オートデスク BIM 活用事例集 2016 - 日経クロス …オートデスクユーザ事例 株式会社日本設計 04 会社名 株式会社 日本設計 所在地 東京都新宿区
固相抽出ビギナーズガイド - Waters Corporation...固相抽出ビギナーズガイド...
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固相抽出ビギナーズガイド
日本ウォーターズ株式会社
日本ウォーターズ株式会社 www.waters.com東京本社 140-0001 東京都品川区北品川1-3-12 第 5小池ビル TEL 03-3471-7191 FAX 03-3471-7118大阪支社 532-0011 大阪市淀川区西中島5-14-10 サムティ新大阪フロントビル11F TEL 06-6304-8888 FAX 06-6300-1734ショールーム 東京 大阪テクニカルセンター 東京 大阪 名古屋 福岡 札幌 J LC715003405
Beginner’s Guide to SPE
Solid-Phase Extraction
Joseph C. Arsenault
Copyright © 2012 Waters Corporation
All rights reserved. No part of this book may be reproduced or transmitted in any form by any means, electronic or mechanical, including photocopying, recording, or by any other information storage and retrieval system, without permission from the Publisher.
Waters Corporation
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©2012 Waters Corporation. Waters, Sep-Pak, Oasis, UPLC, Nova-Pak, PoraPak, ACQUITY UPLC, ACQUITY, Atlantis, Xevo, and Alliance are registered trademarks of Waters Corporation. X PoSure, DisQuE, AccQ•Tag, Quattro micro GC, and SunFire are trademarks of Waters Corporation. Luer is a registered trademark of Becton Dickinson. Teflon is a registered trademark of
E. I. du Pont de Nemours and Company. Kool-Aid is a registered trademark of Kraft Foods Global Brands, LLC. Rxni is a registered trademark of Rxi Pharmaceuticals Corporation.
October 2012 715003405 VW-FP
はじめに
ようこそ皆様に固相抽出（SPE）へのご興味を持っていただいたことをとても嬉しく思います。
私たちは皆様のラボにおけるサンプル前処理の課題を解決するために SPE をどのように活用するかをご紹介したく本書を作成いたしました。分析機器の進歩、特に感度の向上と高速化により、サンプル前処理方法に対する要望はますます高まっています。
SPE はある意味、「アラジンと魔法のランプ」に登場する「魔神」のようなものです。ひとたびその使い方がわかれば、驚くほど様々な分析上の課題を解決する際に役に立ちます。魔神と同じく SPE はツールです。したがって、その力を左右するのは「ご主人様」である分析科学者の創造性なのです。
本書では、SPE の基本の全てと、過去 30年間にこのテクノロジーに携わった世界中の科学者から得られた成功のテクニックをご紹介します。今日、科学者は難しいサンプル前処理や分析上の課題を克服するための手法として、SPE が役立つ手法であることをこれまで以上に見出しています。本書を通して SPE が持つ能力を理解しマスターすることにより、このテクノロジーの持つ力をラボで活用できるようになることを願っています。
ご成功をお祈りいたします。
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献辞
簡単ではありますが、私から心よりの献辞を捧げたいと思います。
はじめに、Sep-Pak® カートリッジと Oasis® ファミリーの開発を通じて、34年以上 S P E の世界の先駆者であり続けているウォーターズコーポレーションの Dr. Patrick McDonaldに本書を捧げます。極めて優秀な科学者であるDr. Mc Donaldは、SPE テクノロジーなど革新的なクロマトグラフィー製品の開発に携わり、常に自身の優れた知識や洞察力で世界中の分析科学者が直面している課題の克服に尽力してきました。
次に Dr. Uwe Neueに本書を捧げます。クロマトグラフィー界の第一人者の 1人である Dr. Neueは 2010年に亡くなられましたが、液体クロマトグラフィーの世界の解明と革新に語り尽くせないほどの遺産を遺しました。
私がクロマトグラフィーを学び活用することで成功することができたのは、その知識を惜しみなく授け、助けてくださったこのお二人によるところが大です。
最後に、私とともに液体クロマトグラフィーに寄り添ってくれた素晴らしい家族、妻の Ann Marie、娘の Christine、息子の Joseph に本書を捧げたいと思います。私が科学を追究し、同僚や顧客の皆様が今日の生活をよりよくする方法を見つけられるよう支援し、そして次世代のためによりよい世界をつくれるよう、私を励まし支えてくれました。
謝辞
本書を執筆するにあたり、素晴らしいアイデアとサポートを提供してくれた Dr. Diane Diehl と Dr. Mark Baynhamに感謝いたします。
Kathy Coffey、Jessalynn Wheaton、John Martin、Dr. Nebila Idris、Damian Morrison、Erin Chambers、Dr. Michael S. Young、Dr. James Teuscher、Dr. Ben Yong、Xin Zhang、Nicole Cotta、そして Gary Manthaは、惜しみない協力と貴重なコメントをくれました。ありがとう。
そして最後に、ウォーターズの化学製品マーケティングコミュニケーションチーム、特に本書の制作で献身的に働いてくれた Natalie Crosier、Vicki Walton、および Ian Hanslopeに、心より感謝したいと思います。
［ 献辞 ］
5
［ 目次 ］
目次
はじめに ............................................................................................................ 3
献辞および謝辞 ................................................................................................. 4
サンプル前処理における固相抽出の利点 ......................................................... 17固相抽出の定義 ............................................................................................................................................................................ 18
SPE の 4つの主要な恩恵 ........................................................................................................................................................... 19
1. 複雑なサンプルマトリックスの単純化 ...................................................................................................................... 19
2. MSアプリケーションにおけるイオンサプレッションとエンハンスメントの低減 .......................................... 22
3. サンプルマトリックスから分析種を属性の違いにより分画する能力 ................................................................. 23
4. 微量成分の濃縮 .............................................................................................................................................................. 25
SPE は LCです ................................................................................................ 27極性に基づく分離 ........................................................................................................................................................................ 29
極性に基づくメソッドの設計 ........................................................................................................................................... 30
移動相 ................................................................................................................................................................................... 30
固定相 ................................................................................................................................................................................... 31
分析種の性質 ....................................................................................................................................................................... 31
順相 SPE ............................................................................................................................................................................... 32
逆相 SPE ............................................................................................................................................................................... 33
コンディショニングと平衡化ステップの重要性 .......................................................................................................... 35
撥水現象と乾燥が SPE にもたらす影響 ......................................................................................................................... 39
逆相 SPE の保持曲線 .......................................................................................................................................................... 41
pHの影響 .............................................................................................................................................................................. 43
電荷に基づく分離：イオン交換クロマトグラフィー（ I EC） ................................................................................................ 44
解離状態 ............................................................................................................................................................................... 44
SPE 用イオン交換充塡剤の選択 ....................................................................................................................................... 48
強陽イオン交換 -逆相ミックスモード充塡剤 ............................................................................................................... 48
強陰イオン交換 -逆相ミックスモード充塡剤 ............................................................................................................... 49
弱陽イオン交換 -逆相ミックスモード充塡剤 ............................................................................................................... 50
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［ 目次 ］
弱陰イオン交換 -逆相ミックスモード充塡剤 ............................................................................................................... 51
