48

was suitable for cell growth of Zedoary in flask 250 mL. The cell biomass was maximum with 10.44 g fresh weight (0.66 g dry weight) after 14 culture days with inoculum size of 3 g.

3. The basic MS medium contained 3% sucrose, supplemented with 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D; agitation speed 150 rpm/min, aeration rate 2,5 L/min was suitable to growth of Zedoary cells in 10 L bioreactor. The cell biomass was maximum with 603 g fresh weight (53.25 g dry weight) after 14 culture days with inoculum size of 200 g.

4. The concentration of essential oil in cells reached maximum at 2.57% dry weight after 14 culture days, 1.6 times higher than that in rhizome. The concentration of curcumin in cells reached maximum at 1.16% after 14 culture days, 2.7 times higher than that in rhizome. There was a biotransformation of curcuminoid in cell culture. The concentration of polysaccharide in cell was maximum at 6.55% dry weight after 10 culture days, 1.4 time lower than that in rhizome. There was accumulation of sesquiterpenes in cell culture. The compositions of sesquiterpene distributed in suspension cells was less than that in rhizome. There were 3-4 peaks of sesquiterpene distributed similar to rhizome. There was a biotransformation of sesquiterpene in cell culture.

5. Essential oil could inhibit growth of B. cereus ATCC 11778 (31 mm), S. aureus ATCC 6538 (22.33 mm) and E. coli ATCC 25922 (18.33 mm). Overall, the antibacterial ability of essential oil derived from culture cell was high.

RECOMMENDATION 1. More studies to enhance the accumulation ability of

bioactive compounds in Zedoary cells. 2. More studies in composition as well as bioactivities of

curcumin, sesquiterpenes, polysaccharides produced from Zedoary cells.

1

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Thực vật là nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm

thực phẩm. Hơn nữa, thực vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, hương liệu... Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, chúng được xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX và đến nay có khoảng hơn 80.000 hợp chất đã đuợc công bố. Việc khai thác nguồn dược liệu tự nhiên từ thực vật đang trở thành một vấn đề quan trọng mang tính toàn cầu và chúng ngày càng được thương mại hóa nhiều hơn. Vấn đề đặt ra hiện nay là nơi sống tự nhiên của các loài cây thuốc đang bị biến mất nhanh chóng do sự biến động của điều kiện môi trường và địa lý, cũng như sự khai thác bừa bãi của con người. Điều này buộc các nhà khoa học cần phải tính đến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế để cung cấp nguyên liệu ổn định cho ngành công nghiệp sản xuất dược phẩm.

Nuôi cấy tế bào thực vật đã được quan tâm nghiên cứu từ những năm 1950. Nhiều nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy tế bào thực vật là một phương thức hiệu quả trong sản xuất các hoạt chất sinh học hoặc các chất chuyển hóa của chúng. Đến nay, người ta đã thành công trong sản xuất rất nhiều loại hợp chất có giá trị theo phương thức này như anthraquinone, vincristine, berberin, diosgenin, taxol, ginsenoside…. Nghệ đen là loài thảo dược quý, không độc, có chứa các chất như curcumin, terpenoid và tinh dầu. Curcumin của nghệ đen có khả năng ức chế khối u; chống lại một số dạng ung thư ở chuột như ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung thư buồng trứng; curcumin cũng có tác dụng chống đông máu và hạ huyết áp;

2

curcuminoid và sesquiterpen là những chất có khả năng ức chế sự hình thành TNF-α của đại thực bào đã được hoạt hóa, do đó có tác dụng chống viêm nhiễm; curcumin còn là một chất chống oxy hóa có khả năng bảo vệ tế bào. Tinh dầu nghệ đen có tác dụng kháng khuẩn và kháng đột biến rất cao. Bên cạnh đó, polysaccharide của nghệ đen ức chế hiệu quả sinh trưởng của các bướu thịt (sarcoma 180), ngăn ngừa đột biến nhiễm sắc thể, có hoạt tính kích thích đại thực bào. Trong tự nhiên, nghệ đen là loài nhân giống bằng thân rễ, phải mất một thời gian dài để tạo củ nên hệ số nhân kém; năng suất thu hoạch thường thấp, đặc biệt là phụ thuộc rất lớn vào điều kiện khí hậu, mùa vụ, chi phí nhân công và vật tư sản xuất. Mặt khác, nghệ đen trong tự nhiên còn dễ mắc các bệnh như thối củ và đốm lá. Vì vậy, rất khó có đủ nguồn nguyên liệu dồi dào và ổn định để sản xuất lượng lớn các hoạt tính sinh học quý của cây nghệ đen sử dụng trong bào chế dược phẩm.

Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng”. 2. Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp để sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định khả năng tích lũy và hoạt tính sinh học của một số hợp chất trong tế bào cây nghệ đen nuôi cấy huyền phù.

3. Nội dung nghiên cứu - Tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro; - Nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen; - Khảo sát sự tích lũy các hợp chất có hoạt tinh sinh học của tế bào; - Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu của tế bào. 4. Những đóng góp mới của luận án - Đã tạo ra dòng tế bào callus (rắn và rời rạc) từ bẹ lá của cây

47

(22.33 mm) and finally E. coli (18.33 mm). Meanwhile, essential oil derived from rhizome can inhibit the growth of B. Cereus; E. coli; S. aureus (16 mm; 17.67 mm and 14 mm) respectively. Table 3.18. The antibacterial ability of essential oil in Zedoary cells

D-d (mm) Bacteria

Control Essential oil of cells Rhizome essential

oil B. cereus ATCC 11778 0 22.33b 16.00a

E. coli ATCC 25922 0 18.33b 17.67a

S. aureus ATCC 6538 0 31.00a 14.00a

Figure 3.14. Antibacterial ability of essential oil. A: E. coli ATCC 25922. B: B. cereus ATCC 11778. C: S. aureus ATCC 6538. ĐC: control. TN: essential oil of rhizome. TB: essential oil of cells

CONCLUSION AND RECOMMENDATION CONCLUSION

1. The basic MS medium supplemented with 3% sucrose, 0.8% agar; 0.5 mg/L BA and 0.5 mg/L 2,4-D was suitable to callus induction from leaf-base of in vitro Zedoary. The yellow compact and friable callus were most suitable for cell suspension culture.

2. The basic MS medium contained 3% sucrose, supplemented with 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D; shaking speed of 120 rpm/min

46

Figure 3.13. Distribution of sesquiterpene. A: Accumulation of sesquiterpene in rhizome;

B: kinetics of sesquiterpene accumulation in suspension cells from day 2 to 18

3.5. Antibacterial activity of essential oil in Zedoary cells Results performed in table 3.18 indicated that, essential oil

extracted from both cells and rhizome can depress growth E. coli, S. aureus and B. cereus. Overall, essential oil collected from suspension cells could be antibacterial (Figure 3.14). The essential oil from culture cells depressed most to S. aureus (31 mm), then to B. cereus

3

nghệ đen in vitro thích hợp để nuôi cấy huyền phù, đồng thời xác định một cách có hệ thống các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng nhanh và ổn định của tế bào nghệ đen nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác và trong hệ lên men 10 lít.

