組織からのゲノム DNA 抽出キット Tissue Genomic DNA ......http:...

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組織からのゲノム DNA抽出キット

Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit

目次

基本データ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・3

キットの内容・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・3

重要事項・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・4

操作・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・4

サンプル別プロトコール・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・7

トラブルシューティング・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・9

＊本製品は研究用です＊


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本キットは動物の組織からトータル DNA を迅速に効率よく抽出するようにデザインされています。

また、細菌、固定組織、酵母用のプロトコールも用意しています。サンプルはカオトロピック塩と

Proteinase K で溶解し、DNA をカラムのシリカ膜へ吸着させます。エタノールを含む Wash Buffer

で洗浄し、DNAを Elution Bufferまたは ddH2Oで溶出します。操作時間は約 60分（サンプルにより

溶解時間が異なります。）で、精製できる DNA のサイズは最大 50kb（主に 20-30kb）です。精製後

の DNAは直接その後のアプリケーションへ使用できます。

品質管理

本キットは、ロットベースで品質管理を行っています。10mg のマウスの肝臓から抽出したゲノム

DNA は分光光度計で抽出量を測定し、アガロースゲル泳動で確認しています。ゲノム DNA は 10

μ g以上、抽出できます。A260/A280は 1.7-1.9です。

サンプル量と収量

サンプル 25mgまでの新鮮・冷凍組織

サンプル種組織、細菌、固定組織、酵母、血斑

収量 50μ ｇ（サンプル種により異なります）

所要時間 30-60分

キットの内容

FATGK 001

(50 preps)

FATGK 001-1

(100 preps)

FATGK 001-2

(300 preps)

