Citometriadeflujo Linfomasyleucemias 100908063735 Phpapp02

Unidad mixta

CSIUAH

APLICACIONES CLÍNICAS DE

LA CITOMETRÍA DE FLUJOAlfredo Prieto Martín

Profesor Contratado Doctor de InmunologíaCoordinador del programa de doctorado en Inmunología

MENCIÓN DE CALIDAD MECD

Universidad de Alcalá[email protected]

http://www.alfredoprieto.tkwww2.uah.es/problembasedlearning

http://www.alfredoprieto.tk/

Objetivos

1. Recapitular y reforzar lo que habeis aprendido sobre fundamentos y aplicaciones de la citometría de flujo.

2. Conocer las distintas técnicas de citometria de flujo con aplicación diagnóstica o terapéutica

Plan de la exposición1. Generalidades de la Citometría y su utilidad clínica 1-102. CDs y estudio de la heterogeneidad celular 11-163. Inmunofenotipo de superficie 17-384. Marcaje intracelular 395. Ciclo celular 45

1. Cantidad de DNA 462. Historial de divisiones 52

6. Estudio de apoptosis 557. Uso de micropartículas 708. Anticuerpos biespecíficos y microbeads biespecíficas78

¿Qué es la citometría de flujo?¿Qué es la citometría de flujo?

FSC

90º90º2- 4º

Columna de muestra

Meeting pointMeeting pointLáserLáser

Detecto

res de lu

z

Detecto

res de lu

z

AmplificaciónAmplificacióndigitalizacióndigitalización

RepresentaciónRepresentación y Análisis y Análisis

FlujoFlujo

Permite identificar células, contarlas y caracterizarlas

Uso clínico de los citómetrosCélulas

CitómetroInformación Numérica(analizador)

Células purificadas(separador)

Decisión diagnóstica o terapéutica

Transfusión celular

1. Citometría como herramienta de utilidad clínica

• Metodología en la que se basan decisiones diagnósticas y terapéuticas

• La citometría de flujo posibilita: 1. La diagnosis de leucemias y linfomas mediante

detección de células con fenotipos aberrantes 2. El seguimiento de marcadores pronósticos como las

cuentas de linfocitos CD4 en pacientes con infección por HIV

3. La determinación de la eficacia de tratamientos antitumorales e inmunosupresores

PROBLEMAS CLÍNICOS ABORDABLES MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO• Estudio de la heterogeneidad de las células

sanguíneas o de otros tejidos– Neoplasia, – inmunodeficiencias congénitas y adquiridas– Monitorización del efecto de terapia inmunosupresora en

pacientes trasplantados • Estudio de la ploidia y proliferación celular• Estudio de la apoptosis• Cuantificación de concentraciones de moléculas

solubles• Purificación de células antígeno-específicas

Comparación con otras metodologías de análisis clínicos en células

Citometría de imagen

Citometría de flujo

Bioquímica

Unidad de la que extrae

información

Célula Célula Muestra

Localización en la célula(s)

Si No “Si” fraccionando

Velocidad baja alta alta

Tipo de información

Cualitativa Cuantitativa Cuantitativa

Medida de fluorescencia en células individuales por citometría de flujo

Propiedades VentajasEs específica de color Permite estudio

multiparamétrico simultáneo

Es cuantitativa con un amplio rango de medida

Altísima sensibilidad1974(3000mol/cel) 2003 (300mol/cel)

Alta velocidad

Mide en cantidades elevadas de células Obtener conclusiones estadísticamente fidedignas objetivas y reproducibles

Evolución instrumentación• Análisis multiparamétrico

– FACScan 3 colores 1986– FACSaria 12 colores 2003

• Soporte informático tecnología se abarata

1961 1981 2001

IBM IBM PC Clónico de sobremesa

4.000.000 $ 4000 $ 800 $

Nomenclatura:Cluster Designation Numbers

• Tecnología de monoclonales permitió obtener Tecnología de monoclonales permitió obtener anticuerpos frente a antígenos leucocitarios.anticuerpos frente a antígenos leucocitarios.

