DIRECTRICES PARA LA EJECUCIÓN DEL EXAMEN DE LA … · 3. Todas las observaciones para evaluar la...

STG/81/6

INTERNATIONAL UNIONFOR THE PROTECTIONOF NEW VARIETIES OF

PLANTS

UNION INTERNATIONALEPOUR LA PROTECTION

DES OBTENTIONSVÉGÉTALES

INTERNATIONALERVERBAND ZUM SCHUTZ

VON PFLANZEN-ZÜCHTUNGEN

UNIÓN INTERNACIONALPARA LA PROTECCIÓNDE LAS OBTENCIONES

VEGETALES

DIRECTRICES

PARA LA EJECUCIÓN DEL EXAMEN

DE LA DISTINCIÓN, LA HOMOGENEIDAD Y LA ESTABILIDAD

GIRASOL

(Helianthus annuus L.)

GINEBRA2000

Pueden obtenerse copias de este documento previa petición al precio de 10 francossuizos cada ejemplar, incluyendo correo ordinario por superficie, dirigiéndose a la Oficina dela UPOV, 34 chemin des Colombettes, P.O. Box 18, 1211 Ginebra 20, Suiza.

Este documento puede ser reproducido, traducido y publicado, total o parcialmente, sinla autorización expresa de la UPOV, siempre que se haga mención de la fuente.

* * * * * * *

TG/81/6ORIGINAL: InglésFECHA: 2000-04-05

INTERNATIONAL UNIONFOR THE PROTECTIONOF NEW VARIETIES OF

PLANTS

UNION INTERNATIONALEPOUR LA PROTECTION

DES OBTENTIONSVÉGÉTALES

INTERNATIONALERVERBAND ZUM SCHUTZ

VON PFLANZEN-ZÜCHTUNGEN

UNIÓN INTERNACIONALPARA LA PROTECCIÓNDE LAS OBTENCIONES

VEGETALES

DIRECTRICES

PARA LA EJECUCIÓN DEL EXAMEN

DE LA DISTINCIÓN, LA HOMOGENEIDAD Y LA ESTABILIDAD

GIRASOL

(Helianthus annuus L.)

Se deberán interpretar las Directrices conjuntamente con el documentoTG/1/2, el cual contiene notas explicativas sobre los principiosgenerales utilizados para el establecimiento de estas Directrices.

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-2-

ÍNDICE PÁGINA

I. Objeto de las directrices ............................................................................... 3

II. Material necesario ......................................................................................... 3

III. Ejecución del examen ................................................................................... 3

IV. Métodos y observaciones ............................................................................. 4

V. Modo de agrupar las variedades ................................................................... 6

VI. Caracteres y símbolos ................................................................................... 6

VII. Tabla de caracteres ...................................................................................... 7

VIII. Explicaciones de la tabla de caracteres .......................................................... 19

IX. Bibliografía ................................................................................................. 28

X. Cuestionario técnico ................................................................................... 29

ANEXO

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-3-

I. Objeto de las directrices

Estas Directrices de Examen se aplican a todas las variedades de Helianthus annuus L.,incluidos líneas puras, híbridos y variedades de polinización libre.

II. Material necesario

1. Las autoridades competentes deciden cuándo, dónde y en qué cantidad y calidad sedeberá entregar el material vegetal necesario para la ejecución de exámenes de la variedad.Los solicitantes que presentan material procedente de un país distinto de aquél en el que seefectuará el examen deberán asegurarse de que se han cumplido todas las formalidadesaduaneras. La cantidad mínima de semillas que debe presentar el solicitante en una o variasmuestras será de:

5.000 semillas para líneas puros1 kg para híbridos y variedades de polinización libre

En el caso de híbridos, se deberán presentar otras 5.000 semillas de cada componente (porejemplo, para un híbrido simple, línea femenina (línea androestéril) y la línea masculina). Enel caso de líneas androestériles, se presentarán otras 5.000 semillas de la línea mantenedora.La semilla deberá cumplir, al menos, los requisitos mínimos de capacidad germinativa,contenido de humedad y pureza para la comercialización de semillas certificadas en el país enel que se haya presentado la solicitud. La capacidad germinativa debe ser lo más elevadaposible.

2. El material vegetal deberá estar exento de todo tratamiento, salvo autorización encontrario o solicitud expresa de las autoridades competentes. Si ha sido tratado, se deberáindicar en detalle el tratamiento aplicado.

III. Ejecución del examen

1. La duración mínima del examen será, normalmente, de dos ciclos de crecimientoindependientes.

2. Normalmente, se deberán efectuar los ensayos en un solo lugar. Si ese lugar no permitela expresión de ciertos caracteres importantes de la variedad, se podrá estudiar esa variedadtambién en otro lugar.

3. Se deberán efectuar los ensayos en condiciones que aseguren un desarrollo normal. Lasparcelas deberán tener un tamaño tal que permitan la extracción de plantas o partes de plantaspara efectuar medidas y conteos sin perjudicar las observaciones ulteriores que se efectuaránhasta el final del período de vegetación. Cada ensayo deberá abarcar al menos 40 plantas queestarán repartidas en dos o más repeticiones. Solamente se podrán utilizar parcelas separadaspara observación y medición si han estado sometidas a condiciones ambientales similares.

4. Se podrán ejecutar ensayos adicionales con fines particulares, por ejemplo ensayos delíneas-capítulo, en caso de que las autoridades competentes acepten resultados obtenidos porel solicitante antes de la fecha de la solicitud.

5. En caso de que se controle la fórmula de híbridos mediante electroforesis enzimática, sedeberá efectuar un examen en un mínimo de 10 plántulas de cada línea endocriada. Se

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-4-

analizarán, como mínimo, 4 plántulas para híbridos simples, y, al menos, 10 plántulas parahíbridos de tres vías. En caso de duda, analícense plántulas adicionales.

IV. Métodos y observaciones

1. Se emplearán los caracteres descritos en el Capítulo VII para ejecutar el examen de ladistinción de las líneas parentales, de los híbridos y de variedades de polinización libre.

2. Sin embargo, para determinar la distinción de los híbridos, se podrá establecer unsistema de preselección sobre la base de las líneas parentales y de la fórmula, de conformidadcon las siguientes recomendaciones:

a) descripción de las líneas parentales de conformidad con las Directrices deExamen;

b) comprobación de la originalidad de esas líneas parentales comparadas con lacolección de referencia basada en los caracteres que figuran en el Capítulo VII, a fin deseleccionar las líneas puras más parecidas;

c) comprobación de la originalidad de la fórmula de los híbridos comparada con lade los híbridos más conocidos, teniendo en cuenta las líneas puras más parecidas;

d) evaluación de la distinción a nivel de híbrido de variedades con fórmulascercanas.

3. Todas las observaciones para evaluar la distinción y la homogeneidad, incluidos loscaracteres electroforéticos, de haberlos, se deberán efectuar en al menos 40 plantas o partes decada una de las 40 plantas en cada lugar de examen y en cada período de vegetación.

4. Todas las observaciones se deberán efectuar en el tallo principal.

5. Todas las observaciones de la hoja se deberán efectuar en hojas completamentedesarrolladas a 2/3 de altura de la planta, desde el estado de botón floral, pero antes del estadode floración. El botón floral deberá alcanzar un tamaño de aproximadamente 5 cm.