4種類のイオン交換 -逆相ミックスモード充塡剤を用いたSPEメソッド開発を簡素化する強力なストラテジー ... 51
専用固相 ........................................................................................................................................................................................ 55
大気中のホルムアルデヒドその他のアルデヒドおよびケトン分析用 Sep-Pak DNPH -シリカカートリッジ .... 55
オゾンスクラバーカートリッジ ....................................................................................................................................... 57
ポータブルポンプを使った、室内大気中のアルデヒド測定用 Waters XPoSureアルデヒドサンプラーカートリッジ ................................................................................................. 58
地表および地下水中の爆発性物質分析用 PoraPak Rdx Sep-Pakカートリッジ ...................................................... 59
Sep-Pak Dry カートリッジ ............................................................................................................................................... 60
主要な用語と計算 ............................................................................................ 61ホールドアップボリュームの測定 ............................................................................................................................................ 63
流速と線速度 ................................................................................................................................................................................ 64
線速度とは ........................................................................................................................................................................... 64
流速コントロールの重要性 ............................................................................................................................................... 65
スケーリングと線速度 ....................................................................................................................................................... 66
回収率計算 .................................................................................................................................................................................... 69
SPE 製品あるいはプロトコルの調整 .............................................................................................................................. 70
マトリックス効果の計算 ............................................................................................................................................................ 72
ラボで ............................................................................................................. 77固相抽出製品の形状 .................................................................................................................................................................... 78
シリンジ形状 ................................................................................................................................................................................ 79
シリンジバレル型 ............................................................................................................................................................... 79
Vac RC型 ............................................................................................................................................................................... 80
96ウェルプレート ...................................................................................................................................................................... 81
µElution 96ウェルプレート ............................................................................................................................................ 82
クローズ設計のカートリッジ .................................................................................................................................................... 83
Classicカートリッジ .......................................................................................................................................................... 83
Plusカートリッジ ............................................................................................................................................................... 84
Light カートリッジ ............................................................................................................................................................. 84
7
［ 目次 ］
オンライン処理 ............................................................................................................................................................................ 85
分散型 SPE .................................................................................................................................................................................... 87
基本的なセッティング‐送液方法 ............................................................................................................................................ 90
重力による自然落下 ........................................................................................................................................................... 90
加圧とポンプ圧 ................................................................................................................................................................... 92
減圧 ....................................................................................................................................................................................... 95
サンプルと溶媒のロード ..................................................................................................................... ...............97
ルアー型カートリッジで減圧を利用する方法 ..................................................................................................99
96 ウェルプレートで減圧を利用する方法 ..................................................................................................... 100
SPE メソッドのステップ ..........................................................................................................................................................101
オリジナルサンプルの調製 .............................................................................................................................................101
SPE カートリッジの準備 .................................................................................................................................................102
SPE カートリッジのコンディショニング ....................................................................................................................102
SPE カートリッジの平衡化 .............................................................................................................................................104
サンプルロード .................................................................................................................................................................106
分析妨害成分の洗浄 .........................................................................................................................................................108
分析種の脱離 .....................................................................................................................................................................109
溶媒乾固と移動相への再溶解 .........................................................................................................................................110
メソッド開発 .................................................................................................. 113
