB1 20 μg/ml 8, 24시간

처리 후 포 해하여 Western blot 통해 PrxI-III, V, GAPDH

측 함. (D) 마우스 BMDM 포에 HMGB1과 poly(dA:dT) 1 μg/ml 처리

후 포 양액 수합하여 IFN-α ELISA 수행함. (E) J774 포에

HMGB1 20 μg/ml 8, 24시간 처리하거나 HBSS 1, 2시간 시행한 후 포

수합해 해한 후 Western blot 진행하여 LC3I/II, GAPDH 함.

24

4. LTbR HMGB1 결합

BMDM 포에 HMGB1에 해 TRIM30a 도 하

다. TRIM30a LTbR가 도 단 질 알 다.

HMGB1 처리에 해 TRIM30a가 도 LTbR가 여하 지 알아보

해 LTbR HMGB1 결합 immunoprecipitation과 ELISA

하여 하 다. 해 재 합 LTbR-Fc 단 질과 HMGB1 단 질

시킨 후 protein G bead 역 강하 다. 그 결과 HMGB1과

LTbR-Fc가 결합 함 찰할 수 었다 (그림 4A). 또한 HMGB1 단

질 2 μg/ml ELISA plate에 24시간 동안 상 에 고 시킨 후 재

합 LTbR-Fc 단 질 양 가 시켰 간 결합 도

가함 찰하 다(그림 4B). 실 LTbR가 플라마

tolerance에 여하 지 하 해 LTbR에 한 agonistic 항체 0.5

μg/ml 처리 후 LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 2.5 mM 30 처리하

비 IL-1β, TNF-a 양 감 하여 플라마 tolerance 과가

도 찰하 다 (그림 4C). 라 , 처리 HMGB1 LTβR에 결합

하여 플라마 알 진 TRIM30α 하여

NLRP3 플라마 에 한 IL-1β 비 억 시키 것 찰 다.

25

그림 4. LTbR HMGB1 결합 . (A) Protein G bead LTbR-Fc 단 질

37°C에 2시간 시키고 후 HMGB1 4°C에 24시간 시킨

후 시켜 HMGB1 항체 결합 함. 단 질 사람 Ig

함. (B) ELISA plate에 HMGB1 2 mg/ml 도 착시킨 후 LTbR 10

mg/ml 고 도 , 2 수 하여 시키고 결합 ELISA .

(C) 마우스 BMDM 포에 LTbR agonistic 항체 0.5 μg/ml 처리 후

LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 2.5 mM 30 극해 포 양액 IL-1β,

TNF-a 생 양 ELISA 함 (*P<0.001, *P<0.0001).

26

5. LTbR HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance 과

HMGB1 처리에 해 도 플라마 tolerance 과가 LTbR

지 하 해 LTbR 결 마우스 BMDM 하 다. 또한

HMGB1 수 체 알 RAGE 결 마우스 BMDM과 TLR4 결

마우스 BMDM 함께 함 플라마 tolerance 도 시 다

수 체 여 여 하 다. 야생 , LTbR, TLR4, RAGE 결

C57BL/6 마우스 골수 포 BMDM 포 하여 얻 후

HMGB1 20 μg/ml 24시간 처리 후 LPS 500 ng/ml 4시간, ATP 2.5 mM 30

처리하 다. TLR4 결 BMDM 경우 TLR3 리간드 poly(I:C) 1 μg/ml

4시간, ATP 30 처리하여 포 양액과 포 수합해 Western blot

IL-1β, caspase-1, GAPDH 찰하 다. 야생 BMDM 포에 도

플라마 tolerance가 LTbR 결 BMDM과 RAGE 결 BMDM 포에

찰 지 않았다 (그림 5 A). RAGE 경우 HMGB1과 DNA 함께

처리하 AIM2 플라마 억 시킬 수 다 연 결과가

어 RAGE 플라마 과 연 시 었 NLRP3 플

라마 과 계 아직 진 가 없다.19 TLR4가 결 BMDM 포

에 야생 과 마찬가지 플라마 tolerance가 도 었다 (그림 5B).