6. Para evaluar la homogeneidad de las líneas puras, se deberá aplicar una poblaciónestándar del 2% con una probabilidad de aceptación de al menos 95%. Además, se deberánaplicar la misma población estándar y la misma probabilidad de aceptación en lo que respectaa plantas provenientes de cruzamientos naturales y a plantas autofecundadas fértiles, dentro deuna línea androestéril. Para evaluar la homogeneidad de híbridos simples, se deberá aplicaruna población estándar del 5% con una probabilidad de aceptación de al menos 95%. Paraaquellos países en los que la adaptación de su sistema a las nuevas normas adoptadas supongaun cambio demasiado grande con las consiguientes dificultades, se podrá prever un períodoprovisional de 2 años desde la adopción de las Directrices de Examen antes de que cambien alas nuevas normas. Por lo que atañe a los híbridos de tres vías y a las variedades depolinización libre, la variabilidad dentro de la variedad no debería superar la variabilidad devariedades comparables ya conocidas.

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-5-

Número de plantas atípicas permitidas para diferentes casos y tamaños de muestras

Plantas atípicas Número deplantas

observadas

Número deplantas atípicas

permitidas

Plantas decruzamientos

naturales

19 - 41 2

y 42 - 69 3

70 - 99 4

Línea pura1 androestéril

plantasautofecundadas

fértiles 100 – 131 5

(población estándar: 2%, 19 - 41 2

Posibilidad de aceptación:95%)

Otras 42 - 69 3

plantas atípicas 70 - 99 4

100 - 131 5

19 - 41 2

Línea pura masculina fértil Todo tipo de 42 - 69 3

(población estándar: 2%, plantas atípicas 70 - 99 4

posibilidad de aceptación:95%)

100 - 131 5

17 - 28 3

29 - 40 4

41 - 53 5

Híbridos simples Todo tipo de 54 - 67 6

(población estándar: 5%, plantas atípicas 68 - 81 7

posibilidad de aceptación:95%)

82 - 95 8

96 - 110 9

111- 125 10

7. Si se emplea la electroforesis enzimática para determinar la distinción, se deberánaplicar la misma población estándar y la misma probabilidad de aceptación que para losdemás caracteres. Todas las plantas de una línea pura con uno o más loci heterocigotes paralos cuales un alelo en cada locus provenga de la línea endocriada en cuestión (por ejemplo,

1 Por ejemplo, se aceptará una línea pura androestéril con 2 plantas de cruzamiento natural

y 2 plantas atípicas con respecto a los caracteres de las hojas, en 40 plantas observadas. Por otraparte, se rechazará una línea endocriada androestéril con tres plantas atípicas para los caracteresde las hojas en 40 plantas observadas.

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-6-

AX) se considerarán como plantas de cruzamientos naturales. Se considerarán plantasatípicas, todo otro caso de heterocigosis así como los casos en los cuales un gen ajeno a lalínea esté presente en estado de homocigosis.

V. Modo de agrupar las variedades

1. La colección de las variedades que vayan a cultivarse se deberá dividir en grupos parafacilitar la evaluación de la distinción. Los caracteres que deberán utilizarse para definir losgrupos serán los que la experiencia ha demostrado que no varían, o que varían poco, dentro deuna variedad. Sus diferentes niveles de expresión deberán repartirse con suficienteuniformidad en la colección.

2. En primer lugar, se separarán las variedades en líneas puras y otras variedades. Dentrode cada grupo, se recomienda a las autoridades competentes la utilización de los siguientescaracteres para agrupar las variedades:

a) Hoja: color verde (carácter 4)b) Hoja: abullonado (carácter 5)c) Época de la floración (carácter 14)d) Planta: altura (carácter 28)e) Planta: ramificación (excluyendo la causada por el medio ambiente) (carácter 29)f) Semilla: estrías en el borde (carácter 39)g) Semilla: estrías entre los bordes (carácter 40)

VI. Caracteres y símbolos

1. Para evaluar la distinción, la homogeneidad y la estabilidad, se deberán utilizar loscaracteres indicados en la tabla de caracteres, con sus diferentes niveles de expresión.

2. A efectos del tratamiento electrónico de datos, se han introducido notas (números)frente a los niveles de expresión de cada carácter.

3. Signos convencionales

(*) Se trata de caracteres que deberán emplearse para todas las variedades en cada períodode vegetación en el que se ejecuten exámenes, y que deberán figurar siempre en la descripciónde la variedad, a menos que el nivel de expresión de un carácter precedente o las condicionesambientales regionales lo impidan.

(+) Véanse las explicaciones de la tabla de caracteres en el Capítulo VIII.

(1) El estado de desarrollo óptimo para evaluar cada carácter está indicado con un númeroen la segunda columna. Los estados de desarrollo designados por cada número sedescriben al final del Capítulo VIII.

TG/81/6Sunflower/Tournesol/Sonnenblume/Girasol, 2000-04-05

-7-

VII. Table of Characteristics/Tableau des caractères/Merkmalstabelle/Tabla de caracteres

Stage 1)

Stade 1)

Stadium 1)

Estadio 1)

English français deutsch españolExample VarietiesExemplesBeispielssortenVariedades ejemplo

Note/Nota

1. A2 Hypocotyl: antho-cyanin coloration

Hypocotyle: pig-mentation antho-cyanique

Hypokotyl: An-thocyanfärbung

Hipocotilo: pig-mentación anto-ciánica

absent absente fehlend ausente HA 850 1

present présente vorhanden presente RHA 271 9

2. A2 Hypocotyl: inten-sity of anthocya-nin coloration

Hypocotyle: in-tensité de la pig-mentation antho-cyanique

Hypokotyl:Intensität derAnthocyan-färbung

Hipocotilo: inten-sidad de la pig-mentación anto-ciánica

weak faible gering débil H 52.6.3 3

medium moyenne mittel media HA 290 5

strong forte stark fuerte RHA 271 7

3.(*)

E4 Leaf: size Feuille: taille Blatt: Größe Hoja: tamaño

small petite klein pequeña HA 124 3


large grande groß grande DK 3790 7

4.(*)

E4 Leaf: green color Feuille: couleurverte

Blatt: Grünfär-bung

Hoja: color verde

light claire hell claro H 52.9.1.1 3

medium moyenne mittel medio HA 821 5

dark foncée dunkel oscuro HA 303 7

5.(*)

E4 Leaf: blistering Feuille: gaufrure Blatt: Blasigkeit Hoja: abullonado

absent or veryweak

absente ou trèsfaible

fehlend oder sehrgering

ausente o muydébil

1

weak faible gering débil HA 342, RHA 273 3


strong forte stark fuerte HA 303, RHA 361 7


-8-

Stage 1)

Stade 1)

Stadium 1)

Estadio 1)


Note/Nota

6.(*)(+)

E4 Leaf: serration Feuille: denture Blatt: Zähnung Hoja: dentado

isolated or veryfine

isolée ou très fine vereinzelt oder sehrfein

aislado o muy fino HA 393 1

fine fine fein fino HA 124 3

medium moyenne mittel medio RHA 271 5

coarse grossière grob grosero RHA 299 7

very coarse très grossière sehr grob muy grosero 9

7.