SPE メソッドの開発 ..................................................................................................................................................................114
サンプル /分析種の属性 ..........................................................................................................................................................115
サンプルマトリックスの調製 ..................................................................................................................................................115
様々な問題解決のための SPE ストラテジー ........................................................................................................................116
ストラテジー 1：パススルー .........................................................................................................................................116
1. サンプル容量がホールドアップボリュームより多い場合 .......................................................................... 117
2. サンプル容量がホールドアップボリュームより少ない場合 ...................................................................... 119
ストラテジー 2：分析種のキャプチャー（捕捉） .......................................................................................................122
ストラテジー 3：分析種のキャプチャー（捕捉）と分画 ..........................................................................................125
ストラテジー 4：分析種のキャプチャー（捕捉）と濃縮 ..........................................................................................131
微量成分の濃縮メソッド ..................................................................................................................................131
濃度の算出 .........................................................................................................................................................137
クロマトグラフィーモードの選択 .................................................................................................................................138
適切な製品サイズの選択 .................................................................................................................................................139
8
［ 目次 ］
メソッド開発におけるマスバランスとトラブルシューティング ............................................................................139
ストラテジーの選択 .........................................................................................................................................................144
ストラテジー1：パススルー ........................................................................................................................... 144
ストラテジー 2：キャプチャー（捕捉） ............................................................................................................147
ストラテジー 3：キャプチャー（捕捉）および分画 ........................................................................................150
ストラテジー 4：キャプチャー（捕捉）および微量成分濃縮 ........................................................................151
ロードキャパシティ /ブレークスルー .................................................................................................................................154
クロマトグラフィー条件設定の重要性 ........................................................................................................................155
ブレークスルーの実験 .....................................................................................................................................................156
メソッドスケーリング：サンプル容量と充塡剤量 ....................................................................................................162
トラブルシューティング .................................................................................165一般的なサンプル前処理に関する問題の原因 .....................................................................................................................168
温度コントロール .............................................................................................................................................................168
流速コントロール .............................................................................................................................................................168
pHコントロール ................................................................................................................................................................168
サンプルの調製と抽出 .....................................................................................................................................................171
サンプルマトリックス .....................................................................................................................................................172
バイアルの状態 .................................................................................................................................................................172
サンプル溶解溶媒 .............................................................................................................................................................172
付録：SPE & LC用語集 .................................................................................. 173
付録：SPE のための Oasis充塡剤テクノロジー ............................................. 191はじめに ......................................................................................................................................................................................192
Oasis ケミストリーの広範な選択肢 ......................................................................................................................................193
高く安定した回収率 ..................................................................................................................................................................194
Oasis HLBと C18固相の乾燥が回収率に及ぼす影響比較 ...................................................................................................195
少ない充塡剤で高いキャパシティ ..........................................................................................................................................196
極めて優れたバッチ間の再現性 ..............................................................................................................................................196
一般的な SPEメソッドの充塡剤量および溶媒の選択 ........................................................................................................197
簡易メソッド開発プロトコル ..................................................................................................................................................198
9
［ 目次 ］
付録：アプリケーション ................................................................................. 201魚介類中の PAH定量 ........................................................................................................................................................202
乳児用粉ミルク中の Melamineおよび Cyanuric Acid分析 ......................................................................................203
ミルク中の残留動物用医薬品の多成分分析 ................................................................................................................204
脳脊髄液中の Amyloid βペプチド ................................................................................................................................204
ポリエチレングリコール 400（ PEG 400）の血漿からの除去 .................................................................................205
血漿および血清タンパク質消化物 .................................................................................................................................205
河川水中の内分泌かく乱物質 .........................................................................................................................................206