• Mismo antígeno reconocido por distintos Mismo antígeno reconocido por distintos anticuerpos monoclonales con distintos nombres.anticuerpos monoclonales con distintos nombres.

• Sinonimias generaban una nomenclatura caótica Sinonimias generaban una nomenclatura caótica que causaba jaquecas a los inmunólogos.que causaba jaquecas a los inmunólogos.

• Se decidió crear una nomenclatura internacional Se decidió crear una nomenclatura internacional para los antígenos de superficie linfocitarios.para los antígenos de superficie linfocitarios.

• Se asigna un CD a cada antígeno que incluye a Se asigna un CD a cada antígeno que incluye a todos los anticuerpos que lo reconocen. todos los anticuerpos que lo reconocen.

CD19CD19

CD3CD3

CD56CD56

CD4CD4 CD8CD8

CD2CD2

CD45

CD14

CD45RACD45RA CD45RACD45RA CD45RACD45ROCD45RO CD45ROCD45RO

CD15

NeuNeuMonoMonoBBNKNKT4T4 T8T8

Estudio de la heterogeneidad celularEstudio de la heterogeneidad celular

Criterios de caracterización Criterios de caracterización de los tipos celularesde los tipos celulares

• CelularesCelulares– Morfología al microscopio.Morfología al microscopio.

• MolecularesMoleculares– GenotípicoGenotípico. (Genoma) Recombinaciones somáticas.. (Genoma) Recombinaciones somáticas.– Fenotípico (Proteoma) Fenotípico (Proteoma) RNARNA expresado, expresado, proteínas. proteínas.

Antígenos de diferenciación leucocitariaAntígenos de diferenciación leucocitaria Los antígenos de superficie pueden ser utilizados Los antígenos de superficie pueden ser utilizados

como como marcadores moleculares específicosmarcadores moleculares específicos de de líneas, tipos y subtipos celulares.líneas, tipos y subtipos celulares.

Para estudiar la heterogeneidad Para estudiar la heterogeneidad celular son necesarias técnicas:celular son necesarias técnicas:

• 1. Con resolución a nivel de célula individual. 1. Con resolución a nivel de célula individual.

• 2. Que caractericen la célula en función de varias 2. Que caractericen la célula en función de varias características (parámetros). V, W, X, Y, Z.características (parámetros). V, W, X, Y, Z.

• 3. Capaces de realizar medidas en números representativos 3. Capaces de realizar medidas en números representativos de células. 100 células error ± 10%, 10.000 error ± 1%.de células. 100 células error ± 10%, 10.000 error ± 1%.

• 4. Capaces de almacenar, procesar, representar, analizar y 4. Capaces de almacenar, procesar, representar, analizar y reducir toda esa información sobre células individuales en reducir toda esa información sobre células individuales en conclusiones útiles acerca de las poblaciones celulares.conclusiones útiles acerca de las poblaciones celulares.

1) Discriminación por FSC-SSC

2) Marcaje celular con anticuerpos

monoclonales

HETEROGENEIDAD CELULARDE LAS CELULAS SANGUINEAS

R1

Granulocitos

Linfocitos

Monocitos

1) DISCRIMINACIÓN POR FSC-SSC

0 256 512 768 1024

4C5144001 FSC-Height ->

GranulocitosGranulocitosCD15+CD15+

MonocitosMonocitosCD14+CD14+

LinfocitosLinfocitosCD3+CD3+

CD4+CD4+CD8+CD8+

CD56+CD56+CD19+CD19+

CD5+CD5+CD5-CD5-

Morfología y antígenos de diferenciación en el Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celularanálisis de la heterogeneidad celular