(+)

E4 Leaf: shape ofcross section

Feuille: forme dela sectiontransversale

Blatt: Form desQuerschnitts

Hoja: forma de laseccióntransversal

strongly concave fortement concave stark konkav fuertemente cóncava 1

weakly concave faiblement concave schwach konkav débilmentecóncava

RHA 273 2

flat droite gerade plana H 55.9.2.1.1 3

weakly convex faiblement convexe schwach konvex débilmente con-vexa

HA 303 4

strongly convex fortement convexe stark konvex fuertemente con-vexa

5

8.(+)

E4 Leaf: shape ofdistal part

Feuille: forme dela partie distale

Blatt: Form desdistalen Teiles

Hoja: forma de laparte distal

lanceolate lancéolée lanzettlich lanceolada 1

lanceolate tonarrow triangular

lancéolée à trian-gulaire étroite

lanzettlich bisschmal dreieckig

lanceolada a trian-gular estrecha

2

narrow triangular triangulaire étroite schmal dreieckig triangular estrecha RHA 855 3

narrow triangularto broad triangular

triangulaire étroiteà triangulaire large

schmal dreieckigbis breit dreieckig

triangular estrechaa triangular ancha

4

broad triangular triangulaire large breit dreieckig triangular ancha HA 821 5

broad triangular toacuminate

triangulaire large àacuminée

breit dreieckig biszugespitzt

triangular ancha aacuminada

6

broad triangular torounded

triangulaire large àarrondie

breit dreieckig bisrundlich

triangular ancha aredondeada

HA 303 7

acuminate acuminée zugespitzt acuminada HA 124 8

rounded arrondie rundlich redondeada HA 234 9


-9-

Stage 1)

Stade 1)

Stadium 1)

Estadio 1)


Note/Nota

9.(*)(+)

E4 Leaf: auricules Feuille: oreilletes Blatt: Größe derOhren

Hoja: aurículas

none or very small absentes ou trèspetites

fehlend oder sehrklein

ausentes o muypequeñas

HA 290 1

small petites klein pequeñas 3

medium moyennes mittel medias HA 852 5

large grandes groß grandes HA 89 7

very large très grandes sehr groß muy grandes HA 303 9

10.

(+)

E4 Leaf: wings Feuille: ailes Blatt: Flügel Hoja: alas

none or veryweakly expressed

absentes ou trèsfaiblementmarquées

keine oder sehrschwach ausge-prägt

ausentes o muydébilmente defini-das

HA 89 1

weakly expressed faiblement mar-quées

schwach ausge-prägt

débilmente defini-das

2

strongly expressed fortementmarquées

stark ausgeprägt fuertemente defini-das

RHA 274, RHA 348 3

11.(*)(+)

E4 Leaf: angle oflowest lateralveins

Feuille: angle desnervures latéralesles plus basses

Blatt: Winkel deruntersten Seiten-nerven

Hoja: ángulo delos nervios latera-les inferiores

acute aigu spitz agudo HA 290, RHA 295 1

right angle ornearly right angle

droit ou presquedroit

rechtwinklig oderfast rechtwinklig

ángulo recto o casiángulo recto

HA 89 2

obtuse obtus stumpf obtuso HA 303 3


-10-

Stage 1)

Stade 1)

Stadium 1)

Estadio 1)


Note/Nota

12.(+)

E4 Leaf: height of thetip of the bladecompared toinsertion ofpetiole (at 2/3height of plants)

Feuille: hauteurde l’extrémité dulimbe par rapportà l’insertion dupétiole (aux 2/3 dela tige à partir dusol)

Blatt: Höhe derBlattspitze imVerhältnis zurAnsatzstelle desStieles (in 2/3 derPflanzenhöhe)

Hoja: altura de lapunta del limboen relación con lainserción delpecíolo (a 2/3 de laaltura de laplanta)

low basse niedrig baja RHA 275 3

medium moyenne mittel media RHA 274 5

high haute hoch alta RHA 400 7

13. F1 Stem: hairiness atthe top (last 5 cm)

Tige: pilosité ausommet (5derniers cm)

Stengel: Behaa-rung an der Spitze(obere 5 cm)

Tallo: vellosidaden el extremo(últimos 5 cm)

absent or veryweak

nulle ou très faible fehlend oder sehrgering

ausente o muydébil

1

weak faible gering débil RHA 271 3


strong forte stark fuerte HA 303 7

very strong très forte sehr stark muy fuerte 9

14.(*)(+)

Time of flowering Époque de flo-raison

Zeitpunkt derBlüte

Época de la flo-ración

very early très précoce sehr früh muy temprana HA 302, RHA 381 1

early précoce früh temprana RHA 273 3


late tardive spät tardía RHA 271 7

very late très tardive sehr spät muy tardía RHA 361 9

15. F3.2 Ray florets: den-sity

Fleurs ligulées:densité

Zungenblüten:Dichte

Flores liguladas:densidad

sparse faible locker laxas HA 385 3

medium moyenne mittel medias HA 89 5

dense forte dicht densas 7


-11-

Stage 1)

Stade 1)

Stadium 1)

Estadio 1)


Note/Nota

16.(+)

F3.2 Ray floret: shape Fleur ligulée:forme

Zungenblüte:Form

Flor ligulada:forma

fusiform allongée spindelförmig fusiforme H 52.9.1.1 1

narrow ovate ovoïde étroite schmal eiförmig oval estrecha RHA 274 2

broad ovate ovoïde large breit eiförmig oval ancha HA 821 3

rounded arrondie rundlich redondeada 4

17. F3.2 Ray floret: dis-position

Fleur ligulée: dis-position

Zungenblüte: An-ordnung

Flor ligulada: dis-posición

flat plane eben plana HA 89 1

longitudinalrecurved

recourbée longitu-dinalement

längsseits nachaußen gebogen

recurvada longitu-dinalmente

HA 850 2

undulated ondulée gewellt ondulada HA 234 3

strongly recurvedto back of head

fortement recour-bée vers le dos ducapitule

stark gebogen zurKorbrückseite

fuertemente recur-vada hacia la parteposterior delcapítulo

CM 592 4

18. F3.2 Ray floret: length Fleur ligulée: lon-gueur

Zungenblüte:Länge

Flor ligulada:longitud

short courte kurz corta RHA 361 3


long longue lang larga H 52.6.3 7

19.(*)

F3.2 Ray floret: color Fleur ligulée:couleur

Zungenblüte:Farbe

Flor ligulada:color

yellowish white blanc jaunâtre gelblichweiß blanco amarillento 1

light yellow jaune pâle hellgelb amarillo pálido 2

medium yellow jaune moyen mittelgelb amarillo medio HA 89 3

orange yellow jaune orange orangegelb amarillo naranja RHA 361 4

orange orange orange naranja CM 587, RHA 295 5

purple pourpre purpur púrpura 6

reddish brown brun rougeâtre rotbraun marrón rojizo 7

multicolored multicolore mehrfarbig multicolor 8


-12-

Stage 1)

Stade 1)

Stadium 1)

Estadio 1)


Note/Nota

20. F3.2 Disk flower: color Fleuron: couleur Röhrenblüte:Farbe

Flósculo (flor deldisco): color

yellow jaune gelb amarillo 1

orange orange orange naranja HA 89 2


21.

(+)

F3.2 Disk flower: an-thocyanin colora-tion of stigma

Fleuron: pigmen-tation anthocya-nique desstigmates

Röhrenblüte: An-thocyanfärbungder Narbe

Flósculo (flor deldisco): pigmenta-ción antociánicadel estigma

absent absente fehlend ausente HA 89 1

present présente vorhanden presente H 55.9.2.1.1, HA 348 9

22.