라 본 실험 결과 합하 HMGB1 처리에 해 도 플라

마 tolerance 과 LTbR RAGE가 여한다 것 하 다.

27

28

그림 5. LTβR 결 마우스 BMDM에 HMGB1 처리에 한 플라마

tolerance 과 . (A) C57BL/6 wt, LTβR 결 마우스, RAGE 결 마

우스 BMDM 포 리해 mGM-CSF 사 20 ng/ml 처

리해 시킨 후 HMGB1 20 μg/ml 24시간동안 처리 후 LPS 500 ng/ml

4시간, ATP 2.5 mM 30 처리하고 포 수합해 해 시킨 후 포

해물 Western blot 하여 IL-1β, caspase-1, GAPDH 함,

(B) 야생 , TLR4 결 마우스 BMDM 포에 HMGB1 처리 후 poly(I:C)

1 μg/ml 4시간, ATP 2.5 mM 30 처리 후 Western blot 하여 함.

29

6. TRIM30a 에 한 ROS 과

ROS 는 플라마 매개하는 주 극 하

TRIM30α 에 해 다.44 라 HMGB1 처리 후 변 하는 ROS

생 도 하여 플라마 tolerance 도에 여하는지

찰하 다. ROS scavenger N-acetyl-L-cysteine (NAC) 양

함께 하 다. J774 포주에 HMGB1 20 μg/ml 24 시간, 또는

NAC 1 mM 1 시간 처리한 후 LPS 500 ng/ml 4 시간, ATP 2.5 mM 3

처리하 다. 그 결과 HMGB1 처리 하 ROS 생 감 하

찰하 다. 양 NAC 처리한 포에 도 ROS 생 도가

감 함 하 다(그림 6A). 그러나 TRIM30α 가 knock down

포에 HMGB1 처리에 한 ROS 생 억 과가 감 함

찰하 다 (그림 6B). 라 HMGB1 처리에 한 ROS 과에

TRIM30α 가 여함 하 다.

30

그림 6. TRIM30a 에 한 ROS 과 . (A) J774 포주에 HMGB1

20 μg/ml 24시간, 또는 NAC 1 mM 1시간 처리한 후 LPS 500 ng/ml 4시간,

ATP 2.5 mM 30 처리하 . DCF-DA 10 μM 15 동안 처리한 후 포

수합하여 FACS 통해 하 . (B) J774 포주에 TRIM30α siRNA

transfection 72시간 후 실험에 하 . TRIM30α knock down Western

blot 하 .

31

7. 마우스 에 HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance 과

마우스 에 HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance 과가

타 지 하고 7-8 주 C57BL/6 야생 마우스에 HMGB1 1

mg/kg 24 시간 마다 복강주사 1 또 2 주 후 LPS 10

mg/kg 여하고 2 시간 후에 다시 alum 25 mg/kg 여하 다. 후

4 시간 후에 청 얻어 IL-1β 양 ELISA 통해 량하 다.

C57BL/6 야생 마우스에 PBS 만 복강 주사한 마우스 경우 76.24 ±

56.22 었고, LPS+alum 처리 시 IL-1β 양 624.24 ± 242.28 pg/ml

가하 다. 마우스에 HMGB1 1 처리 한 후 LPS+alum 처리 시

543.02 ± 24.57 플라마 감 과가 도 지 않았지만 HMGB1

2 복주사 하 는 236.11 ± 267.64 pg/ml 감 어 플라마

tolerance 가 도 었다 (그림 7A).

32

그림 7. 마우스 에 HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance

과 . C57BL/6 야생 마우스에 HMGB1 1 또 2 복강주사 후

LPS alum 복강주사하여 마우스 청 얻 . ELISA 하여

청 내 재하 IL-1β 양 량하 . One-way ANOVA 후

Bonferroni 보 함 (*P<0.0001).

33

그림 8. HMGB1 처리에 한 LTβR LPS tolerance 과.