土壌中の有機塩素系農薬および PCB ............................................................................................................................206
付録：参考文献リスト ...................................................................................207
10
図一覧
図1：SP E メソッドの例 ...............................................................................................................................................................19
図 2：複雑なサンプルの例 ......................................................................................................................................................... 20
図 3：サンプルマトリックスの複雑さの比較 .......................................................................................................................... 20
図 4：より適切なサンプル前処理による定量の正確性の向上 .............................................................................................21
図 5：SP E テクノロジーにより大幅に改善したベースライン ................................................................................................21
図 6：サンプルマトリックスの影響によるイオンサプレッションの例 ............................................................................... 22
図7：適切な SP E 前処理で軽減されたイオンサプレッション ............................................................................................ 23
図 8：SP E によるサンプル前処理 ............................................................................................................................................. 24
図 9：微量成分の分析例 ............................................................................................................................................................ 25
図10：SP E の力 ........................................................................................................................................................................... 26
図11：極性範囲 ............................................................................................................................................................................ 29
図12：移動相と固定相の適切な組み合わせが極性に基づく分離を実現 ......................................................................... 30
図13：移動相のクロマトグラフィー極性範囲 ........................................................................................................................ 30
図14：固定相のクロマトグラフィー極性範囲 .........................................................................................................................31
図15：化合物 /分析種のクロマトグラフィー極性範囲 .........................................................................................................31
図16：順相クロマトグラフィー ................................................................................................................................................. 32
図17：逆相クロマトグラフィー、SP E と LC ............................................................................................................................ 33
図18：逆相 SP E ........................................................................................................................................................................... 34
図19：高極性表面と高極性の液体 .......................................................................................................................................... 35
図 20：非極性表面と高極性の液体 .......................................................................................................................................... 36
図 21：細孔が湿潤した状態の逆相充塡剤 ...............................................................................................................................37
図 22：細孔の撥水現象（De-Wetting） ...................................................................................................................................... 38
図 23：撥水された細孔により分析種の保持に障害が出ている例 ..................................................................................... 38
図 24：コンディショニングと平衡化のステップ ...................................................................................................................... 39
図 25：細孔の撥水現象がもたらす回収率の低下 ................................................................................................................. 40
図 26：Oasis HLB充塡剤の純粋な逆相保持曲線 .................................................................................................................. 42
図 27：イオン交換クロマトグラフィー ..................................................................................................................................... 44
［ 図一覧 ］
11
図 28：分析種の解離状態と pHの関係 ................................................................................................................................... 45
図 29：イオン交換 -逆相ミックスモード充塡剤の Oasisファミリー（RP＝逆相） ........................................................... 45
図 30：Oasis MCXの弱塩基性化合物保持曲線 ...................................................................................................................... 48
図 31：Oasis MAXの弱酸性化合物保持曲線 .......................................................................................................................... 49
図 32：Oasis WCXの強塩基性化合物保持曲線 ...................................................................................................................... 50
図 33：Oasis WAXの強酸性化合物保持曲線 ..........................................................................................................................51
図 34：Oasis 2× 4メソッド開発ストラテジー ...................................................................................................................... 52
図 35：分析種の荷電状態と pHの関係 ................................................................................................................................... 52
図 36：Oasis MCXによる弱塩基性化合物の捕捉 .................................................................................................................. 53
図 37：Oasis WAXによる強酸性化合物の捕捉 ...................................................................................................................... 53
図 38：Oasis MAXによる弱酸性化合物の捕捉 ...................................................................................................................... 54
図 39：Oasis WCXによる強塩基性化合物の捕捉 .................................................................................................................. 54
図 40：Oasis MCXによる両性イオン性化合物の捕捉 ........................................................................................................... 55
図 41：Sep-Pak DNPHカートリッジ―ショートボディーとロングボディー ........................................................................ 56
図 42：代表的なアルデヒドおよびケトン類 DNPH 誘導体の HPLC 分離（DNPH） ............................................................ 56
図 43：実験室大気中の低濃度アルデヒド類の分析 ..............................................................................................................57
図 44：自動車の排出ガス中の高濃度アルデヒド類の分析 ..................................................................................................57
図 45：オゾンスクラバーカートリッジ ..................................................................................................................................... 58
図 46：大気サンプリングシステムのフロー図 ....................................................................................................................... 58
図 47：Waters XPoSureアルデヒドサンプラー ....................................................................................................................... 58
図 48：XPoSureアルデヒドサンプラーを使った実験室大気中の低濃度アルデヒド分析 ............................................. 59
