DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS POR IFI SISTEMAS DE … · •IFA en células HEp-2 es el gold...
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DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS POR IFI SISTEMAS DE LECTURA AUTOMÁTICA Dra Mª Belén Aparicio Hernández Complejo Asistencial Universitario Salamanca
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Pruebas de diagnóstico: Detección autoanticuerpos
(1)2011. Humbel. History of autoimmune serology. From prediction to prevention of autoimmune diseases. Autoantigens, auroantibodies, autoimmunity. Volume 7 (2) 1997. Fulton. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrixTM system. Clinical chemistry (3)2011. Araujo-Filho. POTENTIAL APPLICATIONS OF THE CHEMILUMINESCENT METHODS IN TUMORAL DISEASES INVESTIGATION. International journal of Pharma
and Bioscience
Hewett Coons
Sussman-Yahow & Bersus
Herbrink
AÑO Técnica Investigador
Perlmann, Engvall, Weenen & Schuurs
Horan
1888
1896
1897
1901
1905
1950
1959
1971
1977
1982
2001
Aglutinación (1)
Inmunoprecipitación (1)
Fijación complemento (1)
Inmunodifusión (1)
Radionmunoensayo (1)
Inmunofluorescencia (1)
ELISA (1)
Microesferas- Citometria flujo (2)
Inmunodot (1)
EliA
Quimioluminiscencia (3)
Weideman
Gruber & Durhan
Kraus
Bordet & Gengou
Belchhold
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INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
e
orientar y caracteriza
Antiinmunoglobulina marcada Corte de tejido
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INMUNOFLUORESCENCIA
llevan unidos compuestos Emplea anticuerpos que
fluorescentes o fluorocromos.
Isotiocianato de fluoresceína 488nm 530nm
Rodamina B 545nm 585nm
Excitación Emisión
Ficoeritrina 488nm 576nm
Y directa
Y indirecta
Fluoróforos: hidrocarburos poliaromáticos o heterociclicos
llamados fluoróforos o colorantes fluorescentes. Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
400 800 1000
t( s)
detección decaimiento
Fluorescencia
quelatos
componentes
fluorescentes de la
muestra
Inmunoensayos de fluorescencia
resuelta en el tiempo Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Detección de ANA mediante IFI
•American College of Rheumatology (ACR)
• IFA en células HEp-2 es el gold standard para estudio
de ANA (100-150 Ags, nucleares y celulares)
• Grupos de expertos internacionales
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RECOMENDACIONES EXPERTOS
Agmon-Levin N et al; Ann Rheum Dis 2014
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CÉLULAS HEP 2
Imagen Homogénea + Periférica Imagen Moteada
Imagen Nucleolar
Imagen Centromérica
Imagen Citoplasmática
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C-ANCA (PR3)
p-ANCA (MPO)
ANCA atípico
ETANOL
FORMALINA
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA ANCAS Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Figure 3 | Visual representation of the 1999 recommendations and revised 2017 recommendations. a| In the 1999 consensus document, the recommended approach for anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA) detection was to screen for ANCA by indirect immunofluorescence (IIF) and to test for proteinase 3 (PR3)-ANCAs and myeloperoxidase (MPO)-ANCAs in IIF-positive samples; the ideal approach was to perform IIF and immunoassay on all samples. b| In the 2017 consensus, the use of high-quality immunoassays is recommended as the preferred first screening method for ANCA detection in patients suspected of having the ANCA-associated vaculitides granulomatosis with polyangiitis (GPA) and microscopic polyangiitis (MPA). ANCA detection for non-ANCA-associated vasculitis conditions is not included in this consensus. *A second PR3-MPO-ANCA or IIF can be considered for negative results in patients with a high clinical suspicion (to increase sensitivity) or in case of low antibody levels (to increase specificity). Take antibody level into account.