FATG1 Buffer 15ml 30ml 70ml

FATG2 Buffer 15ml 30ml 70ml

W1 Buffer 22ml

エタノール(96-100%)を

8ml加えてください。

44ml



124ml



Wash Buffer 10ml



20ml



50ml



Elution Buffer 15ml 30ml 30ml×3

Proteinase K 11mg 11mg×2 11mg×6

＊11mgの Proteinase Kへ 1.1mlの ddH2Oを加えてください。

Collection Tube 100 pcs 200 pcs 600 pcs

Elution Tube 50 pcs 100 pcs 300 pcs

FATG Mini Column 50 pcs 100 pcs 300 pcs

Micropestle 50 pcs 100 pcs 300 pcs

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注意

取扱時はゴム手袋、白衣を着用してください。

重要事項

1. 作業は、ゴム手袋と白衣を着用して行ってください。

2. ddH2O を 1.1ml、Proteinase K へ加えてボルテックスでよく混和し、10mg/ml に調整します。そ

の後は 4℃に保管してください。

3. 操作を始める前に、ドライバスまたは、ウォーターバスを１台 60℃(ステップ４)に、もう１台 70℃

（ステップ７）に設定してください。

4. サンプルを室温に戻して処理してください。

5. 全ての遠心操作は、14,000rpm (10,000×g)で行ってください。

操作

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<一般的な手法>

操作を始める前に、ドライバスまたはウォーターバスを 60℃(ステップ 4）と 70℃(ステップ 7)に設定

してください。

Step 1 組織の分離

a) 新鮮組織

最大 25ｍｇの組織サンプルをチューブ（お客様でご用意ください）に移します。

キットに含まれる Micropestle ですり潰す、または液体窒素で組織を粉末化し、粉末をチューブ（お

客様でご用意ください）へ移します。

b) 冷凍組織

最大 25mgまでの組織サンプルをはかり、液体窒素で組織を粉末状にし、チューブへ移します。

細胞量の多い組織（脾臓など）は 10mg程度のサンプル量を使用してください。

2. 200μ lの FATG1 Bufferを加え、Micropestleを使用してホモジナイズします。

Step 2 溶解

3. 20μ lの Proteinase K(10mg/ml)をサンプルに加え、ボルテックスで混和します。

4. 60℃で組織が溶解するまでインキュベートします。（サンプルにより異なりますが、通常は 1 時

間程度インキュベートします。）

＊インキュベート中は、10-15分に一度ボルテックスでサンプルを混和してください。

5. 数秒間スピンダウンし、蓋の内側についた溶液を回収します。

＜RNA-free genomic DNAを抽出する場合のオプションステップ＞

6. 4μ lの RNaseA (100mg/ml)をサンプルに加え、室温で 2分間インキュベートしてください。

7. 200μ lの FATG2 Bufferをサンプル溶液に加え、パルスボルテックスし、70℃で 10分間インキ

ュベートしてください。


＊不溶性の残渣がある場合は、2 分間遠心分離し、上清を新しいチューブ（お客様でご用意く

ださい）へ移します。

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Step 3 DNAの吸着

9. 200μ lのエタノール（96-100％）をサンプル溶液に加え、パルスボルテックスで混和します。


11. FATG Mini Column を 2.0ml Collection Tubeへ取り付けます。サンプル溶液（沈殿物も含めま

す。）を FATG Mini Column にアプライし、1分間遠心分離します。ろ液を捨て、FATG Mini Column

を新しい Collection tubeに付けます。

Step 4 洗浄

12. 500μ lの W1 Buffer（事前にエタノールを加えてください）を FATG Columnへ加え、1分間遠

心分離し、ろ液を捨てます。

13. 750μ lのWash Buffer（事前にエタノールを加えてください）を加え、1分間遠心分離し、ろ液を

捨てます。

14. さらに 3分間、10,000×g で遠心分離し、Columnを乾燥させます。

＊この操作は酵素処理を阻害する物質を取り除くための重要なステップです。

Step 5 DNAの溶出

15. FATG Mini Column を Elution Tubeへ取り付けます。

16. 50-200μ lの Elution Bufferまたは、ddH2O(pH7.5-8.5)を FATG Mini Column膜の中央にアプ

ライし、3分間静置します。

＊効率よく溶出させるため、Elution Bufferをカラム膜中央へ加え、完全に吸着させてください。

＊通常 200μ l で溶出しますが、サンプル量が少なかった場合などは、50-150μ l で溶出してくださ

い。

17. 2分間遠心分離し、DNAを溶出します。

18. 4℃または、 -20℃で精製した DNAを保管してください。

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サンプル別プロトコール

細菌の培養液

1. 1ml の細菌培養液をチューブ（お客様でご用意ください）に移します。

2. 2分間遠心分離し、上清を完全に除去します。

3. 一般的な手法のステップ 2へ進んでください。

生体試料中(Biological fluids)の細菌

1. サンプルを 7,500rpm又は 5,000×gで 10分間遠心分離し、細菌を回収してください。


目鼻咽頭又は他のスワブ

1. スワブを 2mlの PBSに室温で 2-3時間つけておきます。

2. 7,500rpm又は 5,000×gで 10分間遠心分離し、細菌を回収してください。


グラム陽性の細菌

ドライバスまたはウォーターバスを 60℃と 95℃に設定してください。

1. 1ml の細菌培養液をチューブ（お客様でご用意ください）に移します。

2. 2分間遠心分離し、上清を完全に除去してください。

3. ペレットを 200μ ｌの lysozyme reaction solution (20mg/ml lysozyme; 20mM Tris-HCl, pH8.0;

2mM EDTA; 1.2% Triton) を加え、再懸濁します。

4. 37℃で 30分インキュベートします。

<RNA-free genomic DNAを抽出する場合のオプションステップ>

5. 4μ lの RNaseA (100mg/ml)をサンプルに加え、室温で 2分間インキュベートしてください。

6. 20μ lの Proteinase K と 200μ lの FATG 2 Buffeｒをサンプルに加え、パルスボルテックスで混

和します。

7. 60℃で 30分インキュベートし、さらに 95℃で 15分インキュベートしてください。


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<固定組織＞

パラフィン埋め込み組織

1. 25mgまでの組織をチューブ(お客様でご用意ください。)へ移します。

2. 1ml のキシレンを加え、よく混ぜ室温で 30 分インキュベートします。5 分間遠心分離し、ピペッ

ティングでろ液を捨てます。1mlのエタノール( 96-100%)を脱パラフィン化した組織に加え、ボルテッ

クスで緩やかに混和します。

3. 5分間遠心分離し、上清をピぺットを使用して除去します。

4. 1mlのエタノール(96-100%)を加え、ボルテックスで混和します。

5. 5分間遠心分離し、上清をピぺットを使用して除去します。

6. 37℃で 10分インキュベートし、エタノールを蒸発させます。

7. 組織を付属の Micropestle ですり潰す、または液体窒素で粉末にします。一般的な手法のス

テップ 2へ進んでください。

<固定組織＞

ホルマリン固定組織

1. 25mgの組織を 1mlの PBSで 2回洗浄し、ホルマリンを除去します。

2. 組織を付属のMicropestleですり潰す、または液体窒素で粉末にします。一般的な手法のステ

ップ 2へ進んでください。

<酵母>

1. 3mlの酵母培養液(OD600=10)をチューブ(お客様でご用意ください)へ移します。

2. 7,500rpm又は 5,000×gで 10分間遠心分離し、上清を完全に除きます。

3. ペレットを 600μ lの sorbitol buffer (1M sorbitol; 100mM EDTA; 14mM β -mercaptoethanol)で