図 49：PoraPak Rdx カートリッジ ............................................................................................................................................ 59
図 50：E PA メソッド 8330分析種のアイソクラティック分離（PoraPak Rdx） .................................................................. 60
図 51：Sep-Pak Dryカートリッジ ............................................................................................................................................. 60
図 52：SP E 製品のホールドアップボリューム ......................................................................................................................... 62
図 53：空隙容積の身近な例 ...................................................................................................................................................... 63
図 54：流速コントロールが必要なロード、洗浄、脱離のステップ .................................................................................... 65
図 55：流速をコントロールする重要性‐ロードステップ .................................................................................................... 66
図 56：SP E 製品の小径から大径へのスケーリング ...............................................................................................................67
［ 図一覧 ］
12
図 57：SPE 製品の大径から小径へのスケーリング .............................................................................................................. 68
図 58：回収率の確認 .................................................................................................................................................................. 69
図 59：より正確な回収率の確認 .............................................................................................................................................. 70
図 60：回収率の計算 ...................................................................................................................................................................71
図 61：マトリックス効果の測定方法 ........................................................................................................................................ 73
図 62：第1の状況（マトリックス効果なし） .............................................................................................................................74
図 63：第 2の状況（著しいイオンサプレッション） ............................................................................................................... 75
図 64：第 3の状況（イオンエンハンスメント） ....................................................................................................................... 76
図 65：SPE 製品のラインアップ ................................................................................................................................................ 78
図 66：シリンジバレル型カートリッジ .................................................................................................................................... 80
図 67：拡張リザーバーバレル型 Vac RC ................................................................................................................................... 80
図 68：96ウェルプレート ...........................................................................................................................................................81
図 69：96ウェルプレートの Oasis充塡ベッド構成 ...............................................................................................................81
図70：96ウェルプレートのシリカベースの充塡ベッド構成 ............................................................................................... 82
図71：Waters Oasis µElutionプレート ..................................................................................................................................... 82
図72：特許取得済 µElutionプレート先端のデザイン .......................................................................................................... 83
図73：Classicカートリッジ ....................................................................................................................................................... 83
図74：Plusカートリッジ ............................................................................................................................................................ 84
図75：Light カートリッジ .......................................................................................................................................................... 84
図76：オンライン SP E 製品 ...................................................................................................................................................... 85
図77：オンライン SP E システムのロード・脱離ステップの流路図 .................................................................................... 86
図78：2本の SP E カラムを使った複雑なオンライン SPE システム ..................................................................................87
図79：QuEChERS法分散型サンプル前処理製品 DisQuE .....................................................................................................87
図 80：DisQuEチューブ1のプロトコル（QuEChERS法） ....................................................................................................... 88
図 81：DisQuEチューブ 2のプロトコル（QuEChERS法） ....................................................................................................... 89
図 82：重力を送液力として利用 .............................................................................................................................................. 90
図 83：重力を送液力として利用 ...............................................................................................................................................91
図 84：遠心力を利用 ...................................................................................................................................................................91
図 85：シリンジ /プランジャーを利用した加圧式の送液力 ............................................................................................... 92
［ 図一覧 ］
13
図 86：適切な流速コントロール‐液滴 .................................................................................................................................. 92
図 87：流速コントロールの重要性 ........................................................................................................................................... 93
図 88：加圧のためのシリンジ接続 .......................................................................................................................................... 93
図 89：ポンプとクローズ設計のカートリッジの接続 ............................................................................................................ 94
図 90：96ウェルプレート用加圧送液プロセッサー ............................................................................................................. 94
図 91：ガラス製のバキュームマニホールド .............................................................................................................................. 95
図 92：ガラス製バキュームマニホールドの接続例 ................................................................................................................ 96
図 93：シリンジ型カートリッジへの溶液のロード .................................................................................................................97
図 94：リザーバーの接続 ........................................................................................................................................................... 98
図 95：大容量サンプルのロード ............................................................................................................................................... 98
図 96：ルアー型 S P E 製品 ......................................................................................................................................................... 99