플라마 1 차 TLR signaling 통해 NLRP3, pro-IL-1β 가

도 고, 2 차 ATP, nigericin, alum, ROS 극 가

어 . 마우스 BMDM 포에 HMGB1 처리하 LTβR 결합

루어 상 하여 TRIM30α 단 질 . TRIM30α 는 ROS

생 억 시키고 플라마 감 시켜 결과 IL-1β IL-

18 비가 감 하여 플라마 tolerance 도함.

34

Ⅳ. 고찰

플라마 병원 물질 또 상 포 비 물질

식하여 결과 사 비하거 포사 도한다.5,6,45-

47 플라마 해 TLR signaling 1차 극과 ATP,

nigericin, alum, poly(dA:dT) 같 것들에 해 2차 극 루어 야

루어진다. 플라마 천 역과 역 매개하

여 역 도하고 숙주 생 가시킨다.48-50 하지만, 러한

역 지 않 가 역질 또 역질

문에 플라마 신 달 엄격하게 어야 한다.5 라

근에 플라마 할 수 가 무엇 지에

한 연 가 진행 에 다.51 핵단 질 HMGB1 DAMP

한다고 알 근에 LPS에 한 TLR매개 염 하

여 NK-κB 신 비 TNF-α 양 감 시킬 뿐만 아니라

ischemia/reperfusion에 한 포 상 시킨다 연 가 보고 어

역 tolerance 도할 수 다 새 운 가 시 었다.24-26,52

본 실험에 HMGB1 처리에 해 도 플라마 tolerance

과 에 여하 하 다. 그 결과 HMGB1 처리

시간과 도에 라 IL-1β TNF-α 비가 감 하 것 J774 포주

마우스 BMDM 포에 찰하 다. 플라마 NLR family

35

AIM2가 재하 각각 특 들에 해 다. LPS에 한

TLR 하 신 달 후 ATP, nigericin, alum 처리하 NLRP3 플라마

고, poly(dA:dT) 처리하 AIM2 플라마

다.5 HMGB1 처리에 한 플라마 과가 NLRP3 AIM2

플라마 에 동 하게 하 지 찰한 결과 미 게도 HMGB1

처리 하 AIM2 플라마 에 tolerance 도하지 않았지만

NLRP3 플라마 에 특 tolerance가 도 하 다. 그

러 러한 플라마 에 특 차 에 해

보고 가 없다. 라 한 에 해 가 실험

필 하다.

HMGB1에 해 플라마 과가 어 것 지

해 보고 여러 가지 플라마 해 보았다.

재 지 보고 NLRP3 플라마 가포식, Type I IFN,

A20, iNOS, TRIM30α 다.7,41-44 HMGB1 처리에 들

량 변 한 결과 HMGB1 처리하고 24시간 후 TRIM30α

가함 하 다. 그러 가포식, Type I IFN, A20, iNOS에

변 가 없었다. 처리한 HMGB1 플라마 tolerance

하 TRIM30α 가시킬 수 상 했 것

상 다.

ROS 균 감염, 포 상 시 가하 특 미 콘드리아 래

36

ROS 가 NLRP3 플라마 시키 주 한

다.53 라 본 연 에 플라마 뿐만 아니라 포질

과 미 콘드리아 ROS 감 시키 항산 단 질 Prx도 함께 찰하

다. Prx 6가지 동 단 질 그 Prx I과 Prx II가 포질

에 하게 재하여 포질 내 ROS 감 시키고 Prx III Prx V 미

콘드리에 하여 미 콘드리아 래 ROS 거에 여한다.54 HMGB1

처리 후 Prx I-III, V 찰한 결과, 아무런 변 가 없 하

다. 라 HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance 과 NLRP3

플라마 특 TRIM30α가 여하여 도 것

생각 다.