3. Marcaje Superficial

4. Marcaje Intracelular

Marcaje de antígenos por inmunofluorescencia

3. MARCAJE SUPERFICIAL

Estudio monoparamétrico

FICT

CD3

T

PE

CD56

NK

PerCP

CD19

B

Estudio multiparamétrico

Doblesnegativos

Simplespositivos

Doblespositivos

Triplespositivos

Fenotipos posibles

Representación de la información

- Caracterización fenotípica: CD3, CD56, CD19

- Diferenciación celular: CD95, CD45RA, CD45RO

- Coestimulación: CD28, ICOS, CTLA-4

- Recirculación: CD62L, CLA, 47

- Activación celular: CD57, CD25, HLA-DR, CD71

¿De que nos informan los estudios inmunfenotípicos?

Aplicación clínica del marcaje inmunofluorescente: diagnóstico de

leucemias y linfomas1. Identificar la población leucémica.

2. Describir su fenotipo, cada leucemia tiene un patrón

de expresión característico.

3. Interpretar estos hallazgos en el contexto de la

morfología para diagnosticar y clasificar la leucemia.

- Leucemia Mieloide MPO: CD33, CD14, CD15- Leucemias Linfoides:

- T: CD3, TRC- B: CD79a, Ig, CD22

- BI proB: CD79a, CD22, CD19- BII: CD10- BIII: preB- BIV B: sIg

Clasificación diagnóstica de las leucemias

El aumento de expresión de CD38 en pacientes

con Leucemia Linfática Crónica de células B

(LLC-B) es signo de un mal pronóstico de

evolución de la enfermedad

Expression de Zap 70 correlaciona con CD38

Clasificación pronóstica de los síndromes linfoproliferativos

-Reaparición de células leucémicas tras trasplante

de médula ósea. Detección de EMR

-Reaparición de células cancerígenas en sangre

periférica después de un tratamiento

anticancerígeno. Cáncer de mama.

Monitorización del tratamiento

Tipos de leucemias linfoides

Síndromes linfoproliferativos de células B maduras

Clasificación de línfomas B

http://www.nordiqc.org/images/CD_markers/CD5-algo.jpg

Leucemias agudas B y T

CD4 T cellsCD4 T cells

CD 8 CD 8 T CellsT Cells

Cuantificación del número de linfocitos T CD4 en pacientes con HIV

Seguimiento de HIV recuento de linfocitos CD4

Otras aplicaciones clínicas del inmunofenotipo de superficie

• Identificación de pacientes sépticos con alto riesgo de mortalidad por sus niveles aumentados de CD69 y CD62L.

• Actividad de la enfermedad y predicción de la eficacia terapéutica en pacientes con Lupus Eritematoso Sistémico – Aumento porcentaje CD19+, CD27high+/CD20- aumento cuentas

CD19+ CD27high+/CD20-– Disminución porcentaje CD27-/CD20+CD19– Arthritis & Rheumatism 48:1332-1342, (2003)

Porcentaje y cifras de linfocitos T CD69+ en pacientes con sepsis de alto riesgo

CONTROL SEPSIS IAM

T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28

CD

3+C

D69

+ (%

)

0

10

20

30

40

p<0.05

p<0.05

p<0.05vs

p<0.05vs

‡

† ‡

*

*

*

*

**

CONTROLESSEPSIS NO SOBREVIVENSEPSIS SOBREVIVENIAM NO SOBREVIVENIAM SOBREVIVEN

CONTROL SEPSIS IAM

T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28

CD

3+C

D69

+ (N

º/

l)

0

50

100

150

200

250

300

p<0.05

p<0.05vs

p<0.05vs

p<0.05vs

†*

**

* ‡


†

CONTROL SEPSIS IAM

T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28

CD

19+C

D23

+ (%

)

0

20

40

60

80

100

120

p<0.05 †

*

*

*

*

*


† †

CONTROL SEPSIS IAM

T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28

CD

19+C

D23

+ (N

º/

l)

0

100

200

300

400

p<0.05

p<0.05vs

*

**


†

Porcentaje y cifras de linfocitos B CD23+ en pacientes con sepsis de alto riesgo

CONTROL SEPSIS IAM

T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28

CD

3+C

D8+

CD

62L+

(Nº/

l)