a 1999 consensus
Ideal approach
b 2017
consensus
IIF
IIF+
ANCA–
IIF+
ANCA+
IIF
• PR3-ANCA and MPO-ANCA
• Immunoassays
• PR3-ANCA and MPO-ANCA
• Immunoassays
Not covered by this consensus
ANCA– ANCA+
Second assay*
Second assay*
Gating strategy
Suspected AAV
Non AAV
Recommended approach Recommended approach
IIF– IIF+
• PR3-ANCA and MPO-ANCA
• Immunoassays
IIF–
ANCA–
IIF–
ANCA+
IIF+
ANCA–
IIF+
ANCA+
CONSENSUS S TATEMENT
POS IT ION PAPER
Revised 2017 international consensus on testing of ANCAs in granulomatosis with polyangiitis and microscopic polyangiitis
Xavier Bossuyt1, Jan-Willem Cohen Tervaert2, Yoshihiro Arimura3, Daniel Blockmans4, Luis Felipe Flores-Suárez5, Loïc
Guillevin6, Bernhard Hellmich7, David Jayne8, J. Charles Jennette9, Cees G. M. Kallenberg10, Sergey Moiseev11, Pavel
Novikov11, Antonella Radice12, Judith Anne Savige13, Renato Alberto Sinico14, Ulrich Specks15, Pieter van Paassen16,
Ming-hui Zhao17, Niels Rasmussen18, Jan Damoiseaux19 and Elena Csernok7
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INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA ENDOMISIO
ESÓFAGO DE MONO INTESTINO DE MONO
CORDÓN UMBILICAL HUMANO
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La determinación de EMA se realizará para detectar enfermedad residual, o en casos en que la
t-TG2 IgA supere el cutoff establecido o esté en zona gris con clínica sugestiva.
- Si los EMA son positivos no se realizarán diluciones seriadas.
Niños y adolescentes con síntomas sugestivos de EC, dieta con gluten y valores de t-TG2 IgA
> 10 veces VR, deben ser confirmados mediante la determinación de EMA. Es aconsejable
realizar estudio genético de EC con el fin de reforzar el diagnostico y evitar la realización de BI.
El paciente presenta valores de t-TG2 IgA moderadamente elevados (<10 veces VR), se
confirmarán mediante EMA IgA, en caso de título positivo sería recomendable realizar biopsia
intestinal, si el título fuera negativo, repetir estudio serológico pasados 3 – 6 meses,
manteniendo dieta con gluten.
CLINICAL GUIDELINE
European Society for Pediatric Gastroenterology,
Hepatology, and Nutrition Guidelines for the Diagnosis of
Coeliac Disease J. Pediatr Gastroenterol Nutr.2012 Jan;54(1):136-60
Working Group on Coeliac Disease Diagnosis, on behalf of the ESPGHAN Gastroenterology Committee Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
ASMA AMA LC1
CP ADRENAL ICA
PIEL MUSCULO ESTRIADO ONCONEURONAL
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F F
?
F F
Antígeno
Muestra,
Controles Positivo
y Negativo
Conjugado - FITC
Medio montaje
Diluyente /
Tampón lavado
Portaobjetos
Informe
Positivo/negativo
Patrón fluorescencia
Intensidad/título
Intervalos referencia
Tipo de sustrato a
Tipo de muestra Tipo de conjugado
IFI
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DESVENTAJAS IFI
•Subjetivo
•No estandarizado
•Necesaria experiencia
•Microscopio
•Baja sensibilidad ciertos Ags
•Baja especificidad
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INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA AUTOMATIZADA
LABORATORIO DE AUTOINMUNIDAD Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
DE GRUYTER DOl 10.1515/ cclm-2012-0191 - Clin Ch em La b M e d 2013; 51(1): 129 - 138
Review
Renato Tozzoli, Chiara Bonaguri, Alessandra Melegari, Ant onio Ant i co, Dan il a Basse tt i
an d Nicola Bizzaro*
Current state of diagnostic technologies in the
autoimmunology laboratory
Varelisa
Report
3 r-
; i l .. , ..
... :::,
_g. M anual
§' M onoplex methods
t-
(IIF, DID, WB)
1 970
Automated
Monoplex methods
(EIA, FIA, LIA, RIA)
1995
Low automated
Multjplex methods
(line blot, array)
2003
Full automated
lndirect lmmunofluorescence
2009
Fu ll automated l Mu l t iplex methods
(microarray)
2006
l IIF Western Blot 1
Time
Figure 1 The evolu t ion o f te ch nolog i e s for a u t oa nt i body d etec t ion: t he ro le of a uto mat io n (see text for le ge nd s) .
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Autoimmunity Reviews
Automated antinuclear immunofluorescence antibody screening: A
comparative study of six computer-aided diagnostic systems
Nicola Bizzaro a,⁎, Antonio Antico b, Stefan Platzgummer c, Elio Tonutti d, Danila Bassetti e,
Fiorenza Pesente a, Renato Tozzoli f, Marilina Tampoia g, Danilo Villalta h, Study Group on Autoimmune Diseases of the Italian Society of Laboratory Medicine, Italy
Contents lists available at ScienceDirect
journal homepage: www.elsevier.com/locate/autrev
Review
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Suite software include (a) homogeneous, (b) speckled, (c) nuclear dots, (d) nucleolar and (e) centromeres. Additionally, the following patterns of related antibodies can be recognized: (f) nuclear membranes and (g) cyto- plasmic. Finally, negative and unspecific results (h) are recognized and selected in a different tab. ANA: antinuclear antibodies; IIF: indirect immunofluorescence.
