Celulase

Tallyta Santos TeixeiraTecnologia de Processos Fermentativos IProf. Alex Cangussu

AGOSTO/2013

CelulaseIntroduoFontesProduoSubstratosInculoBiorreatores (FSm e FSS)Comparao entre FSm e FSSPurificaoEnsaio de celulaseConcluses e perspectivas

INTRODUOCerca de 1,8 x 1012 toneladas de biomassa so produzidas no planeta Terra anualmente;

Cerca de 60% lignocelulose;35-50% de celulose;20-35% de hemicelulose;10-25% de lignina.

Fonte: Santos et al 2012.Complexo enzimtico lignocelulsicoComponentes:

Hemicelulases,Diferentes enzimas que degradam ligninaComposto estrutural essencial em: txteis, de papel e materiais de construo.Principal nutriente para animais ruminantesCelulasesCelulose4Cadeias lineares de b-1,4-D-glicose;Composta por longo polmero no ramificado de glicose;Cristais altamente insolveis.

Fonte: http://comendonaquimica.blogspot.com.br/2012_07_01_archive.html CeluloseCelulaseComponentes enzimticos principais:- Endoglucanase;Exoglucanases ou celobiohidrolases;b-glicosidases ou celobiase.

Fonte: Ogeda e Petri, 2010

Celulose

CelobioseIndstria AplicaoAlimentcia Extrao de sucos de frutas e vegetais, Tratamento de vinhos, Produtos de padaria.

TxtilBiostoning Polimento de tecido celulsico

Papel- Reutilizao de papelLimpezaDetergente para roupasAgro-biotecnolgica Biocombustveis Suplemento da alimentao

FONTESMicrorganismos terrestres e marinhos;Fungos filamentosos:Solo,Plantas,Ambiente marinho.Bactrias.

Fusarium solaniFonte: http://www.apsnet.org/publications/imageresources/Pages/phyto31.aspx

Aspergillus nigerFonte: http://www.taxateca.com/ordeneurotiales.htmlCelulases: baixa atividade especfica.Pesquisas:Isolar estirpes selvagens altamente produtoras,

Trichoderma reesei Fonte: Nature Biotechnology, 20081970 E.U.A Primeiro programa de mutaoTrichoderma reesei QM 6a : estirpe selvagem.Mutante: Trichoderma reesei QM 9414; Produziu de duas a quatro vezes mais celulase do que o tipo selvagem QM 6a (Mandels et al, 1971).

Fonte: http://mycorant.com/trichoderma-sex-and-fuel/Trichoderma sp.

Trichoderma reesei QM 6aFonte: http://ec.asm.org/content/11/7/885/F3.expansion.htmlFinal dos anos 80: Engenharia Gentica e novas estirpes T. reesei .Mutante T. reesei Rut NG-14 ; Mutante T. reesei Rut C30

Fonte: Castro e Pereira, 201011PRODUODepende do uso;Custos relativamente altos;

Reduo dos custos:Produo in situ: resduo do substrato incorporado no final do produto;Fermentao em estadoSlido: tecnologia alternativa.

Fonte: http://www.maisgestao.com.br/images/calcular-custo-producao.jpg SubstratoCelulase pura ou monocomponenteCelulose puraFonte de carbono e nitrognio solveisResduos de colheitas:

Fonte: Revista Plantar, 2013

Fonte: Nirvana, 2012

Fonte: Dreamstime, 2012Bagao da canaSerragemFarelo de trigoSubproduto do milhoGros de cevadaPolpa de sorgo doceFonte: Bana Craft, 2013.Fonte: Correio do Estado, 2011.Fonte: Gonalves, 2012

Materiais lignocelulsicos naturais;Produtos de base a granel com aplicao agro-biotecnolgica;

Pr-tratamento:Fsico: moinho de bolas;Qumico: cido ou base;Combinado: exploso a vapor.

Fonte: Santos et la, 2012.InculoDisponibilidade de uma cultura inicial confivel para a produo de microrganismo;

Miclio:- Vantagem: rpido crescimento;Desvantagem: controle preciso;

Esporos:- Vantagem: produo longe dos silos;Desvantagem: crescimento mais lento; Cultura mista (T. reesei e Aspergillus spp).

Fonte: InfoescolaBiorreatoresCondies timas para o crescimento do fungo:Fermentao SubmersaReator agitado mecanicamente (STR);T. reesei so cultivados em:Fermentadores de at 230 m;Meios simples e barato ;Materiais como soro e vrios resduos vegetais.

Fonte:http://www.discoverarmfield.co.uk/data/cex/images/cem.jpg

Mutante T. reesei Rut C30:32- 33 C ;pH 3,5- 4,0. Primeiro estgio (0-48h): mximo cultivo;Segundo estgio (48-96h):produo de enzimas.Fonte: Limn et al 2011

Modo de operacional mais comum: Fermentao descontnua simples;FPU (Filter paper unit): Unidade internacional de papel de filtro;Fermentao descontnua alimentada:

Fermentao contnua no tem tido sucesso para produo de celulase.Fermentao em Estado SlidoTecnologia alternativa;Mutantes de T. reesei:Rendimento: 100-200 FPU /g ;Produtividade: 200-800 FPU /mL.