0

100

200

300

400

500

p<0.05

p<0.05

p<0.05vs

§p<0.05vs

† ‡*

*

**

*


†*

Porcentaje y cifras de linfocitos T CD8+ CD62L+ en pacientes con sepsis de alto riesgo

Expresión de CD38 y riesgo en LLC-B

Stage group

% o

f CD

19+C

D38

+ ce

lls

0

20

40

60

80

100

StableSm

ProgressiveSm

A non Sm

B & C

EscasaHipermutaciónPregerminalesZAP-70+Mal pronóstico

HipermutaciónelevadaPosgerminalesZAP-70-Buen pronóstico

Marcaje

superficial

Fijación

Permeabilización

Marcaje

intracelular

4. MARCAJE INTRACELULAR

0.22%

33.8%

PRODUCCION DE IL-6 POR LOS MONOCITOS (CD14+) DE SANGRE PERIFERICA DE PACIENTES CON SHOCKSEPTICO

R1

EXPRESION DE IL-6 (GATE R1)

R1

R1= MONOCITOS

CONTROL

0.1%

CONTROL NEGATIVO (GATE R1)

PACIENTE SHOCK SEPTICO

R1= MONOCITOS CONTROL NEGATIVO (GATE R1) EXPRESION DE IL-6 (GATE R1)

PE

0.3%

PE

- Detección de linfocitos CD4 productores de IL-4 y

células plasmáticas secretoras de IGE en síndrome

hipereosinofílico.

-Producción descontrolada de citocinas en pacientes

sépticos de alto riesgo.

APLICACIONES DEL MARCAJE INTRACELULAR

CONTROL SEPSIS IAM

T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28

CD3+

CD8+

CD45

RO+

IL-2

+ (%

)

0

10

20

30

40

50

60

*

*

* ††p<0.05

*

CONTROLES

SEPSIS SOBREVIVEN

IAM SOBREVIVEN

SEPSIS NO SOBREVIVEN

IAM NO SOBREVIVEN

B

CONTROL SEPSIS IAM T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28

CD

3+C

D8+

IL-6

+ (%

)

0

10

20

30

40

†

‡

‡*

* †p<0.05

CONTROLES

SEPSIS SOBREVIVEN

IAM SOBREVIVENSEPSIS NO SOBREVIVEN

IAM NO SOBREVIVEN

B

CONTROL SEPSIS IAM T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28

CD3+

CD8+

IL-4

+ (%

)

0

5

10

15

20

25

30

††*

p<0.05

*

CONTROLES

SEPSIS SOBREVIVEN

IAM SOBREVIVENSEPSIS NO SOBREVIVEN

IAM NO SOBREVIVEN

B

Producción aumentada de citocinas en linfocitos CD8 de pacientes con sepsis

de alto riesgo

Detección de la quinasa ZAP-70

• Marcaje intracelular.• Su expresión correlaciona con mala

prognosis de los pacientes con LLC-B.

5.1 Estudio de la cantidad de DNA en células

individuales

5.2 Historial de divisiones de células marcadas

5 . ESTUDIO DEL CICLO CELULAR

Ciclo celular

Fase Cantidad DNA

G0/G1 2n

S 2n-4n

G2/M 4n

CANTIDAD DE DNAEN RELACIÓN CON LA FASE

DEL CICLO

PI

Fijación

Permeabilización

MARCAJE FLUORESCENTE DE DNA EN CÉLULAS INDIVIDUALES

M1

M2 M3

G0/G1S

G2/M

2n2n 4n4n

RESULTADO DE LA MEDIDA RESULTADO DE LA MEDIDA DE DNA EN POBLACIONES DE DE DNA EN POBLACIONES DE

CÉLULAS CÉLULAS

Aneuploidías en células tumorales

Hiperplasia y lesión celularHiperplasia y lesión celular

- Carboxifluorescein diacetato succinimidil ester (CFSE)