- Đã khảo sát sự tích lũy các hợp chất có hoạt tính sinh học như: tinh dầu, curcummin, sesquiterpene và polysaccharide trong tế bào nghệ đen nuôi cấy. Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng và thời điểm tích lũy cao nhất của các hợp chất này theo đường cong sinh trưởng và đồng thời cho thấy có sự chuyển hóa sinh học các chất như curcumin và sesquiterpene xảy ra trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen.

- Đã khảo sát được khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào cây nghệ đen nuôi cấy in vitro và nhận thấy, tinh dầu của tế bào có khả năng ức chế sinh trưởng một số loài vi sinh vật gây bệnh.

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 5.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học

mới, có tính hệ thống về nuôi cấy tế bào cây nghệ đen và khả năng tích lũy một số hoạt chất sinh học của chúng; đồng thời là nguồn tài liệu tham khảo hữu ích trong nghiên cứu, giảng dạy về nuôi cấy tế bào và sản xuất các hoạt chất sinh học có giá trị cao từ nuôi cấy tế bào thực vật.

5.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của luận án sẽ là cơ sở khoa học để phát triển nuôi cấy tế

bào cây nghệ đen nhằm sản xuất nhanh sinh khối, cung cấp nguồn nguyên liệu ổn định để chiết tách thu hồi các hợp chất thứ cấp dùng làm dược liệu, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng. 6. Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 105 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được chia thành các phần: Phần Mở đầu có 4 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 32 trang; Chương 2: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu, 7

4

trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận, 36 trang; Phần Kết luận và đề nghị, 2 trang; Các công trình đã công bố liên quan đến luận án: 1 trang, Tài liệu tham khảo: 23 trang với 193 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh; Luân án có 18 bảng số liệu và 16 hình.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Luận án đã tham khảo 17 tài liệu tiếng Việt và 189 tài liệu tiếng Anh với các nội dung liên quan gồm: (1) Nuôi cấy tế bào thực vật; (2) Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật nuôi cấy in vitro; (3) Giới thiệu về cây nghệ đen.

Thử nghiệm đầu tiên về nuôi cấy tế bào bên ngoài một cơ thể thực vật hoàn chỉnh được công bố vào năm 1902 bởi Haberlandt - nhà Sinh lý thực vật người Đức, người được biết đến như nhà sáng lập ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật. Những thử nghiệm đầu tiên trong nuôi cấy tế bào đơn để sản xuất dược phẩm đã được tiến hành trong những năm 1950 tại công ty Charles Pfizer. Đến nay, một thế kỷ sau những nghiên cứu của Haberlandt, nhiều hợp chất thứ cấp đã được sản xuất thương mại bằng con đường nuôi cấy tế bào thực vật.

Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các tế bào không phân hóa, được gọi là callus. Nuôi cấy callus đạt được bằng cách nuôi cấy các mẫu mô tách từ thực vật trên môi trường dinh dưỡng cơ bản có chất làm rắn là agar. Nuôi cấy huyền phù tế bào thường được khởi đầu bằng cách chuyển các khối callus vào nuôi cấy trong môi trường lỏng được khuấy bởi máy lắc, quay hoặc màng lọc xoay. Mô callus nuôi cấy nên là loại mô dễ vỡ vụn để có thể thiết lập được dịch huyền phù tế bào với mức độ phân tán cao nhất. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong môi trường lỏng cung cấp một hệ thống duy nhất cho những nghiên cứu chi tiết về sinh trưởng và sản xuất các chất chuyển hóa. Trong nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật cần thiết phải

45

For examples, peak 1 (retention time 4.7 min) had absorption of 6.05 mAU in rhizome but got just 2.55 mAU in suspension cells, meanwhile, peak 4 (retention time 7.5 min) in suspension cells had absorption of 7.33 mAU and 2.23 mAU in rhizome. Some peaks appeared in rhizome (5-8) were absent or trace (< 1 mAU) in suspension cells. However, in suspension cells, some new peaks appeared (not numbered) that had retention time about 6.8; 7.8; 8.2 and 9.2 min and the absorption of 1.38-4.10; 5.62-7.54; 1.70-8.41 and 1.06-8.38 mAU respectively. These resultd indicated that many biotransformation of sesquiterpene were occuring in process of cell culture, producing different sesquiterpene types compared with the rhizome control. Table 3.17. Comparision of eluted peak heights (mAU) for rhizome control and

suspension cells of Zedoary at different culture times Compound number/retention time (min) Culture

time (day) 1/4.7 2/5.1 3/6.0 4/7.5 5/12.7 6/13.8 7/19.2 8/20.5 9/26.7

2 2.11 - 2.49 5.99 - trace trace trace - 4 1.93 - 2.23 5.76 - trace trace trace - 6 1.15 trace 2.81 3.17 - trace - - - 8 1.06 - 1.54 3.57 - - - - -

10 1.22 - 1.02 4.05 - trace trace - - 12 1.04 trace 2.14 3.29 - trace - trace - 14 2.55 1.59 - 7.33 - trace - trace - 16 1.58 - 3.82 4.04 - trace - - - 18 2.36 1.15 1.15 5.11 - trace - trace -

Rhizome 6.05 2.59 2.15 2.23 6.23 1.46 3.59 1.29 1.19

44

Figure 3.12. HPLC results of curcumin in Zedoary suspension cells from days 2 to18

3.4.4. Sesquiterpenes Study showed that the appearance of separated peaks in rhizome

was more than that in suspension cells (Figure 3.13). Overall, peaks had retention time related to sesquiterpene compounds (numbered 1-9) in the rhizome and in suspension cells had different absorption spectrums (mAU), particularly peaks numbered 1 and 4 (Table 3.17).

5

quan tâm đến các yếu tố sau: Môi trường nuôi cấy như các chất điều hòa sinh trưởng, nguồn carbon và các điều kiện nuôi cấy như: cỡ mẫu nuôi cấy ban đầu, sự khuấy trộn, sục khí…Trình tự của một quá trình nâng cấp điển hình bắt đầu từ nuôi cấy tế bào trong các chai, lọ đến bình tam giác nuôi cấy lắc có dung tích 1 L, sau đó đến hệ lên men bằng thuỷ tinh từ 1-10 L, và sau đó nâng cấp đến hệ lên men bằng thép không rỉ từ 30-150 L rồi đến 1000 L. Hệ lên men là một hệ thống nuôi cấy tự động mà chức năng chính của nó là cải thiện kiểm soát môi trường để đạt được các điều kiện tối ưu cho sinh trưởng của tế bào và/hoặc hình thành sản phẩm.

