Diagnostico de diabetes´ mediante espectroscopia Raman y ... · 2.4 Norma ANSI Z136.1-2007 ......

Diagnostico de diabetesmediante espectroscopia Raman

y hemoglobina glicosilada

por

M. en C. Jose Fabian Villa Manrıquez

Tesis sometida como requisito parcial para obtener elgrado de

DOCTOR EN CIENCIAS EN LA ESPECIALIDADDE OPTICA

en el

Instituto Nacional de Astrofısica, Optica y ElectronicaSeptiembre 2017

Tonantzintla, Puebla

Supervisada por:

Dr. Jorge Castro Ramos, INAOE

c©INAOE 2017El autor otorga al INAOE el permiso de reproducir y distribuir copias en su totalidad

o en partes de esta tesis.

Diagnostico de diabetes medianteespectroscopia Raman yhemoglobina glicosilada

por

M. en C. Jose Fabian Villa Manrıquez

Tesis sometida como requisito parcial para obtener el grado de

DOCTOR EN CIENCIAS EN LA ESPECIALIDAD DEOPTICA

en el

Instituto Nacional de Astrofısica, Optica y ElectronicaSeptiembre 2017

Tonantzintla, Puebla

Supervisada por:

Dr. Jorge Castro Ramos, INAOE

c©INAOE 2017El autor otorga al INAOE el permiso de reproducir y distribuir copias en su totalidad o en

partes de esta tesis.

Jurado de examen

Dr. Mauricio Ortiz Gutierrez, UMSNH

Dr. Francisco Gutierrez Delgado, CEPREC

Dr. Juan Jaime Sanchez Escobar, CETI

Dr. Sergio Vazquez y Montiel, UIEPA

Dr. Alberto Jaramillo Nunez, INAOE

v

Indice general

1 Introduccion 11.1 Objetivos y metas de la tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.1.1 Obetivos particulares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2 Teorıa 52.1 Glucosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52.2 Hemoglobina glicosilada (HbA1c) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72.3 Espectroscopıa Raman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

2.3.1 Introduccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82.3.2 Efecto Raman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

2.4 Norma ANSI Z136.1-2007 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142.5 Analisis de componentes principales (PCA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.5.1 Calculo de los Componentes Principales . . . . . . . . . . . . . . . . . 152.6 Maquinas de Soporte Vectorial (SVM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.6.1 SVM para clasificacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182.7 Curva ROC (Curva de Caracterısticas Operacionales del Receptor) . . . . . . . 23

3 Arreglo experimental 253.1 Componentes de espectrometro QE65000 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263.2 Ruidos en espectroscopia Raman y metodos de procesado . . . . . . . . . . . . 28

3.2.1 Wavelets symlets . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293.2.2 Metodo adaptativo MinMax . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

4 Resultados 334.1 Obtencion de Espectros Raman de pacientes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 334.2 Analisis de PCA-SVM para espectros Raman . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

5 Conclusiones 495.1 Trabajo a futuro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 505.2 Participaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 505.3 Publicaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

Apendices 51

vii

INDICE GENERAL INDICE GENERAL

A Consentimiento informado 51A.1 Informacion y forma de consentimiento para el sujeto adulto de estudio “Estu-

dio in-vivo de glucosa mediante espectroscopia Raman” . . . . . . . . . . . . 51

B Codigo para filtraje de espectros Raman 57

viii

Indice de figuras

2.1 Modelo tridimensional de la molecula de glucosa. Las partes negras representanlos atomos de carbono. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.2 Isoforma de la D- y L-glucosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62.3 Formacion no enzimatica de HbA1c. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82.4 Experimento de C.V. Raman donde se hace incidir la luz del sol a una muestra

para observar el cambio en la radiacion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92.5 Proceso de absorcion y emision de una molecula. . . . . . . . . . . . . . . . . 102.6 Diagrama de Jablonski. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122.7 Espectro Raman del sulfuro mostrando las bandas Rayleigh, Stokes y anti-Stokes. 132.8 Ejemplo de caso linealmente separable, donde la lınea continua y punteada son

los planos separadores. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192.9 Busqueda de hiperplano separador de las clases. . . . . . . . . . . . . . . . . . 192.10 Caso de clases no separables, los puntos caen dentro del plano de separacion de

clases. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212.11 Ejemplo de curvas ROC, A es una curva mala cuya area bajo la curva no rebasan

el 50 %, B es una curva regular ya que su area supera 60 % sin embargo siguesiendo mala, y C que es una curva buena ya que su area esta cercana a 100 %. . 24

3.1 Esquema del arreglo experimental para la obtencion de espectros Raman depacientes. a) Laser 785 nm, b) Espectrometro QE65000, c) Computadora, d)Punta de prueba y e) Muestra. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3.2 Componentes del espectrometro Raman QE65000. . . . . . . . . . . . . . . . 263.3 Diagrama de la punta de prueba. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273.4 Wavelets symlet 6 (izquierda) funcion de escala y funcion wavelet (derecha). . 293.5 Descomposicion de la senal usando wavelets. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303.6 Ajuste con el metodo MinMax de un espectro con fluorescencia de tipo Gaussiano. 31

4.1 Mapa de Juchitan y comunidades aledanas como Tehuantepec e Ixtepec, dondese obtuvieron los espectro de pacientes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

4.2 Glucometro empleado para la prueba de dextrostix. . . . . . . . . . . . . . . . 344.3 Obtencion de espectro Raman del dedo ındice de una paciente. . . . . . . . . . 384.4 Obtencion de espectro Raman de frente de una paciente. . . . . . . . . . . . . 384.5 Bandas encontradas de HbA1c, de acuerdo con lo reportado por I. Barman et

al. [39]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

ix

INDICE DE FIGURAS INDICE DE FIGURAS

4.6 Bandas encontradas de HbA1c, de acuerdo con lo reportado por I. Barman etal. [39], para un grupo de pacientes sanos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

4.7 Bandas encontradas de HbA1c, de acuerdo con lo reportado por I. Barman etal. [39], para un grupo de pacientes diabeticos controlados. . . . . . . . . . . . 40

4.8 Bandas encontradas de HbA1c, de acuerdo con lo reportado por I. Barman etal. [39], para un grupo de pacientes diabeticos no controlados. . . . . . . . . . 41

4.9 Procedimiento del analisis de espectros Raman y su clasificacion . . . . . . . . 424.10 PC 1 y 3 para la frente, la cual fue la mejor region para clasificar pacientes

diabeticos controlados (azules) y diabeticos no controlados (rojos) . . . . . . . 434.11 PC 2 y 3 para la frente, la cual fue la mejor region para clasificar pacientes sanos

(azules) y diabeticos controlados (rojos) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 434.12 PC 1 y 2 para dedo ındice, la cual fue la mejor region para clasificar pacientes

sanos (azules) y diabeticos no controlados (rojos) . . . . . . . . . . . . . . . . 444.13 Espectro Raman de Aspirina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 454.14 Componentes principales entre pacientes diabeticos controlados vs no contro-

lados y el espectro de Aspirina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 464.15 Curva ROC de los resultados de la clasificacion usando PCA-SVM, para cada

grupo de pacientes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

x


“Nunca pienso en el futuro. Llega demasiado pronto”.Albert Einstein

“La vida es y siempre seguira siendo una ecuacion incapaz de resolver,pero tiene ciertos factores que conocemos”.

Nikola Tesla

xi

Dedicatoria

A mis padres Guillermo Villa Venegas† y Marıa de los Angeles Manrıquez Lopez.

A mis hermanos Lennin, Miguel y Daniel.

A Tere por su amor, sus ensenanzas y por hacer de mi vida diferente.

Y a toda mi familia que siempre me ha apoyado.

xiii

Agradecimientos

Quiero agradecer a mis padres por su gran apoyo a lo largo de mi vida academica y por confiaren mi. A mi asesor el Dr. Jorge Castro Ramos por su apoyo y por permitirme trabajar en sugrupo. A mi gran amigo el Dr. Adrian E. Villanueva por sus ensenanzas y sus consejos. Al Dr.Francisco Gutierrez, Lorena Vengas y CEPREC por permitirme realizar la parte experimentalde esta tesis y por su gran apoyo en mi estancia en Juchitan Oaxaca. Al INAOE por permitir-me realizar mis estudios de posgrado. A CONACyT por la beca otorgada para la manutenciondurante mis estudios de doctorado. A Teresa Cerda por su amor, carino, ensenanzas y por rega-larme el ultimo ano de doctorado mucha felicidad. Mi amigo Dr. Abraham Lopez por su apoyoy amistad en gran parte del posgrado. A mis companeros del grupo de GIOB. A la coordinacionde optica, a Paty y Eisela por su gran ayuda en toda mi estancia del posgrado. A mis profesoresde posgrado por ensenarme lo importante que es la optica en el mundo. A mis companeros delposgrado y todos mis amigos que he conocido a lo largo de estos 6 anos por Puebla.

A mis sinodales los doctores Mauricio Ortiz Gutierrez, Francisco Gutierrez Delgado, JaimeSanchez Escobar, Sergio Vazquez y Montiel y Alberto Jaramillo Nunez, por sus criticas y co-mentarios para mejorar esta tesis.

xv

Resumen

En este trabajo de tesis se identifico y clasifico niveles altos y bajos de hemoglobina glicosilada(HbA1c) en pacientes diabeticos y sanos, 86 pacientes fueron evaluados, las mediciones fueronrealizadas en el centro de estudios y prevencion del cancer A.C. (CEPREC) en Juchitan Oaxaca,Mexico. Los espectros Raman se obtuvieron en tres zonas del cuerpo: dedo ındice, lobulo deoreja derecha y frente. Las mediciones fueron realizadas para comparar las diferencias entre pa-cientes sanos y diabeticos, de los cuales 15 fueron sanos, 22 diabeticos “controlados” (es decir,su nivel de hemoglobina glicosilada < 6.5 %) y 49 “no controlados” (su nivel de hemoglobinaglicosilada > 6.5 %). Dichos valores son establecidos por la Organizacion Mundial de la Salud(OMS), como riesgo bajo y alto respectivamente. Utilizando metodos multivarible como Anali-sis de Componentes Principales (PCA) combinado con Maquinas de Soporte Vectorial (SVM),se desarrollo un algoritmo para clasificar entre estos tres grupos (sanos, diabeticos controladosy no controlados). La frente fue la mejor zona para diferenciar entre sanos contra diabeticoscontrolados y diabeticos controlados contra no controlados, con una sensibilidad y especifici-dad de 100 %, 100 % y 100 %, 60 %, respectivamente para cada grupo de pacientes; mientrasque para diferenciar entre pacientes sanos contra diabeticos no controlados, el dedo ındice fuela mejor zona de medicion con una sensibilidad y especificidad de 100 % y 80 %, respectiva-mente. Para validar la eficacia del algoritmo se calculo la curva de caracterısticas operacionalesdel receptor (curva ROC), con areas bajo la curva de 0.99 para diabeticos controlados contrano controlados y 1 para sanos contra diabeticos controlados y no controlados, respectivamente.Tambien se lograron obtener algunas bandas Raman reportadas en el analisis de la HbA1c, lascuales se encuentran aproximadamente en 1000, 1200, 1400 y 1600 cm−1. En general este tra-bajo demuestra que la combinacion de espectroscopıa Raman y PCA-SVM son una herramientafactible en el diagnostico no invasivo de diabetes clasificando cualitativamente niveles altos ybajos de HbA1c in vivo.

xvii


Abstract

In this doctoral thesis, it was possible to identify and classify high and low levels of glycatedhemoglobin (HbA1c) in diabetic patients and healthy volunteers, 86 patients were evaluated,the measurements were carried in Centro de Estudios y prevencion del Cancer A.C. (CEPREC)from Juchitan Oaxaca, Mexico. Raman spectra were measured in three anatomical regions of thebody: index fingertip, right ear lobe, and forehead. The measurements were performed to com-pare the difference between healthy volunteers and diabetic patients, of whom 15 were healthyvolunteers, 22 well-controlled diabetic patients (i.e. HbA1c < 6.5 %) and 49 not controlleddiabetic patients (i.e. HbA1c > 6.5 %). These values were established by world OrganizationHealthy (HOW), like a low and high-risk, respectively. Multivariable methods such as PrincipalComponents Analysis (PCA) combined with Support Vector Machine (SVM) were used to de-velop effective diagnostic algorithms for classification among these groups (Healthy volunteers,well-controlled diabetic and not controlled diabetic patients). The forehead was the best anato-mical region to differentiate between healthy volunteers versus well-controlled diabetic patients,and well-controlled diabetic versus not controlled diabetic patients show highest sensitivity andspecificity, of 100 %, 100 %, and 100 %, 60 %, respectively for each group of patients; while theindex fingertip show the best sensitivity and specificity of 100 % and 80 %, respectively. Theefficacy of diagnostic algorithm by Receiver Operating Characteristic (ROC) curve was confir-med, with the area under ROC 0.99 for well-controlled diabetic versus not controlled diabeticpatients and 1 for healthy volunteers versus well-controlled diabetic and not controlled diabeticpatients, respectively. It was also possible to obtain some Raman bands according to reportedin other research. These are approximately in 1000, 1200, 1400 and 1600 cm−1. Overall, ourstudy demonstrates that the combination of Raman spectroscopy and PCA-SVM are a feasiblenon-invasive diagnostic tool in diabetes to classify qualitatively high and low levels of HbA1cin vivo.

xviii

Capıtulo 1

Introduccion

La diabetes es una enfermedad cronica grave que sobreviene cuando el pancreas no producesuficiente insulina (hormona que regula la concentracion de azucar [glucosa] en la sangre oglucemia) o cuando el organismo no puede utilizar de manera eficaz la insulina que produce.La diabetes es un problema de salud publica importante y una de las cuatro Enfermedades NoTransmisibles (ENT) (como son enfermedades cardiovasculares, cancer, enfermedades respira-torias y diabetes). A escala mundial se calcula que 422 millones de adultos tenıan diabetes en2014 en comparacion con 108 millones en 1980. Desde 1980 la prevalencia mundial de la dia-betes (normalizada por edades) ha ascendido a casi el doble del 4.7 % al 8.5 % en la poblacionadulta, esto corresponde con un aumento de sus factores de riesgo tales como el sobrepeso y laobesidad. En el ultimo decenio, la prevalencia de diabetes ha aumentado con mas rapidez en lospaıses de ingresos medianos que en los de ingresos altos [1].