- Sonda fluorescente que se une a proteínas intracelulares y

que se reparte por igual entre las células hijas

5.2 HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE

CFSE

XX

Fluorescencia / célulaFluorescencia / célula

X / 2X / 2 X / 4X / 4

MONITORIZACIÓN DEL HISTORIAL DE DIVISIONES CON CFSE

Sin dividir

Tras una división Tras dos divisiones

ESTUDIO DE ALORREACTIVIDAD EN TRASPLANTE CON CSFE

No proliferantesProliferantesalorreactivas

ESTUDIO DE LA APOPTOSIS

Apoptosis correlaciona con grado de Apoptosis correlaciona con grado de

actividad de enfermedades autoinmunesactividad de enfermedades autoinmunes

Utilidad pronostica en evaluación y Utilidad pronostica en evaluación y

predicción de respuesta a tratamiento con predicción de respuesta a tratamiento con

IFNIFN en pacientes con esclerosis en pacientes con esclerosis

múltiplemúltiple

-La apoptosis es un modo de muerte celular

activo y fisiológico en el que la célula ejecuta

el programa de su propia muerte

- Deben existir señales que induzcan la

apoptosis

APOPTOSIS

- La apoptosis es un modo de muerte celular

activo y fisiológico en el que la célula ejecuta

el programa de su propia muerte.

- La necrosis es una muerte accidental debida

a un estrés: choque térmico, hipotónico, pH...

- Los métodos deben distinguirlas

APOPTOSIS vs. NECROSIS

APOPTOSIS vs. NECROSIS

Temprana

Apoptosis NecrosisProgramada genéticamente Accidental

Se mantiene Se pierde

Disminuye Aumenta

Se preservan Se desintegran Condensación de la cromatina Tardía

Fragmentación del DNA

Tardía en fragmentos grandes

. En cuerpos apoptóticos rodeados por membrana

Son reconocidos y fagocitados

Los contenidos de los orgánulos

se liberan Inducen

inflamación local

Integridad de membrana

Tamaño celular

Orgánulos

Temprana en fragmentos

oligonucleosomalesFragmentación celular

Restos celulares

Mecanismo

Diferencias entre apoptosis y necrosis.

Activación decaspasas

Pérdida de laasimetría de la membrana

Pérdida de laintegridad demembrana /FragmentaciónDNA

Fragmentaciónen cuerposapoptóticos

DIAGRAMA DE LA CINETICADE LA APOPTOSIS

Sustratos Sustratos de de

caspasascaspasas

Unión de Unión de anexina Vanexina V

Extracción Extracción LMW LMW DNADNA

TUNELTUNEL

Sondas Sondas catiónicascatiónicas

Marcaje de Marcaje de fragmentosfragmentos

Sustratos de caspasas

• Se vuelven fluorescentes al ser hidrolizados por ellas

• FLICA

Permeabilidad sondas catiónicas

• No distingue entre células apoptoticas y necróticas

• Hay que combinarla con un método específico

- Translocación de la PS durante la apoptosis

- La translocación es universal y específica

- Anexina V reconoce específicamente PS

- Combinación con sondas vitales (7AAD)

CAMBIOS EN LA COMPOSICIÓN LIPÍDICA: AUMENTO DE PS

Viables

Necróticas

Apoptóticastempranas

Apoptóticastardías


(En combinación con una sonda vital)


Ventajas: - Detecta fase temprana de la apoptosis - Se puede combinar con marcaje con

anticuerpos monoclonales. - Discrimina necróticas

Desventajas: - No es específico en determinadas condiciones

EXTRACCIÓN DE DNA DEBAJO PESO MOLECULAR

Diploide (2n)

Viables

Hipodiploide (<2n)

Apoptóticas

PI


M1

M2

M1

M2

MEDIO CHX


Ventajas: - Simple y barato - Permite estudio de ciclo celular

Desventajas: - Detecta apoptosis intermedia y tardía - Puede generar artefactos - No discrimina necróticas