TRIM30α 단 질 항 러스에 여하여 역 도하

러스 감염 시 가하 단 질 알 다.55 근 보고에

TRIM30α 단 질 TAB2/3 해 통해 TLR 매개 도 NK-κB 신

하 , ROS 생 함 NLRP3 플라마

억 시킨다 연 가 었다.28,44,56 TRIM30α 단 질 LTβR

도 다.39 LTβR TLR4 TLR9 2차 극 시 비 염

시 과 염 매개 단 질 량 감 시키 TRIM30α

단 질또한 NK-κB에 한 량 가한다.57 본 실험

에 HMGB1과 LTβR 결합 하여 처리 HMGB1 LTβR

결합하여 TRIM30α 도하 것 하 다. LTβR가 플라마

37

tolerance에 여하 지 하 해 LTβR에 한 agonistic 항체

하여 HMGB1과 동 한 건 처리 한 후 플라마 시켰

tolerance가 도 것 찰하 다. 러한 상 처리

HMGB1 LTβR과 결합하고 TRIM30α 하여 NLRP3 플라

마 에 한 IL-1β 비 억 시키 것 생각 다.

TLR4 RAGE HMGB1과 결합 루 수 체들 다.20 처리

HMGB1 도 플라마 tolerance에 LTbR 어

상 지 알아보 해 각각 LTbR, RAGE, TLR4 결 마우스 BMDM

하여 플라마 tolerance 과 해 보았다. 재 보고

에 RAGE HMGB1과 DNA 함께 처리하 AIM2 플라

마 에 한 tolerance 도할 수 다 연 결과가 어 RAGE

플라마 과 연 시 었 NLRP3 플라마 과

계 아직 진 가 없다.19 야생 과 TLR4가 결 BMDM 포에

HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance가 도 LTbR,

RAGE 결 BMDM 포 경우 플라마 tolerance가 찰 지 않았다.

앞에 언 하 듯 HMGB1 처리에 한 플라마 tolerance 도에

LTbR가 여함 할 수 었다. RAGE 또한 NLRP3 플라마

tolerance 도에 여함 찰할 수 었지만 어 한 신 달 체계

갖고 tolerance 도하 지에 해 심도 연 가 필 할 것

보 다.

38

ROS 는 NLRP3 플라마 시키는 도물질 하나

하 주 미 콘드리아 포질 비 다. 미 콘드리아는

포 스트 스에 매우 민감하게 하는 포 극 게

ROS 뿐만 아니라 미 콘드리아 DNA 하여 NLRP3

플라마 시킬 수 다. TRIM30α 는 포질 내 ROS

감 시킴 NLRP3 플라마 억 할 수 다고 알

다.44,53 라 본 연 에 는 HMGB1 에 해 도 TRIM30α

ROS 가 는지 찰하 다. HMGB1 처리 한 포에 ROS

생 감 하 나 TRIM30α 가 knock down 포에 LPS+ATP

처리에 한 ROS 생 과는 NAC 에 하여 억 는 , HMGB1

처리에 ROS 과는 상실 는 것 찰하 다. 라 HMGB1 에

한 ROS 과는 TRIM30α 도 하 다. 그러나

TRIM30α 에 한 ROS 아직 지 진 가 없

가 실험 다.

HMGB1 처리에 한 플라마 억 과는 마우스 실험에 도

동 하게 도 하 다. C57BL/6 마우스 에 HMGB1 1

처리 하 는 플라마 tolerance 과가 도 지 않았 나 2

처리 하 플라마 tolerance 과가 도 하 다. 청

내 재하는 HMGB1 단 질 가수 해 에 해 쉽게 해 어

진다고 보고 어 다.58 아마도 1 주 HMGB1 가수 해 에

39

해 해 어 플라마 tolerance 과가 감 것 사료 다.

라 HMGB1 2 주 하 HMGB1 처리에 한 과가

지 어 플라마 tolerance 가 도 것 생각 다. 처리

HMGB1 LTβR 결합하여 플라마 TRIM30α

시켜 결과 마우스 에 도 플라마 억 할 수

보여 다.