La diabetes causo 1.5 millones de muertes en 2012 y las elevaciones de la glucemia por encimade los valores ideales provocaron otros 2.2 millones de muertes por efecto de aumento del ries-go de sufrir enfermedades cardiovasculares y de otro tipo. De estas muertes, el 43 % se produceantes de la edad de 70 anos. El porcentaje de las muertes atribuibles a la hiperglucemia o a ladiabetes que se producen antes de los 70 anos de edad es mayor en los paıses de ingresos bajosy medianos que en los de ingresos altos. Esta enfermedad genera grandes perdidas economicaspara los diabeticos y sus familias, ası como para los sistemas de salud y las economıas nacio-nales, en forma de gastos medicos directos y de una perdida de trabajo e ingresos. Aunque lahospitalizacion y la atencion ambulatoria representan los mayores componentes del gasto.La diabetes de todo tipo puede producir complicaciones en muchas partes del cuerpo y aumen-ta el riesgo general de morir prematuramente. Algunas de las complicaciones a las que puedellevar son el infarto del miocardio, los accidentes cerebrovasculares, la insuficiencia renal, laamputacion de miembros inferiores, la perdida de agudeza visual y la neuropatıa. En el emba-razo, la diabetes mal controlada aumenta el riesgo de muerte fetal y otras complicaciones [1].La prueba principal para determinar si un paciente es candidato o tiene la enfermedad, es me-diante la prueba de extraccion sanguınea con el uso de un glucometro (pinchazo en un dedo yextraer una gota de sangre) o la prueba de laboratorio (extraccion de unos mililitros de sangre).Si los niveles son mayores a 126 mg/dL el paciente ya se considera propenso a la enfermedado bien un nivel de 200 mg/dL 2 horas despues de beber una solucion de 75 g de glucosa, estaprueba se llama test de tolerancia a la glucosa. Otra de las pruebas en el diagnostico de diabetes

1

es la prueba de hemoglobina glicosilada (HbA1c) (tambien extraen unos mililitros de sangre),si la concentracion de HbA1c es mayor a 6.5 % el pacientes ya se considera diabetico [2]

Con el proposito de desarrollar metodos de deteccion de glucosa de manera no invasiva, se hanpublicado varios trabajos implementando tecnicas no invasivas, como el caso de Cygnus Inc. [3]introdujeron el GlucoWatch, un sensor de glucosa electroquımico cuyo funcionamiento basicoes la iontoforesis, el cual implica un paso de corriente muy debil a traves de la piel. Yuqig et al.[4] desarrollaron un biosensor utilizando saliva para medir los niveles de glucosa sanguınea. Loanterior son solo un ejemplo de algunos desarrollos de dispositivos, sin embargo existe una granvariedad de investigaciones con otras tecnicas no invasivas, como: ultrasonido, espectroscopiade infrarrojo [5], bioimpedancia [6], espectroscopıa de fluorescencia, polarimetrıa, tomografıaoptica coherente (OCT), espectroscopıa ocular, fotoacustica y espectroscopıa Raman [7], [8].Otros de los metodos para detectar glucosa en la sangre de manera no invasiva, se desarrollo enla universidad Syracuse por el Dr. Chaiken [18–22], el instrumento mide en la yema de losdedos usando luz infrarroja, en la que colectan esparcimiento Raman, Rayleigh y Mie ademasde la fluorescencia. Debido a que los dedos son zonas altamente vascularizadas, son buenaspara recolectar informacion de la sangre. El aparato incluye medios para la colocacion precisay reproducible de los tejidos en relacion con la abertura optica para manipular la cantidad desenal obtenida en las mediciones. Con el se producen observaciones y mediciones reproduciblesque permiten palpacion consistente de los tejidos de una amplia gama de tipos de piel, con unapresicion de 92 % y un coeficiente de correlacion de 0.8.Uno de los laboratorios que lleva mucho tiempo trabajando en la deteccion de glucosa es elGeorge Harrison el cual estaba dirigido por el Dr. Feld (hasta su fallecimiento en 2010) [23–28].El principal obstaculo que se enfrentaron es que la luz en el infrarrojo cercano penetra solo lamitad de un milımetro por debajo de la piel, por lo que mide la cantidad de glucosa en el lıquidoque bana las celulas de la piel (conocida como lıquido intersticial), no la cantidad en la sangre.Para superar esto, desarrollaron un algoritmo que relaciona las dos concentraciones, lo que lespermite predecir los niveles de glucosa en sangre a partir de la concentracion de glucosa en ellıquido intersticial. Sin embargo, esta calibracion se hace mas difıcil inmediatamente despuesde que el paciente come o ingiere bebidas azucaradas, por que la glucosa en la sangre se elevarapidamente, mientras que se requieren 5 a 10 minutos para ver un aumento correspondienteen los niveles de glucosa en fluido intersticial. Por lo que las mediciones de lıquido intersticialno dan una idea exacta de lo que esta sucediendo en el torrente sanguıneo. Para abordar estetiempo de retraso, Barman y Kong desarrollaron un metodo de calibracion, llamado correccionde concentracion dinamica (DCC), que incorpora la velocidad a la que la glucosa se difundedesde la sangre hacia el lıquido intersticial. En un estudio de 10 voluntarios sanos, los investi-gadores utilizaron espectroscopia Raman calibrada con DCC para aumentar significativamentela precision de las mediciones de glucosa en la sangre obteniendo una mejora promedio del 15por ciento y hasta un 30 por ciento en algunos pacientes [29].

La espectroscopıa Raman es empleada para detectar vibraciones en moleculas. Esta es exten-samente usada para proveer informacion de estructuras quımicas y para identificar sustancias apartir de las caracterısticas de los patrones espectrales o “huellas digitales” y para determinarcualitativamente o semicualitativamente la cantidad de una sustancia en una muestra [10].Dado que la espectroscopıa Raman tiene un amplio rango de aplicaciones en el area de biomedi-ca debido a que es una tecnica no destructiva, tambien puede adecuarse para realizar la toma de

2

CAPITULO 1. INTRODUCCION

espectros directamente in vivo y ademas obtener la informacion en tiempo real [12]. Las prin-cipales aplicaciones de Raman en piel son deteccion de lesiones o cancer [13,14], contenido delıpidos [15], concentraciones de glucosa, colesterol, trigliceridos, urea y albumina presentes enla sangre [16] y cancer de seno [17]

Otra alternativa en la medicion de glucosa in vivo es usando espectroscopıa Raman de mejora-miento de superficie conocida como SERS (por sus siglas en ingles Surface Enhanced RamanSpectroscopy). En la universidad de Northwestern el grupo del Dr. Van Duyne [30–35] ha rea-lizado muchos de los trabajos que se reportan en la literatura respecto a esta tecnica. El metodoconsiste en una tecnica optica altamente especıfica y sensible adecuada para la deteccion direc-ta de la glucosa. El efecto SERS es altamente dependiente de la distancia focal, con lo que lasmoleculas de glucosa que estan dentro de unos pocos nanometros o absorbido a una superficieSERS activa pueden no reaccionar y por tanto la senal sera baja. Este sensor, se realiza con unamonocapa auto-ensamblada (SAM) que facilita las interacciones reversibles entre moleculas deglucosa y la superficie. La cantidad de glucosa cerca de la superficie es proporcional a su con-centracion en el medio ambiente circundante.Se han reportado pocos trabajos con respecto al uso de espectroscopıa Raman para identificarhemoglobina glicosilada; Syamala Kiran et al [36] utilizaron espectroscopıa de resonancia Ra-man de mejoramiento de superficie conocida como SERRS (por sus siglas Surface EnhancedResonance Raman Spectroscopy) para analizar las diferencias entre la hemoglobina (Hb) y he-moglobina glicosilada (HbA1c), encontrando la banda 827 cm−1 de HbA1c para diferenciarlarespecto a Hb. Dichas mediciones se realizaron a la sustancia pura la cual fue adquirida enSigma-Aldrich (Hb) y en Lee Biosolution Inc. (HbA1c) con nanopartıculas de plata (Ag NPs).Su Heo et al. [37] realizaron un estudio para detectar niveles de hemoglobina glicosilada usan-do la tecnica resonancia de plasmones en superficies localizadas LSPR (del ingles LocalizedSurface Plasmon Resonance) y espectroscopıa Raman de mejoramiento de superficie (SERS) ydisenaron un chip basado en LSPR usando una placa plastica, con el cual mejoran bastante lasenal Raman, amplificando las bandas de algunos biomarcadores para la deteccion de diabetes.J. Lin et al. [38] aplico espectroscopıa Raman a muestras de hemoglobina glicosilada derivadasde sangre humana, encontrando tres bandas de gran intensidad 1562, 1580 y 1621 cm−1. 1562cm−1 es atribuido a CβCβ , 1580 cm−1 atribuido fenilalanina y modo asimetrico CαCm quetambien contribuye en 1621 cm−1. Estos picos estan relacionados con el grupo vinilo con res-pecto al nucleo porfirina por lo que los altos contenidos de niveles de glucosa no solo influyenen funcion de las proteınas, tambien afectan la estructura Hemo. Demostrando que la espectros-copia Raman combinada con analisis multivariable como analisis de componentes principales(PCA) y discriminante lineal (LDA), se puede distinguir entre pacientes sanos y diabeticos conuna especificidad y sensibilidad de 92.3 % y 73 % respectivamente.I. Barman et al. [39] reportan un metodo analıtico para cuantificar hemoglobina glicosilada,usando espectroscopia Raman de deposicion de capas por gota DCDR (por sus siglas en inglesdrop coating deposition Raman). Logrando diferenciar entre hemoglobina y hemoglobina gli-cosilada con diferentes concentraciones, usando analisis de componentes principales.Lo anterior muestra los trabajos mas importantes reportados en cuanto al estudio de diabetescon el uso de espectroscopia Raman. Como podemos ver el monitoreo de glicemia con espec-troscopia Raman es un tema bastante estudiado, mientras que la hemoglobina glicosilada invivo es un tema poco estudiado, su enfoque principal ha sido en la identificacion de sus bandascaracterısticas in vitro. Por lo que estos trabajos nos motivaron para realizar un estudio in vivo

3

1.1. OBJETIVOS Y METAS DE LA TESIS

ya que no hay trabajos realizados en cuanto al analisis de HbA1c in vivo.

1.1 Objetivos y metas de la tesis

El objetivo principal de esta tesis consiste en obtener espectros Raman in vivo de pacientesdiabeticos y sanos y clasificarlos por su nivel alto o bajo de HbA1c, utilizando metodos mul-tivariable como Analisis de Componentes Principales (PCA) y Maquinas de Soporte Vectorial(SVM), correlacionando los resultados clınicos, con los espectros obtenidos. Con ello propo-ner la espectroscopia Raman como una herramienta para el diagnostico no invasivo de diabetesmediante HbA1c.

1.1.1 Obetivos particulares

• Obtener espectros Raman in vivo de pacientes diabeticos y sanos con distintos niveles dehemoglobina glicosilada en tres zonas del cuerpo, dedo ındice, lobulo de oıdo y frente.Para determinar si tiene un nivel alto o bajo de esta.

• Combinar Analisis de Componentes Principales y Maquinas de Soporte Vectorial pa-ra clasificar los pacientes e incrementar la sensibilidad y especificidad del diagnostico,correlacionando los espectros Raman con los resultados clınicos, para entrenar el clasifi-cador.

• Usar la espectrocopıa Raman como una herramienta de diagnostico no invasivo de diabe-tes mediante hemoglobina glicosilada.

Por lo que la estructura de la tesis se divide como sigue: En el capıtulo 2 se describe lo quees la glucosa y hemoglobina glicosilada (HbA1c), ası como la parte teorica de la tecnica deespectroscopıa Raman y los metodos multivariable utilizados en esta tesis, como son analisis decomponentes principales (PCA) y maquinas de soporte vectorial (SVM) y la curva ROC que esuna herramienta para mostrar la validez de la clasificacion.El capıtulo 3 describe el arreglo experimental utilizado, ası como las componentes del es-pectrometro Raman para finalizar con la descripcion de los tipos de ruidos presentes en es-pectroscopia Raman y los metodos matematicos para el filtrado.En el capıtulo 4 se detallan las mediciones realizadas a los pacientes y los resultados logradosen este trabajo de tesis y por ultimo en el capıtulo 5 las conclusiones logradas en este trabajo,finalizando con el trabajo a futuro y la publicacion derivada de este proyecto.

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Capıtulo 2

Teorıa

En este capıtulo se describe la glucosa y hemoglobina glicosilada (HbA1c), ası como la teorıade espectroscopıa Raman y los metodos multivariable empleados en la clasificacion de hemo-globina glicosilada alta y baja, como son analisis de componentes principales (PCA) y maquinasde soporte vectorial (SVM).

2.1 Glucosa

La glucosa es un monosacarido, que es el carbohidrato central en la fisiologıa humana, cuyaformula molecular es C6H12O6 [40] se muestra en la figura 2.1. El nombre viene de la palabragriega “glykys” (γλνκν ′ς), que significa “dulce”. Existen dos tipos de isomeros de glucosa,el D-glucosa y L-glucosa (figura 2.2) y ambos son opticamente activos con quiralidad opuesta.Sin embargo, solo la D-glucosa esta involucrada con el metabolismo humano. La L-glucosa estapresente en los alimentos pero no puede ser usado en celulas de mamıferos. La glucosa es laforma de transporte de carbohidratos y el combustible importante para alimentar de energıa elmetabolismo en todas las celulas humanas [41]. La glucosa es participante de una gran cantidadde reacciones bioquımicas que modulan el metabolismo tanto en fisiologıa como en patologıa.La glucosa juega un papel crıtico en la produccion de proteınas y lıpidos. Los niveles de glu-cosa en sangre son un parametro de alta predictibilidad en desordenes como diabetes mellitus,enfermedad coronaria e hipertension arterial.

Figura 2.1: Modelo tridimensional de la molecula de glucosa. Las partes negras representan losatomos de carbono.

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2.1. GLUCOSA

Figura 2.2: Isoforma de la D- y L-glucosa.

Para el diagnostico definitivo de diabetes mellitus y otras categorıas de la regulacion de glucosa,se usa la determinacion de glucosa en plasma o suero. En ayunas de 10 a 12 horas, las glicemiasnormales son < 100 mg/dl. En un test de sobrecarga oral a la glucosa (75g), las glicemiasnormales deben ser: Basal < 100, a los 30, 60 y 90 minutos < 200 despues de ingerir la bebidacon glucosa y los 120 minutos post sobrecarga < 140 mg/dl.

Diabetes MellitusEl paciente debe cumplir con alguno de estos 3 criterios para ser confirmado en otra oportunidady asegurar el diagnostico.

• Glicemia (en cualquier momento) ≥ 200 mg/dl, asociada a sıntomas clasicos (poliuria,polidipsia, baja de peso).

• Dos o mas glicemias ≥ 126 mg/dl.

• Respuesta a la sobrecarga a la glucosa alterada con una glicemia a los 120 minutos postsobrecarga ≥ 200 mg/dl.

Intolerancia a la glucosaSe diagnostica cuando el sujeto presenta una glicemia de ayuno < 126 mg/dl y a los 120 mi-nutos post sobrecarga oral de glucosa entre 140 y 199 mg/dl.

Glicemia de ayuno alteradaUna persona tiene una glicemia de ayuno alterada si tiene valores entre 100 y 125 mg/dl.Sera conveniente estudiarla con una sobrecarga oral de glucosa [42].

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CAPITULO 2. TEORIA

2.2 Hemoglobina glicosilada (HbA1c)

El origen de los globulos rojos es la medula osea, su vida media es de aproximadamente 120dıas. La cantidad de globulos rojos que se producen diariamente es aproximadamente igual ala de globulos rojos que se retiran de circulacion por parte del hıgado y del bazo, por lo quela cantidad de globulos en una persona en cualquier momento es casi siempre la misma. Lafuncion principal de la hemoglobina es transportar los gases de la respiracion, mientras quelos globulos rojos a su vez tienen como funcion transportar la hemoglobina. La hemoglobinacomprende de cuatro cadenas de aminoacidos, cada una unida a un componente hemo. La es-tructura primaria de la hemoglobina consiste en una secuencia lineal de aminoacidos, unida poruniones covalentes componiendo ası las cadenas polipeptıdicas forman una helice (estructurasecundaria) que se mantiene por puentes de hidrogeno entre grupos carbonilo (C=O) y amida(N-H) de ciertos peptidos [43]. La hemoglobina glicosilada fue observada por primera vez porHuisman et al en 1958 [44] cuando buscaban los componentes heterogeneos de la oxihemo-globina por cromatografıa intercambiadora de cationes hemolizados de celulas rojas. Utilizarondesarrolladores a base de sodio, cianuro de potasio, fosfato de sodio y fosfato acido de sodio,observaron que existıa un componente menor que ocupaba cerca del 10 % de la hemoglobinatotal, al cromatografıar nuevamente la zona A1, vieron otras tres zonas a las cuales denomina-ron por su orden de elusion como HbA1a, HbA1b y HbA1c que se encontraban en proporciones1:1:4. Para la formacion de la hemoglobina glicosilada se lleva a cabo una reaccion dentro delglobulo rojo, que consiste en la union no enzimatica de la glucosa con la hemoglobina. Durantela reaccion, la glucosa se condensa con el grupo N-aminoterminal de la cadena beta de la hemo-globina, especıficamente al aminoacido valina formando una cetoamina poco estable llamadabase de Schiff, esta se forma continua y lentamente, es un enlace debil y muy disociable. Estahemoglobina glicosilada es una modificacion de la hemoglobina A (o hemoglobina normal) endonde no intervienen enzimas. Posteriormente el enlace cetoamina tambien llamado Pre-A1cda lugar a una modificacion llamada rearreglo de Amadori, para formar un enlace cetoaminaque es mas estable dando origen a la hemoglobina glicosilada [45]. Debido a este enlace es irre-versible, la hemoglobina glicosilada se empieza a acumular dentro de los globulos rojos lentay continuamente durante el lapso de vida de esta, que es en promedio de 120 dıas. El azucarcirculante en la sangre pasa a traves de la pared celular del globulo rojo y reacciona con lahemoglobina. En este primer paso la union del azucar a la hemoglobina ocurre rapidamente yesta union azucar-hemoglobina es reversible, por lo que si la concentracion de azucar decrece launion reversible se rompe facilmente. El producto del primer paso es un intermediario conocidopor los nombres: base Schiff, traccion labil, pre-A1c o aldimina. La base Schiff lentamente searreglara molecularmente para formar una union irreversible, este producto es la hemoglobinaglicosilada. Si las altas concentraciones de glucosa persisten la doble union de la aldimina, quees sumamente inestable, se arregla a traves de una reaccion de transposicion lenta (rearreglode Amadori) formandose un complejo glucosa-proteına de tipo cetoamina estable que ya no sedescompone y que subsiste durante la vida de la proteına y solo desaparece por degradacion(figura 2.3 [46]). La prueba de la hemoglobina glicosilada (HbA1c) es un examen que mide lacantidad de hemoglobina que se glicosila en la sangre (es decir la cantidad de azucar que se pe-go a la hemoglobina) y brinda un buen estimado de que tan bien esta siendo tratada la diabetesmellitus durante los ultimos 3 meses.