(+)

F3.2 Disk flower: in-tensity of antho-cyanin colorationof stigma

Fleuron: intensitéde la pigmenta-tion anthocyani-que des stigmates

Röhrenblüte:Intensität derAnthocy-anfärbung derNarbe

Flósculo (flor deldisco): intensidadde la pigmenta-ción antociánicadel estigma

weak faible gering débil HA 290, HA 394 3

medium moyenne mittel media HA 60, HA 291 5

strong forte stark fuerte RHA 348 7

23. F3.2 Disk flower: pro-duction of pollen

Fleuron: produc-tion de pollen

Röhrenblüte:Pollenproduktion

Flósculo (flor deldisco): producciónde polen

absent absente fehlend ausente 1

present présente vorhanden presente 9

24.

(+)

F3.2 Bract: shape Bractée: forme Hüllblatt: Form Bráctea: forma

clearly elongated nettement allongée deutlich länglich claramenteelongada

HA 379 1

neither clearlyelongated norclearly rounded

ni nettementallongée ninettement arrondie

weder deutlichlänglich nochdeutlich rundlich

ni claramenteelongada niclaramenteredondeada

HA 292 2

clearly rounded nettement arrondie deutlich rundlich claramenteredondeada

RHA 801 3


-13-

Stage 1)

Stade 1)

Stadium 1)

Estadio 1)


Note/Nota

25.

(+)

F3.2 Bract: length oftip

Bractée: longueurdu sommet

Hüllblatt: Längeder Spitze

Bráctea: longituddel acumen

short court kurz corta RHA 273, RHA 361 3

medium moyen mittel media HA 302 5

long long lang larga HA 292, HA 55.9.2.1.1 7

very long très long sehr lang muy larga H 52.6.3 9

26. F3.2 Bract: green colorof outer side

Bractée: couleurverte de la faceexterne

Hüllblatt: Grün-färbung der Au-ßenseite

Bráctea: colorverde de la caraexterna

light claire hell claro H 52.9.1.1 3


dark foncée dunkel oscuro HA 303 7

27. M0 Bract: attitude inrelation to head

Bractée: port parrapport au capi-tule

Hüllblatt: Hal-tung zum Korb

Bráctea: porte enrelación con elcapítulo

not embracing orvery slightlyembracing

non enveloppanteou très faiblementenveloppante

nicht umfassendoder sehr geringumfassend

no envolvente omuy ligeramenteenvolvente

H 52.9.1.1 1

slightly embracing faiblement enve-loppante

gering umfassend ligeramente en-volvente

HA 337, HA 343 2

strongly embracing fortement enve-loppante

stark umfassend fuertemente en-volvente

RHA 234 3

28.(*)(+)

M0 Plant: naturalheight

Plante: hauteur Pflanze: Natür-liche Höhe

Planta: altura

very short très courte sehr kurz muy baja HA 379 1

short courte kurz baja HA 291 3


tall haute lang alta H 52.9.1.1 7


-14-

Stage 1)

Stade 1)

Stadium 1)

Estadio 1)


Note/Nota

29.(*)

M0 - M2 Plant: branching(excluding envi-ronmentalbranching)

Plante: ramifi-cation (à l’ex-clusion de laramification due àl’environnement)

Pflanze: Verzwei-gung (ohne um-weltbedingteVerzweigung)

Planta: ramifica-ción (excluyendola causada por elmedio ambiente)

absent absente fehlend ausente HA89 1

present présente vorhanden presente RHA 271 9

30.(*)(+)

M0 - M2 Plant: type ofbranching (as for29)

Plante: type deramification(comme pour 29)

Pflanze: Art derVerzweigung (wieunter 29)

Planta: tipo deramificación(como para 29)

only basal uniquement basale nur basal sólo basal RHA 295 1

predominantlybasal

prédominancebasale

überwiegend basal predominantemen-te basal

2

overall totale vollständig total RHA 273 3

predominantlyapical

prédominanceapicale

überwiegend apikal predominantemen-te apical

RHA 271 4

only apical uniquement apicale nur apikal solo apical RHA 294 5

31. M0 - M2 Plant: naturalposition of highestlateral head to thecentral head

Plante: positionnaturelle du capi-tule latéral le plushaut par rapportau capitulecentral

Pflanze: Natür-liche Position deshöchsten Seiten-korbes zumHauptkorb

Planta: posiciónnatural del capí-tulo lateral másalto, en relacióncon el capítulocentral

below au-dessous unterhalb debajo RHA 361 1

same level au même niveau gleiche Höhe al mismo nivel RHA 857 2

above au-dessus oberhalb encima RHA 274 3


-15-

Stage 1)

Stade 1)

Stadium 1)

Estadio 1)


Note/Nota

32.(*)(+)

M3 Head: attitude Capitule: port Korb: Haltung Capítulo: porte

horizontal horizontal waagerecht horizontal 1

inclined incliné geneigt inclinado 2

vertical vertical senkrecht vertical RHA 395 3

half-turned downwith straight stem

demi-renversé avectige droite

halbüberhängendmit geradem Sten-gel

semiinvertido con eltallo recto

4

half-turned downwith curved stem

demi-renversé avectige arquée

halbüberhängendmit gebogenemStengel

semiinvertido con eltallo arqueado

5

turned down withstraight stem

renversé avec tigedroite

überhängend mitgeradem Stengel

invertido con eltallo recto

6

turned down withslightly curvedstem

renversé avec tigelégèrement arquée

überhängend mitgering gebogenemStengel

invertido con eltallo ligeramentearqueado

7

turned down withstrongly curvedstem

renversé avec tigefortement arquée

überhängend mitstark gebogenemStengel

invertido con eltallo fuertementearqueado

8

over turned retourné zurückgebogen retorcido 9

33.(*)

M3 Head: size Capitule: taille Korb: Größe Capítulo: tamaño

small petit klein pequeño RHA 273 3

medium moyen mittel medio RHA 271 5

large grand groß grande H 52.9.1.1 7


-16-

Stage 1)

Stade 1)

Stadium 1)

Estadio 1)


Note/Nota

34.(*)(+)

M3 Head: shape ofgrain side

Capitule: formede la face portantles grains

Korb: Form derKornseite

Capítulo: forma dela parte del grano

strongly concave fortement concave stark konkav fuertemente cón-cavo

1

weakly concave faiblement concave schwach konkav débilmente cóncavo 2

flat plan gerade plano RHA 273 3

weakly convex faiblement convexe schwach konvex débilmente convexo HA 89 4

strongly convex fortement convexe stark konvex fuertemente con-vexo

CM 400 5

deformed difforme verunstaltet deformado RHA 271 6

35. M4 Seed: size Grain: taille Korn: Größe Semilla: tamaño

small petit klein pequeña RHA 801 3

medium moyen mittel media HA 89 5

large gros groß grande HA 292 7

very large très gros sehr groß muy grande HA 316 9

36.(*)(+)

M4 Seed: shape Grain: forme Korn: Form Semilla: forma

elongated allongé länglich elongada HA 60 1

narrow ovoid ovoïde étroit schmal eiförmig ovoide estrecha RHA 271 2

broad ovoid ovoïde large breit eiförmig ovoide ancha HA 89 3

rounded arrondi rundlich redondeada CM 447 4

37. M4 Seed: thicknessrelative to width

Grain: épaisseurpar rapport à lalargeur

Korn: Dicke imVerhältnis zurBreite

Semilla: grosorcon relación a laanchura

thin mince dünn delgada RHA 274 3

medium moyen mittel media RHA 271 5

thick épais dick gruesa 7


-17-

Stage 1)

Stade 1)

Stadium 1)

Estadio 1)


Note/Nota

38.(*)(+)