Trong vài thập kỷ qua, những bằng chứng từ thực nghiệm và trong thực tế cho thấy, các hợp chất thứ cấp ở thực vật có các chức năng cơ bản sau: Bảo vệ cơ thể chống lại các loài động vật ăn cỏ; kháng nấm và vi khuẩn; kháng virus... Các hợp chất hóa học này còn được dùng nhiều trong dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, thuốc nhuộm, gia vị, chất tạo mùi, thuốc trừ sâu. Các hợp chất thứ cấp của thực vật có thể phân thành ba nhóm chính đó là terpene, phenol và các hợp chất chứa nitrogen. Nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy đã được tiến hành bởi các nhà khoa học thực vật và vi sinh vật ở nhiều quốc gia. Hầu hết các ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong công nghệ sinh học đều nhằm vào mục đích sản xuất các hợp chất thứ cấp. Những thành tựu đạt được trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất dùng để chữa bệnh đã tạo ra khả năng có thể sản xuất trên qui mô lớn các chất thuộc nhóm alkaloid, terpenoid, steroid, saponin, phenol, flavonoid và các amino acid.

Ở nước ta, công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật phát triển vào những năm 1970 và đến nay đã đạt được một số thành công. Một trong những kết quả nuôi cấy tế bào thành công nhất đó là nuôi cấy tế bào cây sâm Ngọc Linh. Ngoài ra còn có một số nghiên cứu nuôi cấy tế bào các loài cây thuốc khác như cây thông đỏ, cà gai leo, rau má, dừa

6

cạn… Nghệ đen là cây thảo dược có chứa các nhóm chất như tinh dầu bao gồm các chất thuộc sesquiterpene và monosesquiterpene; curcuminoid. Ngoài ra, nghệ đen còn chứa các chất như tinh bột, chất dẻo và một số chất có vị đắng khác. Cây nghệ đen đã được con người dùng trong bài thuốc Đông y cổ truyền để chữa bệnh. Nhiều nghiên cứu cho thấy, các hợp chất như tinh dầu, curcumin, sesquiterpene.. của nghệ đen có các hoạt tính sinh học quý như: kháng ung thư, bảo vệ gan, kháng loét, kháng viêm, kháng khuẩn và kháng nấm.

Có một số công trình nghiên cứu về nhân giống in vitro ở cây nghệ đen chẳng hạn như tái sinh chồi từ callus nghệ đen; nhân giống in vitro cây nghệ đen từ chồi. Ngoài các nghiên cứu nhân giống in vitro cây nghệ đen, một số kết quả bước đầu trong nuôi cấy callus và huyền phù tế bào cây nghệ đen cũng đã được công bố. Cho đến nay, công trình nghiên cứu nuôi cấy tế bào với khả năng tích lũy sinh khối cao cũng như khảo sát sự tích lũy các hợp chất có hoạt tính học của tế bào nghê đen nuôi cấy in vitro trong hệ lên men là rất hạn chế.

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tương nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là cây nghệ đen. Nguyên liệu nghiên cứu là

các tế bào callus được tạo từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro. 2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Nuôi cấy callus Bẹ lá của cây nghệ đen in vitro được nuôi trên môi trường MS có

2% sucrose và 0,8% agar, bổ sung 0,5-4,0 mg/L 2,4-D và 0,5-4,0 mg/L BA để tạo callus. 2.2.2. Nuôi cấy tế bào huyền phù 2.2.2.1. Nuôi cấy tế bào trong bình tam giác

Khoảng 2 g callus 2 tuần tuổi được chuyển vào bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường MS lỏng có 2% sucrose, bổ sung 0,5 mg/L

43

speak at 1.16% before gradually decreasing from day 16 to day 18 alongs to cell growth (Figure 3.9). Overall, concentration of curcumin in culture cell with diferent culture time was higher than that in rhizome (0.43%). Bảng 3.16. Concentration of curcumin in Zedoary cells cultured in 10L bioreactor

Culture time (day)

Retention time (min)

Peak square (mAU)

Curcumin concentration (%)

2 2.09 1909 0.44g 4 1.98 2226 0.52e 6 2.05 2285 0.53e 8 2.00 2442 0.56e 10 1.97 4244 0.98b 12 1.99 4448 1.03b 14 2.07 5034 1.16a 16 1.99 3631 0.84c 18 2.07 2573 0.60d

Rhizome 2.06 1868 0.43g

Figure 3.10. HPLC result of standard curcumin Figure 3.11. HPLC result of rhizome

42

3.4.2. Total water soluble polysaccharide Table 3.15 showed the concentration of total water soluble

polysaccharide (% dry quantity) from Zedoary cells at variety time. Overall, concentration of polysaccharide increased from 2 to 10 and reached a peak at 6.55%, 1.4 time lower than that in Zedoary (9.46%) (p

8

glucose (4-20 mg/ml) theo Chaplin và cs 1994 và tính toán theo hệ số chuyển đổi sang polysaccharide là 3,168 theo Li và cs 2007. 2.2.7. Xác định sesquiterpene

Tách chiết sesquiterpene theo phương pháp của Jang và cs 2004. Phân tích HPLC để xác định sesquiterpene được thực hiện trên máy Spectra System (Thermo Electron, Mỹ) bằng chương trình ChromQuest (ver. 4.2.34). 2.2.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu

Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu được xác định theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch của Lehrer và cs (1991) . 2.2.9. Xử lý thống kê

Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần. Số liệu thực nghiệm được tính trung bình mẫu ± sai số chuẩn và phân tích Ducan’s test (p

40

Table 3.11. Effects of inoculum size on cell growth Inoculum size (g) Fresh weight (g) Dry weight (g)

100 241.67c 22.28d

150 358.33bc 32.68c

200 514.67a 47.97a

250 441.00b 38.89b

3.3.2.2. Agitation speed This research showed that, the increase of agitation speed 100-150

rpm/min resulted in the increase of cell biomass as well as can got peak 561 g fresh weight (50,84 g dry weight). However, at the higher agitation speed (>150 rpm/min) cell growth decreased with 437 g fresh weight (37,42 g dry weight) at 200 rpm/min (table 3.12). Table 3.12. Effects of agitation speed on cell growth

Agitation speed (rpm/min)

Fresh weight (g) Dry weight (g)

100 435.67c 38.19c

120 514.67bc 47.97b

150 561.00a 50.84a

180 547.33b 50.03a

200 437.00c 37.42c

3.3.2.3. Effects of aeration rate Increasing aeration rate from 1.5 to 2.5 L/min resulted in a

increase of cell growth and reached a peak at 603 g fresh weight (53.25 g dry weight). However, increasing aeration rate from 3 to 3.5 L/min, cell growth were decreased. With aeration rate of 3.5 L/min, fresh weight of cell was 441 g fresh weight (33,17 g dry weight) (Figure 3.9 và Table 3.13).

9

Bảng 3.1. Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro

2,4-D

(mg/L)

BA

(mg/L)

% mẫu vật

tạo callus

Sinh trưởng

của callus Hình thái callus

0,0 0,0 - - -

0,5 0,5 15,74c ++ Trắng, mọng nước

1,0 1,0 46,01a ++++ Trắng, xốp

2,0 2,0 40,10b ++++ Trắng, xốp

3,0 3,0 10,20d +++ Trắng, mọng nước

4,0 4,0 8,20cd + Trắng, mọng nước

++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +:

sinh trưởng kém; - : không xuất hiện callus.

Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro. (A) callus trắng và xốp,

(B) callus trắng và mọng nước

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất KTST lên sinh trưởng và phát sinh hình thái của callus

2,4-D

(mg/L) BA (mg/L)

Sinh trưởng

của callus Hình thái callus

0,25 0,25 + Trắng và mọng nước

0,50 0,50 ++++ Vàng sáng, rắn và rời rạc

1,00 1,00 ++ Trắng và xốp

2,00 2,00 ++ Trắng và mọng nước

4,00 4,00 - Hóa nâu và chết

++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +:

sinh trưởng kém; - : không sinh trưởng.

BA

10

Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn và rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy Callus sơ cấp có màu trắng, xốp và sinh trưởng mạnh được cấy

chuyển lên môi trường MS có bổ sung 2,4-D và BA từ 0,25-4 mg/L. Kết quả cho thấy, các callus sinh trưởng trên môi trường có 2 mg/L 2,4-D và 2 mg/L BA dần dần hóa nâu và chết sau khi cấy chuyển. Các callus trên môi trường có 1 mg/L 2,4-D và 1 mg/L BA phát triển thành dạng callus thứ cấp tốt nhất trên môi trường có chứa 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA (Bảng 3.2). Các môi trường còn lại không có tác dụng kích thích sinh trưởng callus (callus sinh trưởng kém hoặc hóa nâu và chết) sau 4 tuần cấy chuyển. Các calus thứ cấp có màu vàng sáng, rắn và dễ vỡ vụn (Hình 3.2) thu được trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA tạo nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào huyền phù.

3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác 3.2.1. Ảnh hưởng của cỡ mẫu

Với cỡ mẫu 2 g, sinh khối đạt cao nhất sau 16 ngày là 4,12 g tươi (0,37 g khô) và chỉ số sinh trưởng là 2,06. Với 3 g tế bào nuôi cấy thì sinh trưởng của tế bào đạt cực đại chỉ sau 14 ngày là 5,61 g tươi (0,41 g khô) và chỉ số sinh trưởng là 1,87. Khi tăng cỡ mẫu lên 4-5 g, sinh khối đạt cực đại sau 12 ngày, tương ứng là 6,12 g tươi (0,46 g khô) và 7,22 g tươi (0,51 g khô) nhưng chỉ số sinh trưởng thấp chỉ đạt 1,54 và 1,44. Mặc dù cỡ mẫu 2 g sau 14 ngày cũng có chỉ số sinh trưởng có cao (2,0), nhưng chất lượng tế bào kém hơn (tế bào có màu vàng nhạt, dịch huyền phù ít đồng nhất) so với khi sử dụng 3 g (tế bào có màu

39

3.3. Cell suspension culture of Zedoary in bioreactor 3.3.1. Assessment of cell growth

Study showed that cell mass got maximum on the 14th with 241.67 g fresh weight (22.28 g dry weight), then decreased. The fresh cell biomass was 132.67 g fresh weight (10.08 g dry weight) after 18 days of culture.

Figure 3.7. Growth of Zedoary cells in 10 litter bioreactor

Figure 3.8. Fresh weight biomass (A) and dry weight biomass (B)

Based on observating the growth curve of Zedoary cell, we study effects of some culture conditions on cell biomass accumulation after 14 days. 3.3.2. Effects of culture conditions 3.3.2.1. Inoculum size

Results showed that the inoculum size effected on cell growth. Biomass increased when supplementing 100-200 g of cell and got pick at 514.64 g fresh weight (47,97 g dry weight). However, when increasing the inoculum size up to 250 g, cell growth was depressed (441 g fresh weight and 38.89 g dry weight) (Table 3.11).

38

from 20-60 g/L, the cell biomass also increases and reaches a maximum of 8.40 g fresh weight (0.62 g dry weight). However, when the fructose up to 70 g/L, the cell growth slowed (7.65 g fresh weight and 0.57 g dry weight). Table 3.10. Effects of fructose on cell growth

Fructose (g/L) FW DW GI 20 6.72b 0.35c 2.24 30 7.34b 0.55b 2.45 40 7.70ab 0.57b 2.57 50 7.72ab 0.59b 2.57 60 8.40a 0.62a 2.80 70 7.65b 0.57b 2.55

Cell culture of Zedoary on MS medium supplemented with 3% sucrose, 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D, shaking speed 120 rpm/min. The maximum biomass was gotten after 14 days with 10.44 g fresh weight (Figure 3.4 and 3.5).

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Dry

cel

l wei

ght(

g)

Fres

h ce

ll w

eigh

t(g)

Culture time (days)

Fresh cell weight

Dry cell weight

Figure 3.4. Growth of Zedoary cells in flask of 250 ml

Figure 3.5. Cell culture of Zedoary in flask of 250 ml

11

vàng đậm và tươi, dịch huyền phù đồng nhất). Vì thế, theo nhận định của chúng tôi cỡ mẫu 3 g là thích hợp hơn cả. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên tích lũy sinh khối của tế bào nghệ đen

2 g 3 g 4 g 5 g TN FW DW GI FW DW GI FW DW GI FW DW GI 2 2,22c 0,18d 1,11 3,14d 0,28c 1,05 4,07c 0,32b 1,02 5,20d 0,39c 1,04 4 2,52c 0,24c 1,26 3,52c 0,32c 1,17 4,34c 0,35b 1,09 5,32d 0,42c 1,06 6 3,00b 0,24c 1,50 4,00c 0,35b 1,33 4,94c 0,37b 1,24 5,61c 0,44c 1,12 8 3,30b 0,30b 1,65 4,53b 0,38b 1,51 5,65b 0,40b 1,41 6,09c 0,47b 1,22 10 3,50b 0,33b 1,75 4,92b 0,40a 1,64 6,04a 0,42b 1,51 7,02b 0,48b 1,40 12 3,70a 0,35b 1,85 5,15b 0,40a 1,72 6,15a 0,44a 1,54 7,22a 0,51a 1,44 14 4,00a 0,35b 2,00 5,61a 0,41a 1,87 6,12a 0,46a 1,53 5,68c 0,41c 1,14 16 4,12a 0,37a 2,06 5,21b 0,37b 1,74 5,20b 0,35b 1,30 5,00d 0,32cd 1,00 18 4,01a 0.23c 2,01 4,67b 0,29c 1,56 4,56c 0,27c 1,14 4,12e 0,22d 0,82

TN: thời gian nuôi cấy (ngày); FW: khối lượng tươi (g); DW: khối lượng khô (g), GI:

chỉ số sinh trưởng

3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.4. Nhìn chung, tốc độ

lắc cũng đã ảnh hưởng lên sinh trưởng của tế bào. Ở tốc độ lắc 80-120 vòng/phút, sinh khối tế bào đã tăng dần lên và đạt cực đại là 5,91 g tươi (0,44 g khô), chỉ số sinh trưởng là 1,97 và dịch huyền phù tế bào có màu vàng sáng, đồng nhất. Khi tăng tốc độ lắc lên cao hơn 150-180 vòng/phút, tế bào sinh trưởng chậm lại, đặc biệt bị ức chế mạnh ở 180 vòng/phút, sinh khối cao nhất chỉ là 4,75 g tươi (0,35 g khô), dịch huyền phù tế bào chuyển sang màu nâu nâu sau 14 ngày nuôi cấy. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh sinh trưởng tế bào