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2.3. ESPECTROSCOPIA RAMAN

Figura 2.3: Formacion no enzimatica de HbA1c.

2.3 Espectroscopıa Raman

2.3.1 Introduccion

Debido a la alta sensibilidad, alta informacion del contenido y su naturaleza no destructiva, laespectroscopia Raman es usada en una amplia gama de campos de la quımica, biologıa, geo-logıa, farmacologıa, ciencias forenses y ciencia de materiales. Librerıas espectrales de 16000compuestos estan disponibles para la directa identificacion de muestras [47]. Dado que la es-pectroscopia Raman es una tecnica no destructiva tiene un amplio rango de aplicaciones en elcampo de la biomedicina. Ya que la tecnica puede usarse de manera no invasiva es de particu-lar interes en la investigacion de la piel. Por ejemplo se ha demostrado que los cambios en lacomposicion y estructura molecular son resultado de enfermedades que se ven reflejadas en elespectro Raman [48]. Esta tecnica mide los modos fundamentales de las vibraciones molecula-res por lo que es sensible a cambios estructurales de las muestras [49].

2.3.2 Efecto Raman

El fenomeno de esparcimiento inelastico de la luz fue postulado por Smekal en 1923 y obser-vado experimentalmente por primera vez en 1928 por el fısico Hindu Chandrasekhara VenkataRaman y K. S. Krishnan [50] (figura 2.4). Desde entonces el fenomeno ha sido referido comoespectroscopia Raman. En el experimento original la luz del sol fue enfocada por un objetivode telescopio de 18 cm de apertura y 230 cm de longitud focal y por una segunda lente de 5cm de longitud focal. En el foco de la segunda lente se coloco el material de esparcimientoque fue ya sea un lıquido purificado o de vapor libre de polvo. Un sistema de filtros opticosse uso para mostrar la existencia de radiacion esparcida con una frecuencia alterada de la luzincidente, caracterısticas basicas de la espectroscopia Raman. Los filtros fueron de color azul-violeta combinado con un filtro amarillo-verde los cuales se colocaron en la luz incidente, pero

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CAPITULO 2. TEORIA

esta desaparecıa por completo cuando pasaba por el lıquido o vapor. La luz reaparecıa cuandoel filtro amarillo-verde se colocaba despues de la muestra, dicha luz era la radiacion esparcidamodificada.

Figura 2.4: Experimento de C.V. Raman donde se hace incidir la luz del sol a una muestra paraobservar el cambio en la radiacion.

Cuando la luz interactua con la materia, los fotones que constituyen la luz pueden ser absorbi-dos o esparcidos o pueden no interactuar con el material y pueden pasar a traves de este. Lasvariaciones de frecuencia observadas en el fenomeno de esparcimiento Raman, son equivalen-tes a variaciones de energıa. A cada uno de los movimientos vibracionales y rotacionales de lamolecula le correspondera un valor determinado de energıa molecular. Si una molecula interac-tua con un campo electromagnetico puede ocurrir una transferencia de energıa del campo a lamolecula, solo cuando se satisface la condicion de frecuencia de Bohr, es decir

∆E = hν = hc

λ= hcν, (2.1)

donde ∆E es la diferencia de energıa entre dos estados cuantizados, h la constante de Planck(6.62 x10−27 ergios s), c la velcocidad de la luz y ν es el nemero de onda el cual es directamenteproporcional a la energıa de transicion.

Supongamos que ∆E = E2 −E1 son las energıas del estado excitado y base, respectivamente.Entonces la molecula “absorbe” cuando se excita de E1 a E2 y “emite” cuando se revierte deE2 a E1 (figura 2.5).

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Figura 2.5: Proceso de absorcion y emision de una molecula.

Si la energıa de un foton incidente corresponde a la banda prohibida de energıa entre el estadobase de la molecula y un estado excitado, el foton puede ser absorbido y la molecula ascen-dera al estado excitado de mayor energıa. Es este el cambio que se mide en la espectroscopiade absorcion por la deteccion de perdida de energıa de la luz. Sin embargo esto solo es posiblepara fotones que interactuan con la molecula y son esparcidas por esta. En este caso no haynecesidad de que el foton tenga una energıa que coincida con la diferencia entre los dos nivelesde energıa de la molecula. El esparcimiento de fotones puede ser observado colectando la luzformando un angulo con el haz de luz incidente y siempre que no haya absorcion de cualquiertransicion electronica que tenga energıas similares al de la luz incidente, la eficiencia incremen-ta como la cuarta potencia de la frecuencia de la luz incidente [10]. La espectroscopia Ramanusa solo una frecuencia para irradiar la muestra y es esta la radiacion esparcida de la molecula,una unidad de energıa vibracional del haz incidente que es detectado. Ası a diferencia de laabsorcion infrarroja, el esparcimiento Raman no requiere que coincida la radiacion incidentecon la diferencia de energıa entre el estado base y excitado. En el esparcimiento Raman, la luzinteractua con la molecula y distorsiona (polariza) la nube de electrones alrededor del nucleopara formar un estado de vida corta llamado “estado virtual”. Este estado no es estable y el fotones rapidamente re-radiado [10]. Los cambios de energıa que son detectados en la espectroscopiavibracional son los necesarios para causar el movimiento nuclear. Si solo la nube de electronesdistorsionada es envuelta en el esparcimiento, los fotones seran esparcidos con un cambio muybajo de frecuencia. Este proceso de esparcimiento es considerado como esparcimiento elasticoy este es el proceso dominante. Para moleculas este es llamado esparcimiento de Rayleigh ytiene la misma frecuencia que el haz incidente (ν0). Sin embargo si el movimiento nuclear esinducido durante el proceso de esparcimiento, la energıa sera transferida ya sea desde el fotonincidente a la molecula o de la molecula al foton esparcido. En este caso el proceso es inelasticoy la energıa del foton esparcido es diferente a la del foton incidente por una unidad vibracio-nal [50]. La figura 2.6 muestra el proceso basico que ocurre para una vibracion. A temperaturaambiente, la mayorıa de las moleculas, pero no todas se encuentran en el nivel de energıa vi-bracional mas bajo. Ya que el estado virtual no es un estado real de la molecula pero es creadocuando el laser interactua con el electron y provoca la polarizacion, la energıa de este estadoes determinada por la frecuencia de la luz de la fuente usada. El proceso de Rayleigh sera elmas intenso ya que la mayorıa de fotones se esparcen de esta manera. No se trata de cualquiercambio de energıa y consecuentemente el retorno de la luz de algunos estados de energıa. El

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CAPITULO 2. TEORIA

proceso de esparcimiento Raman del estado vibracional base conduce a la absorcion de energıapor la molecula y esta asciende a un nivel de energıa vibracional excitado virtual, este es llama-do esparcimiento Stokes (ν0 − νm)donde νm es la frecuencia de vibracion de la molecula [?].Sin embargo debido a la energıa termica, algunas moleculas pueden presentarse en un estadoexcitado ν = 1 tal como en la figura 2.6. El esparcimiento de estos estados al estado base esllamado esparcimiento anti-Stokes (ν0 +νm) y envuelve transferencia de energıa al foton espar-cido. Las intensidades relativas de los dos procesos dependen en la poblacion de varios estadosde la molecula. Estas poblaciones se pueden resolver a partir de la ecuacion de Boltzmann peroa temperatura ambiente, el numero de moleculas se espera que esten en un estado vibracionalexcitado mientras que otras en cualquiera de las energıas bajas [10].De acuerdo con la teorıa clasica el esparcimiento Raman puede explicarse como sigue: El campoelectrico E de una onda electromagetica lo podemos representar como sigue

E = E0Cos(2πν0t), (2.2)

donde E0 es la amplitud y ν0 la frecuencia del laser. Sı una molecula diatomica es radiada poruna onda como la anterior, se induce un momento dipolar P

P = αE = αE0Cos(2πν0t), (2.3)

donde, α es una constante de proporcionalidad llamada polarizabilidad. Si la molecula estavibrando con frecuencia νm el desplazamiento nuclear q se escribe

q = q0Cos(2πνmt), (2.4)

donde q0 es la amplitud. Para amplitudes vibracionales pequenas, α es una funcion lineal de q.Podemos escribir como sigue:

α = α0 +

(∂α

∂q

)0

+ ..., (2.5)

donde, α0 es la polarizabilidad de la posicion de equilibrio y (∂α/∂q)0 es la relacion de cambiode α con respecto al cambio en q evaluado en la posicion de equilibrio. Combinando 2.3 con2.4 y 2.5, obtenemos

P = αE0Cos(2πν0t)

= α0E0Cos(2πν0t) +

(∂α

∂q

)0

qαE0Cos(2πν0t)

= α0E0Cos(2πν0t) +

(∂α

∂q

)0

qαE0Cos(2πν0t)Cos(2πνmt)

= α0E0Cos(2πν0t) +1

2

(∂α

∂q

)0

qαE0[Cos2π(ν0 + νm)t+ Cos2π(ν0 − νmt)]

11


Figura 2.6: Diagrama de Jablonski.

De acuerdo con la teorıa clasica, el primer termino representa un dipolo oscilando radiandouna luz de frecuencia ν0 (esparcimiento Rayleigh), mientras el segundo termino corresponde alesparcimiento Raman de frecuencias ν0 + νm (anti-stokes) y ν0 − νm (stokes) [11].

Comparando el esparcimiento Stokes con el anti-Stokes, sera mas debil la frecuencia de vi-bracion, debido al decrecimiento de poblacion del estado excitado. Ademas el esparcimientoanti-Stokes se incrementara relativamente al esparcimiento Stokes conforme se eleva la tempe-ratura. Usualmente el esparcimiento Raman es recordado solo en la parte de las bajas energıaspara dar el esparcimiento Stokes pero ocasionalmente el esparcimiento anti-Stokes es preferido.Por ejemplo, cuando hay interferencia en la fluorescencia esta ocurrira a energıas mas bajas quela frecuencia de excitacion y consecuentemente el esparcimiento anti-Stokes puede usarse paraquitar la interferencia. La diferencia en intensidades de las bandas Raman en el esparcimientoStokes y anti-Stokes puede usarse solo para medir temperatura [10]. El espectro Raman esta for-mado por una banda principal o Rayleigh y dos series de bandas secundarias correspondientesa las bandas Raman Stokes y anti-Stokes, situadas simetricamente a ambos lados de la bandaRayleigh esto se muestra en la figura 2.7.

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CAPITULO 2. TEORIA

Cambio Raman (cm ) -1

Int

ensi

dad

(U

.A.)

Esparcimiento Rayleigh

Esparcimiento anti-Stokes

Figura 2.7: Espectro Raman del sulfuro mostrando las bandas Rayleigh, Stokes y anti-Stokes.

Para la absorcion infrarroja cada pico representa una energıa de radiacion absorbida por lamolecula. El eje Y da la cantidad de la luz absorbida y es usualmente mostrada con la maximaabsorbancia como el punto mas bajo en la senal. El esparcimiento Raman esta representado solocomo el espectro Stokes y esta dado como un cambio en la energıa de la energıa del haz. Estose obtiene sustrayendo la energıa esparcida de la energıa del laser. De este modo la diferenciade energıa correspondiente al estado vibracional base y excitado (figura 2.6) se obtiene. Ası ladiferencia de energıa es lo que esta medido directamente por el infrarrojo. El esparcimiento esmedido como la luz detectada por el espectrometro y el maximo valor de la luz detectado es elpunto mas alto en la senal. Estrictamente hablando, el esparcimiento Raman debe ser expresadocomo el cambio en la energıa de la radiacion de excitacion el cual se expresa simplemente comocm−1 [10]. Resaltando que el desplazamiento de las longitudes Raman respecto a la longitud deonda incidente ν0 es independiente de esta ultima y por ello suele tomarse este desplazamientocomo abscisa para representar los espectros Raman, situando el centro de la banda Rayleighcomo origen del eje. De tal forma que en el eje de las abscisas aparecera la diferencia entre lalongitud de onda Raman y la de excitacion del laser,

∆R(cm−1) =

(1

λ0(nm)− 1

λ1(nm)

)∗ 107, (2.6)

donde ∆R es el desplazamiento Raman en cm−1, λ0 es la longitud de onda de excitacion ennm y λ1 es la longitud de onda del espectro Raman en nm.

En ocasiones, debido a algunos materiales como tejidos biologicos, unido al efecto Ramanse produce fluorescencia que puede llegar a enmascarar las bandas Raman; en estos casos,podrıa resultar de interes medir el espectro anti-Stokes ya que a estas frecuencias, aunque elefecto Raman es mas debil, tambien lo es la fluorescencia y pueden observarse bandas en laparte anti-Stokes del espectro, que se encuentran enmascaradas en la parte Stokes [51]. En el

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2.4. NORMA ANSI Z136.1-2007

proceso de fluorescencia la molecula absorbe completamente al foton incidente y pasa a unestado electronico excitado y transcurre un tiempo (tiempo de vida media) cuando la moleculasufre una nueva transicion al estado electronico inferior remitiendo radiacion normalmente delongitud de onda superior a la que absorbio.

2.4 Norma ANSI Z136.1-2007

El uso de laser en el espectrometro Raman, implica ciertos cuidados en el uso con pacientes,ya que si la potencia utilizada es muy alta podemos danar al paciente. La norma encargada deregular el uso seguro de los laseres fue creada por el Instituto de estandares nacional Ame-ricano (ANSI del acronimo en ingles American National Standars Institute), con la intencionde proporcionar la clasificacion de los laseres, efectos biologicos y la maxima exposicion per-mitida (MPE) para el ojo y en el caso que nos interesa que es la piel. La ANSI Z136.1-2007proporciona las siguientes ecuaciones para calcular el maximo de exposicion permitida, comose mostrara a continuacion se tiene 3 diferentes ecuaciones para los distintos tiempos. Y unaecuacion mas para el factor de correccion (CA) el cual incrementa en el infrarrojo cercano en labanda espectral de (0.7-1.4 µm) basado en la reduccion de las propiedades de absorcion de lospigmentos de melanina granulados encontrados en la piel y el pigmento retinal del epitelium.