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Lupus (2015) 24, 516–529
http://lup.sagepub.com
SPECIAL ARTICLE
EUROPattern Suite technology for computer-aided immunofluorescence
microscopy in autoantibody diagnostics
C Krause1, K Ens1, K Fechner1, J Voigt1, J Fraune1, E Rohwa¨der1, M Hahn1, M Danckwardt1, C Feirer1, E Barth2, T Martinetz2 and W Sto¨cker1
1Institute for Experimental Immunology, Euroimmun AG, Lu¨beck, Germany; and 2Institute for Neuro-
and Bioinformatics, University of Lu¨beck, Lu¨beck, Germany
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INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA AUTOMATIZADA
EUROPattern
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Cargador 50 portas
cLED
Objetivos (20x, 40x)
Binocular Integrado
LECTURA E INTERPRETACIÓN
AUTOMÁTICA
EUROPattern
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MOSAICO BIOCHIP
Tecnología EUROPLUS
EUROPattern
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EtOH HEp-2/EtOH
HCHO MBG
PR3 MPO
pANCA
cANCA
xANCA
MBG
PR3
MPO
ANA positivo EUROPattern
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Riñon
Granulocitos
Chritidia
Esófago
Intestino
delgado
Células
HEp-2
Nervios EUROPattern
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PROCESADO IFI
LECTOR CB MUESTRAS
LECTOR CB PORTAS
MICROSCOPIO INCORPORADO
CAPTURA IMÁGENES
ORDENADOR INCORPORADO
HELIOS
Grifols
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Captación de imagen integrada: Microscopio motorizado LED integrado
ÓPTICA NIKON
• Objetivo 20X
• Zoom digital hasta 40X
MICROSCOPIO MOTORIZADO
• Desarrollado por AESKU (ingeniería alemana)
• Autoenfoque rápido y preciso
HELIOS
Grifols
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HELIOS
HEp-2 ANCA nDNA
rLKS mLKS EMA
SUSTRATOS DISPONIBLES LECTURA AUTOMÁTICA
Grifols
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HELIOS
Atlas de patrones de fluorescencia para HEp-2, Triple tejido, Endomisio, Crithidia y ANCA
SOFTWARE VALIDACIÓN INTEGRADO
Grifols
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HELIOS Automatización total procesado
y lectura IFI
PROCESADO Y LECTURA EN 1 INSTRUMENTO
Grifols
HELIOS
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LECTOR AUTOMÁTICO DE PORTAS
© Palex Medical SA
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Portas disponibles:
Hep-2
Hep-2000®:
• Células transfectadas que sobreexpresan
SSA/Ro 60 kDa
• Sobreexpresión en 10-20% de las células del
cultivo
Crithidia luciliae
ANCAS
Triple tejido
Endomisio.
IMAGE NAVIGATOR 3.0
Palex
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Revisión Controles
© Palex Medical SA 05.2017
35
Revisión Positivos
Revisión Negativos
Asistente
Palex
Navigator 3.0 HEP 2/HEP 2000
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SISTEMA INTERPRETACION IFA: NOVA View
Werfen
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¿Cómo trabaja NOVA View?
1
2
3 4
5
NOVA View escanea 3-5 regiones alrededor del centro de
cada pocillo: enfoque con DAPI / FITC.
Selecciona una única imagen por región para el análisis
final.
Archiva 3-5 imágenes: confirmación y revisión del
resultado.
Reconocimiento de patrones por algoritmos
matemáticos: imagen holográfica 3D.
El algoritmo mide los picos y valles de cada imagen y
propone un patrón.
Patrón moteado
Werfen
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Werfen
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NOVA View
Werfen
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ANA - IFI AUTOMATIZADO
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Zenit PRO
ACCESO REMOTO
RECONOCIMIENTO PATRONES
SOLO COMO LECTOR
PATRONES HEP 2, ANCAS, CRITHIDIA, EMA.
PORTAS MÚLTIPLES EN UNA SESIÓN
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Combinación preparación de portas y lectura.
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ZENIT PRO: IMÁGENES
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Zenit PRO
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IMÁGENES EN MINIATURA
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ZENIT PRO: IMÁGENES
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MITOSIS
ATLAS DE PATRONES Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Nuevas tecnologías para el estudio de Autoanticuerpos
Técnicas proteómicas
Métodos de separación e
identificación de proteínas
Arrays
Secuenciación masiva
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MUCHAS GRACIAS Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017