Tốc độ lắc (vòng/phút) FW DW GI 80 5,00ab 0,34c 1,67 100 5,61b 0,41b 1,87 120 5,91a 0,44a 1,97 150 5,60b 0,42b 1,87 180 4,75ab 0,35c 1,58

3.2.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST 3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA

Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ BA 0,25 và 0,5 mg/L có hiệu quả tương đương (p

12

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh sinh trưởng tế bào BA (mg/L) FW DW GI

0,25 6,17a 0,45a 2,06 0,5 6,25a 0,46a 2,08 1,0 5,76b 0,42ab 1,92 1,5 5,92b 0,37b 1,97 2,0 5,41bc 0,35b 1,80 2,5 4,55bc 0,32b 1,52

3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D Khả năng sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong môi trường có bổ

sung 2,4-D từ 0,25-2,5 mg/L sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ 2,4-D 1,5 mg/L có ảnh hưởng lớn nhất, khối lượng tươi của tế bào đạt 6,75 g (0,52 g khô) và chỉ số sinh trưởng là 2,25, cao hơn các môi trường còn lại. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh sinh trưởng tế bào

2,4 D (mg/L) FW DW GI 0,25 5,10c 0,42b 1,70 0,5 5,77b 0,43b 1,92 1,0 6,02b 0,45b 2,01 1,5 6,75a 0,52a 2,25 2,0 6,04b 0,46b 2,01 2,5 5,35c 0,36c 1,78

3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA Tế bào nghệ đen được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BA và

2,4-D nồng độ từ 0,25-2,5 mg/L. Kết quả sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh sinh trưởng tế bào

2,4 D (mg/L) BA (mg/L) FW DW GI 0,5 0,25 5,82b 0,43b 1,94 0,5 0,5 5,91b 0,44b 1,97 0,5 1,0 5,32c 0,40c 1,77 0,5 1,5 5,00c 0,39c 1,67 0,5 2,0 4,45cd 0,38c 1,48 0,5 2,5 4,00d 0,35c 1,33

0,25 0,5 5,12c 0,39c 1,71 0,5 0,5 5,91b 0,44b 1,97 1,0 0,5 6,20b 0,46b 2,07 1,5 0,5 7,22a 0,55a 2,41 2,0 0,5 6,03b 0,43b 2,01 2,5 0,5 6,01b 0,42b 2,00

37

culture were showed in figure 3.8. Table 3.8. Effects of sucrose on cell growth

Sucrose (g/L) FW DW GI 20 7.22c 0.55b 2.41 30 10.44a 0.66a 3.48 40 8.85b 0.64a 2.95 50 8.80b 0.65a 2.93 60 8.75b 0.70a 2.92 70 6.75c 0.60b 2.25

Results showed that, cell growth were slowly at low concentration of 20 g/L sucrose (7,22 g of fresh weight and 0.55 g dry weight). The medium contained 30 g/L sucrose, cell growth increase dramatically (10.44 g fresh weight and 0.66 g dry weight) with growth index of 3.48, the suspension solution was bright yellow and rather homogenous. At the sucrose concentration of 40-70 g/L, cell growth decreased, especially at 70 g/L (6.75 g fresh weight and 0.6 g dry weight). 3.2.4.2. Effects of glucose

Results indicated that cell biomass was rather low when culturing cells on medium contain 20-30 g/L glucose. At the glucose of 40-60 g/L cell biomass got maximum (7.32 g fresh weight and 0.59 g dry weight), with growth index of 2.44. At the glucose of 70 g/L, the cell growth was depressed. Table 3.9. Effects of glucose on cell growth

Glucose (g/L) FW DW GI 20 3.15cd 0.22c 1.05

30 6.05c 0.42bc 2.02

40 7.12a 0.53b 2.37

50 7.20a 0.55b 2.40

60 7.32a 0.59a 2.44

70 6.65b 0.53b 2.22

3.2.4.3. Effects of fructose The study results showed that fructose has significant influence

than glucose. When fructose concentrations in the medium increasing

36

mg/L was most effect, fresh weight of cell got 6.75 g (0.52 g dry weight) and growth index was 2.25, higher than other medium. Table 3.6. Effects of 2,4-D on cell growth

2.4 D (mg/L) FW DW GI 0.25 5.10c 0.42b 1.70 0.5 5.77b 0.43b 1.92 1.0 6.02b 0.45b 2.01 1.5 6.75a 0.52a 2.25 2.0 6.04b 0.46b 2.01 2.5 5.35c 0.36c 1.78

3.2.3.3. Effects of 2,4-D and BA The cells of Zedoary were cultured on the medium supplemented

with BA and 2,4-D (0.25-2.5 mg/L). Results after 14 days of culture were showed in table 3.7. Table 3.7. Effects of 2,4-D and BA on cell growth

2.4 D (mg/L)

BA (mg/L) FW DW

GI

0.5 0.25 5.82b 0.43b 1.94 0.5 0.5 5.91b 0.44b 1.97 0.5 1.0 5.32c 0.40c 1.77 0.5 1.5 5.00c 0.39c 1.67 0.5 2.0 4.45cd 0.38c 1.48 0.5 2.5 4.00d 0.35c 1.33

0.25 0.5 5.12c 0.39c 1.71 0.5 0.5 5.91b 0.44b 1.97 1.0 0.5 6.20b 0.46b 2.07 1.5 0.5 7.22a 0.55a 2.41 2.0 0.5 6.03b 0.43b 2.01 2.5 0.5 6.01b 0.42b 2.00

Overall, the medium that supplemented both 2,4-D and BA showed better result, compared to the medium supplemented only one of them. The cell weight and growth index got maximum on the environment containing 2,4-D 1.5 mg/L and BA 0.5 mg/L, with 7.22 g fresh weight (0.55 g dry weight) and 2.41 respectively. 3.2.4. Effects of carbon sources 3.2.4.1. Effects of sucrose

Effects of sucrose on the growth of Zedoary cells after 14 days of

13

Nhìn chung, môi trường có bổ sung đồng thời 2,4-D và BA cho kết quả tốt hơn các môi trường bổ sung riêng rẽ hai chất này. Khối lượng tế bào và chỉ số sinh trưởng đạt cao nhất trong môi trường có 2,4-D 1,5 mg/L và BA 0,5 mg/L, tương ứng là 7,22 g tươi (0,55 g khô) và 2,41. 3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon 3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose

Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.8. Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng tế bào

Sucrose (g/L) FW DW GI 20 7,22c 0,55b 2,41 30 10,44a 0,66a 3,48 40 8,85b 0,64a 2,95 50 8,80b 0,65a 2,93 60 8,75b 0,70a 2,92 70 6,75c 0,60b 2,25

Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nồng độ sucrose thấp (20 g/L) tế bào sinh trưởng chậm, chỉ đạt 7,22 g khối lượng tươi (0,55 g khô). Sinh trưởng của tế bào đã tăng mạnh đạt 10,44 g khối lượng tươi (0,66 g khô) với chỉ số sinh trưởng là 3,48 trong môi trường có 30 g/L sucrose, dịch huyền phù có màu vàng tươi và khá đồng nhất. Ở nồng độ sucrose từ 40-70 g/L, sinh trưởng của tế bào giảm, đặc biệt là ở 70 g/L (chỉ đạt 6,75 g tươi/0,60 g khô). 3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose

Kết quả cho thấy, tế bào có sinh khối tương đối thấp khi được nuôi trong môi trường có 20-30 g/L glucose. Ở nồng độ glucose từ 40-60 g/L sinh khối tăng lên và đạt cực đại là 7,32 g tươi (0,59 g khô), chỉ số sinh trưởng là 2,44. Glucose ở nồng dộ 70 g/L đã ức chế sinh trưởng của tế bào.