CA = 10λ−0.7 para λ = 0.7 a 1.05µm, (2.7)

λ = 0.4 hasta 1.4µm T = 10−9s a 10−7s MPE = 2CAx10−2(J/cm2), (2.8)

λ = 0.4 hasta 1.4µm T = 10−7s a 10s MPE = 1.1CAt0.25(J/cm2), (2.9)

λ = 0.4 hasta 1.4µm T = 10s a 30000s MPE = 2CA(J/cm2), (2.10)

Para este trabajo utilizamos la ecuacion 2.10 ya que el tiempo de integracion para las medicionesfue de 15 s.

2.5 Analisis de componentes principales (PCA)

Cuando se recopila informacion de una muestra de datos, lo mas frecuente es tomar el mayornumero posible de variables. Sin embargo, si tomamos demasiadas variables, lo normal es queesten relacionadas o que midan lo mismo bajo distintos puntos de vista. Por ejemplo, en estu-dios medicos, la presion sanguınea a la salida del corazon y a la salida de los pulmones estanfuertemente relacionadas. Entonces es necesario reducir el numero de variables. Es importanteresaltar el hecho de que el concepto de mayor informacion se relaciona con el de mayor varia-bilidad o varianza. Cuanto mayor sea la variabilidad de los datos (varianza) se considera queexiste mayor informacion. La tecnica de componentes principales tiene origen en los ajustes or-togonales por mınimos cuadrados introducidos por Karl Pearson en 1901 [52]. Las componentesprincipales tienen una doble utilidad: permiten representar optimamente un espacio de gran di-mension con pequenas observaciones de un espacio general p-dimensional. En este sentido, lascomponentes principales es el primer paso para identificar las posibles variables latentes, o noobservadas que generan los datos. Y permiten transformar las variables originales, en generalcorrelacionadas, en nuevas variables incorrelaciondas, facilitando la interpretacion de los datos.

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CAPITULO 2. TEORIA

2.5.1 Calculo de los Componentes Principales

La tecnica fue desarrollada por Pearson y posteriormente estudiadas por Hotelling en 1933.Sin embargo, hasta la aparicion de los ordenadores se empezo a popularizar. Para estudiar lasrelaciones que se presentan entre p variables correlacionadas (que pueden medir informacionen comun) se puede transformar el conjunto original de variables en otro conjunto de nuevasvariables incorreladas entre sı (es decir, que no tengan repeticion o redundancia en la informa-cion) llamado conjunto de componentes principales. Las nuevas variables son combinacioneslineales de las anteriores y se van construyendo segun el orden de importancia en cuanto a lavariabilidad total que recogen de la muestra. De manera ideal, se buscan m < p variables quesean combinaciones lineales de las p originales y que esten incorreladas, recogiendo la mayorparte de la informacion o variabilidad de los datos [53].Se considera una serie de variables (x1, x2, ..., xp) sobre un grupo de objetos o individuos yse trata de calcular, a partir de ellas, un nuevo conjunto de variables y1, y2, ..., yp, incorreladasentre sı, cuyas varianzas vayan decreciendo progresivamente.Cada yj (donde j = 1, ..., p) es una combinacion lineal de las x1, x2, ..., xp originales, es decir:

yj = aj1x1 + aj2x2 + ...+ ajpxp, (2.11)

Obviamente, si lo que queremos es maximizar la varianza, como veremos luego, una formasimple podrıa ser aumentar los coeficientes aij . Por ello para mantener la ortogonalidad de latransformacion se impone que el modulo del vector aj = (a1j , a2j , ..., apj) sea 1. Es decir,

a′jaj =

p∑k=1

a2kj = 1, (2.12)

El primer componente se calcula eligiendo a1 de modo que y1 tenga la mayor varianza posible,sujeta a la restriccion de que a

′1a1 = 1. El segundo componente principal se calcula obte-

niendo a2 de modo que la variable obtenida, y2 este incorrelada con y1. Del mismo modo seeligen y1, y2, ..., yp incorrelados entre sı, de manera que las variables aleatorias obtenidas vayanteniendo cada vez menos varianza.

Extraccion de factores

Queremos elegir a1 de modo que se maximice la varianza de y1 sujeta a la restriccion de quea′1a1 = 1

V ar(y1) = V ar(a′1x) = a

′1

∑a1, (2.13)

El metodo habitual para maximizar una funcion de varias variables sujeta a restricciones es usarel metodo de los multiplicadores de Lagrange. El problema consiste en maximizar la funciona′1

∑a1 sujeta a la restriccion a

′1a1 = 1. Se puede observar que la incognita es precisamente

a1 (el vector desconocido que nos da la combinacion lineal optima). Ası, se construye la funcionL:

15

2.5. ANALISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES (PCA)

L(a1) = a′1

∑a1 − λ(a1

′a1 − 1), (2.14)

buscando el maximo derivando e igualando a cero:

∂L

∂a1= 2

∑a1 − 2λIa1 = 0 =⇒ (2.15)(∑

−λI)a1 = 0. (2.16)

Para que el sistema tenga solucion distinta de cero, el determinante de la matriz tiene que sersingular, es decir, el determinante debe ser igual a cero:

|∑−λI| = 0. (2.17)

de modo que, λ es un autovalor de∑

. La matriz de covarianzas∑

es de orden p y si ademases definida positiva, tendra p autovalores distintos, λ1, λ2, ..., λp tales que, λ1 > λ2 > ... > λp.Desarrollando la expresion anterior,

(∑−λI

)a1 = 0 (2.18)∑

a1 − λIa1 = 0 (2.19)∑a1 = λIa1 (2.20)

entonces,

V ar(y1) = V ar(a′1x) = a

′1

∑a1 = a

′1λIa1 (2.21)

= λa′1a1 = λ · 1 = λ. (2.22)

Ahora, para maximizar la varianza de y1 se tiene que tomar el mayor autovalor, supongamosλ1, y el correspondiente autovector a1, entonces

y1 = a′1x = a11x1 + a12x2 + ...+ a1pxp. (2.23)

El segundo componente principal, y2 = a′2x, se obtiene de manera analoga, pero se quiere y2

este incorrelado con el anterior componente y1, entonces, Cov(y2, y1) = 0. Por lo tanto:

Cov(y2, y1) = Cov(a′1x,a

′1x) = (2.24)

= a′2 · E[(x− µ)(x− µ)

′] · a1 = (2.25)

= a′2

∑a1, (2.26)

16

CAPITULO 2. TEORIA

es decir, se requiere que a′2

∑a1 = 0.

Entonces todos los componentes y (en total p) se pueden expresar como el producto de unamatriz formada por los autovectores, multiplicada por el vector x que contiene las variablesoriginales x1, ..., xp

y = Ax

Donde

y =

y1y2...yp

, A =

a11 a12 . . . a1pa21 a22 . . . a2p

......

. . ....

ap1 ap2... app

, x =

x1x2...xp

como

V ar(y1) = λ1

V ar(y2) = λ2

. . .

V ar(yp) = λp

la matriz de covarianzas de y sera

Λ =

λ1 0 . . . 00 λ2 . . . 0...

.... . .

...

0 0... λp

ya que y1, ..., yp se ha construido como variables incorreladas.

2.6 Maquinas de Soporte Vectorial (SVM)

Las maquinas de soporte vectorial (SVM) fueron introducidas por Vladimir Vapnik en 1995,basado en la idea de minimizacion del riesgo estructural (SRM) [54]. Esta tecnica se usa comoclasificador y algunas de las aplicaciones son el reconocimiento de imagenes como rostro ycategorizacion de textos. Las SVM mapean los puntos de entrada a un espacio de caracterısti-cas de una dimension mayor, para luego encontrar el hiperplano que los separa y maximice elmargen entre las clases. Pertenece a la familia de los clasificadores lineales puesto que induceseparadores lineales o hiperplanos en espacios de caracterısticas de muy alta dimensionalidad(introducidos por funciones nucleo o kernel). La formulacion matematica de las maquinas de

17

2.6. MAQUINAS DE SOPORTE VECTORIAL (SVM)

soporte vectorial varıa dependiendo de la naturaleza de los datos; es decir, existe una formula-cion para los casos lineales, ası como, para los casos no lineales. Es importante tener claro que,de una manera general para clasificacion, las maquinas de soporte vectorial buscan encontrar unhiperplano optimo que separe las clases. Las maquinas de soporte vectorial han sido desarro-lladas como una tecnica robusta para clasificacion y regresion aplicado a grandes conjuntos dedatos complejos con ruido; es decir, con variables inherentes al modelo que para otras tecnicasaumenta la posibilidad de error en los resultados pues resultan difıciles de cuantificar y observar.

2.6.1 SVM para clasificacion

Se debe construir un hiperplano que separe las dos clases, etiquetadas como y ∈ {−1, 1}, deforma que la distancia entre el hiperplano optimo y el patron de entrenamiento mas cercano (omargen), sea maxima, con la intencion de forzar la generalizacion de la maquina de aprendizaje.La solucion del hiperplano optimo debe ser descrita como la combinacion de unos pocos puntosde entrada que son llamados vectores de soporte. Sin ningun conocimiento del mapeo, la SVMencuentra el hiperplano optimo utilizando el producto punto con funciones en el espacio decaracterısticas que son llamadas Kernels.

Caso linealmente separable

Supongamos que tenemos un conjunto de puntos etiquetados para entrenamiento como se apre-cia en la figura 2.8, cada punto xi de entrenamiento pertenece a alguna de dos clases y se da unaetiqueta yi ∈ {−1, 1} con dos clases, w1, w2. Una solucion para esta situacion es mapear el es-pacio de entrada en un espacio de caracterısticas de una dimension mayor y buscar el hiperplanooptimo con margen maximo. Debemos encontrar el hiperplano

g(x) = wx + w0 = 0 (2.27)

donde w es el vector ortogonal al hiperplano y w0 una constante. Entonces se dice que elconjunto de puntos es linealmente separable si existen (w, w0) tales que

wx + w0 ≥ 1, ∀x ∈ w1

wx + w0 ≤ −1, ∀x ∈ w2

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CAPITULO 2. TEORIA

Figura 2.8: Ejemplo de caso linealmente separable, donde la lınea continua y punteada son losplanos separadores.

Figura 2.9: Busqueda de hiperplano separador de las clases.

Sea zi la distancia mas corta entre el hiperplano y el punto mas cercano (clase 1 o clase 2),

19


entonces zi se define como

zi =1

‖ w ‖(2.28)

para hallar la frontera que mejor separa un conjunto de puntos segun las SVM, se maximiza ladistancia z. Maximizar 1

‖w‖ es la misma solucion que minimizar ‖w‖2

2 . El problema se puedeexpresar en su formulacion dual que es mas facil de resolver. Para ello, se utiliza la ecuacion deLagrange y las condiciones de Karush-Kuhn-Tucker [55] las cuales son:

∂

∂wL(w, w0, λ) = 0 (2.29)

∂

∂w0L(w, w0, λ) = 0 (2.30)

λi ≥ 0, i = 1, 2, ..., N (2.31)

λi[yi(wx + w0)− 1] = 0, i = 1, 2, ..., N (2.32)

donde λ es el vector de los multiplicadores de Lagrange, λi, y L(w, w0, λ) es la funcion deLagrange definida como:

L(w, w0, λ) =1

2‖ w ‖ −

N∑i=1

λi[yi(wx + w0)− 1] (2.33)

Combinando 2.33 con 2.29 y 2.35 tenemos

w =

N∑i=1

λiyixi (2.34)

N∑i=1

λiyi = 0 (2.35)

Las condiciones de Karus-Kuhn-Tucker implican que, solo en el caso en el que los datos noson vectores soporte, λi = 0. En la ecuacion del hiperplano se puede observar que este solodepende de los vectores soporte ya que el resto de los puntos cumplen λ = 0. Esto significaque si se volviera a calcular la frontera de decision unicamente con los vectores de soporte sellegarıa a la misma solucion.

20

CAPITULO 2. TEORIA

Caso no separable

Cuando las clases no son linealmente separables, lo anterior expuesto no necesariamente esvalido. En la figura 2.11 se muestra el caso en que dos clases no son separables, cualquierintento por dibujar un hiperplano, nunca tendremos una buena separacion de las clases. Paratratar con datos que no son linealmente separables, el analisis previo puede ser generalizadointroduciendo algunas variables no-negativas ξi ≥ 0 [55] de tal modo que ahora tenemos:

yi(wx + w0) ≥ 1− ξi, i = 1, 2, ..., N (2.36)

las variables ξi son conocidas como variables de holgadura (slack variables).

Figura 2.10: Caso de clases no separables, los puntos caen dentro del plano de separacion de clases.

Matematicamente el problema es minimizar la funcion

J(w, w0, ξ) =1

2‖ w ‖2 +C

N∑i=1

I(ξi) (2.37)

donde ξ es el vector de los parametros ξi y C una constante positiva.

I(ξi) =

1, ξi > 0

0 ξi = 0

sujeto a la restriccionyi[wx + w0] ≥ 1− ξi,

21


por lo que el problema de los multiplicadores de Lagrange queda dado por:

L(w, w0, ξ, λ, µ) =1

2‖ w ‖2 +C

N∑i=1

ξi −n∑i=1

µiξi −N∑i=1

λi[yi(wx + w0)− 1 + ξi] (2.38)

Las correspondientes condiciones de Karush-Kuhn-Tucker son:

∂L

∂w= 0 o w =

N∑i=1

λiyixi (2.39)

∂L

∂w0= 0 o w =

N∑i=1

λiyi = 0 (2.40)

∂L

∂ξi= 0 o C − µi − λi = 0, i = 1, 2, ..., N (2.41)

λi[yi(wx + w0)− 1 + ξi] = 0, i = 1, 2, ..., N (2.42)

µiξi = 0, µi ≥ 0, λi ≥ 0, i = 1, 2, ..., N (2.43)

siguiendo el mismo procedimiento utilizado en el caso linealmente separable, la solucion vienedada por:

Maximizar

N∑i=1

λi −1

2

∑ij

λiλjyiyjxixj (2.44)

sujeto a

0 ≤ λi ≤ C,N∑i=1

λiyi = 0, i = 1, 2, ..., N.

Las maquinas de soporte vectorial tienen ciertas caracterısticas que las han puesto en venta-ja respecto a otras tecnicas de clasificacion. Una de dichas caracterısticas es que las mismaspertenecen a las disciplinas de aprendizaje automatico o aprendizaje estadıstico. La idea quehay detras de este tipo de aprendizaje es la de hacer que las maquinas puedan ir aprendiendo,a traves de ejemplos. La diferencia mas notable de las SVM con respecto a otros algoritmosde aprendizaje, es la aplicacion de un nuevo principio inductivo, que busca la minimizacion

22

CAPITULO 2. TEORIA

del riesgo estructural, ademas del uso de una funcion nucleo o kernel, atribuyendole una grancapacidad de generalizacion, incluso cuando el conjunto de entrenamiento es pequeno. Se diceque tanto la capacidad de generalizacion como el proceso de entrenamiento de la maquina nodependen necesariamente del numero de atributos, lo que permite un excelente comportamientoen problemas de alta dimensionalidad.

2.7 Curva ROC (Curva de Caracterısticas Operacionales del Re-ceptor)

Uno de los problemas medicos mas comunes es el de clasificacion o tomar una decision clınica.Clasificar a un paciente con la presencia o ausencia de determinada enfermedad se logra a travesde las “pruebas diagnosticas” de las cuales es importante conocer su exactitud o precision. Lacurva ROC (Receiver Operator Characteristic) es una de las herramientas mas usadas para eva-luar la exactitud de estos tests, aun cuando la variable en la prueba que se desea estudiar seael tiempo que tarda en ocurrir un suceso. El caso mas sencillo que se puede plantear es el deuna prueba dicotomica, en donde se clasifica a cada paciente como sano o enfermo en funcionde que el resultado de la prueba sea positivo o negativo. En casos como este, generalmente unresultado positivo se asocia con la presencia de enfermedad y un resultado negativo con la au-sencia de la misma. El resultado puede ser correcto (verdadero positivo y verdadero negativo)o incorrecto (falso positivo y falso negativo). En 1947, Yerushalmy [56] introduce los terminosde sensibilidad y especificidad como indicadores estadısticos que evaluan el grado de eficienciainherente a una prueba diagnostica.