M4 Seed: main color Grain: couleurprincipale

Korn: Hauptfarbe Semilla: colorprincipal

white blanc weiß blanca 1

whitish grey gris-blanchâtre weißlich grau gris blancuzca 2

grey gris grau gris TRISUN 860 3

light brown brun clair hellbraun marrón clara 4

medium brown brun moyen mittelbraun marrón medio RHA 273 5

dark brown brun foncé dunkelbraun marrón oscuro 6

black noir schwarz negra HA 89 7


39.(*)(+)

M4 Seed: stripes onmargin

Grain: stries surles bords

Korn: Streifen amRand

Semilla: estrías enel borde


aucune ou trèsfaiblementmarquées


ninguna o muydébilmente defini-das

RHA 273 1

weakly expressed faiblementmarquées



H 52.9.1.1 2



HA 89 3

40.(*)(+)

M4 Seed: stripes be-tween margins

Grain: stries entreles bords

Korn: Streifenzwischen denRändern

Semilla: estríasentre los bordes


aucune ou trèsfaiblementmarquées


ninguna o muydébilmente defini-das

RHA 273 1

weakly expressed faiblement mar-quées



RHA 293 2



HA 89 3


-18-

Stage 1)

Stade 1)

Stadium 1)

Estadio 1)


Note/Nota

41. M4 Seed: color ofstripes

Grain: couleurdes stries

Korn: Farbe derStreifen

Semilla: color delas estrías

white blanches weiß blanco RHA 295 1

grey grises grau gris HA 89 2

brown brunes braun marrón HA 292 3

black noires schwarz negro Narval 30 4

42. M4 Seed: spots onpericarp

Grain: tâches surle péricarpe

Korn: Flecken aufder Samenschale

Semilla: manchasen el pericarpio

absent absentes fehlend ausentes 1

present présentes vorhanden presentes 9

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-19-

III. Explicaciones de la Tabla de caracteres

Ad. 6: Hoja: dentado

1 3 5 7 9

aislado o muyfino

fino medio grosero muy grosero

Ad. 7: Hoja: forma de la sección transversal (en el medio de la hoja)

sección transversal

1 2 3 4 5

fuertementecóncava

débilmentecóncava

plana débilmenteconvexa

fuertementeconvexa

Ad. 8: Hoja: forma de la parte distal

1 3 5 8 9

lanceolada triangularestrecha

triangularancha

acuminada redondeada

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-20-

Ad. 9: Hoja: aurículas

1 3 5 7 9

ausentes o muypequeñas

pequeñas medias grandes muy grandes

Ad. 10: Hoja: alas (parénquima en la base de los nervios laterales)

1 2 3

ausentes o muy débilmentedefinidas

débilmente definidas fuertemente definidas

Ad. 11: Hoja: ángulo de los nervios inferiores

1 2 3

agudo ángulo recto o casi ángulo recto obtuso

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-21-

Ad. 12: Hoja: altura de la punta del limbo en relación con la inserción del pecíolo

3 5 7

baja media alta

Ad. 14: Época de la floración

La época de floración se alcanza cuando 50% de las plantas están en flor. Se consideraque una planta está en flor cuando tiene al menos una flor ligulada erguida y coloreada.

Ad. 16: Flor ligulada: forma

1 2 3 4

fusiforme oval estrecha oval ancha redondeada

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-22-

Ad. 21 y 22: Flósculo (flor del disco): pigmentación antociánica del estigma

La pigmentación antociánica se registrará en estigmas del tercio central del capítulo,inmediatamente después de que haya aparecido el polen en la parte superior de lasanteras.

Ad. 24: Bráctea: forma

1 2 3

claramente elongada ni claramente elongada niclaramente redondeada

claramente redondeada

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-23-

Ad. 25: Bráctea: longitud del acumen

La punta comienza donde cambiala dirección de la curvatura

Ad. 28: Planta: altura

Diferentes condiciones del medio ambiente pueden requerir escalas separadas paralíneas, híbridos y variedades de polinización abierta.

Ad. 30: Planta: tipo de ramificación (excluyendo la causada por el medio ambiente)

1 2 3 4 5

sólo basal predominante-mente basal

total predominante-mente apical

sólo apical

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-24-

Ad. 32: Capítulo: porte

1 2 3 4 5

horizontal inclinado vertical semiinvertidocon el tallo recto

semiinvertidocon el talloarqueado

6 7 8 9

invertido con eltallo recto

invertido con el talloligeramente arqueado

invertido con el tallofuertemente arqueado

retorcido

Ad. 34: Capítulo: forma de la parte del grano

1 2 3 4 5 6

fuertementecóncavo

débilmentecóncavo

plano débilmenteconvexo

fuertementeconvexo

deformado

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-25-

Ad. 36: Semilla: forma

1 2 3 4

elongada ovoide estrecha ovoide ancha redondeada

Ad. 38: Semilla: color principal

El color principal de la semilla es aquel que ocupa la mayor superficie. En caso de dudaen cuanto a cuál es la mayor superficie, el color más oscuro es el color principal.

Ad. 39 y 40: Semilla: estrías

en el borde entre los bordes

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-26-

ESTADOS DE DESARROLLO DEL GIRASOL1

(Se llega a un estado cuando el 50% de las plantas se hallan en ese estado)

Germinación - Emergencia (A) Fase vegetativa (B)

A 1 A 2 B 3 – B 4

Aparición del hipocotilo en cayado. Emergencia de los cotiledones yprimeras hojas visibles

Aparición del segundo par de hojasopuestas que tiene 4 cmaproximadamente de longitud; lospecíolos son visibles desde arriba

Fase de botón floral (E)

E 1 E 2 E 4

Aparición del botón floralestrechamente insertado en medio

de las hojas jóvenes: estado debotón estrella.

El botón se separa de la corona foliar,las brácteas se distinguen claramentede las hojas. El diámetro oscila entre

0,5-2 cm.

El botón está claramenteseparado de las hojas; su

diámetro oscila entre 5-8 cm.Permanece horizontal. Una

parte de las brácteas estádesplegada.

1 Reproducido con la amable autorización de CETIOM (Francia)

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-27-

Floración (F) Maduración (M)

F 1 F 3.2 M 0

Inclinación del botón floral; lasflores liguladas son

perpendiculares al disco.

Los tres círculos de flósculos másexteriores tienen sus anteras

visibles y separadas y sus estigmasdesplegados

Caída de las flores liguladas. Laparte posterior del capítulo sigue

siendo verde.

Maduración (M)

M 2 M 3 M 4

La parte posterior delcapítulo es amarilla. Tres

cuartas partes de las brácteasson de color marrón. La

humedad de la semilla oscilaentre el 20% y el 25%.

La parte posterior del capítulo esde color marrón marmóreo. Eltallo comienza a secarse. La

humedad de la semilla esdel 15% aproximadamente.

Todos los órganos de laplanta son de color marrónoscuro. La humedad de la

semilla es del 10%aproximadamente.