再懸濁し、200Uの zymolaseまたは lyticaseを加え、30℃で 30分インキュベートします。

4. 7,500rpm又は 5,000×gで 5分間遠心分離し、上清を完全に除きます。


<乾燥血液のスポット>

ドライバスまたはウォーターバスを 85℃(ステップ 2)、60℃(ステップ 5)、70℃(ステップ 7)に設定して

ください。

1. 乾燥血液の付着したフィルター紙を細かく切り、チューブ（お客様でご用意ください）へ加えま

す。

2. 200μ lの FATG1 Bufferを加え 85℃で 10分間インキュベートします。

3. 数秒間スピンし、蓋についた溶液を収集します。

4. 20μ lの Proteinase K をサンプル溶液に加え、ボルテックスで混ぜます。

5. 60℃で 1 時間インキュベートします。インキュベート中、10-15 分に 1 度ボルテックスしサンプ

ルを混和します。


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トラブルシューティング

トラブル原因解法

収量が少ない 1. サンプル中の細胞数が少ないサンプルを多めに使用し、200μ lへ

濃縮してください。

2. Proteinase Kが機能していないた

め、溶解が不十分

新たに調整した Proteinase Kを用い

て抽出をやり直してください。

3.1 FATG2 Buffer とサンプルがよく

混和できていないため、溶解が不十

分

抽出をやり直してください。

サンプルと FATG2 Bufferを直ちにパ

ルスボルテックスで混和してください。

3.2 インキュベーション時間が短い新しいサンプルで抽出をやりなおして

ください。インキュベーション時間を長

くし、サンプル断片が残らないように


3.2 ステップ 9 でエタノールを加える

操作を抜かしている

ステップ9のエタノールを加えるステッ

プを忘れずに行ってください。

4.1 Wash Bufferへエタノールが加え

られていない

Wash Buffer を使用する時、エタノー

ル(96-100％)を必要量加えてくださ

い。

4.2 Wash Bufferへ加えたエタノール

の濃度が異なる



い。

5.1 ddH2Oの pHが不適応 ddH2Oの pHを 7.5-9.0に調整してくだ

さい。または、付属のElution Bufferを

使用してください。

5.2 Elution Buffer が FATG Mini

Columnへ十分に吸着されていない

FATG Mini Columnへ Elution Buffer

を添加後 5 分静置してから遠心分離


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洗浄後もカラム膜に

赤褐色の断片が残る

1.1 Proteinase K の劣化により、細

胞を完全に溶解していない

抽出をやり直してください。Proteinase

Kを再度調製してください。

FATG2 Bufferへ Proteinase Kを直接

加えないでください。

1.2 FATG2 Buffer とサンプルが十分

に混和していない

抽出をやり直してください。FATG2

Buffer をサンプルに加えた後、即パ











られていない



い。





い。

カラムが目詰まりをお

こしている

1.1 サンプルが非溶解性の断片を

含む

フィルター紙、骨、毛髪などの断片を

取り除いてください

1.2 サンプルの粘性が高いサンプル量を減らしてください







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精製した DNA の

A260/A280が低い







1.2 FATG2 Buffer とサンプルが十分

に混和していない

抽出をやり直してください。FATG2

Buffer をサンプルに加えた後、即パ











られていない



い。





い。

3.3 ゲノム DNAがコンタミしているチューブの縁へサンプルやバッファー

をつけないように操作してください。

精製した DNA の

A260/A280が高い

1.1 RNA断片がコンタミしているステップ6を行い、RNAを除去してください

1.2 RNase A を加える前に FATG2

Bufferを加えた

オプションステップを行う場合は、RNase

Aを加えてから、FATG2 Bufferを加えてく

ださい。

溶出した DNAが変性

している

1.1 サンプルが古い新鮮なサンプル、またはよく保管されたサ

ンプルを使用してください。

1.2 電気泳動用のバッファーが

DNaseでコンタミしている

電気泳動には、新しい泳動バッファーを

利用してください。

1.3 パラフィン固定サンプルからの

場合

パラフィン固定組織から抽出したゲノム

DNAは変性しています。PCRへは使用で

きますが、ザンブロッティングや制限酵素

処理には不向きです。

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日本総代理店

株式会社チヨダサイエンス

〒101-0044 東京都千代田区岩本町 2-13-11 TEL: 03 (3864) 7701 FAX: 03 (3864) 7752

E-mail: [email protected] vol.0905

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