본 연 에 는 HMGB1 처리에 해 TRIM30α 가 도 고

결과 NLRP3 플라마 tolerance 가 도 는 것 하 다.

라 HMGB1 처리에 한 TRIM30a 도 통하여 NLRP3

플라마 매개 IL-1b 생 역할 수행할 수

새 게 시하는 다.

40

Ⅴ. 결

플라마 병원 물질 식하여 천 역과 역

매개하 한 단 질 복합체 IL-1β, IL-18 비 포 사 에

여한다. 그러 아직 지 플라마 에 해 많

진 가 없다. 근 연 에 HMGB1 처리에 해 LPS

tolerance 도하고 ischemia/reperfusion 에 한 포 상

감 시킨다 보고가 다. 본 연 에 HMGB1 처리에 해

플라마 tolerance 가 도 것 찰하 러한 tolerance

과에 ROS 생 도가 감 하 것 하 다. 러한 상

에 처리 HMGB1 LTβR 결합 루어 TRIM30α 단 질

도함 ROS 루어 질 것 생각 다. 본 연 통해

HMGB1 처리가 NLRP3 플라마 에 한 할 수

새 게 시한다.

41

IV. 참고문헌

1. Boehm T, Iwanami N, Hess I. Evolution of the immune system in the

lower vertebrates. Annu Rev Genomics Hum Genet 2012;13:127-49.

2. Lamkanfi M, Dixit VM. Mechanisms and functions of

inflammasomes. Cell 2014;157:1013-22.

3. Takeuchi O, Akira S. Pattern recognition receptors and inflammation.

Cell 2010;140:805-20.

4. Kayagaki N, Warming S, Lamkanfi M, Vande Walle L, Louie S, Dong

J, et al. Non-canonical inflammasome activation targets caspase-11.

Nature 2011;479:117-21.

5. Latz E, Xiao TS, Stutz A. Activation and regulation of the

inflammasomes. Nat Rev Immunol 2013;13:397-411.

6. Miao EA, Rajan JV, Aderem A. Caspase-1-induced pyroptotic cell

death. Immunol Rev 2011;243:206-14.

7. Mao K, Chen S, Chen M, Ma Y, Wang Y, Huang B, et al. Nitric oxide

suppresses NLRP3 inflammasome activation and protects against

LPS-induced septic shock. Cell Res 2013;23:201-12.

8. Magna M, Pisetsky DS. The role of HMGB1 in the pathogenesis of

inflammatory and autoimmune diseases. Mol Med 2014;20:138-46.

9. Read CM, Cary PD, Crane-Robinson C, Driscoll PC, Norman DG.

Solution structure of a DNA-binding domain from HMG1. Nucleic

Acids Res 1993;21:3427-36.

10. Yang H, Antoine DJ, Andersson U, Tracey KJ. The many faces of

HMGB1: molecular structure-functional activity in inflammation,

apoptosis, and chemotaxis. J Leukoc Biol 2013;93:865-73.

42

11. Lotze MT, Tracey KJ. High-mobility group box 1 protein (HMGB1):

nuclear weapon in the immune arsenal. Nat Rev Immunol

2005;5:331-42.

12. Ulloa L, Batliwalla FM, Andersson U, Gregersen PK, Tracey KJ.

High mobility group box chromosomal protein 1 as a nuclear protein,

cytokine, and potential therapeutic target in arthritis. Arthritis Rheum

2003;48:876-81.

13. Andersson U, Tracey KJ. HMGB1 is a therapeutic target for sterile

inflammation and infection. Annu Rev Immunol 2011;29:139-62.

14. Wang H, Bloom O, Zhang M, Vishnubhakat JM, Ombrellino M, Che J,

et al. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice.

Science 1999;285:248-51.

15. Scaffidi P, Misteli T, Bianchi ME. Release of chromatin protein

HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation. Nature

2002;418:191-5.

16. Kim YH, Kwak MS, Park JB, Lee SA, Choi JE, Cho HS, et al. N-

linked glycosylation plays a critical role for the secretion of HMGB1.