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-28-

IX. Bibliografía

J.F. Miller: “Update on Inheritance of Sunflower Characteristics,” USDA - ARS, NorthernCrop Science Laboratory, Fargo, North Dakoto 58105, USA

ASFIS, GEVES, GNIS: “Description des géniteurs et variétés de tournesol”, édition 2000(English, French, Spanish), ASFIS, 44, rue du Louvre, 75001 Paris, FR

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-29-

X. Cuestionario técnico

Número de referencia (a rellenarpor la Administración)

CUESTIONARIO TÉCNICOa rellenar en relación con la solicitud de título de obtención vegetal

1. Especie Helianthus annuns L.

GIRASOL

2. Solicitante (nombre y dirección)

3. Denominación propuesta o referencia del obtentor

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-30-

4. Información sobre el origen, la conservación y la reproducción de la variedad

4.1 Tipo de material

a) línea endocriada– línea androestéril [ ]– línea masculina fértil [ ]

b) híbrido– híbrido androestéril [ ]– híbrido masculino fértil [ ]– híbrido de tres vías [ ]

c) variedad de polinización libre [ ]d) otros (indíquese) [ ]

4.2 Fórmula (cuando proceda, añádase la información a tenor de los párrafos 5 a 7 paracada componente, en hojas separadas).

Híbrido simple

(......................................) x (......................................)línea femenina línea masculina

Híbrido de tres vías

(......................................) x (......................................) línea parental femenina línea parental masculina

del híbrido simple utilizado como hembra x (......................................) línea parental masculina del híbrido de tres vías

NB: En caso de que se utilice el sistema de la adroesterilidad, indíquese el nombre de lalínea mantenedora de la línea parental femenina:

………………………………………………………………………………………….

4.3 Origen genético (a llenar para cada componente en el caso de una variedad híbrida)

Nombre del Componente Orígen genético Parentezco con cualquier otro componente conocido

… …. ….… …. ….

4.4 Otras informaciones

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-31-

5. Caracteres de la variedad que deben indicarse (el número entre paréntesis hacereferencia al carácter correspondiente en las Directrices de Examen; márquese el nivelde expresión apropiado).

Caracteres Variedades ejemplos Nota

5.1(4)

Hoja: color verde

claro H 52.9.1.1 3[ ]

medio HA 821 5[ ]

oscuro HA 303 7[ ]

5.2(5)

Hoja: abullonado

ausente o muy débil 1[ ]

débil HA 342, RHA 273 3[ ]

medio HA 291 5[ ]

fuerte HA 303, RHA 361 7[ ]

5.3(14)

Época de la floración

muy temprana HA 302, RHA 381 1[ ]

temprana RHA 273 3[ ]

media RHA 274 5[ ]

tardía RHA 271 7[ ]

muy tardía RHA 361 9[ ]

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-32-


5.4(19)

Flor ligulada: color

blanco amarillento 1[ ]

amarillo pálido 2[ ]

amarillo medio HA 89 3[ ]

amarillo naranja RHA 361 4[ ]

naranja CM 587, RHA 295 5[ ]

púrpura 6[ ]

marrón rojizo 7[ ]

multicolor 8[ ]

5.5(28)

Planta: altura

muy baja HA 379 1[ ]

baja HA 291 3[ ]

media RHA 801 5[ ]

alta H 52.9.1.1 7[ ]

5.6(29)

Planta: ramificación (excluyendo la causada por el medioambiente)

ausente HA89 1[ ]

presente RHA 271 9[ ]

5.7(39)

Semilla: estrías en el borde

ninguna o muy débilmente definidas RHA 273 1[ ]

débilmente definidas H 52.9.1.1 2[ ]

fuertemente definidas HA 89 3[ ]

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

-33-


5.8(40)

Semilla: estrías entre los bordes

ninguna o muy débilmente definidas RHA 273 1[ ]

débilmente definidas RHA 293 2[ ]

fuertemente definidas HA 89 3[ ]

6. Variedades con características similares y diferencias respecto de esas variedades

Denominación de lavariedad similar

Carácter en el que lavariedad similar es

diferenteo)

Nivel de expresión dela variedad similar

Nivel de expresión dela variedad candidata

______________o) Cuando los niveles de expresión de las dos variedades sean idénticos, se ruega indicar laamplitud de la diferencia.

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-34-

7. Información complementaria que pueda ayudar a distinguir las variedades

7.1 Resistencia a plagas y enfermedades

a) Mildiú velloso [ ](precísense las razas)

.........................................................................................................

.........................................................................................................

b) Roya [ ]c) Otras pestes o enfermedades [ ]

(especifíquese)

.........................................................................................................

7.2 Utilización

a) aceite y torta [ ]b) pájaros y consumo directo para el hombre [ ]c) ornamental [ ]d) otras utilizaciones

.........................................................................................................

7.3 Condiciones particulares para el examen de la variedad

7.4 Otros datos

8. Autorización para la diseminación

a) ¿Requiere la variedad autorización previa para su diseminación según lalegislación sobre protección del medio ambiente, la salud humana y animal?

Sí [ ] No [ ]

b) ¿Se ha obtenido dicha autorización?

Sí [ ] No [ ]

Si la respuesta a esta pregunta es sí, por favor incluya una copia de dicha autorización.

[Sigue el Anexo]

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ANEXO

Explicaciónes útiles adicionales

ÍNDICE PÁGINA

Parte I. Introducción .......................................................................... 2

Parte II. Caracteres obtenidos medianteelectroforesis .......................……………………………….. 3

Parte III. Descripción del método a emplear ......................................... 5

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

Anexo, página 2

Parte I

Introducción

El Anexo siguiente contiene una lista de caracteres obtenidos mediante electroforesis yuna descripción del método que debe emplearse. La UPOV ha decidido publicar esoscaracteres en un anexo de las Directrices de Examen, creando con ello una categoría especialde caracteres, habida cuenta de que la mayoría de los Estados miembros de la UPOV opinanque es imposible establecer la distinción solamente sobre la base de la diferencia encontradaen un carácter mediante electroforesis. Por consiguiente, se deberán emplear esos caracteressolamente como complemento de otras diferencias comprobadas para caracteres morfológicoso fisiológicos. La UPOV confirma que se consideran esos caracteres útiles pero que,aisladamente, no pueden ser suficientes para establecer la distinción. No se los debe emplearcomo caracteres de rutina, sino a petición, o con el acuerdo del solicitante de la variedadobjeto de la solicitud.

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Anexo, página 3

Parte II

Caracteres obtenidos mediante electroforesis

English français deutsch español Example VarietiesExemplesBeispielssortenVariedades ejemplo

Note/Nota

43.(+)

Allele expressionat locus Me1

Genotype 2/2

Genotype 4/4

Genotype 2/4

Expressionallélique au locusMe1

Génotype 2/2

Génotype 4/4

Génotype 2/4

Allel-Ausprägungim Locus Me1

Genotyp 2/2

Genotyp 4/4

Genotyp 2/4

Expresión alélicadel locus Me1

Genotipo 2/2

Genotipo 4/4

Genotipo 2/4

HA 89

RHA 274

Florence

1

2

3

44.(+)

Allele expressionat locus Pgd1

Genotype 2/2

Genotype 4/4

Genotype 2/4

Expressionallélique au locusPgd1

Génotype 2/2

Génotype 4/4

Génotype 2/4

Allel-Ausprägungim Locus Pgd1

Genotyp 2/2

Genotyp 4/4

Genotyp 2/4

Expresión alélicadel locus Pgd1

Genotipo 2/2

Genotipo 4/4

Genotipo 2/4

RHA 274

HA 850

Santafe

1

2

3

45.(+)

Allele expressionat locus Pgi2

Genotype 2/2

Genotype 4/4

Genotype 2/4

Expressionallélique au locusPgi2

Génotype 2/2

Génotype 4/4

Génotype 2/4

Allel-Ausprägungim Locus Pgi2

Genotyp 2/2

Genotyp 4/4

Genotyp 2/4

Expresión alélicadel locus Pgi2

Genotipo 2/2

Genotipo 4/4

Genotipo 2/4

RHA 274

H559211

Santafe

1

2

3

46.(+)