Marcaje de los fragmentos 3’OH con nucleósidos

marcados mediante la transferasa terminal de

deoxinucleótidos (TdT)

TUNEL

V) TUNEL

Ventajas: -Permite estudio simultáneo de ciclo celular-Puede combinarse con marcaje antigénico

Desventajas: - Detecta apoptosis intermedia y tardía - No discrimina necróticas

V) TUNEL

6. Uso de micropartículas1. Referencia para enumeración celular.

2. Referencia para cuantificación de la expresión

antigénica en células individuales.

3. Detección de moléculas solubles

1. Distintas esferas utilizables simultáneamente

2. Kits comerciales con fines diagnósticos

Quantibrite Quantibrite

CUANTIFICACIÓN DE CONCENTRACIONES DE MOLÉCULAS

SOLUBLES POR BEAD ARRAYS

El numero medio de moléculas de citocina capturadas por cada partícula se relaciona con la concentración de la citocina en el sobrenadante

PROTOCOLO

Incubación Lavado

Marcaje

Lavado

DETERMINACIÓN DE CITOCINAS SOLUBLES

Citocina

- +

Citocina

- +SSC

CUANTIFICACIÓN DE CONCENTRACIONES DE MOLÉCULAS

SOLUBLES

• Más rápido y sensible que el ELISA. 90 min.

Sensibilidad fentomolar: 10-15 M

• Multiparamétrico se pueden detectar las

concentraciones de múltiples citocinas en una

misma muestra en un mismo ensayo

7. MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS

BIESPECÍFICOS• Uso de anticuerpos biespecificos anti-CD45-anti-

citocina para la captura de las citocinas producidas por células individuales

• Se pueden fabricar también con fragmentos Fab

• Su utilidad es la selección de células productoras de una determinada citocina para terapia de transfusión celular

MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS

CD45 Anti-citocina Citocina

MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS

• Permite la separación de las células viables productoras de una citocina determinada por FACS o por separación inmunomagnética

• Estas células se pueden analizar por otros métodos o cultivarse para obtener clones

Selection of reactive T cells by Cytokine secretion assays

•

3. Captura del producto secretadoDuring the incubation of 45 minutes at 37°C, the secreted cytokine binds to the Cytokine Catch Reagent on the surface of the secreting cells. It is important to avoid close contact of the cells, they are kept in suspension using the MACSmix™.

1. EstimulaciónThe cells are stimulated, e.g. with antigen, for 3-16 hours in vitro. The responding cells rapidly begin to secrete cytokines.

2. Marcaje con reactivo de capturaA Cytokine Catch Reagent is now attached to the cell surface of all leukocytes via the CD45 antigen.

Selection of reactive T cells by Cytokine secretion assays

•

4. Marcaje de la citocina capturada4. Marcaje de la citocina capturadaThen the cells are stained with a fluorochrome-labeled Cytokine Detection Antibody. The cells are now ready for analysis by flow cytometry.

5. Marcaje con anticuerpos unidos a microparticulas paramagnéticasPara aislar, cytokine-secreting cells se marcan con micropartículas recubiertas de anticuerpos Anti-PE.

6. Selección de las células productorasThe cytokine-secreting cells are now enriched by using a MACS Separator and MACS Columns (up to 10,000-fold).

Separación células para terapias de transfusión celular

• Tetrámeros permiten la selección de células antígeno especificas

• Anticuerpos biespecíficos permiten la selección de células productoras de una citocina especifica.

• Clonación de células antileucémicas con un perfil determinado de producción de citocinas para su posterior expansión y reinfusión en el paciente

Habéis aprendido

• Los métodos de citometría de flujo que tienen aplicación clínica

Bibliografía

• Shapiro H Practical Flow Cytometry 4th Edition 2003 Ed Willey

• www2.uah.es/problembasedlearning/

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