J Cell Sci 2015.

17. Bonaldi T, Talamo F, Scaffidi P, Ferrera D, Porto A, Bachi A, et al.

Monocytic cells hyperacetylate chromatin protein HMGB1 to redirect

it towards secretion. EMBO J 2003;22:5551-60.

18. Youn JH, Shin JS. Nucleocytoplasmic shuttling of HMGB1 is

regulated by phosphorylation that redirects it toward secretion. J

Immunol 2006;177:7889-97.

19. Liu L, Yang M, Kang R, Dai Y, Yu Y, Gao F, et al. HMGB1-DNA

complex-induced autophagy limits AIM2 inflammasome activation

through RAGE. Biochem Biophys Res Commun 2014;450:851-6.

43

20. Tian J, Avalos AM, Mao SY, Chen B, Senthil K, Wu H, et al. Toll-like

receptor 9-dependent activation by DNA-containing immune

complexes is mediated by HMGB1 and RAGE. Nat Immunol

2007;8:487-96.

21. Park JS, Svetkauskaite D, He Q, Kim JY, Strassheim D, Ishizaka A, et

al. Involvement of toll-like receptors 2 and 4 in cellular activation by

high mobility group box 1 protein. J Biol Chem 2004;279:7370-7.

22. Li J, Wang H, Mason JM, Levine J, Yu M, Ulloa L, et al.

Recombinant HMGB1 with cytokine-stimulating activity. J Immunol

Methods 2004;289:211-23.

23. Wu H, Steenstra R, de Boer EC, Zhao CY, Ma J, van der Stelt JM, et

al. Preconditioning with recombinant high-mobility group box 1

protein protects the kidney against ischemia-reperfusion injury in

mice. Kidney Int 2014;85:824-32.

24. Hu X, Xu C, Zhou X, Cui B, Lu Z, Jiang H. PI3K/Akt signaling

pathway involved in cardioprotection of preconditioning with high

mobility group box 1 protein during myocardial ischemia and

reperfusion. Int J Cardiol 2011;150:222-3.

25. Aneja RK, Tsung A, Sjodin H, Gefter JV, Delude RL, Billiar TR, et al.

Preconditioning with high mobility group box 1 (HMGB1) induces

lipopolysaccharide (LPS) tolerance. J Leukoc Biol 2008;84:1326-34.

26. Izuishi K, Tsung A, Jeyabalan G, Critchlow ND, Li J, Tracey KJ, et al.

Cutting edge: high-mobility group box 1 preconditioning protects

against liver ischemia-reperfusion injury. J Immunol 2006;176:7154-8.

27. Nisole S, Stoye JP, Saib A. TRIM family proteins: retroviral

restriction and antiviral defence. Nat Rev Microbiol 2005;3:799-808.

44

28. Shi M, Deng W, Bi E, Mao K, Ji Y, Lin G, et al. TRIM30α negatively

regulates TLR-mediated NF-κB activation by targeting TAB2 and

TAB3 for degradation. Nat Immunol 2008;9:369-77.

29. Bowie AG. TRIM-ing down Tolls. Nat Immunol 2008;9:348-50.

30. Rathinam VA, Vanaja SK, Waggoner L, Sokolovska A, Becker C,

Stuart LM, et al. TRIF licenses caspase-11-dependent NLRP3

inflammasome activation by gram-negative bacteria. Cell

2012;150:606-19.

31. Pertel T, Hausmann S, Morger D, Zuger S, Guerra J, Lascano J, et al.

TRIM5 is an innate immune sensor for the retrovirus capsid lattice.

Nature 2011;472:361-5.

32. Versteeg GA, Benke S, Garcia-Sastre A, Rajsbaum R. InTRIMsic

immunity: Positive and negative regulation of immune signaling by

tripartite motif proteins. Cytokine Growth Factor Rev 2014;25:563-76.

33. Hehlgans T, Pfeffer K. The intriguing biology of the tumour necrosis

factor/tumour necrosis factor receptor superfamily: players, rules and

the games. Immunol 2005;115:1-20.