Allele expressionat locus Shdh1

Genotype 2/2

Genotype 4/4

Genotype 2/4

Expressionallélique au locusShdh1

Génotype 2/2

Génotype 4/4

Génotype 2/4

Allel-Ausprägungim Locus Shdh1

Genotyp 2/2

Genotyp 4/4

Genotyp 2/4

Expresión alélicadel locus Shdh 1

Genotipo 2/2

Genotipo 4/4

Genotipo 2/4

HA 89

RHA 856

Florence

1

2

3

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Anexo, página 4

English français deutsch español Example VarietiesExemplesBeispielssortenVariedades ejemplo

Note/Nota

47.(+)

Allele expressionat locus Pgm4

Genotype 2/2

Genotype 4/4

Genotype 2/4

Expressionallélique au locusPgm4

Génotype 2/2

Génotype 4/4

Génotype 2/4

Allel-Ausprägungim Locus Pgm4

Genotyp 2/2

Genotyp 4/4

Genotyp 2/4

Expresión alélicadel locus Pgm4

Genotipo 2/2

Genotipo 4/4

Genotipo 2/4

RHA 274

HA 89

Florence

1

2

3

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Anexo, página 5

Parte III

Descripción del método a emplear

Descripción del método para el análisis de isoenzimas en geles de almidón de Helinanthus annuus L.

1. Número de semillas por ensayo:

• Para revisar la fórmula:

10 plántulas para cada una de las líneas puras 4 plántulas para los híbridos simples10 plántulas para los híbridos 3 vías.

• Para los test de distinguibilidad, uniformidad y estabilidad:Al menos 40 semillas para líneas puras, híbridos y variedades de polinización libre.

2. Aparatos y equipo

Se puede utilizar cualquier sistema de electroforesis que mantenga los geles a 4º C. Serecomienda un grosor del gel de 10 mm. La fuente de alimentación utilizada deberá ser capazde proporcionar un voltaje constante.

3. Productos químicos

Todos los productos químicos deben ser de calidad “reactivo analítico” o mejores.

3.1 Productos químicos para la extracción de las enzimas

Tris (hidroximetil) aminometano (Tris)Acido clorhídricoβ-Mercaptoetanol

3.2 Productos químicos para la electroforesis

Azul de bromofenolAcido cítrico monohidratoL-HistidinaAlmidón hidrolizado, para electroforesis (Sigma S-45010 ó similar)

3.3 Reactivos para las tinciones de las enzimas

Etanol del 95%Acido etilendiaminotetraacético, sal disódica-2-hidrato (EDTA Na2)D-Fructosa 6-fosfato, sal disódicaα-D-Glucosa 1-fosfato, sal disódica monohidrato

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Anexo, página 6

Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (Sigma G-5885)Acido clorhídricoCloruro de magnesio seis hidrato (Mg Cl2.6H2O)Acido DL-málico, sal monosódicaDimetiltiazol difenil tetrazolio (MTT)β-Nicotinamida-adenina-dinucleótico fosfato (NADP)Cloruro de azul Nitrotetrazolio (NBT)Acido 6-fosfoglucónico, sal trisódica hidratadaFenazina metilsulfatoAcido sikimicoHidróxido sódico (NaOH)Tris-(hidroximetil)-aminometano (Tris)

4. Soluciones

4.1 Solución de extracción

Tris HCl 0,1 M (pH 7.2) + 2-mercaptoetanol al 0,2% (v/v)

4.2 Tampones de electroforesis

4.2.1 Tampones para electroforesis en geles de almidón pH 6.5

4.2.1.1 Solución stock: L-histidina-citrato 0,364 M

50,44 g de L-histidina8,34 g. de ácido cítrico monohidratoenrasar a 1 l con agua desionizada

4.2.1.2 Tampón de migración: L-histidina-citrato 0,072 M, pH 6,5 (Dilución de lasolución stock 1 en 5)

400 ml de solución stock (4.2.1.1)enrasar a 2 l con agua desionizada

4.2.1.3 Tampón del gel: L-histidina-citrato 0,024 M, (Dilución de la solución stock 1 en15)

80 ml de solución stock (4.2.1.1.)enrasar a 1.200 ml con agua desionizada

4.2.2 Tampones para electroforesis en geles de almidón pH 5.7

4.2.2.1 Tampón de migración: L-histidina-citrato 0,067 M. pH 5.7

20,18 g de L-histidina8,34 g.de ácido cítrico monohidrato

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

Anexo, página 7

enrasar a 2 l con agua desionizada

4.2.2.2 Tampón gel: L-histidina-citrato 0,011 M (tampón de migración diluido 1 en 6)

100 ml de tampón de migración (4.2.2.1.)enrasado a 1.200 ml con agua desionizada

4.2.2.3 Solución de azul de bromofenol

50 mg de azul de bromofenol disuelto en 100 ml. de agua desionizada.

4.3 Soluciones de tinción

4.3.1 Soluciones stock

4.3.1.1 Tris-HCl 1 M pH 7,5

121,1 g de Tris, enrasar a 1 l. con agua desionizada y ajustar a pH 7.5 con HCl al 50%.

4.3.1.2 Tris-HCl 1 M pH 8.5

121,1 g de Tris, enrasar a 1 l. con agua destilada y ajustar a pH 8.5 con HCl al 50%.

4.3.1.3 Solución de MTT

1 g de MTT, enrasar a 100 ml. con agua desionizada.

4.3.1.4 Solución de NBT

1 g de NBT, enrasar a 100 ml. con agua desionizada

4.3.1.5 Solución de PMS

200 mg de PMS, enrasar a 100 ml. con agua desionizada

4.3.1.6 Solución de MgCl2

10 g de Cloruro de magnesio hexahidratado, enrasar a 100 ml. con agua desionizada.

4.3.1.7 Solución de malato sódico

2,5 g de ácido DL-málico, enrasar a 50 ml. con agua desionizada y ajustar a pH 8.0 conNaOH 1 M.

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

Anexo, página 8

4.3.2 Soluciones de teñido

4.3.2.1 Solución de teñido de ME

100 ml de Tris-HCl 0,1 M, pH 7.5 (4.3.1.1. diluido 1 en 10) 4 ml de solución de malato sódico (4.3.1.7.) 1 ml de solución de NBT (4.3.1.4.) 1 ml de solución de PMS (4.3.1.5.)

1.8 ml de solución de MgCl2 (4.3.1.6.)17,5 mg de NADP

4.3.2.2 Solución de teñido de PGD+ PGI

100 ml de Tris-HCl 0,1 M, pH 7.5 (4.3.1.1. diluido 1 en 10)100 mg de D-fructosa 6-fosfato, sal disódica 60 mg de ácido 6-fosfoglucónico, sal trisódica 10 mg de NADP 1 ml. de (la) solución de MTT (4.3.1.3.) 1,5 ml de (la) solución de PMS (4.3.1.5.) 1 ml de (la) solución de MgCl2 (4.3.1.6.) 40 unidades de Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (Sigma G-5885)Para teñir PGI solamente, no añadir el ácido 6-fosfoglucónico.Para teñir PGD solamente, no incluir ni fructosa 6-fosfato, ni glucosa 6-fosfatodeshidrogensa.