14

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng tế bào Glucose (g/L) FW DW GI

20 3,15cd 0,22c 1,05 30 6,05c 0,42bc 2,02 40 7,12a 0,53b 2,37 50 7,20a 0,55b 2,40 60 7,32a 0,59a 2,44 70 6,65b 0,53b 2,22

3.2.4.3. Ảnh hưởng của fructose Kết quả nghiên cứu cho thấy, fructose có ảnh hưởng đáng kể hơn

glucose. Khi tăng nồng độ fructose trong môi trường từ 20-60 g/L, sinh khối tế bào tăng theo và đạt cực đại là 8,40 g tươi (0,62 g khô). Tuy nhiên, khi bổ sung fructose lên đến 70 g/L thì sinh trưởng của tế bào chậm lại và chỉ còn 7,65 g tươi (0,57 g khô). Bảng 3.10. Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng tế bào

Fructose (g/L) FW DW GI 20 6,72b 0,35c 2,24 30 7.34b 0,55b 2,45 40 7,70ab 0,57b 2,57 50 7,72ab 0,59b 2,57 60 8,40a 0,62a 2,80 70 7,65b 0,57b 2,55

Chúng tôi cũng đã thành công khi nuôi cấy tế bào nghệ đen trong môi trường MS có 3% sucrose, 0,5 mg/L BA và 1,5 mg/L 2,4-D, tốc độ lắc 120 vòng/phút. Sinh khối cực đại thu được chỉ sau 14 ngày là 10,44 g tươi (Hình 3.4 và 3.5).

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Khối

lượn

g kh

ô tế

bào

(g)

Khối

lượn

g tươi

tế

bào

(g)

Thời gian nuôi cấy (ngày)

Khối lượng tươi tế bào

Khối lượng khô tế bào

Hình 3.4. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml

35

3.2.2. Effects of shaking speed The results were showed in table 3.4. Overall, the shaking speed

also affected on biomass. At the speed of 80-120 rpm/min, biomass increases and got the maximum of 5.91 g fresh weight (0.44 g dry weight), growth index was 1.97 and the solution of cell suspension was bright yellow, homogenous. When the speed increased to 150-180 rpm/min, cell growth was slower, depressed especially at 180 rpm/min, the best biomass was 4.75 g fresh weight (0.35 g dry weight), solution of cell suspension become brown after 14 days of culture. Table 3.4. Effects of shaking speed on cell growth

Shaking speed (rpm/min) FW DW

GI

80 5.00ab 0.34c 1.67 100 5.61b 0.41b 1.87

120 5.91a 0.44a 1.97

150 5.60b 0.42b 1.87

180 4.75ab 0.35c 1.58

3.2.3. Effects of hormones 3.2.3.1. Effects of BA

The results indicated that, concentration BA 0.25 and 0.5 mg/L showed similar effects (p

34

calluses that were light yellow, compact and friable (Figure 3.2) were collected from MS medium supplemented with 0.5 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L BA and then become materials of suspension cell culture.

3.2. Suspension cell culture in flasks 3.2.1. Effects of inoculum size

With inoculum size of 2 g, cell biomass was maximum after 16 days with 4.12 g fresh weight (0.37 g dry weight) and the growth index was 2.06. With inoculum size of 3 g, cell biomass was maximum after 14 days with 5.61 g fresh weight (0.41 g dry weight) and the growth index was 1.87. When increasing the inoculum size up to 4-5 g, cell biomass get maximum after 12 days, with 6.12 g fresh (0.46 g dry weight) and 7.22 g fresh weight (0.51 g dry weight) respectively but the growth index were low, at 1.54 and 1.44. Although inoculum size of 2 g after 14 days got a rather high growth index (2.0), the cell quality was worse (cells were light yellow, suspension was less homogenous), compared to inoculum size of 3 g (cells were bold and bright yellow, homogenous suspension). Thus, the inoculum size of 3g was the best. Table 3.3. Effect of inoculum size on biomass accumulation of Zedoary cells

2 g 3 g 4 g 5 g TN FW DW GI FW DW GI FW DW GI FW DW GI

2 2.22c 0.18d 1.11 3.14d 0.28c 1.05 4.07c 0.32b 1.02 5.20d 0.39c 1.04

4 2.52c 0.24c 1.26 3.52c 0.32c 1.17 4.34c 0.35b 1.09 5.32d 0.42c 1.06

6 3.00b 0.24c 1.50 4.00c 0.35b 1.33 4.94c 0.37b 1.24 5.61c 0.44c 1.12

8 3.30b 0.30b 1.65 4.53b 0.38b 1.51 5.65b 0.40b 1.41 6.09c 0.47b 1.22

10 3.50b 0.33b 1.75 4.92b 0.40a 1.64 6.04a 0.42b 1.51 7.02b 0.48b 1.40

12 3.70a 0.35b 1.85 5.15b 0.40a 1.72 6.15a 0.44a 1.54 7.22a 0.51a 1.44

14 4.00a 0.35b 2.00 5.61a 0.41a 1.87 6.12a 0.46a 1.53 5.68c 0.41c 1.14

16 4.12a 0.37a 2.06 5.21b 0.37b 1.74 5.20b 0.35b 1.30 5.00d 0.32cd 1.00 18 4.01a 0.23c 2.01 4.67b 0.29c 1.56 4.56c 0.27c 1.14 4.12e 0.22d 0.82

TN: culture time (day); FW: fresh weight (g); DW: dry weight (g), GI: Growth index

15

Hình 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác đặt trên máy lắc

3.3. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men 3.3.1. Khảo sát sinh trưởng của tế bào

Kết quả nghiên cứu cho thấy, sinh khối tế bào đạt cực đại ở ngày thứ 14 với 241,67 g tươi (22,28 g khô), sau đó bắt đầu giảm dần. Sinh khối tươi tế bào chỉ còn lại 132,67 g (10,08 g khô) sau 18 ngày nuôi.