図 97：クローズ設計の S P E 製品への溶液のロード ............................................................................................................. 99
図 98：マニホールドに取り付けた 96ウェルプレート .......................................................................................................100
図 99：適度な湿潤が必要な充塡剤の細孔 ........................................................................................................................... 103
図100：有機溶媒を使った逆相充塡剤細孔のコンディショニング ..................................................................................104
図101：水またはサンプル溶解溶媒を使った細孔の平衡化 .............................................................................................. 105
図102：ロードステップでの化合物の捕捉には細孔の適切な湿潤が必要不可欠 ......................................................... 106
図103：サンプルロード ........................................................................................................................................................... 107
図104：分析妨害成分の洗浄 ..................................................................................................................................................108
図105：分析種の溶出 ..............................................................................................................................................................109
図106：溶媒乾固と移動相への再溶解 ..................................................................................................................................110
図107：乾固と再溶解のステップが必要な理由 .................................................................................................................... 111
図108：ストラテジー1：パススルー ...................................................................................................................................... 117
図109：サンプル容量がホールドアップボリュームより多い場合のパススルーストラテジー ......................................118
図110：サンプル容量がホールドアップボリュームより多い場合のパススルーストラテジー .......................................119
図111：サンプル容量がホールドアップボリュームより少ない場合のパススルーストラテジー ................................... 120
図112: サンプル容量がホールドアップボリュームより少ない場合のパススルーストラテジー .....................................121
図113：キャプチャー（捕捉）ストラテジー‐ロードステップ ............................................................................................ 122
図114：キャプチャー（捕捉）ストラテジー‐洗浄ステップ ............................................................................................... 123
［ 図一覧 ］
14
図115：キャプチャー（捕捉）ストラテジー‐脱離ステップ（第 2のケース） .................................................................. 124
図116：キャプチャー（捕捉）および分画ストラテジー ...................................................................................................... 125
図117：キャプチャー（捕捉）および分画ストラテジー‐ロードステップ ........................................................................ 126
図118：キャプチャー（捕捉）および分画ストラテジー‐脱離1 ....................................................................................... 127
図119：キャプチャー（捕捉）および分画ストラテジー‐脱離 2 ...................................................................................... 128
図120：キャプチャー（捕捉）および分画ストラテジー‐脱離 3 ...................................................................................... 129
図121：キャプチャー（捕捉）および分画ストラテジー‐脱離 4 ...................................................................................... 130
図122：SPEを使った微量成分濃縮‐ストラテジー 4 ....................................................................................................... 132
図123：微量成分濃縮ストラテジー‐サンプルを追加してロード ................................................................................... 133
図124：微量成分濃縮ストラテジー‐脱離ステップ ........................................................................................................... 134
図125：微量成分濃縮ストラテジー‐逆方向の脱離ステップ（シリンジ） ....................................................................... 135
図126：微量成分濃縮ストラテジー‐逆方向の脱離ステップ（Plus） ............................................................................... 136
図127：マスバランス‐k値の影響 ........................................................................................................................................140
図128：マスバランス‐k値の変更 ........................................................................................................................................ 141
図129：マスバランス‐サンプル容量の変更 ...................................................................................................................... 142
図130：強溶離溶媒の利点 ...................................................................................................................................................... 143
図131：マスバランス‐パススルー‐完全な脱離ステップ ............................................................................................... 145
図132：マスバランス‐パススルー‐不完全な脱離ステップ ..........................................................................................146
図133：マスバランス‐キャプチャー（捕捉） ...................................................................................................................... 147
図134：マスバランス‐捕捉‐完全な脱離ステップ ........................................................................................................... 149
図135：マスバランス‐捕捉および分画 .............................................................................................................................. 150
図136：マスバランス‐微量成分濃縮 .................................................................................................................................. 152
図137：脱離ステップにおける逆方向の送液方法 ............................................................................................................... 154
図138：ブレークスルーの検討‐ロード .............................................................................................................................. 156
図139：ブレークスルーの検討‐回収率とロード容量 ...................................................................................................... 157
図140：回収率とロード容量 ...................................................................................................................................................160
図141：ロードステップ ..............................................................................................................................................................161
図142：純粋な逆相充塡剤の保持マップ ..............................................................................................................................168
図143：シリカベースの SPE 充塡剤における pHの影響 ................................................................................................... 169
図144：C18シリカ充塡剤の保持マップ .................................................................................................................................. 169
［ 図一覧 ］
15
図145：充塡剤の解離状態 . ..................................................................................................................................................... 170
図146：シリカベースの充塡剤使用時における、不適切なpHコントロールによる塩基性化合物の回収率の低下 ....171
図147：理論段数（ N）の計算方法 .......................................................................................................................................... 177
図148：逆相条件下の溶離力 .................................................................................................................................................. 179
図149：高圧グラジエントシステム ........................................................................................................................................180
図150：低圧グラジエントシステム ........................................................................................................................................ 181
