実習１： MEGA7のダウンロードとインストール

MEGAのWebサイトは http://www.megasoftware.net/（下図）。正式には、黄緑色の［ＤＯＷＮＬＯＡＤ］ボタンをクリ

ックし、次の画面でもう一度［ＤＯＷＮＬＯＡＤ］をクリックすると、ダウンロードできる。

実習２： 配列データのダウンロードとアライメント

例題データ (data)： Actin gene coding region

１．配列データのダウンロード

（１） MEGAのメインメニュー[Alignment] – [Query Databanks] を選択する。

（２） Accession number を入力し、[Search] ボタンをクリックする。

（３） 遺伝子全長（1374bp）の配列データが表示される。「CDS」のリンクをクリックすると（①）、CDS の部分だけマークさ

れる（②）。右下の「GenBank」をクリックすれば、タンパク質コード領域（1134bp）の配列だけが表示される（③）。ス

クロールして配列データを確認する。

①

②

③

※CDS （coding sequence）をクリックしないと、イントロンを含むものと含まないものが混在し、アライメントに支障が出る

ので注意する。

（４） [Add to Alignment] ボタンをクリックする。

（５） ［Input Sequence Label］ ダイアログボックス（右図）が表示されるので、以下のように選択する。

1．「First word」は種名である「Homo sapiens」を選択する。

2. 「Second word」は遺伝子名である「ACTA1」を選択する。

3. 今回は 「Use Initial for Genus Name」 のチェックを外す。

（６） 同じ要領で以下のデータを全て Alignment Explorer にダウンロードする。（スペースで区切って、複数の番号をク

エリにすれば、一度に検索できる。）

gi：5016087: Homo sapiens, actin, alpha 1, skeletal muscle

gi：16359157: Homo sapiens, actin, beta

gi：11038618: Homo sapiens, actin, gamma 1

gi：11038625: Homo sapiens, actin, gamma 2, smooth muscle, enteric

gi：4501882: Homo sapiens, actin, alpha 2, smooth muscle, aorta

gi：15928833: Mus musculus, actin, alpha 1, skeletal muscle

gi：23271068: Mus musculus, actin, gamma, cytoplasmic

gi：28277650: Danio rerio, actin, alpha 1, skeletal muscle

gi：3044209: Danio rerio. beta-actin

gi：1552221: Oryzias latipes, mRNA for muscle actin

gi：3336983: Oryzias latipes, mRNA for cytoplasmic actin

gi：156758: Drosophila melanogaster, actin gene, complete cds, locus 5C

gi：170985: Yeast (Saccharomyces cerevisiae) actin gene

gi：2588915: Pneumocystis carinii mRNA for actin

gi：1049306: Arabidopsis thaliana actin-2

gi：30409355: Oryza sativa

※注意： ［CDS］をクリックして coding sequenceのみをダウンロードする。

２．配列データのアライメント

（１） 「Translated Protein Sequences」タブをクリックし、アミノ酸配列を表示する。

（２） 「Ctrl+A」で全配列の全領域を選択し、ClustalW（W）ボタンをクリックし、表示される「ClustalW Parameters」ダイア

ログボックスの「OK」ボタンをクリックし、アライメントを行う。

この条件（デフォルト設定）で得られるアライメントの N 末端領域（開始コドンのすぐ下流）のアライメント精度は通

常よくない。アライメントの精度は DNA配列でも確認してみよう。

（３） アライメントの最上行（灰色）をドラグし、最初の 10 アミノ酸座だけ選択、アライメントしてみる。

（４） 同じ領域について、「Gap Opening Penalty」（Pairwise とMultiple の 2 箇所）を「1」にしてアライメントしてみる。

※理想的には領域毎に適切な「Gap penalty」値を用いてアライメン

トを行うのがよい。

（５） 「DNA Sequences」タブをクリックし、DNA酸配列に戻した後、「Save Session」でデータフ ァイルを保存する。

実習３：分子系統樹の作成

１．近隣結合法による系統樹の作成とブートストラップ・テスト

（１） 作成したアライメントファイルを開き、[Data] – [Phylogenetic Analysis] をクリックする。

（２） メインメニュから [Phylogeny]-[Construct/Test Neighbor-Joining Tree] をクリックする。

（３） 「Analysis Preferences」で以下のように設定し、DNA 塩基配列（下図左）、タンパク質アミノ酸配列（下図右）のそ

れぞれ場合について系統樹を作成してみる。配列間の距離は、取りあえず p-distance （proportion of different

sites）を用いる（一般的には多重置換を補正する他の方法の方がよい）。

（４） [Compute] をクリックすれば系統樹が作成され、Tree Explorer に表示される（下図：アミノ酸配列の系統樹）。

（５） Tree Explorer を使って系統樹の形を整える。まず、植物（Arabidopsis、Oryza）より、菌類（Saccharomyces、

Pneumocystis）の方が動物に近縁なので、系統樹の根（root）の位置を変え、植物が外群（outgroup）になるように

する。

rootが付くべき、植物に至る枝をクリックして選択する。(Click on the branch leading to plants.)