0

5

10

15

20

25

0

50

100

150

200

250

300

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Khối

lượn

g kh

ô tế

bào

(g)

Khối

lượn

g tươi

tế

bào

(g)

Thời gian nuôi cấy (ngày)

Khối lượng tươi tế bào

Khối lượng khô tế bào

Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 lít

Hình 3.8. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào nghệ đen Dựa trên kết quả khảo sát đường cong sinh trưởng của tế bào nghệ

đen, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sự tích lũy sinh khối tế bào sau 14 ngày. 3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 3.3.2.1. Cỡ mẫu

Kết quả của chúng tôi cho thấy, lượng mẫu đã ảnh hưởng thật sự

16

lên sự sinh trưởng của tế bào. Sinh khối tăng lên khi đưa vào môi trường từ 100-200 g tế bào và đạt cực đại là 514,64 g tươi (47,97 g khô). Tuy nhiên, khi tăng lượng mẫu lên 250 g thì sinh trưởng của tế bào bị ức chế do tăng mật độ, vì thế chỉ đạt 441 g tươi (38,89 g khô) (Bảng 3.11). Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào

Cỡ mẫu (g) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) 100 241,67c 22,28d 150 358,33bc 32,68c 200 514,67a 47,97a 250 441,00b 38,89b

3.3.2.2. Tốc độ khuấy Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, khi tăng tốc độ khuấy từ 100-

150 vòng/phút thì sinh khối tế bào cũng tăng theo và cực đại đạt là 561 g tươi (50,84 g khô). Tuy nhiên, khi khuấy trộn trên 150 vòng/phút thì sinh trưởng tế bào bắt đầu giảm và chỉ đạt được 437 g tươi (37,42 g khô) ở 200 vòng/phút (Bảng 3.12). Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế bào

Tốc độ khuấy (vòng/phút) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) 100 435,67c 38,19c 120 514,67bc 47,97b 150 561,00a 50,84a 180 547,33b 50,03a 200 437,00c 37,42c

3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí Ở tốc độ 1,5-2,5 L/phút, sinh trưởng của tế bào tăng dần và đạt

cực đại với 603 g tươi (53,25 g khô). Nếu tốc độ sục khí tiếp tục tăng lên từ 3-3,5 L/phút thì sinh trưởng của tế bào sẽ giảm. Ở tốc độ sục khí 3,5 L/phút, khối lượng tươi của tế bào chỉ đạt 441 g (33,17 g khô) (Hình 3.9 và Bảng 3.13). Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế bào

Tốc độ sục khí (l/phút) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) 1,5 489,67c 36,9b

2,0 561,00b 50,84a

2,5 603,00a 53,25a

3,0 583,33b 50,33a

3,5 441,00d 33,17b

33

Figure 3.1. Callus induction culture of Zedoary. (A) White and soft callus, (B) White

and viscous callus

Table 3.2. Effect of hormone on growth and morphogenesis of callus 2,4-D

(mg/L) BA

(mg/L) Callus growth Callus morphogenesis

0.25 0.25 + White and viscous 0.50 0.50 ++++ Light yellow, compact and friable 1.00 1.00 +++ White and soft 2.00 2.00 ++ White and viscous 4.00 4.00 - Brown and dead

++++: high growth of callus; +++: medium growth of callus; ++: low growth of callus; +: weak growth; - : no growth.

Figure 3.2. The yellow, compact and friable callus after 14 days of culture

Primary callus that were white, soft and high growth were subcultured to MS medium supplemented with 2,4-D and BA (0.25 – 4.0 mg/L). The results showed that callus growed on the medium contained 2.0 mg/L 2,4-D and 2.0 mg/L BA become brown and dead after subculture. Callus growing on the medium supplemented with 1.0 mg/L 2,4-D and 1.0 mg/L BA become the best secondary callus on the medium containing 0.5 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L BA (Table 3.2). The other medium did not stimulate callus growth (callus was weak growth or becoming brown and dead) after 4 weeks of subculture. Secondary

BA

32

method of agar plate diffusion as Lehrer et al. (1991) . 2.2.9. Statistics

Every experiment was repeated 3 times. The collected data were calculated average ± standard error and analysed Ducan’s test (p

18

3.4.2. Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số Bảng 3.15 trình bày hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước

tổng số (% khối lượng khô) trong tế bào nghệ đen tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau. Nhìn chung, hàm lượng polysaccharide tăng từ 2-10 và đạt cực đại là 6,55% thấp hơn khoảng 1,4 lần so với củ nghệ đen (9,46%) (p

30

anticancer, protecting brave, antiulcerated, anti-inflammatory, antibacterian and antifungus.

There have been some studies in in vitro multiplication of the curcuma such as regenerating buds from callus of Zedoary. Overmore, some initial results in culturing callus and cell suspension of the curcuma have been published already. Up to now, there have been no any studies of cell culture of the Zedoary in fermentation system as well as no any assessment in their ability in accumulating bioactive compounds.

Chapter 2

RESEARCH OBJECTIVE AND METHODS 2.1. Research objective The objective was C. zedoaria Roscoe. The materials were callus

from leaf-base of in vitro Zedoary. 2.2. Methods

2.2.1. Callus culture Leaf-base of in vitro Curcuma zedoaria Roscoe were cultured on

the MS medium supplemented with sucrose 2% and agar 0.8%; 0.5-4.0 mg/L 2,4-D; and 0.5-4.0 mg/L BA. 2.2.2. Cell suspension culture 2.2.2.1. Culturing cells in flask

2 g callus of two weeks age were transfered into flasks of 250ml containing 50 mL of MS liquid medium supplemented with 2% sucrose, 0.5 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L BA, cultured on the shaking machine with speed of 500 rpm/min. The liquid MS medium added variety of carbon resources and hormones like BA and 2,4-D cultured on the shaking machine with speed of 500 rpm/min to evaluate the ability of cells growth. 2.2.2.2. Cell suspension culture in bioreactor

100 g of cell mass was transfered to fermentation system of 10 L

19

cực đại là 1,16%, sau đó giảm từ ngày 16-18 cùng với sinh trưởng của tế bào (Hình 3.9). Nhìn chung, hàm lượng curcumin trong tế bào ở các thời gian nuôi cấy khác nhau đều cao hơn trong củ nghệ đen tự nhiên (0,43%), lúc cao nhất gấp khoảng 2,7 lần. Bảng 3.16. Hàm lượng curcumin của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít

Thời gian nuôi cấy (ngày)

Thời gian lưu (phút)

Diện tích peak (mAU)2

Hàm lượng curcumin (%)

2 2,09 1909 0,44g 4 1,98 2226 0,52e 6 2,05 2285 0,53e 8 2,00 2442 0,56e

10 1,97 4244 0,98b 12 1,99 4448 1,03b 14 2,07 5034 1,16a 16 1,99 3631 0,84c 18 2,07 2573 0,60d

MTN 2,06 1868 0,43g

Hình 3.10. Phổ HPLC của curcumin chuẩn (0,5 mg/ml)

Hình 3.11. Phổ HPLC của dịch chiết củ nghệ đen tự nhiên

20

Hình 3.12. Phổ HPLC của dịch chiết tế bào nghệ đen sau 2-18 ngày nuôi cấy

3.4.4. Xác định sesquiterpene Kết quả cho thấy, sự hiện diện của các peak phân tách trong củ

nghệ tự nhiên nhiều hơn trong tế bào huyền phù (Hình 3.13). Nhìn chung, các peak có thời gian lưu liên quan với các hợp chất sesquiterpene (được đánh số từ 1-9) trong củ nghệ và tế bào huyền phù có chiều cao phổ hấp thụ (mAU) khác nhau, đặc biệt là peak số 1 và 4

29

bottles, jars to flasks of 1 litter in shaking culture, after that, glass fermentation system of 1-10 litter, and then unrested steel bioreactor of 30-150 L and final up to 1000 L. Bioreactor is a automatic culture system with main aim of improving the ability of controlling optimal condition for cell growth or for producing products.