34. Stopfer P, Mannel DN, Hehlgans T. Lymphotoxin-β Receptor

Activation by Activated T Cells Induces Cytokine Release from

Mouse Bone Marrow-Derived Mast Cells. J Immunol 2004;172:7459-

65.

35. Fütterer A, Mink K, Luz A, Kosco-Vilbois MH, Pfeffer K. The

Lymphotoxin β Receptor Controls Organogenesis and Affinity

Maturation in Peripheral Lymphoid Tissues. Immunity 1998;9:59-70.

36. Rennert PD, James D, Mackay F, Browning JL, Hochman PS. Lymph

Node Genesis Is Induced by Signaling through the Lymphotoxin β

Receptor. Immunity 1998;9:71-9.

45

37. Kabashima K, Banks TA, Ansel KM, Lu TT, Ware CF, Cyster JG.

Intrinsic lymphotoxin-β receptor requirement for homeostasis of

lymphoid tissue dendritic cells. Immunity 2005;22:439-50.

38. Wang YG, Kim KD, Wang J, Yu P, Fu YX. Stimulating Lymphotoxin

Receptor on the Dendritic Cells Is Critical for Their Homeostasis and

Expansion. J Immunol 2005;175:6997-7002.

39. Wimmer N, Huber B, Barabas N, Rohrl J, Pfeffer K, Hehlgans T.

Lymphotoxin-β receptor activation on macrophages induces cross-

tolerance to TLR4 and TLR9 ligands. J Immunol 2012;188:3426-33.

40. Wimmer N, Huber B, Wege AK, Barabas N, Rohrl J, Pfeffer K, et al.

Lymphotoxin-β receptor activation on macrophages ameliorates acute

DSS-induced intestinal inflammation in a TRIM30α-dependent

manner. Mol Immunol 2012;51:128-35.

41. Shi CS, Shenderov K, Huang NN, Kabat J, Abu-Asab M, Fitzgerald

KA, et al. Activation of autophagy by inflammatory signals limits IL-

1β production by targeting ubiquitinated inflammasomes for

destruction. Nat Immunol 2012;13:255-63.

42. Guarda G, Braun M, Staehli F, Tardivel A, Mattmann C, Forster I, et

al. Type I interferon inhibits interleukin-1 production and

inflammasome activation. Immunity 2011;34:213-23.

43. Vande Walle L, Van Opdenbosch N, Jacques P, Fossoul A, Verheugen

E, Vogel P, et al. Negative regulation of the NLRP3 inflammasome by

A20 protects against arthritis. Nature 2014;512:69-73.

44. Hu Y, Mao K, Zeng Y, Chen S, Tao Z, Yang C, et al. Tripartite-motif

protein 30 negatively regulates NLRP3 inflammasome activation by

modulating reactive oxygen species production. J Immunol

2010;185:7699-705.

46

45. Schroder K, Tschopp J. The inflammasomes. Cell 2010;140:821-32.

46. Rathinam VA, Vanaja SK, Fitzgerald KA. Regulation of

inflammasome signaling. Nat Immunol 2012;13:333-42.

47. Davis BK, Wen H, Ting JP. The inflammasome NLRs in immunity,

inflammation, and associated diseases. Annu Rev Immunol

2011;29:707-35.

48. Sander LE, Davis MJ, Boekschoten MV, Amsen D, Dascher CC,

Ryffel B, et al. Detection of prokaryotic mRNA signifies microbial

viability and promotes immunity. Nature 2011;474:385-9.

49. Bauernfeind FG, Horvath G, Stutz A, Alnemri ES, MacDonald K,

Speert D, et al. Cutting edge: NF-κB activating pattern recognition

and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by

regulating NLRP3 expression. J Immunol 2009;183:787-91.

50. Franchi L, Eigenbrod T, Nunez G. Cutting edge: TNF-α mediates

sensitization to ATP and silica via the NLRP3 inflammasome in the

absence of microbial stimulation. J Immunol 2009;183:792-6.

