Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología

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Capítulo 16 Investigación de Drogas de Abuso y Productos de Corte Dr. Luis Alberto Ferrari Perito I del Cuerpo Químico Forense. Profesor de Química Forense en la Universidad de Morón.

Cannabis y sus componentes Análisis físico de los productos de Cannabis.

Los características microscópicas de Cannabis sp., permiten reconocer por técnicas micrográficas el material que puede estar finamente particulado o en grandes trozos. Los abundantes tricomas presentes en los distintos componentes de la planta (hoka, subunidades floridas y frutos) son los elementos histológicos más importantes para distinguir la Cannabis sativa. Se reconocen también pelos cistolíticos unicelulares y tricomas o pelos glandulares. Los pelos glandulares pueden observarse como glándulas sésiles, pequeños tricomas glandulares pluricelulares (con pie y cabezuela). Ensayos presuntivos

Se trata de reacciones presuntivas adecuadas para realizarse en terreno, de manera de poder descartar “a priori” el estar en presencia de material proveniente de Cannabis. Reacción con Fast Blue:

La reacción se fundamenta en la reacción de copulación de los canabinoides con Fast Blue B formando un compuesto de color púrpura intenso. Se utilizan dos papeles de filtro de manera de retener en el primero, compuestos fenólicos que se encuentran en Cannabis y que interfieren con la reacción produciendo falsos positivos. Con dos papeles de filtro se forma un embudo realizando cuatro dobleces en forma adecuada. Se coloca una pequeña cantidad pulverizada de la planta o resina en el centro del papel. Se añaden dos gotas de éter de petróleo de modo que penetren en el papel de filtro inferior, dejando secar el papel de filtro inferior. Se deposita una pequeña cantidad de Fast Blue B sólido en el centro del papel inferior. Se añaden dos gotas de agua al reactivo y se extiende la mezcla sobre el papel con una espátula. Si aparece un color púrpura, se está en presencia de canabinoides. Se recomienda no usar el reactivo en exceso para evitar el amarronamiento de la mancha. Ensayo de Duquenois-Levine:

La prueba puede realizarse sobre material pulverizado o sobre su extracto. Este se obtiene de la siguiente forma: 100 mg de muestra se extraen con éter de petróleo. Filtrar y evaporar en cápsula hasta sequedad. Se coloca una pequeña cantidad del material sospechoso o su extracto. Se agregan 2 ml del reactivo preparado con acetaldehído y vainillina en etanol al 95 % agitando 1 minuto. Se añaden luego 2 ml de HCl conc por los bordes del tubo, dejando en reposo durante 10 minutos. En presencia de cannabinoides aparece en la interfase una gama de colores: verde, azul y violeta. Puede extraerse en fase clorofórmica observándose color violeta. Cromatografía en capa delgada

Tiene por objeto poner de manifiesto los componentes canabinoides más importantes: CBD, THC y CBN. La siembra se hace a partir de un extracto obtenido con el contacto de una hora del material con acetato de etilo que luego se concentra por calentamiento en baño maría.

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Como fase estacionaria se utiliza Sílica Gel G con indicador de fluorescencia a 254 nm. Respecto a la fase móvil se han propuesto muchas mezclas de las cuales dos que ofrecen resultados satisfactorios son éter de petróleo: éter etílico 80:20 y benceno: n-hexano: dietilamina (75:30:5). Como fase móvil se utilizará una mezcla acetato de etilo: metanol: amoníaco 90:10:II. El agente revelador es Fast Blue B en agua destilada al 1 % y posterior exposición a vapores de amoníaco.