図151：ホールドアップボリューム‐SPE カートリッジ ....................................................................................................... 182
図152：理論段数（ N）の計算方法 .........................................................................................................................................186
図153：独自の水湿潤性 Oasis HLB ポリマー ....................................................................................................................... 193
図154：Oasis充塡剤 ................................................................................................................................................................194
図155：Oasis HLB：充塡剤の乾燥の影響は見られず .........................................................................................................195
図156：ブレークスルーのない高キャパシティを実現する高い保持性能 ...................................................................... 196
図157：Oasis HLB のバッチ間再現性 .................................................................................................................................... 196
図158：Oasis 2× 4メソッド .................................................................................................................................................. 198
図159：Oasis96ウェルメソッド開発プレート：Cephalexinの Oasis 2×4メソッド評価 ............................................ 199
［ 図一覧 ］
16
表一覧
表1：順相 /逆相クロマトグラフィーの比較 ........................................................................................................................... 34
表 2：保持時間 ............................................................................................................................................................................. 43
表 3：イオン交換ガイドライン .................................................................................................................................................. 46
表 4：イオン交換‐逆相ミックスモード Oasisファミリー ..................................................................................................... 48
表 5：流速コントロールの必要なステップ .............................................................................................................................. 65
表 6：カートリッジの I Dと線速度の関係 .................................................................................................................................67
表 7：マトリックス効果の状況 .................................................................................................................................................. 73
表 8：コンディショニングおよび平衡化のステップの必要性 ............................................................................................. 102
表 9：クロマトグラフィーモードと充塡剤の選択 ................................................................................................................ 138
表10：スケーリング情報 .......................................................................................................................................................... 163
表11：新しい条件へのスケーリング ...................................................................................................................................... 163
表12：スケーリング情報 .......................................................................................................................................................... 163
表13：新しい条件へのスケーリング ......................................................................................................................................164
表14：メソッド開発プロセス時の問題 .................................................................................................................................. 166
表15：既存のメソッド実施時の問題 ..................................................................................................................................... 167
表16：Oasis 96ウェルプレートおよびカートリッジのキャパシティと溶出容量 ............................................................ 197
表17：一般的な SPE メソッドの脱離溶媒選択ガイド（1-D）†溶離溶媒は分析種の極性に基づいて選択 .............. 197
［ 表一覧 ］
17
サンプル前処理における固相抽出の利点
18
［ 固相抽出の定義 ］
よりよいサンプル前処理のための強力な手法
分析科学者は、求める結果を得るための最適な手法を決定するにあたり、多くの課題に直面します。サンプル前処理手法やアプローチの選択は、分析の成否を左右する可能性のある重要な問題です。
もちろん、一切サンプル前処理が不要ならば、それに越したことはありません。しかし実際には、ほとんどの場合においてサンプル前処理が必要です。既存のサンプルに対してスループットを向上させる、または分析あたりのコストを下げるためにメソッドを改善しなければならないこともあるでしょう。あるいは、種類の異なる様々なサンプル中の、新規の分析種について分析、報告するよう求められることもあるかもしれません。新たな種類のサンプルには、新しい分析課題が存在する可能性があります。さらに、科学者は今日、かつてないほど低濃度の値を正確性と精度を損なうことなく報告しなければならないという重大な課題に直面しています。
本書は、サンプル前処理技術の非常に強力な手法である固相抽出（SPE）について、幅広い知識を得て理解を深められるよう構成されています。クロマトグラフィー用パーティクルを充塡した製品を使用するこのテクノロジーが皆さんの抱えている分析課題の解決にどのように役立つかを見ていきます。
固相抽出の定義SPE は、固体粒子、通常はクロマトグラフィー用パーティクルをカートリッジに充塡して使用し、サンプル中の異なる成分を化学的特性により分離するサンプル前処理技術です。一部、気体中に含まれるサンプルを処理する特殊なアプリケーションもありますが、サンプルはほとんどの場合、液体の状態です。図 1は、黒色で示したサンプルが S P E カートリッジを移動していき、クロマトグラフィーの原理に基づいてサンプルを構成している個々の色素成分に分離されていく様子を表しています。
19
［ SPEの4つの主要な恩恵 ］
ロードサンプル（黒色）
脱離ステップ 1
脱離ステップ 2
1 本のカートリッジで 3 種類の色素すべてを分画可能
脱離ステップ 3
注： 色素を分画するために脱離力の異なる溶媒を使用
固定相
図1. S PE メソッドの例
クロマトグラフィー充塡剤を用いてサンプル中の異なる成分を分離し、その後の分析試験の精度をより高めることができます。例えば SPE は、分析の妨害成分の選択的な除去によく使われます。
SPE は、クロマトグラフィーの充塡剤は固体であり、サンプルは液体の状態であるため、技術的には「液 -固相抽出」と呼ぶのが正しい名称ということになります。HPLC に使用されている液体クロマトグラフィーと同じ基本原理がS P E に適用されていますが、形状と使用目的が異なり、分析試験の前にサンプルをより分析しやすい状態にするために用いられます。
サンプル前処理では、血漿や唾液、尿など生体試料、水や空気、あるいは土などの環境サンプル、穀物、肉、魚介類といった食品や、医薬品、栄養補助食品、飲料、工業製品など幅広い種類のサンプルを取り扱います。蚊の頭部をサンプルとして扱うこともあります。蚊の脳から抽出した神経ペプチドの分析に用いられたサンプル前処理手法が、SPE でした。（Waters Applications Database, 1983）
SPEの4つの主要な恩恵SPE によって得られる多くの恩恵の中から、特に有用な 4つを紹介します。
1. 複雑なサンプルマトリックスの単純化分析化学者にとって最も難しい問題の 1つに、分析種が複雑なサンプルマトリックス中に含まれている問題があります。例えば、穀物中に含まれるマイコトキシンや、エビ中に含まれる抗生物質、あるいは血漿、血清、尿中の薬物代謝物などを分析する場合です。サンプルマトリックス中には、分析種のほかに多くの分析を妨害する分析妨害成分が含まれており、分析を著しく困難にします。
20
［ SPEの4つの主要な恩恵 ］
まず解決しなければならない問題点は、分析種を定性、定量するために、多くの成分が含まれる複雑なサンプル成分を分離することです（図 2を参照してください）。
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 分
このサンプルのクロマトグラムには多くのピークが検出されていますが、その大半は分析種のピークではありません
図 2. 複雑なサンプルの例
複雑なサンプルは、わずかな変化でも分離の難しい分析種の分離に影響を及ぼす可能性があるため、正確な分析が難しい場合があります。
もう 1つ考慮しなければならないのは、分析サンプル中に存在する分析妨害成分です。このような成分が多量に存在すると、ロードのたびに装置が汚染され、試験を中断しなければならなくなる可能性があります。この分析妨害成分をサンプル前処理の段階で除去しておけば、分析種をより簡単にかつ確実に分析できるようになります。図 3の上図に元の分析サンプル、下図に SPEで前処理を行ったサンプルのクロマトグラムを示し、比較しました。
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 分
いくつかの成分は、MSまたはカラムに問題を起こし、ダウンタイムを
増加させる可能性がある
必要なピークだけを分析
図 3. サンプルマトリックスの複雑さの比較
21
［ SPEの4つの主要な恩恵 ］
サンプルマトリックスを単純化するもう 1つの恩恵は、定量の正確性が向上することです。図 4で分析種 1を示す青線のピークは、一見問題のないように見えますが、赤で示したブランクサンプルと比較すると、サンプルマトリックス由来のコンタミネーションの影響を受けていることがわかります。適切な S P E 前処理を行ったクロマトグラムを下に示します。妨害成分の影響を受けず、化合物 1の定量の正確性が向上しています。
ブランクサンプルマトリックス
スパイクサンプル
ブランクサンプルマトリックス
スパイクサンプル
ピーク1はサンプルマトリックス由来のコンタミネーションの
影響を受けている
ピーク2と3はクリーン
ピーク1はクリーン
12
30.004 AU
10 分86420
1
3
20.004 AU
図 4. より適切なサンプル前処理による定量の正確性の向上
もう 1つの例を図 5に示します。上図のクロマトグラムでは、分析種 1、2のどちらにもサンプルマトリックス中の分析妨害成分の影響が大きく出ています。それに対して下図は、S P Eで適切なサンプル前処理を行ったことでベースラインが大幅に改善し、分析結果の正確性が向上しています。同様にサンプルから分析種を分離、精製する場合でも、はるかに精製度の高い抽出液を得ることができます。
PDA
(0.
01 A
UFS)
1 2
0 10 分5
1
2
SPEサンプル前処理未実施のメソッド
SPEメソッド
図 5. SPEテクノロジーにより大幅に改善したベースライン
22
［ SPEの4つの主要な恩恵 ］
2. MSアプリケーションにおけるイオンサプレッションとエンハンスメントの低減複雑なサンプルマトリックスの 2つめの問題は、検出器として質量分析計（LC/MSまたは LC/MS/MS）を用いた場合に生じます。正しい MS信号応答（感度）を得るには、化合物が適切にイオン化されなければなりません。サンプルマトリックス中の分析妨害成分により、化合物のイオン化が阻害されると、シグナル強度が著しく低下します。
その様子を示したのが図 6です。上図は生理食塩水に溶解した分析種を注入した場合のシグナルです。それに対し下図は、ヒト血漿中の同じ分析種を分析した結果ですが、レスポンスが大幅に抑制（サプレッション＞ 90％）されているのがわかります。下図のサンプルは、一般的なタンパク質沈殿を前処理として行いましたが、この方法ではイオンサプレッションを引き起こすマトリックス中の分析妨害成分を除去することはできず、結果としてシグナルレスポンスが大幅に低減しました。
.