Fonte: http://www.slideshare.net/EmeC1/celulasesT. Reesei Rut C30Reator bsico: Reator bandejas do tipo Koji

Fonte: Adaptado de Durand, 2003Reator de bandeja modificado (PlaFractor).

Fonte: http://www.sciencephoto.com/media/211806/enlargeFonte: Adaptado de Suryanarayan, 2003

Novos modelos:Fermentao SubmersaFermentao SlidaPrefervel quandoEnzimas puras ou componentes enzimticos especficos so desejados.O produto fermentado bruto pode ser usado diretamente.Rendimento global200-400 FPU/g DM em substrato100-400 FPU/hLProdutividade10-20 FPU/mL33 FPU/mLReator bsicoSTR- Stirred Tank ReactorsReator Tipo KojiCusto$ 160/m Rendimento mdio de celulase de 20 FPU/ mL Estimativa do custo de produo: $8/ 106 FPU$150/ toneladas Rendimento mdio de produo de celulase de 50 FPU/ g de substrato, Estimativa do custo de produo: $3/ 106 FPUPURIFICAOPrimeira etapa downstream (FSm): separao da cultura lquida da parte insolvel da fermentao;

Filtros rotativos a vcuoFonte: http://media-sa.viva-images.com/vivastreet_br/clad/63/7/71619394/large/1.jpg?dt=11246aa48ae159eb188c80d0a8fe6a2f

Centrfuga decantadoraFonte:http://www.hellopro.es/Riera_Nadeu_S_A_-8923-noprofil-1001494-10142-0-1-1-fr-societe.htmlSegunda etapa: ultrafiltrao de lquido (sobrenadante).

Fonte http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/b6/Ultrafiltration_Grundm%C3%BChle.jpgUltrafiltraoPurificao laboratorial de celulases e seus componentes:

Cromatografia de troca inicaFonte: Lehninger et al, 2006

Cromatografia de excluso por tamanhoCromatografia de afinidadeFonte: Lehninger et al, 2006 ENSAIO DE CELULASEIdentificar a atividade hidroltica total em substratos selecionados;Mtodo mais utilizado: Ensaio da atividade em papel filtro (FPA) Quantifica a capacidade de hidrlise de uma preparao enzimtica de numa faixa do papel filtro Whatman #1 em acares redutores.

Fonte: http://img1.mlstatic.com/papel-filtro-qualitativo-whatman-n-1_MLB-O-2778193674_062012.jpg

Fonte: Wikienergia, 2009Celulose: 1 mg de protena total representa atividades de 0.54-0.57 FPU (Nieves et al 1998).1 mg de protena celulase pura era equivalente a aproximadamente 1 FPU.

Fonte: http://enzymeinchina.com.pt/product/6-3b.jpg

Fonte: http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Wood12.htmlCONCLUSO E PERSPECTIVASA celulase uma das mais importantes enzimas industriais;Variabilidade de aplicao na indstria;Limitaes: alto preo;

Fonte: http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Wood12.htmlFonte: http://www.epama.com.br/demissoes-de-alto-custoPara obter sucesso na produo de celulase so necessrios:1) Seleo e melhoria dos melhores microrganismos produtores de celulase;2) Escolha da tecnologia de fermentao;

A demanda pelo uso racional de lignocelulose ir guiar a produo microbiana de celulase.

RefernciasCASTRO, A. M.; JNIOR, N. P. Produo, propriedades e aplicao de celulases na hidrlise de resduos agroindustriais. Quim. Nova, Vol. 33, No. 1, 181-188, 2010.DURAND, A.Bioreactor designs for solid state fermentation. Biochemical Engineering Journal , v. 13 ,2003, p.113125LEHNINGER, A.L.; NELSON, D.L.; COX, M.M. Princpios de bioqumica. 4 ed. So Paulo: SARVIER, 2006, p. 102. LIMN, M.C.; PAKULA, T.; SALOHEIMO, M.; PENTILLA, M.The effects of disruption of phosphoglucose isomerase gene on carbon utilisation and cellulase production in Trichoderma reesei Rut-C30. Microbial Cell Factories, v.10, n. 40, p. 1-21, 2011.SANTOS, F. A. ; QUEIRZ, J.H. de; COLODETTE, J. L.; FERNANDES, S.A.; GUIMARES, V.M.; REZENDE, S. T. Potencial da palha de cana-de-acar para produo de etanol .Quim. Nova, v. 35, n. 5, p. 1004-1010, 2012. SURYANARAYAN, S. Current industrial practice in solid state fermentations for secondary metabolite production: the Biocon India experience. Biochemical Engineering Journal v. 13, n. 23, March 2003, p. 189195.SZAKACS, G.; TENGERDY, R. P.; NAGY, V. Cellulases. In: PANDEY, A.; WEBB, C.; SOCCOL, C. R.; LARROCHE, C. Enzyme Technology. New Delhi: Springer, p. 253 272, 2010.