Este revelador tiene un límite de detección de aproximadamente 0,5 g. Detección de productos canábicos en sangre Algunos investigadores han informado la dificultad de obtener muestras de sangre de sujetos fumadores ya que los mismos evitan ser identificados. En los casos en que esto es posible se procede de la siguiente manera: Técnica: A 5,0 ml de sangre total se adiciona 1,0 ml de ácido tricloroacético al 10 % luego se agrega 10 ml de n-hexano y después de agitación durante varios minutos se calienta a reflujo durante 30 minutos. Dejar enfriar, centrifugar, separar y reservar la capa orgánica. Con el resto se realiza una segunda extracción utilizando el mismo volumen de solvente. Las dos fracciones orgánicas reunidas se lavan con 10 ml de solución acuosa saturada de NaCl, se secan con sulfato de sodio anhidro, se concentran a presión reducida hasta obtener un volumen aproximado de 0,5 ml. La concentración debe realizarse a temperatura ambiente para reducir la pérdida de compuestos volátiles. Sobre el extracto final se efectúan ensayos cromatográficos en capa delgada o CGL.

Cromatografía gaseosa (CG-FID)

Es utilizada fundamentalmente con fines cuantitativos. Las condiciones de trabajo pueden resumirse a continuación: Detector FID (ionización de llama) H2: 30 ml/min, aire 300 – 450 ml/min Columna 2 m, d.i. (2 – 4) m Relleno 3 % OV – 17, SE – 30, OV –1 Gas portador N2 a 30 ml/min. Condiciones de trabajo: Temperatura inyector: 270 C° Temp. Horno: isotérmica 240 – 260 C° Patrón interno: n-tetradecano, tetracosano.

Canabinoides en saliva

Hasta hoy no se ha encontrado una correlación entre la concentración plasmática de THC en sangre y saliva. Pese a ello, se han observado niveles similares o superiores de THC en saliva respecto al plasma de individuos fumadores de marihuana. Se sugiere que las concentraciones de THC informadas en saliva provienen de un alojamiento o secuestro de la misma en la cavidad bucal durante el fumado. El resultado positivo en este fluido permite detectar la droga psicoactiva por un tiempo más prolongado que en sangre. Si bien no se tiene gran información acerca de los metabolitos de canabinoides en saliva, se estima que el derivado carboxilado puede provenir del mismo acto de fumado o bien del metabolismo bucal. Por otra parte, se ha observado que la ingestión de alimentos y bebidas comunes no interfieren en la detección de canabinoides en saliva. Canabinoides en orina Es el medio que permite detectar estos compuestos por un tiempo más prolongado (5 a 20 dias) dependiendo de la dosis y frecuencia de uso. Como resultado de la biotransformación operada en

el hígado, el THC es convertido, a través de varios intermediarios, en 11-nor- 9- -THC carboxílico en orina.

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Actualmente se utilizan tiras reactivas o placas comerciales basadas en técnica inmunológica. El resultado positivo debe ser confirmado mediante un método analítico independiente. Debe tenerse en cuenta que los valores de corte para estas estructuras se hallan en el orden de los nanogramos, por lo que se deben extremar los cuidados en la fase de aislamiento cuando se debe confirmar el resultado obtenido por la vía del ensayo preliminar. Técnica: colocar 5,0 ml de orina en tubo de centrífuga de 15 ml. Adicionar 0,5 ml de solución de HONa 1 N. Incubar en baño de agua a 50 – 60 C° durante 15 minutos. Enfriar y acidificar con HCl 1N. Agregar 5 ml de n-hexano agitando suavemente durante 20 minutos. Centrifugar a 1000 g durante 5 minutos. Transferir la fase orgánica con la ayuda de una pipeta Pasteur a otro tubo y evaporar a temperatura ambiente mediante corriente de aire seco. Resuspender el residuo con 3-4 gotas de una mezcla de cloroformo-metanol (3:1) y sembrar en placas cromatográficas de alta resolución (HPTLC) conjuntamente con los respectivos patrones. Desarrollar con el sistema n-heptano:n-butanol:ácido acético glacial 90:9:1 en una cuba saturada durante 15 minutos. O bien el sistema Eter Etílico: eter de petróleo (2:8) Secar la placa a temperatura ambiente y revelar rociando con dietilamina seguido del reactivo Fast Blue BB al 0,1 % en agua-metanol (9:1). Esperar 10 minutos, observar y rociar nuevamente con dietilamina.