260 300 340 380 420 460 500 540 580 620 m/z
100
%
0
591.7
354.4 518.5472.6
485.5 609.6
Scan ES+
Scan ES+
354.4
260.2291.3
609.6
485.6472.6
411.5591.6
100
%
0
50/50 水/ACN ＋ ヒト血漿上清液
50/50 水/ACN
タンパク質沈殿処理をしたヒト血漿抽出液に添加した分析種
分析種スタンダード水溶液
260.2291.2354.4411.4472.6485.6591.6609.5
-97 %-96 %-86 %-93 %-93 %-95 %-89 %-93 %
イオンサプレッション（％）
図 6. サンプルマトリックスの影響によるイオンサプレッションの例
もう 1つ、このサプレッションの影響がよくわかる例が図 7です。タンパク質沈殿法のみで前処理した血漿サンプルを用いた上図の MS クロマトグラムでは、terfenadineのピークが 80％も抑制されています。それに対し同じサンプルを SPE メソッドで前処理した下図のクロマトグラムでは、イオンサプレッションが最小限に抑えられているのがわかります。サンプルマトリックス中の分析妨害成分を除去することで、化合物のイオン化が適切に行われ、より正確なシグナルを得ることができます。
23
［ SPEの4つの主要な恩恵 ］
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 分
0
%
100
0
%
100 MRM472.2 > 436.4
1.27e6
MRM472.2 > 436.4
1.27e6
1.89
1.91
80％のイオンサプレッション
最小限のイオンサプレッションSPE (Oasis MCX)
PPT
注：サンプルは乾固して再溶解 グラジエント時間＝1.5 分
SPEによりサプレッションを引き起こす分析妨害成分を除去することで分析種のシグナル抑制が起こっていない
図 7. 適切な SPE 前処理で軽減されたイオンサプレッション
場合によっては、サンプルマトリックス中の分析妨害成分が、化合物のシグナルを大幅に増大させることがあります。これはイオンエンハンスメントと呼ばれ、結果が真値より高い不正確な値になります。適切な S P Eメソッドの活用で、サンプル中の分析妨害成分を除去し、イオンエンハンスメントの影響を最小限に抑えたより正確な値を得ることができます。
3. サンプルマトリックスから分析種を属性の違いにより分画する能力分析者は、幅広い物性をもつ化合物が含まれているソフトドリンクの分析時など、分析効率を大幅に向上させるため、サンプルを属性の違いにより分画しなければならないことがあります。例えば、化合物を極性の違いで分画する際に S PE メソッドが適用できます。高極性化合物と非極性化合物とを分画し各画分を別々に分析することで、それぞれの画分に含まれる成分の極性が類似していてそれに適した分析条件を設定できるため、分析効率を向上させることができます。
24
［ SPEの4つの主要な恩恵 ］
S PE による分画効果例を図 8に示しました。ここでは、複雑な乾燥粉末サンプル（紫色のグレープジュースミックス）が高極性成分、赤色色素、青色色素、非極性成分の 4つに簡単に分画されています。この能力がいかに優れているかについては、本書中の別の項で取り上げていきます。
画分1（透明）水
高極性成分（透明）
画分28％ I PA赤色
徐々に溶媒の強さを上げていくステップグラジエントを使用
分画
画分335％ I PA青色
画分470％ I PA非極性成分（透明）
図 8. SPEによるサンプル前処理
SPE によるサンプルの分画についての詳細は、125ページのメソッド開発を参照してください。
25
［ SPEの4つの主要な恩恵 ］
4. 微量成分の濃縮分析者は今日、1兆分の 1（ppt）またはそれ以下のかつてないほど低い含有率の化合物について報告が必要なことが少なくありません。通常、前処理を行わずにこのレベルの含有率のサンプルを分析する場合、感度面において分析機器の限界があります。
これを示す良い例が、環境サンプル中に含まれる微量の汚染物質や生体試料中に含まれる代謝物の経時変化を分析する場合です。図 9の上図は前処理未実施のサンプルのクロマトグラムで、分析種のレスポンスが非常に低くなっています。微量成分の濃縮に SPE を使用したサンプルを同じ条件で分析した下図のクロマトグラムでは、分析種のシグナル強度が著しく高くなり、サンプル中に含まれる分析種の濃度を、正確に求められるようになります。
4 5 分3210
SPEでサンプル中の分析種を濃縮―良好なレスポンス*
*SPEへロードしたサンプル容量と濃縮後の容量から、元の濃度を計算
分析種の濃度が低すぎる（定量が困難）
図 9. 微量成分の分析例
SPE で使用される固相充塡剤の高い保持能力は、他のサンプル前処理アプローチでは非常に困難である成分の濃縮を可能にすることがあります。
26
［ SPEの4つの主要な恩恵 ］
まとめこれまで見てきた通り、SPE がもたらす 4つの主要な恩恵により、サンプル分析の成功率を向上させることができます（図 10を参照してください）。
サンプルロード（黒色）
脱離 1 脱離 2
1 本のカートリッジで 3 種の色素すべてが分離
逆相クロマトグラフィー
脱離 3
SPE の4つの主要な恩恵
1. サンプルの単純化2. マトリックス効果の軽減3. 分画4. 微量成分の濃縮
図10. S P E の力
本書では、SPE の基本の全てと、過去 30年間にこのテクノロジーに携わった世界中の科学者から得られた成功のテクニックをご紹介します。今日、科学者は難しいサンプル前処理や分析上の課題を克服するための手法として、S PE が役立つ手法であることをこれまで以上に見出しています。
本書を通して SPE が持つ能力を理解しマスターすることにより、このテクノロジーの持つ力をラボで活用できるように
なることを願っています。
固相抽出ビギナーズガイド
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