Sensibilidad es un parametro que se mide en el grupo de sujetos que verdaderamente estan en-fermos. Por tanto, es la probabilidad de obtener un resultado positivo cuando el individuo tienela enfermedad, o la proporcion de verdaderos positivos. La sensibilidad es importante cuandouna enfermedad no debe pasar desapercibida y cuando el pronostico mejora mucho con el tra-tamiento precoz.

La especificidad es un parametro que se mide en el grupo de sujetos no enfermos. Es el cocienteentre verdaderos negativos y el total de no enfermos. Por tanto, es la posibilidad de obtener unresultado negativo cuando el individuo no tiene la enfermedad. La especificidad es importantecuando la enfermedad cambia la vida del enfermo o tiene cierto estigma y tambien cuando lasconsecuencias de un tratamiento suponen un riesgo para el enfermo (amputacion, etc.)

Sensibilidad =V erdaderoPositivo

FalsoNegativo+ V erdaderoPositivo(2.45)

Especificidad =V erdaderoNegativo

FalsoPositivo+ V erdaderoNegativo(2.46)

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2.7. CURVA ROC (CURVA DE CARACTERISTICAS OPERACIONALES DEL RECEPTOR)

La curva ROC es un grafico en el que se observan todos los pares de sensibilidad y comple-mento de especificidad, resultantes de la variacion continua de todos los puntos de corte en todoel rango de resultados observados. Esta curva nos permite la evaluacion visual de la exactitudmediante el area bajo la curva ROC la cual debe ser 1 para el caso perfecto.

Figura 2.11: Ejemplo de curvas ROC, A es una curva mala cuya area bajo la curva no rebasan el50 %, B es una curva regular ya que su area supera 60 % sin embargo sigue siendo mala, y C que esuna curva buena ya que su area esta cercana a 100 %.

En este capıtulo se describio la estructura y niveles adecuados de glucosa y hemoglobina gli-cosilada los cuales se deben mantener para pacientes sanos y diabeticos y no correr riesgos ycomplicaciones derivadas de esta enfermedad. Se describio la teorıa Raman explicando el prin-cipio fısico del fenomeno. La norma ANSI que regula el uso seguro de laseres en aplicacionesen piel. Por ultimo se describieron los metodos multivariable que se usaran para la clasificacionde los pacientes sanos y diabeticos (como analisis de componentes principales y maquinas desoporte vectorial), y la matematica que involucra para el calculo de estas. Finalizando con ladescripcion de la curva ROC la cual nos permite de manera grafica probar que tan eficiente esel algoritmo para la clasificacion.

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Capıtulo 3

Arreglo experimental

En esta seccion se describe el arreglo experimental utilizado en este trabajo de tesis y los rui-dos presentes en la espectroscopıa Raman, ya que uno de los principales problemas cuando seobtienen espectros Raman en tejido biologico es la presencia de ruido y fluorescencia de fondo(Background), ası como los metodos implementados para la reduccion de este.

El arreglo experimental para las mediciones de espectros Raman consta de un laser de 785nm como fuente de excitacion 1 el cual se hace incidir sobre la piel mediante una punta deprueba que consta de dos fibras; una de excitacion y otra de coleccion la cual va conectada alespectrometro QE65000 2 (figura 3.1) de Ocean Optics que incluye un arreglo CCD lineal co-nectado con la circuiterıa necesaria para la operacion del espectrometro, dando como resultadoun sistema compacto y flexible, con ninguna de sus partes moviles. La distancia focal de lapunta de prueba es de 7.5 mm, distancia en la cual se obtiene una mejor intensidad de la senalRaman. El espectrometro es conectado a una computadora mediante un puerto USB 2.0 el cualtiene el software Spectra Suite r desarrollado por Ocean Optics.

Figura 3.1: Esquema del arreglo experimental para la obtencion de espectros Raman de pacientes.a) Laser 785 nm, b) Espectrometro QE65000, c) Computadora, d) Punta de prueba y e) Muestra.

1∗ http://www.inphotonics.com/probeRPB.htmhttp://bwtek.com/products/cleanlaze/

2∗ https://oceanoptics.com/product/qe-pro-raman/

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3.1. COMPONENTES DE ESPECTROMETRO QE65000

3.1 Componentes de espectrometro QE65000

En la figura 3.2 se muestra el esquema del espectrometro QE65000, con las diferentes compo-nentes (numeradas del 1 al 8) de este.

Figura 3.2: Componentes del espectrometro Raman QE65000.

1. Conector SMA: Asegura la entrada de la fibra en el espectrometro. La luz entra a la fibrade entrada y esta lo conduce al banco optico desde el conector.

2. Rendija (slit): Una pieza de material oscuro que contiene una abertura rectangular, lacual va montada directamente detras del conector SMA. El tamano de la abertura regulala cantidad de luz que entra al banco optico y controla la resolucion espectral. Tambiense puede utilizar el QE65000 sin rendija. En esta configuracion, el diametro de la fibraconectada al QE65000 determina el tamano de la entrada de apertura.

3. Filtro: Restringe las radiaciones opticas pertenecientes a la longitud de onda del laser. Laluz pasa a traves del filtro antes de entrar al bando optico. Ambos filtros pasa altas y pasabanda estan disponibles para limitar la radiacion a determinadas regiones de longitud deonda.

4. Espejo colimador: La luz que entra hacia el banco optico es enfocada hacia la rejilladel espectrometro. La luz entra en el espectrometro, pasa a traves del conector SMA, larendija y el filtro, entonces se refleja en el espejo colimador dentro de la rejilla.

5. Rejilla: La luz reflejada del espejo colimador es directamente difractada por la rejilla. Lasrejillas estan disponibles en diferentes densidades de lınea, lo que le permite especificarla longitud de onda de cobertura y resolucion en el espectrometro.

6. Espejo de enfocamiento: este recibe la luz reflejada de la rejilla y la enfoca en el detectorCCD o la lente de coleccion L2 (dependiendo de la configuracion de espectrometro).

7. Area del detector con enfriamiento: Provee el 90 % de eficiencia cuantica y la caja depıxeles de una columna vertical permite adquirir la luz en su totalidad a la altura de laabertura de la imagen del espectrometro. Esto mejora la luz recogida y la senal-ruidosignificativamente.

26

CAPITULO 3. ARREGLO EXPERIMENTAL

8. Detector con filtro OFLV: Elimina los efectos de segundo orden y se utiliza con una rejillade HC-1 en un sistema de 200-950 nm de longitud de onda en un QE65000.

Las caracterısticas del espectrometro QE65000:

• El rango espectral es de 780 a 1000 nm.

• La resolucion optica es de aproximadamente 0.14 a 7.7 nm y FWHM (∼ 6 cm−1).

• Tiempo de integracion de 8 ms a 15 min.

• Punta de prueba Raman RIP-RPB con nucleo de zafiro.

La punta de prueba consta de dos fibras montadas juntas, una de ellas se adjunta a la fuentede excitacion laser y se ilumina la zona de muestreo. La otra fibra recoge la luz esparcida ytransmite la energıa al espectrometro.

La punta de prueba se basa en un diseno patentado (U.S. Patent 5, 112, 127) que optimiza elrendimiento optico de la fibra. Esta se trata de fibra de dos sondas, una fibra se utiliza parala excitacion y otro para la coleccion. La superposicion entre los dos extremos de fibra se haoptimizado mediante el uso de una lente de enfoque, de la cual sale la luz laser y se obtienela coleccion de la radiacion esparcida. La trayectoria del haz se muestra en la figura 3.3. En elextremo de la fibra de excitacion, se utiliza una lente colimadora de la luz laser; un filtro pasabanda que elimina las bandas Raman del zafiro, por lo que solo transmite luz laser. El filtrodicroico transmite la lınea laser la cual va una lente que enfoca la luz en la muestra; la mismalente recoge la luz que es esparcida 180o desde la direccion del haz laser, la senal de colecciones entonces reflejada por el filtro dicroico a traves del filtro pasa altas que solo transmite la luzcon esparcimiento Raman Stokes. Este ultimo filtro atenua la banda de Rayleigh en un factorde 108, lo que reduce la observacion de las bandas de Raman del zafiro que se obtiene en larecopilacion del haz por la fibra. Por ultimo, otra lente se utiliza para enfocar la luz en la fibrade salida en donde solo las bandas de la muestra llegaran al espectrometro. Los componentesopticos de la punta de prueba, son capaces de soportar temperaturas elevadas (hasta 300 oCaproximadamente), la distancia focal es de 7.5 mm aproximadamente y esta disenada para unlaser de 785 nm. A continuacion se muestra el diagrama de la punta de prueba.

Figura 3.3: Diagrama de la punta de prueba.

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3.2. RUIDOS EN ESPECTROSCOPIA RAMAN Y METODOS DE PROCESADO

La serie de laseres BRM tiene una lınea espectral angosta, alta potencia laser, desarrolladoespecıficamente para la aplicacion de la espectroscopia Raman. Es compacta y robusta, aptapara diversas aplicaciones industriales, con un laser integrado, con enfriador termoelectrico yconector de fibra.Las caracterısticas del laser son:

• Tiempo de calentamiento menor a 15 minutos.

• El tiempo de vida del laser es de 10 000 horas.

• Potencia de salida menor a 500 mW .

• Ancho de la lınea espectral es de 0.2 nm.

• Conector SMA 905

3.2 Ruidos en espectroscopia Raman y metodos de procesado

El “ruido” es la informacion indeseada debido a la electronica del instrumento, la respuesta sinconexion logica y eventos aleatorios. De tal manera que el ruido es tan solo un nombre que le ad-judicamos a aquellas senales que no nos interesan. Los ruidos mas habituales que encontramosen la espectroscopia Raman son el ruido de disparo y la fluorescencia de fondo, que se encuen-tran presentes a menudo en tejido biologico. El ruido de disparo (Shot noise) es una fuente deruido inevitable en la medicion de espectros Raman. Es un tipo de ruido electronico que tienelugar cuando el numero finito de partıculas que transportan energıa, tales como los electronesen un circuito electronico o los fotones en un dispositivo optico, es suficientemente pequenopara dar lugar a la aparicion de fluctuaciones estadısticas apreciables en una medicion [57]. Elnivel de este ruido es mayor cuando el valor promedio de la intensidad de corriente electricao la intensidad luminosa es mas grande, segun se trate de un dispositivo electronico u optico.Sin embargo, en tanto que el nivel de senal crece mas rapidamente cuanto mayor es su nivel depromedio, a menudo el ruido de disparo solo supone un problema cuando se trabaja con inten-sidades de corriente o luminosa bajas. El algoritmo de Wavelets divide la senal en diferentescomponentes de frecuencia. La descomposicion wavelets usa funciones espacialmente locali-zadas con valor promedio cero en vez de la convencional funcion sinusoidal de la transformadade Fourier y hace posible tener ambas informaciones de frecuencia y espacio. Basicamente, lasenal es representada en terminos de la suma de wavelets elementales [60].La transformada wavelet es la representacion de una senal en terminos de una forma de onda delongitud finita o de oscilacion rapidamente decreciente y con valor medio cero, llamada waveletmadre o funcion prototipo. Esta forma de onda se escala y desplaza para generar ondas que sise superponen igualan a la senal original. Se puede decir que es una funcion en terminos deoscilaciones tanto en el tiempo como en la frecuencia.

ψj,k(t) =1√sj0

ψ

(t− kτ0sj0

sj0

). (3.1)

Se puede cubrir el espectro finito de la senal con el espectro de wavelets, en la misma forma enque cubrimos el dominio del tiempo de nuestra senal con wavelets trasladadas. Si una wavelet

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puede verse como un filtro pasabanda, una serie de wavelets puede verse como un banco defiltros pasabanda. El analisis con wavelets permite una funcion prototipo o wavelet madre queno siempre es la misma, es decir las funciones base no siempre son iguales a diferencia de lo queocurre con la transformada de Fourier donde las funciones base son siempre el seno y coseno.

3.2.1 Wavelets symlets

Las wavelets Daubechies son una familia de wavelets ortogonales definidas por la transformadadiscreta wavelet y caracterizada por un numero maximo de vanish moments para darles algo desoporte. Cada una de este tipo de wavelets de esta clase, tiene una funcion escala la cual generaun analisis de multi-resolucion ortogonal [61]Las symlets son wavelets casi simetricas propuestas por Daubechies como modificacion de lafamilia Daubechies (db). Las propiedades de las dos familias son similares.Las propiedades de las symlets son:

• Son casi simetricas

• Ortogonales

• Biortogonales

Figura 3.4: Wavelets symlet 6 (izquierda) funcion de escala y funcion wavelet (derecha).

La espectroscopia Raman de una dependencia de intensidad de la luz esparcida inelasticamenteen desplazamiento Raman 1/λ de los fotones despues de su interaccion con el material. Elespectro resultante puede ser tomado como la senal modulada f(x), donde el eje x es el cambioRaman. El algoritmo de wavelets divide la senal f(x) en diferentes componentes de frecuencias.En contraste la descomposicion wavelets usa funciones espacialmente localizadas con valorpromedio cero en vez de la convencional funciones sinusoidales de la transformada de Fouriery hace posible tener ambas informaciones en frecuencia y espacio [60].Primero introducimos el espectro que se le va a quitar el ruido, luego se realiza la descomposi-cion en wavelets de la senal a un nivel 5 usando symlet 6. Finalmente se obtiene una senal sinruido pero con fluorescencia de fondo [57].

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3.2. RUIDOS EN ESPECTROSCOPIA RAMAN Y METODOS DE PROCESADO

Figura 3.5: Descomposicion de la senal usando wavelets.

3.2.2 Metodo adaptativo MinMax

El ruido de fluorescencia de fondo se presenta en el espectro Raman como una curva que enla mayorıa de los casos es de tipo Gaussiano con gran intensidad en la cual esta montado elespectro Raman. Para quitar esta curva la cual distorsiona la intensidad de las bandas Ramande interes existen distintos metodos para eliminarla, pero en este trabajo de tesis se utiliza elmetodo desarrollado por Alex Cao [62], debido a que fue disenado a tipos de fluorescencia decomportamiento Gaussiano que es el tipo que se presenta en tejido biologico. El metodo con-siste en una serie de ajustes de curvas y reasignacion iterativa de puntos de control. El metodoinicia con un ajuste polinomico del espectro original, en la siguiente iteracion, para cada valorde x, el valor mınimo de y de cualquiera ya sea del ajuste polinomico o el espectro original esseleccionado como punto de control para el siguiente ajuste de la curva. Este proceso se repitehasta que un criterio de convergencia especificado se cumple, o hasta que el numero maximode iteraciones se alcance. El criterio de convergencia es que el numero de puntos reasignadosse mantendrıa constante durante 10 iteraciones consecutivas o 200 iteraciones, lo que ocurraprimero.En la practica es posible encontrarse con una amplia gama de proporciones relacion fluorescencia-senal Raman F/S, dependiendo de la instrumentacion y el tipo de muestra, es difıcil predecirla cantidad de correccion necesaria de antemano. Se define la relacion F/S como la fluores-cencia maxima dividida por el esparcimiento Raman maximo (es decir, restarse del espectro)de la senal cuando se mide con respecto a un valor mınimo de intensidad cero. La definicion

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establece que la razon F/S permanece constante si el espectro se desplaza a lo largo del eje y(es decir, su intensidad), ya que el perfil (fluorescencia + esparcimiento Raman) sigue siendoidentico. El ajuste polinomial no se realiza sistematicamente en todas las proporciones de F/S,ya que esta relacion puede variar dependiendo de la muestra. Por lo que se propone una tecnicade dos pasos que toma ventaja de los beneficios de cada ajuste polinomial. El primer paso im-plica el ajuste polinomico con y sin restricciones para dos diferentes ordenes. El primer ordensera determinado por la parte adaptada del algoritmo basada en la relacion fluorescencia-senalRaman F/S. El segundo paso toma el valor maximo entre el punto inicial y el punto final delajuste (figura 3.6). A esta tecnica le llaman metodo “MinMax”. La parte “min” de la tecnicaes la primara parte del algoritmo que toma el punto mınimo entre el espectro y el ajuste po-linomico, esto se hace para evitar el sobreajuste de los datos. La parte “max” de la tecnica esla segunda parte del algoritmo que toma el valor maximo entre todos los ajustes polinomicosrealizados. En la figura 3.6 se muestra el ajuste del espectro Raman con el metodo MinMax.