4.3.2.3 Solución de teñido de ShDh

100 ml de Tris-HCl 0,2 M, pH 8.5 (4.3.1.2. diluido 1 en 5) 50 mg de ácido sikímico 1 ml de solución de MTT (4.3.1.3.) 1,25 ml de solución de PMS (4.3.1.5.) 12 mg de NADP

4.3.2.4 Solución de tinción de PGM

100 ml de Tris-HCl 0,1 M, pH 8.5 (4.3.1.2. diluido 1 en 10)150 mg de α-D- glucosa 1-fosfato,sal disódica monohidrato150 mg de EDTA, Na2

10 mg de NADP 1,5 ml de solución de MTT (4.3.1.3.) 1 ml de solución de PMS (4.3.1.5.) 4 ml de solución de MgCl2 (4.3.1.6.) 40 unidades de Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

Anexo, página 9

5. Procedimiento

5.1 Extracción de las enzimas

Se ponen a germinar las semillas en papel humedecido, durante 2 a 3 días, a 25ºC en laoscuridad. Se separan las cubiertas de las semillas y se trituran los cotiledones, a 4ºC enmicrotubos de 1,5 ml con 300 µl de tampón de extracción (4.1.)Los extractos se pueden mantener congelados a –30ºC ó a –80ºC.

5.2 Preparación del gel

Los geles se preparán el día anterior a aquel en que se va a realizar la emigración.Para fabricar 2 geles de almidón al 12,5 % (con unas dimensiones de 18x18x1 cm.) : semezclarán 128 g de almidón con 1.020 ml. de tampón gel (4.2.1.3. ó 4.2.2.2.) en un kitasato ycalentar hasta alcanzar los 78ºC. La mezcla se desgasifica con una bomba de vacío durante 30segundos. Se vierte el gel en el molde tal y como describa el manual del equipo utilizado. Sedebe evitar que queden burbujas en el gel. Los geles se mantienen durante 45 minutos atemperatura ambiente, para que se enfríen y después 1 hora en un refrigerador. Pasado esetiempo se cubren con una lámina de polietileno y se dejan toda la noche a temperaturaambiente, volviendo a enfriarlos a 4ºC 1 hora antes de la migración.

5.3 Electroforesis

Se llena cada cubeta de electrodo con el volumen necesario de tampón de migración(4.2.1.2. ó 4.2.2.1.) enfriado previamente a 4ºC. Se retira la lámina de polietileno y se hacendos cortes transversales en el gel, a 3 y 4 cm del borde del molde (zona del cátodo).Se quita esta lámina de gel y se colocan los extractos como sigue:

- Se descongelan los extractos (5.1.) y se absorben en mechas de papel de filtro (Whatmannº 3, de 1,5 mm. X 20 mm.)

- Se insertan estas mechas así embebidas en el gel, apretándolas bien contra el primer corte.- Se coloca una mecha embebida en solución de azul de bromofenol (4.2.2.3.) en cada uno

de los extremos del gel (como marcador de la migración).- Se vuelve a colocar en su sitio la lámina de gel y se cubre éste con una lámina de

polietileno.

Los dos geles, con los extractos en la zona catódica, se colocan en dos cubetas de tampónelectrodo, en un lugar refrigerado a 4ºC.La electroforesis tiene lugar a 4ºC, hacia el ánodo. A los 15’ de migración al primer voltaje,se quitan las mechas de papel y se aumenta el voltaje. Durante cada fase se debe mantener elvoltaje constante.

Las condiciones electroforéticas serán las siguientes:

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

Anexo, página 10

Sistemas de tampónVoltaje constante

Distancia recorridapor el azul debromofenol

Duración de lamigración

Histidina-citrato pH 5.7

260 V durante15 minutos. Después290 V

13 cm 5 h

Histidina-citrato pH 6.5

240 V durante 15 minutos.Después 280 V

11 cm 5 h

Las isoenzimas ME,PGD y PGI, se estudian en los geles realizados a pH 5.7, y lasenzimas PGM y ShDh en los geles de pH 6.5.

5.4 Tenido enzimático

Después de apagar la corriente eléctrica, el gel se corta horizontalmente en capas de 1 mm. degrosor con un alambre de acero o un hilo de pescar. La capa superior no se utiliza. Cada unade las capas restantes se tiñen con la siguiente solución de tinción, dejándolas incubando enoscuridad a 37ºC:

- Para ME: Solución 4.3.2.1. Tiempo de incubación 15 h.- Para PGD y PGI: Solución 4.3.2.2. Tiempo de incubación 1 h.- Para ShDH: Solución 4.3.2.3. Tiempo de incubación 1 h- Para PGM: Solución 4.3.2.4. Tiempo de incubación ½ h.

Después del teñido las capas se lavan con agua desionizada y se fijan en una solución deetanol al 40%.Si se quieren conservar las capas durante largo tiempo, se puede emplear uno de losprocedimientos siguientes: colocar la loncha en una solución al 5% de glicerol y secarladespués de un rato entre dos láminas de celofan mojadas en la misma solución de glicerol, oconservar la capa en bolsas de polietileno cerradas.

6. Reconocimiento de alelos que codifican isoenzimas

6.1 Reconocimiento de alelos que codifican ME

6.1.1 Interpretación genética de los zimogramas

Enzima Estructuracuaternaria

Locus Alelos

Enzima málico(ME)

Tetramérica Me1 24

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

Anexo, página 11

6.1.2 Esquematización de los zimogramas

Bandas

4 EM1 2 -3EM1 2 - 1 EM1 4 ---2 EM1 2 - 2 EM1 4 ---1 EM1 2 - 3 EM1 4 ---

4 EM1 4 -[Em1 2/2 4/4 2/4

6.2 Reconocimiento de alelos que codifican PGD



Locus Alelos

6-Fosfogluconatodeshidrogenasa(PGD)

Dimérica Pgd1 24


Bandas

PGD1 2 - PGD1 2 --PGD1 2 - PGD1 4 ----PGD1 4 - PGD1 4 ----

[Pgd1 2/2 4/4 2/4

Se pueden observar dos zonas de migración; sólo las bandas de más lenta migración sonpolimórficas.

6.3 Reconocimiento de alelos que codifican PGI



Locus Alelos

Fosfoglucoisomerasa(PGI)

Dimérica Pgi2 24

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

Anexo, página 12


Bandas

PGI2 2 - PGI2 2 -PGI2 2 – PGI2 4 ----PGI2 4 – PGI2 4 ----

[Pgi2 2/2 4/4 2/4

Se pueden observar dos zonas de migración, sólo se consideran las bandas de migración máslenta.

6.4 Reconocimiento de alelos que codifican ShDH



Locus Alelos

Sikimatodeshidrogenasa

Monomérica Shdh1 24

6.4.2. Esquematización de los zimogramas

Bandas

ShDH1 2ShDH1 4

[Shdh1 2/2 4/4 2/4

6.5 Reconocimiento de los alelos que codifican PGM



Locus Alelos

Fosfoglucomutasa Monomérica Pgm4 24


Bandas

PGM4 2PGM4 4 PGM3 4

[Pgm4 2/2 4/4 2/4

TG/81/6Girasol, 2000-04-05

Anexo, página 13

Pueden observarse varias zonas de migración, sólo la zona más rápida es polimórfica.

Existe otro gen que no ha sido considerado. Este ha sido designado como Pgm3, codificandoun enzima que coemigra con PGM4 4.

Por eso los genotipos Pgm4 2/2 y Pgm4 2/4, presentan un zimograma de dos bandas. Estosdos genotipos difieren únicamente en la intensidad relativa de sus bandas.

[Fin del documento]

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