↓

ボタンをクリックして rootの位置を変更し、同様に、 や を使ってクラスターの順番を整える。

系統樹全体の大きさ、線の太さ、フォントなどは、 をクリックして[Options] ダイアログを表示させ、設定する。

あ

（６） ブートストラップ法によって、系統樹の安定性を検定してみる。「Analysis Preferences」の[Test of Phylogeny] で

「Bootstrap method」を選択する。

（７） 特定のクラスターを選択し、 をクリックすると、選択されたクラスターの属性を設定することができる。

→ Captionに「muscle」を入力

→ 線の色を「赤」に変更

→ 線の太さを「2 pt」に変更

下の例は脊椎動物の細胞骨格型のクラスターを青、筋肉型を赤で着色し、線の太さを 2ptにしている。

２．最尤法による系統樹の推定

（１） メインメニュから [Models]-[Find Best DNA/Protein Models] をクリックする。

（２） Analysis Preferencesの [Substitution Type] で「Amino acid」を選択する。

以下のような結果が出る（アライメントによって多少異なる）。この場合、LG+G モデルが最適であると考えられる。

（３） メインメニュから [Phylogeny]-[Construct/Test Maximum Likelihood Tree] をクリックする。

（４）「Analysis Preferences」で以下のように “Best Model” に設定し、系統樹を作成してみる。

→ 「Amino acid」を選択

→ 「LG model」を選択

→ 「Gamma Distributed (G)」を選択

使用するCPUコアの数を選択できる。CPU コア数－１がお勧め。

→

（５）得られた最尤系統樹。

※この場合、植物と菌類の位置が離れてしまい、生物学的には上の NJ 系統樹の方が妥当。このように系統樹の

妥当性を生物学的に判断できるようなデータにしておくと、系統解析の成否をチェックできる。

３．Gene Duplication Wizardによる遺伝子重複の推定

（１）ここでは Gene Duplication Wizard を使って、遺伝子系統樹の中で遺伝子重複によって生じた分岐を同定する方

法を試してみる。まずは、メイン・ウィンドウの［User Tree］－［Find Gene Duplications］をクリックする。

Gene Duplication Wizard が表示されるので、それに沿って進める。

（２）Step 1: 最初に、基準とする系統樹を入力する必要がある。今回は、先に作った系統樹を TreeExplorer から出力し

て使う。

Branch Lengths、Bootstrap Values のチェックを外し、［Export］をクリックする。

エディタに表示されるので、［File］－［Save］からファイルに保存する。

保存したファイルを Gene Duplication Wizard で入力する。

（３）Step 2: 以下のように、各遺伝子の「Species Name」を入力し、［Save］ボタンをクリックする。

→ Human

→ Human

→ Human

→ Mouse

→ Zebra fish

→ Medaka fish

→ Fruit fly

→ Human

→ Mouse

→ Zebra fish

→ Human

→ Medaka fish

→ Yeast

→ Carini fungus

→ Thale cress

→ Rice

（４）Step 3: Load species tree file は［Skip］をクリックする。

（５）Step 4: Root the gene tree は［Set Gene Tree Root］をクリックする。

以下のように植物がルートに来るようにする。現在、バグで、１回別の場所をクリックしてからでないとルートに来ない。

以下のようになったら上部の［Finished］をクリックする。

（６）［Launch Analysis］をクリックすると遺伝子重複による分岐が♦で示される。

４．RelTimeによる分岐時間推定

（１）ここでは細胞骨格型のアクチン遺伝子のみを用い、種間の分岐年代推定を行ってみる。脊椎動物には paralog が

複数あるので、以下のように Sequence Data Explorer を使って beta actinのみをチェックする。

（２）次に最尤法で系統樹を推定する。モデルは LG+G を用いる。

（３）Tree Explorer の RelTime のボタン をクリックする。

（４）Timetree Wizard が表示されるので、Step 3: Specify Outgroup で［Select Taxa］をクリックする。真中の矢印ボタンを

使って、Arabidopsis と Oryza（植物）を左の「Taxa In Outgroup」に入れ、下の［Save］をクリックする。

（５）Step 4: Specify Calibrationsで［Add Constraints..］をクリックする。Calibration Editorが表示されたら、◇で示す動物

と菌類の分岐点を選択し、上の をクリックする。

（６）左側のフレームで MinおよびMax Divergence Time に 1216（Time Tree of Life より）を入力し、［Finished］をクリッ

クする。

（７）Step 6: Launch Analysis で［Execute］をクリックすると TreeExplorer に Timetree が表示される。

分岐点を選択し、上部の をクリックすれば詳細な情報が得られる。以下の例では、ショウジョウバエとヒトの

分岐年代は 678.5（287-1070）MYA と推定される（Timetree of life によれば平均 692 MYA）。