Desplazamiento Raman (cm )-1

Inte

nsid

ad R

ela

tiva

Ajuste

Espectro

Figura 3.6: Ajuste con el metodo MinMax de un espectro con fluorescencia de tipo Gaussiano.

En este capıtulo se describio las componentes del arreglo experimental y los metodos utilizadospara remover el ruido y sustraer la fluorescencia de fondo. Los cuales son parte que no se deseanen un espectro Raman para poder hacer una buena asignacion de bandas espectrales. El metodowavelets usado para reducir el ruido es muy eficaz ya que no se pierde mucha intensidad almomento de filtrar la senal. En el metodo MinMax tambien es bueno pero esta el inconvenientede buscar y asignar un polinomio para remover la fluorescencia de fondo.

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Capıtulo 4

Resultados

En este capıtulo se presenta el desarrollo de las mediciones realizadas en pacientes, respetandolos lineamientos clınicos del Centro de Estudios y Prevencion del Cancer (CEPREC), ası comolos resultados que se obtuvieron en este trabajo. El estudio se realizo invitando a la poblacionde las comunidades aledanas a Juchitan de Zaragoza en el estado de Oaxaca, a participar enpruebas de deteccion de glucosa y hemoglobina glicosilada en el cual participaron 86 pacientes,en su mayorıa adultos mayores de 45 anos con distintos niveles de HbA1c y glicemia.

4.1 Obtencion de Espectros Raman de pacientes

Para la obtencion de espectros Raman in vivo de pacientes se hicieron campanas, donde seinvitaba a la poblacion a realizarse una prueba gratis de glucemia y hemoglobina glicosilada.Las muestras fueron tomadas en tres regiones, Juchitan, Tehuantepec e Ixtepec (figura 4.1);donde se obtuvieron un total de 86 pacientes de los cuales 58 fueron mujeres y 28 hombres, yde acuerdo con los resultados clınicos mediante el estudio de hemoglobina glicosilada 15 fueronsanos, 22 diabeticos “controlados” (es decir, HbA1c≤ 6.5 %), y 49 diabeticos “no controlados”(es decir, HbA1c > 6.5 %). Los pacientes diabeticos “controlados” se sabıa que eran diabeticosa pesar de que sus niveles de HbA1c eran por debajo de lo establecido por la organizacionmundial de la salud, ya que estos eran pacientes que tenıan un determinado tiempo siendotratados por su medico familiar y la gran mayorıa tomaban algun medicamento para controlarla azucar.Los pacientes fueron citados en ayunas para la prueba de glucemia, una vez presentes, se lesinformo de que consistıa el estudio y si estaban de acuerdo en participar, estos firmaron unconsentimiento informado (apendice A.1) aceptando el uso de sus resultados clınicos, ası comoalgunos datos por ejemplo edad, sexo, tiempo con la enfermedad y medicamento administra-do para su control. Las mediciones clınicas consistieron de tres pruebas, glucemia en ayunas,HbA1c y la prueba de dextrostix, este ultimo es el clasico pinchazo en el dedo anular, paraesta prueba se utilizo un glucometro de la marca Accu Chek (figura 4.2). Para las dos primeraspruebas se extrajo una muestra de sangre (una por cada prueba, glucemia y HbA1c), las cualesfueron analizadas usando el metodo de inmunoanalisis enzimatico de micropartıculas y meto-do enzimatico por quımica seca para glucemia y HbA1c respectivamente en el laboratorio debioanalistas especializados ARKAIA S.A. de C.V.

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4.1. OBTENCION DE ESPECTROS RAMAN DE PACIENTES

Figura 4.1: Mapa de Juchitan y comunidades aledanas como Tehuantepec e Ixtepec, donde se ob-tuvieron los espectro de pacientes.

Figura 4.2: Glucometro empleado para la prueba de dextrostix.

Los resultados de los analisis clınicos se muestran en las siguientes tablas 4.1, 4.2 y 4.3. Enella se da la edad, sexo (Masculino (M) y Femenino (F)), niveles de glucemia por dextrostix,laboratorio y HbA1c, tiempo con la enfermedad y medicamento (para el caso de pacientesdiabeticos).

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CAPITULO 4. RESULTADOS

Tabla 4.1: Resultados clınicos de pacientes diabeticos y sanos.

Paciente(F/M ) edad

Dextrostix(mg/dl)

Glucemiaen ayunas(mg/dl)

HbA1c % Tiempo condiabetes

Medicamento

M 38 95 62 4.8 6 meses GlibenclamidaM 54 112 78 7.8 No recuerda No lleva controlM 56 113 79 6.1 3 anos MetforminaF 49 100 79 4.4 15 anos GlibenclamidaF 60 115 80 5.1 Sana NadaM 67 112 80 5.4 10 anos MetforminaM 50 135 85 5.8 20 anos InsulinaF 43 104 86 6.1 3 anos No lleva controlF 50 124 90 4 3 anos GlibenclamidaF 53 108 93 7.9 15 anos Glibenclamida/metforminaF 47 107 93 5.8 3 anos GlibenclamidaF 66 116 94 6 No recuerda Pastillas, no recuerdaF 52 129 97 6.1 10 anos Pastillas, no recuerdaM 63 106 97 4 3 anos GlibenclamidaF 52 94 98 5.7 15 anos Pastillas, no recuerdaF 46 105 98 9 1 ano NadaM 58 132 99 6.9 14 anos Pastillas, no recuerdaF 66 99 99 9.7 10 anos Metformina/GlibenclamidaF 49 133 101 4.8 3 meses Pastillas, no recuerdaF 59 132 103 8.5 2 anos MetforminaF 48 136 108 10.6 7 anos Pastillas, no recuerdaM 66 133 110 5.9 12 anos MetforminaM 76 131 112 6.4 8 anos Glibenclamida y MetforminaF 62 144 118 5.5 1 mes NadaF 48 154 120 5.2 1 ano NadaM 65 114 125 13.5 20 anos Glibenclamida/MetforminaF 69 158 126 6.6 1 ano NadaF 56 124 126 8.4 25 anos InsulinaF 51 131 127 7.1 12 anos Insulina, MetforminaF 72 142 128 7.7 30 anos Pastillas, no recuerdaM 58 159 135 4.2 13 anos Pastillas, no recuerdaM 53 145 137 5.6 3 anos Pastillas, no recuerdaF 68 179 139 7.7 8 anos Pastillas, no recuerdaF 51 138 142 7.8 12 anos Metformina/GlibenclamidaF 42 160 153 11.5 20 anos Metformina/GlibenclamidaF 57 244 155 8.8 11 anos Metformina/GlibenclamidaM 72 156 156 8.1 22 anos GlibenclamidaF 57 150 156 6.5 30 anos Insulina, MetforminaF 42 200 161 8.1 10 anos Metformina/GlibenclamidaM 70 173 170 7.4 10 anos Pastillas, no recuerda

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Paciente(F/M ) edad

Dextrostix(mg/dl)



Medicamento

F 54 191 171 9 10 anos MetforminaF 46 172 176 5.8 2 anos MetforminaF 59 275 184 7.9 20 anos Pastillas no recuerdaM 62 198 184 10.8 15 anos GlibenclamidaF 59 254 186 10 3 anos NadaM 51 222 200 9.4 8 anos InsulinaF 79 253 208 9.3 20 anos Pastillas, no recuerdaF 47 247 209 9 4 anos MetforminaF 63 195 209 9 16 anos Insulina, Metformina

y GlibenclamidaM 65 195 209 8.4 10 anos Glibenclamida/MetforminaF 60 201 215 12.9 7 anos GlibenclamidaF 70 261 235 15 18 anos Pastillas, no recuerdaF 58 233 244 9.7 12 anos Glibenclamida/MetforminaF 52 232 245 8.6 10 anos Glibenclamida/MetforminaF 64 226 246 12.7 15 anos Glibenclamida/MetforminaF 36 329 260 11.2 18 anos Glibenclamida y MetforminaF 64 261 268 10.5 12 anos Metformina, InsulinaF 53 310 275 10.4 17 anos Pastillas, no recuerdaF 77 313 278 7.3 6 anos Pastillas no recuerdaM 79 302 280 15 6 anos NadaF 58 322 283 6.7 13 anos Pastillas, no recuerdaM 28 288 299 15 10 anos InsulinaF 53 287 307 11.7 15 anos InsulinaF 52 329 315 9.9 6 anos Pastillas, no recuerdaF 56 307 324 13 15 anos MetforminaM 63 392 367 10 10 anos Pastillas, no recuerdaF 54 366 368 10.8 10 anos GlibenclamidaF 77 435 515 7.8 37 anos Pastillas, no recuerdaF 75 145 141 11.4 6 anos Glibenclamida/metformina

36



Paciente(F/M ) edad

Dextrostix(mg/dl)



Medicamento

M 17 - 61 5.5 sano -F 21 - 76 4.8 sano -F 16 - 79 4.9 sano -F 20 - - 4.9 sano -F 56 - 85 6 sano -F 42 - 85 5.5 sano -F 43 - 87 5.1 sano -M 53 - 90 5.3 sano -M 26 - 90 5.2 sano -M 42 - 90 5.4 sano -M 30 - 91 6.2 sano -M 47 - 92 5 sano -F 38 - 103 5.1 sano -M 61 - 110 6.1 sano -F 57 - 170 5.5 sano -

Los resultados clınicos de los ultimos pacientes no muestran la prueba de dextrostix ya que paraestos pacientes no se tenia el glucometro, este grupo de pacientes fueron los voluntarios sanospor lo que solo se realizo la prueba de glucemia y hemoglobina glicosilada.

como podemos observar muchos de los valores en la prueba de dextrostix y glucemia en ayunasdifieren mas de 10 mg/dl y esto puede deberse a que los pacientes no llegaron en ayuno eingirieron algun alimento minutos antes de la toma de sangre, y como la prueba de dextrostixtoma la glucosa del fluido intersticial este es diferente a la glucosa sanguınea a los pocos minutoscuando se ingieren alimentos. Por ello una razon por el cual solo se trabaja con la hemoglobinaglicosilada.

Para las mediciones con espectroscopıa Raman, se utilizo una potencia laser de 50 mW y untiempo de integracion de 15 s, las mediciones se realizaron en el dedo ındice (figura 4.3), lobuloderecho y frente (figura 4.4) de cada paciente, ya que estas zonas son altamente vascularizadasy en la frente el craneo tiene altos valores de esparcimiento en el rango espectral del infrarrojocercano, y este actua un tanto como “espejo” [63]. Las mediciones se realizaron cuidando quela zona de medicion no tuviera un lunar, una lesion o vellosidades en la piel, ya que para el casodel lunar o lesiones la informacion colectada serıa por la lesion y en el caso de vello este puedeser quemado por el laser y causar molestia al paciente y tener mayor ruido en el espectro; paralas mediciones en frente se cuido no radiar los ojos.

37


Figura 4.3: Obtencion de espectro Raman del dedo ındice de una paciente.

Figura 4.4: Obtencion de espectro Raman de frente de una paciente.

Una vez adquiridos los espectros Raman de los pacientes, estos fueron procesados para la eli-minacion de ruido de disparo y fluorescencia de fondo. Primero quitamos el ruido de disparousando el algoritmo desarrollado por Villanueva-Luna et al [57] basado en la transformada Wa-velet, seguido de la eliminacion de fluorescencia de fondo usando el algoritmo desarrollado porA. Cao [62], finalmente se normalizaron los espectros a la banda 1486 cm−1 el cual pertenecea la vibracion del Triptofano [64], un aminoacido presente en los alimentos como el huevo,leche, cereales integrales, chocolate, avena, garbanzos, etc. Se normaliza a esta banda ya que lapresencia de esa molecula no influye en los niveles de azucar en sangre, por lo que las bandas

38


de interes no se veran afectadas por esta normalizacion.

Una vez filtrados los espectros y normalizados observamos que obtenemos algunas bandas ob-servadas en los espectros reportados por I. Barman et al [39], las cuales estan aproximadamenteen 1000, 1200, 1400 y 1600 cm−1. Las asignaciones de las bandas se muestran en la tabla 4.4y las podemos obervar en la figura 4.5.

Tabla 4.4: Asigancion de bandas.

Desplazamiento Raman (cm−1) Asignacion1000 Fenilalanina, Hemoglobina1200 Acidos nucleicos, Fosfato, C-N, C-O aromaticos, Amida III1400 ν(C=O)O2 aminoacido aspartico y Acido glutamico1600 Amida I debido a la extension C=O, Acetoacetato

Raman shift(cm-1

)

400 600 800 1000 1200 1400 1600

Inte

nsi

ty(A

.U.)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

healthycontrolled diabeticnot controlled diabetic

Figura 4.5: Bandas encontradas de HbA1c, de acuerdo con lo reportado por I. Barman et al. [39].

A continuacion se muestran algunos espectros de los diferentes tipos de pacientes, en la regionde 900 a 1700 cm−1 para apreciar mejor la zona de las bandas encontradas de acuerdo a loreportado por I. Barman.

Como podemos observar en la grafica 4.6, se aprecia como las bandas entre 1000, 1200, 1400y 1600 cm−1, para un grupo de pacientes sanos estan presentes, donde las mas intensas son1000, 1200 y antes de 1600 cm−1. De acuerdo a la asignacion de las bandas en 1000 cm−1 quepertenece a la vibracion de Hemoglobina proteına importante para el analisis de sangre, ya queen ella se adhiere la glucosa [58].

39


Raman shift(cm-1

)

900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700

Inte

nsi

ty(A

.U.)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

healthy

Figura 4.6: Bandas encontradas de HbA1c, de acuerdo con lo reportado por I. Barman et al. [39],para un grupo de pacientes sanos.

Raman shift(cm-1

)

900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700

Inte

nsi

ty(A

.U.)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

controlled diabetic

Figura 4.7: Bandas encontradas de HbA1c, de acuerdo con lo reportado por I. Barman et al. [39],para un grupo de pacientes diabeticos controlados.

40


En la grafica 4.7 la cual es de un grupo de pacientes diabeticos controlados, apreciamos que lasbandas reportadas por I. Barman estan presentes; de nuevo la banda 1000 cm−1 pertenecientea la Hemoglobina se muestra bastante clara, ası como en 1200 cm−1. Podemos observar comoestos espectros tiene un comportamiento muy similar con los espectros de los pacientes sanos,por lo que es complicado diferenciar entre uno y otro.

Raman shift(cm-1

)

900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700

Inte

nsi

ty(A

.U.)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

not controlled diabetic

Figura 4.8: Bandas encontradas de HbA1c, de acuerdo con lo reportado por I. Barman et al. [39],para un grupo de pacientes diabeticos no controlados.

La grafica 4.8 muestra los espectros Raman de un grupo de pacientes diabeticos no controla-dos, cuyo comportamiento sigue siendo similar a los espectros de pacientes sanos y diabeticoscontrolados, sin embargo, para este grupo podemos observar que las bandas 1000 y 1200 cm−1

son mas delgadas en comparacion con las mostradas en los espectro de los pacientes sanos ydiabeticos controlados, lo cual podrıa ser un parametro para diferenciar entre los distintos tiposde niveles de HbA1c.