51. Man SM, Kanneganti TD. Regulation of inflammasome activation.

Immunol Rev 2015;265:6-21.

52. Robert SM, Sjodin H, Fink MP, Aneja RK. Preconditioning with high

mobility group box 1 (HMGB1) induces lipoteichoic acid (LTA)

tolerance. J Immunother 2010;33:663-71.

53. Heid ME, Keyel PA, Kamga C, Shiva S, Watkins SC, Salter RD.

Mitochondrial reactive oxygen species induces NLRP3-dependent

lysosomal damage and inflammasome activation. J Immunol

2013;191:5230-8.

54. Hofmann B, Hecht HJ, Flohe L. Peroxiredoxins. Biol Chem

2002;383:347-64.

47

55. Wang Y, Lian Q, Yang B, Yan S, Zhou H, He L, et al. TRIM30α Is a

Negative-Feedback Regulator of the Intracellular DNA and DNA

Virus-Triggered Response by Targeting STING. PLoS Pathog

2015;11:e1005012.

56. Choi UY, Choi WY, Hur JY, Kim YJ. Polyubiquitin chain-dependent

protein degradation in TRIM30 cytoplasmic bodies. Exp Mol Med

2015;47:e159.

57. Wimmer N, Heigl U, Klingseisen L, Schneider-Brachert W, Hehlgans

T. Lymphotoxin-beta receptor signalling regulates cytokine

expression via TRIM30α in a TRAF3-dependent manner. Mol

Immunol 2013;54:40-7.

58. Ito T, Kawahara K, Okamoto K, Yamada S, Yasuda M, Imaizumi H, et

al. Proteolytic cleavage of high mobility group box 1 protein by

thrombin-thrombomodulin complexes. Arterioscler Thromb Vasc Biol

2008;28:1825-30.

48

Abstract

The Pre-conditioning of High Mobility Group Box 1 Protein (HMGB1)

Negatively Regulates Inflammasome Activation

Su Jung Park

Brain Korea 21 Plus Project for Medical Science, Yonsei University

(Directed by Professor Jeon-Soo Shin)

Inflammasomes are central signaling proteins and cytosolic surveillance

complexes that recognize bacterial infection and metabolic dysregulation.

Inflammasome activation results in interleukin (IL)-1β, IL-18 secretion, and

pyroptosis, yet the regulation mechanisms remain poorly defined. High

mobility group box1 (HMGB1) protein is not only nuclear protein that binds

and stabilizes DNA structure, but also it is a damage-associated molecular

pattern molecules (DAMPs). Although the pro-inflammatory functions of

HMGB1 was revealed first, recent studies have shown that HMGB1 pre-

conditioning protects cell injury triggered by ischemia/reperfusion, and

induces immune tolerance. Here, we demonstrated that the pre-conditioning

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of recombinant HMGB1 negatively regulates NLRP3 inflammasome

activation. Our data indicates that the pre-conditioning of HMGB1 decreases

IL-1β and IL-18 levels in mouse macrophage cell line J774 and mouse bone

marrow-drived macrophages (BMDM) compared to non-pre-conditioned

cells. Furthermore, pre-conditioning of HMGB1 diminishes production of

reactive oxygen species (ROS) level. HMGB1 also induces tripartite-motif

protein 30α (TRIM30α), a regulator of NK-κB signaling and NLRP3

inflammasome, but not inducible nitric oxide synthase (iNOS), A20, or

interferon-α (IFN-α), which are known for inflammasome negative regulators.

In addition, this inflammasome attenuation effect by HMGB1 pre-

conditioning was mostly restored in lymphotoxin β receptor (LTβR)-deficient

cells, which have diminished TRIM30α expression. Taken together, our

results revealed novel role of HMGB1 pre-conditioning as a negative

regulator of NLRP3 inflammasome.

Key Words: HMGB1, NLRP3, inflammasome, tolerance, lymphotoxin breceptor, TRIM30a