41

4.2. ANALISIS DE PCA-SVM PARA ESPECTROS RAMAN

4.2 Analisis de PCA-SVM para espectros Raman

Existen varios estudios, en donde muestran que los PCA y la espectroscopıa Raman son unapotente tecnica como herramienta en el diagnostico de varias enfermedades [65–70]. Para laclasificacion de pacientes de acuerdo a su nivel de HbA1c, se utilizo PCA para encontrar loscomponentes principales que maximizaran la varianza de las caracterısticas mas importantesde los espectros Raman de pacientes diabeticos y sanos. Estos componentes principales nosdieron una buena separacion para identificar los diferentes niveles de HbA1c. Una vez obteni-dos los componentes principales que mejor separaban nuestros grupos, se combino con SVM,cambiando los datos de entrada de los espectros por las componentes principales, con el fin deincrementar la sensibilidad y especificidad de nuestro analisis [59]. En el diagrama de flujo 4.9se muestra la secuencia en el tratamiento y analisis de espectros Raman.

Figura 4.9: Procedimiento del analisis de espectros Raman y su clasificacion

El primer paso para el entrenamiento usando PCA se tomaron 10 pacientes sanos, 10 diabeticoscontrolados y 12 no controlados. Despues del entrenamiento el algoritmo fue validado conel resto de los pacientes. Las figuras 4.10 a 4.12 se muestran las graficas de los dos mejorescomponentes principales entre diabeticos controlados vs no controlados, sanos vs diabeticoscontrolados, y sanos vs diabeticos no controlados, respectivamente. En estas figuras se muestralas diferencias entre los grupos de pacientes usando las componentes principales.

42


PC1

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04

PC

3

-0.02

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

Diabetic controlled

Diabetic not controlled

Figura 4.10: PC 1 y 3 para la frente, la cual fue la mejor region para clasificar pacientes diabeticoscontrolados (azules) y diabeticos no controlados (rojos)

PC1 y PC3 fueron los mejores componentes principales para el grupo diabetico controladovs no controlado (figura 4.10), podemos apreciar la buena separacion entre ambos grupos depacientes. De las tres zonas de medicion la frente fue la mejor region de analisis, ya que lamejor separacion se dio para esta region anatomica, lo cual coincide con la teorıa, ya que elcraneo tiene un coeficiente de esparcimiento alto, por lo que la senal es mejor.

PC2

0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07

PC

3

-0.005

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

0.04

0.045

HealthyDiabetic controlled

Figura 4.11: PC 2 y 3 para la frente, la cual fue la mejor region para clasificar pacientes sanos(azules) y diabeticos controlados (rojos)

Las componentes principales PC2 y PC3 fueron las mejores para pacientes sanos vs diabeticoscontrolados (figura 4.11). Analogamente la frente fue la mejor zona y en la grafica anterior

43


podemos apreciarlo, sin embargo, hay una region en la cual parece mezclarse un par de pacientesdiabeticos con el grupo de pacientes sanos.

PC1

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12

PC

2

-0.09

-0.08

-0.07

-0.06

-0.05

-0.04

-0.03

-0.02

-0.01

0

0.01

HealthyDiabetic not controlled

Figura 4.12: PC 1 y 2 para dedo ındice, la cual fue la mejor region para clasificar pacientes sanos(azules) y diabeticos no controlados (rojos)

Por ultimo los componentes principales PC1 y PC2 para sanos vs diabeticos no controlados(figura 4.12), mostraron la mejor separacion, en este caso fue para las mediciones en el de-do ındice. Caso similar al grupo de pacientes sanos con diabeticos controlados tres pacientesdiabeticos se mezclan con el grupo de pacientes sanos, sin embargo, la clasificacion es bastantebuena.

Se eligieron estos PC’s debido a la buena distribucion, lo que nos permite una buena clasifi-cacion entre los grupos de pacientes. Estos PC’s se usaron como los nuevos datos de entradapara las SVM, con estos valores se entreno las maquinas para obtener las clasificaciones entrecada grupo de pacientes. Obteniendo la sensibilidad y especificidad entre los pacientes sanos ydiabeticos de cada una de las zonas de medicion, estos valores se muestran en la tabla 4.5.

El grupo de pacientes sanos vs diabeticos controlados la mejor zona para obtencion de espec-tros Raman fue la frente con una sensibilidad y especificidad de 100 %, usando un perceptronmulticapa como funcion kernel. Los valores predictivos positivos (PPV) y negativos (NPV) fue-ron calculados usando 5 de los 15 sanos (recordando que 10 se usaron como entrenamiento) y12 de 22 diabeticos controlados, con PPV y NPV de 1, respectivamente. El grupo de pacientesdiabeticos controlados vs diabeticos no controlados con la frente como la mejor zona de medi-cion se obtuvo una sensibilidad y especificidad de 100 % y 60 %, respectivamente, usando unkernel lineal; los PPV y NPV fueron calculados usando 12 de 22 diabeticos controlados y 37 de49 diabeticos no controlados, con valores de 0.9 y 1, respectivamente. Para el grupo de pacien-tes sanos vs diabeticos no controlados una sensibilidad y especificidad de 100 % y 80 % con un

44


Tabla 4.5: Sensibilidad y Especificidad de cada region anatomica de medicion.

Sensibilidad ( %) Especificidad ( %) PPV NPVDedo ındiceWCDP vs NCDP 94.59 60 0.89 0.75HV vs WCDP 100 40 0.76 1HV vs NCDP 100 80 0.97 1Lobulo de orejaWCDP vs NCDP 100 50 0.88 1HV vs WCDP 100 40 0.76 1HV vs NCDP 100 60 0.94 1FrenteWCDP vs NCDP 100 60 0.9 1HV vs WCDP 100 100 1 1HV vs NCDP 100 40 0.92 1

*WCDP: Pacientes diabeticos controlados, NCDP: pacientes diabeticos no controlados, HV: voluntarios sanos.

*Estos valores fueron calculados usando 37 NCDP, 12 WCDP, y 5 HV en cada prueba.

**PPV: valor predictivo positivo, NPV: valor predictivo negativo.

perceptron multicapa como kernel; en el dedo ındice como mejor zona de medicion. Usando 5de 15 pacientes sanos y 37 de 49 diabeticos no controlados los PPV y NPV fueron de 0.97 y 1,respectivamente.

Despues de mostrar la clasificacion entre los distintos tipos de pacientes, a continuacion semuestra el espectro Raman de un farmaco, mas especifico Aspirina (4.13) para mostrar que elclasificador puede diferenciar entre un espectro de piel y uno diferente.

Raman shift(cm-1

)

900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700

Inte

nsi

ty(A

.U.)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

aspirin

Figura 4.13: Espectro Raman de Aspirina.

45


Figura 4.14: Componentes principales entre pacientes diabeticos controlados vs no controlados yel espectro de Aspirina.

La figura 4.14 muestra la clasificacion entre pacientes diabeticos controlados vs no controladosy el espectro de Aspirina, mostrando que el clasificador funciona y puede identificar entre es-pectros de piel y cualquier otra cosa (como un farmaco). En ella observamos que el espectroque pertenece al aspirina se encuentra totalmente alejado del conjunto de espectros de pacientes.

Finalmente para corroborar la eficacia del algoritmo se calculo el area bajo la curva ROC (AUC)dando un area de 0.99 para diabeticos controlados vs no controlados, AUC 1 para sanos vsdiabeticos controlados y AUC 1 para sanos vs diabeticos no controlados (figura 4.15).

46


1-specificity

-0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

Sen

siti

vit

y

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

ROC Curve for PCA-SVM

WCDP-NCDP

HV-WCDP

HV-NCDP

Figura 4.15: Curva ROC de los resultados de la clasificacion usando PCA-SVM, para cada grupode pacientes.

Como podemos observar la grafica anterior nos muestra la buena efectividad del algoritmo, yaque el area bajo la curva ROC es de 1 para la identificacion entre sanos y los dos tipos de diabeti-cos (controlados y no controlados), con ello confirmamos la eficiencia del metodo propuestocon espectroscopia Raman y analisis de componentes principales combinado con maquinas desoporte vectorial (PCA-SVM) como herramienta en el diagnostico de diabetes mediante hemo-globina glicosilada.

En este capıtulo se mostraron los resultados clınicos y espectrales que se obtuvieron utilizandoespectroscopia Raman y analisis de componentes principales combinado con maquinas de so-porte vectorial (PCA-SVM), mostrando que es una buena herramienta como diagnostico en laclasificacion de pacientes sanos y diabeticos.

47

Capıtulo 5

Conclusiones

En esta tesis se obtuvieron espectros Raman in vivo de pacientes sanos y diabeticos con distin-tos niveles de hemoglobina glicosilada.

La espectroscopia Raman fue evaluada como una herramienta de diagnostico no invasivo pa-ra clasificar hemoglobina glicosilada en pacientes sanos y diabeticos, no haciendo medicionesdirectas de los niveles, solo identificando y clasificando niveles altos y bajos de hemoglobinaglicosilada, obteniendo una sensibilidad y especificidad del 100 % en la identificacion de pa-cientes sanos y diabeticos controlados, corroborando la clasificacion con la curva ROC.

Es el primer estudio in vivo donde se demuestra la factibilidad para identificar y clasificar nive-les altos y bajos de HbA1c.

La combinacion de metodos multivariable como PCA-SVM, incrementan significativamente laprecision de la espectroscopıa Raman como herramienta de diagnostico.

La curva ROC confirma la eficacia del algoritmo de diagnostico propuesto obteniendo una areade 1.

Los resultados de la clasificacion muestran que la mejor region anatomica para diferenciar en-tre pacientes sanos y diabeticos controlados es la frente, esto debido a que el craneo tiene uncoeficiente de esparcimiento alto, el cual beneficia en la coleccion de la senal Raman.

La espectroscopıa Raman en combinacion con PCA-SVM surge como una prometedora herra-mienta de diagnostico cualitativo no invasivo para el monitoreo de hemoglobina glicosilada enpoblacion sana y diabetica, debido a los buenos resultados obtenidos.

49

5.1. TRABAJO A FUTURO

5.1 Trabajo a futuro

Analizar mas pacientes (500 aproximadamente) para tener una validacion clınica mas confiable,ya que la poblacion adquirida en este trabajo de tesis, se considera como un estudio previo.

Combinar la espectroscopia Raman con espectroscopia de reflexion difusa, para mejorar la sen-sibilidad y especificidad, y lograr obtener un 100 % en los distintos grupos de pacientes, ademasde obtener resultados cuantitativos.

Construir un espectrometro Raman con software libre para su comercializacion e implementa-cion en hospitales del sector publico y privado.

5.2 Participaciones

Resultados previos de este trabajo de tesis fueron presentados en el FACSS and Scix conferenceorganization 2015, en Rhode Island Providence, como cartel el cual tuvo el tıtulo “Classificationof high and low glycated hemoglobin in diabetic patients with Raman spectroscopy and PCA-SVM”, Jose Fabian Villa-Manrıquez, Jorge Castro-Ramos, Francisco Gutierrez-Delgado.

5.3 Publicaciones

El trabajo de esta tesis fue aceptado para su publicacion en la revista Journal of Biophotonics2016, con el titulo “Raman spectroscopy and PCA-SVM as a non-invasive diagnostic tool toidentify and classify qualitatively glycated hemoglobin levels in vivo” J. F. Villa-Manrıquez, J.Castro-Ramos, F. Gutierrez-Delgado, M. A. Lopez-Pacheco, and A. E. Villanueva-Luna. Doi:10.1002/jbio.201600169.

50

Apendice A

Consentimiento informado

A.1 Informacion y forma de consentimiento para el sujeto adultode estudio “Estudio in-vivo de glucosa mediante espectrosco-pia Raman”

Numero de version 1. Fecha de version: 8 de febrero de 2015.

Codigo de estudio CEPREC-08-001

Se le esta solicitando que participe en un estudio de investigacion. Antes de que usted tome unadecision es importante que entienda por que se hace la investigacion, como se usara su informa-cion, lo que abarcara el estudio y los posibles beneficios, riesgos y molestias. Tome su tiempopara leer detenidamente la siguiente informacion y comentelo con su medico familiar, si ası lodesea.

¿CUALES SON LOS ANTECEDENTES Y EL PROPOSITO DE ESTE ESTUDIO?Usted tiene sed inusual, constante necesidad de orinar, hambre extrema, perdida inusual de pe-so, fatiga e irritabilidad extrema, infecciones recurrente en piel, encıas o vejiga, infeccionesfrecuentes, vision borrosa, cortes/moretones que tardan en sanar, hormigueo o entumecimientoen las manos o los pies, puede tener diabetes; sin embargo sin presentar ninguno de los sınto-mas anteriores puede ser una persona diabetica, a menudo las personas con diabetes tipo 2 nopresentan sıntoma alguno. Por eso es importante realizarse un examen medico. Los pacientescon diabetes requieren de una constante revision de sus niveles de glucosa ya que una alteraciondemasiado alta puede ocasionarle cetoacidosis diabetica, coma e incluso la muerte. Debido aque la diabetes es uno de los problemas de salud a nivel mundial y en los ultimos anos ha ido enaumento, es necesario desarrollar metodos de diagnostico que ayuden a establecer un diagnosti-co de manera no invasiva, con el objetivo de evitar los metodos tradicionales de extraccion desangre, y ası, incrementar la cultura del chequeo constante en pacientes que por la molestia omiedo a la constante extraccion de sangre no estan en constante monitoreo y por ello se com-plica su caso o se llega a la muerte. Este estudio se esta realizando para evaluar si por mediode un dispositivo llamado espectrometro optico o espectroscopia, que sirve para estudiar la luzque interactua con cualquier medio (en este caso con el tejido humano) y nos permite “ver”los componentes quımicos de la piel que pueden determinar si es un paciente sano o con algun

51

A.1. INFORMACION Y FORMA DE CONSENTIMIENTO PARA EL SUJETO ADULTO DE ESTUDIO “ESTUDIO IN-VIVO DE GLUCOSA MEDIANTE

ESPECTROSCOPIA RAMAN”

nivel de glucosa elevado. Los resultados que se obtengan con el uso del espectrometro serancorrelacionados con el analisis de sangre. De esta forma los investigadores podran establecer siel espectroscopio tiene la capacidad para diferenciar entre un paciente sano y uno con diabetes.Participaran aproximadamente otros 80 sujetos voluntarios al igual que usted en este centro deestudios y prevencion del cancer.

¿TENGO QUE PARTICIPAR?Usted decide si desea participar o no en este estudio. Incluso si rehusa participar en el estudioclınico, no tendra ninguna desventaja, incluyendo tratamiento y atencion medica que tiene dere-cho a recibir. Si decide participar se le dara esta forma de consentimiento informado para que lafirme. Si decide participar tiene la libertad de retirarse en cualquier momento; esto no afectara elnivel de los cuidados que usted recibe. Su medico de atencion primaria/medico familiar sera in-formado sobre su participacion, si usted esta de acuerdo en que se le informe. Ası mismo eldoctor que realiza el estudio (el “Doctor del Estudio”), puede decidir que continuar participan-do en el estudio ya no le beneficia y usted sera retirado. Cuando deje de participar en el estudio,debe someterse a los procedimientos de retiro del estudio que el Doctor del Estudio considerenecesarios para su seguridad. Por otra parte, los investigadores podrıan suspender este estudiopor razones administrativas no relacionadas con el proposito de este ensayo. Durante el estudioa usted se le realizara una historia clınica para obtener informacion acerca de sus antecedentesheredo familiares, ademas se le interrogara si ya presenta algun sıntoma de diabetes o si ya fuecanalizado anteriormente como paciente diabetico y posteriormente se le realizara un examenfısico. Posteriormente se colocara sentado en una silla o acostado en una camilla para efectuar lamedicion. La medicion se obtendra al colocar la sonda de fibra optica en el dedo ındice y lobulode lado derecho, ası como, frente. Se tomaran fotografıas de las tres zonas analizadas para verla influencia de la senal con la coloracion de la piel. Si no desea participar en el estudio, hayotros metodos de diagnosticos aprobados que estan disponibles para diagnosticar los nivelesde glucosa en la sangre. Su Doctor del Estudio le puede explicar los metodos de diagnosticodisponibles si usted decide no participar.

¿QUE ME SUCEDERA SI PARTICIPO?El estudio incluye una visita donde se le realizara la historia clınica, el examen fısico y la me-dicion con el espectrometro. En esa fecha se le tomara la muestra de sangre para su analisisde laboratorio y posteriormente acudira a otra visita para que se le informe del resultado delestudio y se le indique el tratamiento especıfico si lo requiere, en caso contrario, se le citara alos 6 meses y un ano con fines exclusivos de vigilancia.

¿QUE TENGO QUE HACER?Debe estar dispuesto a completar las valoraciones en cada visita y acudir a las visitas progra-madas.

¿CUALES SON LOS POSIBLES EFECTOS SECUNDARIOS, RIESGOS Y MOLESTIASDE PARTICIPAR?La medicion con la sonda de fibra optica no tiene ningun efecto secundario ni riesgo, pero puedehaber alguna molestia por el uso del laser, el cual debe expresar a la persona que esta llevandoa cabo la medicion. La extraccion de sangre tiene los riesgos, efectos secundarios y molestiassecundarias a un procedimiento quirurgico menor, como podrıa ser el dolor en el sitio de la

52

APENDICE A. CONSENTIMIENTO INFORMADO

herida por la aguja, el riesgo de infeccion por el mal cuidado de la herida. Estas complicacionesse observan en menos del uno por ciento de los pacientes que se someten a una toma de sangrey aunque son raros y relativamente facil de tratarse es importante que usted sepa que pudieranocurrir.

¿CUALES SON LOS POSIBLES BENEFICIOS DE PARTICIPAR?Se espera que el estudio para la determinacion de niveles de glucosa podra hacer un diagnosticooportuno sin extraer sangre en el paciente y determinar sus niveles de glucosa y de esa manerafavorecer a los pacientes que desconocen si son diabeticos o no y dar un tratamiento oportunopara mantener estable su enfermedad.

¿QUE SUCEDE SI HAY NUEVA INFORMACION?Le comunicaremos si se cuenta con nueva informacion sobre este metodo de diagnostico quepudiera influir su decision de continuar con el estudio.

¿CUAL ES EL COSTO DE PARTICIPAR?La extraccion de sangre, la medicion con el espectrometro, las visitas al doctor del estudioy la interpretacion del analisis de sangre por parte del laboratorio no tendran ningun costopara usted. Si sufre algun efecto secundario o lesion en el periodo postoperatorio, notifique deinmediato al doctor del estudio para que pueda recibir el tratamiento medico apropiado. Si ustedsufre alguna lesion derivada directamente de su participacion en el estudio, El presupuesto delestudio de investigacion cubrira los gastos del tratamiento medico del dano directo que llegaraa producirse en usted a causa de la toma de sangre y procedimientos descritos en el protocolo,ası como otorgarle una indemnizacion a la que legalmente tiene derecho el individuo; en el casode que ası lo amerite usted sera compensado de acuerdo con las leyes de la Republica Mexicana,lo anterior siempre y cuando los procedimientos definidos en el protocolo de estudios hayan sidorealizados por el investigador, su equipo y el sujeto como lo indica el protocolo, es decir si:

1. Siguio las indicaciones del Doctor del estudio

2. Se le notifico inmediatamente al investigador/Doctor sobre su lesion o dano y,

3. Se siguieron las recomendaciones medicas del doctor del estudio.

¿COMO SE USARAN MIS DATOS PERSONALES?Al firmar esta forma da su consentimiento a su Doctor del Estudio y a su personal para recopi-lar y procesar sus datos personales del estudio (“Datos del Estudio”), incluyendo lo siguiente:fecha de nacimiento, sexo, origen etnico y datos personales sobre su salud fısica o “mental” osu padecimiento. Su consentimiento para utilizar sus datos del estudio no tiene una fecha es-pecıfica de expiracion, pero usted puede descontinuar su consentimiento en cualquier momentonotificando a su Doctor del Estudio. Los Datos del Estudio estan protegidos por el uso de uncodigo (el “Codigo”), el cual es un numero especıfico para usted. El Doctor del Estudio tiene elcontrol del codigo clave, que es necesario para relacionar sus Datos del Estudio con usted. Losmiembros del Comite de Etica del Centro de estudios y prevencion del Cancer AC (CEPREC),las autoridades regulatorias u otros organos supervisores pueden revisar alguno de sus Datosdel Estudio conservados por su Doctor del Estudio. El Doctor del Estudio utilizara sus Datosdel Estudio para concluir el estudio. Los investigadores participantes en este estudio pueden

53



utilizar sus Datos del Estudio para conducir el Estudio y para investigacion relacionada con eldesarrollo de productos farmaceuticos, diagnosticos o guıas medicas. El Doctor del Estudio ylos investigadores son responsables por el manejo de sus Datos del Estudio de acuerdo con la(s)Ley(es) de Proteccion de Datos aplicable(s).

¿A QUIEN DEBO CONTACTAR SI NECESITO MAS INFORMACION O AYUDA?En caso de una lesion relacionada con el estudio o siempre que tenga dudas acerca del estudio,por favor comunıquese con:

Dr. Enfermera:

Numero de telefono: Numero de telefono:

Direccion:

Los investigadores pueden compartir sus Datos del Estudio con otros investigadores dentro desu grupo, unicamente para los propositos descritos arriba. Los investigadores pueden transferirsus Datos del Estudio a paıses fuera de Mexico para los fines descritos en este documento ypara proporcionar los datos a autoridades regulatorias. Por favor tome en cuenta que las leyesde ciertos paıses pudieran no brindar el mismo nivel de proteccion de datos que las leyes deMexico, y pudieran no evitar que las personas a quienes usted ha autorizado para que vean susDatos del Estudio los compartan con otras personas. Todos los datos que se transfieren serancodificados. Por favor tome en cuenta que los resultados del estudio pueden publicarse en li-teratura medica, pero no se revelara su identidad. Tiene el derecho de solicitar la informacionsobre cualquier dato personal que el Doctor del Estudio o los investigadores puedan retener deusted. Tambien tiene el derecho de solicitar que se corrija cualquier equivocacion en sus datospersonales. Si desea hacer alguna peticion, sırvase contactar al Doctor del Estudio en primerainstancia, quien puede ayudarlo a contactar a los investigadores de ser necesario. Si retira suconsentimiento, el Doctor del estudio ya no utilizara sus Datos del Estudio ni la compartira conotros. Los investigadores pueden aun utilizar informacion sobre usted que fue compartida antesde retirar su consentimiento. Por lo que al firmar esta forma yo consiento al uso de los Datosdel Estudio como se describe en ella. Si tiene pregunta sobre sus derechos como sujeto de in-vestigacion, usted puede ponerse en contacto con:

Nombre:

Numero de telefono:

He recibido informacion verbal sobre el presente estudio y he leıdo la informacion por escritoanexa. Estoy de acuerdo en participar en el estudio y estoy consciente de que mi participaciones por completo voluntaria.Entiendo que me puedo retirar en cualquier momento sin que esto afecte mi atencion medica enel futuro.Al firmar esta informacion y forma de consentimiento acepto que mis datos personales, inclu-yendo los datos relacionados con mi estado de salud fısica y mental o padecimiento y raza uorigen etnico, pueden ser utilizados como se describe en esta forma de consentimiento.

54

APENDICE A. CONSENTIMIENTO INFORMADO

Firma del sujeto Fecha de la firma

Para ser firmado y fechado por el sujeto

Nombre del sujeto (CON LETRA DE MOLDE Y MAYUSCULA)

Firma de la persona que condujo la Fecha de la firmadiscusion del consentimiento informado

Nombre de la persona que condujo la discusion del consentimiento informado (CON LETRASDE MOLDE Y MAYUSCULAS)

Se agregara la firma del representante legalmente aceptable si el sujeto es menor de edad o si esincapaz de firmar por el mismo. Debe mencionarse la relacion entre el sujeto y el representantelegalmente aceptable. Se agregara la firma de 2 testigos imparciales.

Nombre del representante legalmente aceptado (CON LETRAS DE MOLDE Y MAYUSCU-LAS)

Firma del representante legalmente Fecha de la firmaaceptado

Relacion del representante legalmente aceptado con el sujeto (CON LETRAS DE MOLDE YMAYUSCULAS)

Firma del testigo imparcial 1 Fecha de la firma

Nombre de testigo imparcial 1 (CON LETRAS DE MOLDE Y MAYUSCULAS)

55



Relacion del testigo imparcial 1 con el sujeto (CON LETRAS DE MOLDE Y MAYUSCULAS)

Firma del testigo imparcial 2 Fecha de la firma

Nombre de testigo imparcial 2 (CON LETRAS DE MOLDE Y MAYUSCULAS)

Relacion del testigo imparcial 2 con el sujeto (CON LETRAS DE MOLDE Y MAYUSCULAS)

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Apendice B

Codigo para filtraje de espectrosRaman

Listing B.1: Codigo Matlab

%% programa para q u i t a r r u i d o de d i s p a r o y de f l u o r e s c e n c i a defondo .

% a n t e s de c o r r e r e l programa se debe e s t a r se gu ro que l ac a r p e t a de t r a b a j o es donde se t i e n e n

% l o s a r c h i v o s r e c o r t a r p i e l . m, w a v e l e t s .m y BGminmax .m ya quee s t a s son

% f u n c i o n e s que nos ayudaran a q u i t a r e l r u i d o de f l u o r e s c e n c i ay d i s p a r o

% y s i e s t o s no se e n c u e n t r a n en l a c a r p e t a de t r a b a j o e lprograma no

% f u n c i o n a r a .

n= input ( ’ i n t r o d u c e e l numero de e s p e c t r o s ’ ) ;%con e s t a i n s t r u c c i o n dec imos e l numero de e s p e c t r o s que

queremos f i l t r a r .

i n t e n s i d a d = z e r o s ( 1 0 4 4 , n ) ; %se crea una m a t r i z de c e r o s donde seguardaran

%l a s i n t e n s i d a d e s de l o s e s p e c t r o s cuando se f i l t r e e l r u i d od i s p a r o .

f i l t r a = z e r o s ( 1 0 4 4 , n ) ; %se crea una m a t r i z de c e r o s donde seguardaran l a s

%i n t e n s i d a d e s de l o s e s p e c t r o s d e s p u e s de f i l t r a r todo e l r u i d o( d i s p a r o y de fondo ) .

57

f o r j =1 : n % en e s t e c i c l o ” f o r ” q u i t a r e m o s e l r u i d o de l o se s p e c t r o s que se d e s e e a n a l i z a r .

f i l e = input ( ’ I n t r o d u c e e l nombre d e l a r c h i v o ’ ) ;%cargamos e l a r c h i v o que deseamos p r o c e s a r .

%[ s p e c t ]= r e c o r t a r p i e l ( f i l e ) ; %se r e c o r t a n l o s e s p e c t r o s de 360a 1800 cmˆ{−1} .

%l a i n s t r u c c i o n a n t e r i o r e s para r e c o r t a r l o s e s p e c t r o s a unazona deseada .

[ f i n a l 1 , f i n a l 2 , f i n a l 3 ]= w a v e l e t s ( f i l e ( : , 1 ) , f i l e ( : , 2 ) ) ;%se q u i t a e l r u i d o de d i s p a r o con e l metodo w a v e l e t s i m p l e t s

d e s a r r o l l a d o por A . E . V i l l a n u e v a−Luna .

[ i n d a t a ]=BGminmax ( f i n a l 1 ( : , 2 ) , 1 1 ) ;%se q u i t a f l u o r e s c e n c i a con e l metodo minmax con un p o l i n o m i o

de grado 1 1 .%El grado d e l p o l i n o m i o uno l o puede e l e g i r yo use e s e por que

para mi f u e e l mejor .

f i n a l = i n d a t a−min ( i n d a t a ) ; %d e s p u e s de f i l t r a r en o c a s i o n e s l a si n t e n s i d a d e s d e l e s p e c t r o quedan n e g a t i v a s

% e s t o es por que e l p o l i n o m i o minmax q u i t a l a curva def l u o r e s c e n c i a de fondo , e n t o n c e s

% con l a i n s t r u c c i o n a n t e r i o r ponemos e l e s p e c t r o en u n i d a d e sp o s i t i v a s de l a i n t e n s i d a d .

n1 = f i n a l ( : , 1 ) . / r epmat ( f i n a l ( 5 4 6 , 1 ) , [ 1 0 4 4 , 1 ] ) ; %con e s t ai n s t r u c c i o n normal i zamos

%l o s e s p e c t r o s a l pun to ( 5 4 6 , 1 ) , e s t e pun to se e sc o ge deacuerdo a l a

%mues t ra que se e s t a a n a l i z a n d o . El d e t a l l e e s e l e g i r un pun toque no

%a f e c t e l a s bandas de i n t e r e s de n u e s t r o e s p e c t r o . y sen o r m a l i z a para

%poder comparar l o s e s p e c t r o s o b t e n i d o s cuando se a n a l i z a nm u e s t r a s

%i g u a l e s . El numero e n t r e c o r c h e t e s [ ] e s e l tamano d e le s p e c t r o .

i n t e n s i d a d ( : , j ) = f i n a l 1 ( : , 2 ) ; % se guardan l o s e s p e c t r o s s i nr u i d o de d i s p a r o .

f i l t r a ( : , j ) =n1 ; % se guardan l o s e s p e c t r o s f i l t r a d o s .

end

58

APENDICE B. CODIGO PARA FILTRAJE DE ESPECTROS RAMAN

f i g u r e ( 1 ) % g r a f i c a m o s l o s e s p e c t r o s s i n r u i d o cosmico pero conf l u o r e s c e n c i a

p l o t ( f i l e ( : , 1 ) , i n t e n s i d a d , ’ LineWidth ’ , 1 . 2 ) %g r a f i c a d e le s p e c t r o f i l t r a d o .

xl im ( [ 2 0 0 2 0 0 0 ] ) % rango de l a g r a f i c ax l a b e l ( ’Raman s h i f t ( cmˆ{−1}) ’ , ’ F o n t a n g l e ’ , ’ i t a l i c ’ , ’ FontName ’ , ’

Times new roman ’ , ’ FontWeight ’ , ’ bo ld ’ , ’ F o n t S i z e ’ , 1 8 ) ;y l a b e l ( ’ I n t e n s i t y (A.U . ) ’ , ’ F o n t a n g l e ’ , ’ i t a l i c ’ , ’ FontName ’ , ’ Times

new roman ’ , ’ FontWeight ’ , ’ bo ld ’ , ’ F o n t S i z e ’ , 1 8 ) ;

f i g u r e ( 2 )

p l o t ( f i l e ( : , 1 ) , f i l t r a , ’ LineWidth ’ , 1 . 2 ) %g r a f i c a d e l e s p e c t r of i l t r a d o .

xl im ( [ 2 0 0 2 0 0 0 ] ) % rango de l a g r a f i c ax l a b e l ( ’Raman s h i f t ( cmˆ{−1}) ’ , ’ F o n t a n g l e ’ , ’ i t a l i c ’ , ’ FontName ’ ,

’ Times new roman ’ , ’ FontWeight ’ , ’ bo ld ’ , ’ F o n t S i z e ’ , 1 8 ) ;y l a b e l ( ’ I n t e n s i t y (A.U . ) ’ , ’ F o n t a n g l e ’ , ’ i t a l i c ’ , ’ FontName ’ , ’ Times

new roman ’ , ’ FontWeight ’ , ’ bo ld ’ , ’ F o n t S i z e ’ , 1 8 ) ;

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Diagnostico de diabetes´ mediante espectroscopia Raman y ... · 2.4 Norma ANSI Z136.1-2007 ......

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