Some collected evidences from reality over recent decades indicated that secondary substance possed basic functions such as protecting from herbivores, antibacterial, antivirus. Such substances were also applied in pharmacy, agriculture chemicals, staining chemical, perfurme – created substances, insecticide. Secondary substances come from plant can be devided into 3 groups: terpene, phenol and nitrogen compounds. Studies in the ability of biosynthetic of cultured cells were conducted by botanist and microbiologist in many nations. Most of applications of plant cell culture in biotechnology are focused on producing secondary substance. Some archievements in the field of plant cell culture to produce substances applied in treatment indicated the future of producing with a large – scale substances of class of alkaloid, terpenoid, steroid, saponin, phenol, flavonoid and amino acids.

In Vietnam. The technology of plant cell has been culture developed from 1970s and already got some suscesses up to now. One of most successful archivements is culturing ginseng Ngoc Linh. Besides, there were some other cell culture of others medicinal plants like Taxus Wallichiana zucc, Solanum hainanense, Centella asiatica, vinca rosea... Zedoary possess essential oil including sesquiterpene and monosesquiterpene; curcuminoid. Moreover, the plant also stores starch, plastic and some other bitterness compounds. Zedoary has been utilized in some remedies of oriental medicine for treatment. Many studies indicated that compounds like essential oil, curcumin, sesquiterpene… of Zedoary possess precious bioactivities such as

28

and discussion, 36 pages; Conclusion and recommendation, 2 pages; Publcation related to the thesis: 1 page. References: 23 pages (including 193 English and Vietnamese references); 18 table of data and 16 figures

Chapter 1

OVERVIEW 17 Vietnamese references and 189 English references were

refered, related to: (1) Plant cell culture; (2) Accumulation of secondary metabolites in in vitro plant cell culture; (3) Introduction of C. zedoaria Rocoe.

The first experience of plant tissue was published in 1902 by Haberlandt-the German plant Physiologist, known as the man invented method of plant cell culture. First experiments in single cell culture for pharmaceutical production in 1950s in Charles Pfizer company. Up to now, 1 century since Haberlandt research, many sub – substances were produced via plant cell culture.

Plant cell culture started from appearance of unsplitting cells that called callus. Callus culture was based on tissue culture taken from plants on the essential culture environment including agar. The cell suspension culture started by transferring callus mass to liquid culture using stirring machine, spin or whirl filter membrane. The callus cultured were fragile, so it is possible to establish the cell suspension liquid with highest level of dispersion. Culturing the cell suspension in liquid environment provided a unique system for detail studies about growth and production transformef substances.

In this culture process, some elements should be in high interst such as: culture environment including hormones, carbon resource, culture conditions such as size of original samples, agitation, aeration rate. The order of a improved process started from culturing cell in

21

(Bảng 3.17). Chẳng hạn, peak số 1 (thời gian lưu 4,7 phút) co độ hấp thụ là 6,05 mAU trong củ nghệ nhưng chỉ đạt 2,55 mAU trong tế bào huyền phù, ngược lại peak số 4 (thời gian lưu 7,5 phút) ở tế bào huyền phù có độ hấp thụ là 7,33 mAU còn củ nghệ là 2,23 mAU. Một số peak hiện diện trong củ nghệ (5-8) thì không có hoặc chỉ có ở dạng vết (< 1 mAU) trong tế bào huyền phù. Tuy nhiên, ở tế bào huyền phù lại xuất hiện những peak mới (không đánh số) với các thời gian lưu xấp xỉ 6,8; 7,8; 8,2 và 9,2 min tương ứng với độ hấp thụ 1,38-4,10; 5,62-7,54; 1,70-8,41 và 1,06-8,38 mAU. Kết quả này cho thấy, trong quá trình nuôi cấy tế bào đã xuất hiện sự chuyển hóa sinh học của các sesquiterpene, tạo ra những hợp chất sesquiterpene khác so với củ nghệ. Bảng 3.17. Chiều cao của của phổ hấp thụ (mAU) của sesquiterpene trong tế bào

nuôi cấy ở hệ lên en 10 L và củ nghệ tự nhiên Hợp chất sesquiterpene (số)/thời gian lưu (phút)

TN 1/4,7 2/5,1 3/6,0 4/7,5 5/12,7 6/13,8 7/19,2 8/20,5 9/26,7

2 2,11 - 2,49 5,99 - vết vết vết - 4 1,93 - 2,23 5,76 - vết vết vết - 6 1,15 vết 2,81 3,17 - vết - - - 8 1,06 - 1,54 3,57 - - - - -

10 1,22 - 1,02 4,05 - vết vết - - 12 1,04 vết 2,14 3,29 - vết - vết - 14 2,55 1,59 - 7,33 - vết - vết - 16 1,58 - 3,82 4,04 - vết - - - 18 2,36 1,15 1,15 5,11 - vết - vết -

MTN 6,05 2,59 2,15 2,23 6,23 1,46 3,59 1,29 1,19

22

Hình 3.13. Phổ HPLC về sự phân bố sesquiterpene. A: Củ nghệ đen tự nhiên; B: tế

bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít từ 2-18 ngày

3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen Kết quả trình bày ở bảng 3.18 cho thấy, tinh dầu tách chiết từ tế

bào và củ nghệ đen tự nhiên đều có khả năng ức chế sinh trưởng của cả 3 loài vi khuẩn E. coli, S. aureus và B. cereus. Nhìn chung, tinh dầu

27

4. Thesis contributions - Successful selection of cell line (compact and friable) from the

leaf-base explants of in vitro Zedoary to culture suspension, along with systematical identification of suitable conditions and culture medium for the quick and stable growth of cells of C. zedoaria Roscoe that were from suspension culture in flasks and 10 litter bioreactor.

- Study the accumulation of some bioactive substances such as: essential oil, curcummin, sesquiterpene and polysaccharide in cells of Curcuma zedoaria Roscoe.

- Studied the antibacterial ability of the essential oil extracted from the in vitro cultured zedoary cells and already found that the essential oil was able to depress growth of some pathogenic microorganisms.

5. Science meaning and reality 5.1. Science meaning

The thesis results can provide some new science data systematically on cell culture of Zedoary and on their accumulation ability of some bioactive compounds. Moreover, the results can be a useful reference for other researches and teaching in cell culture and producing high valuable bioactive substances. 5.2. Reality meaning

The study results also could be a science base to develop the process of cell culture for Zedoary in order to quickly produce biomass and provide a stable material resource for extracting and collecting some secondary metabolites used for medicine. 6. The thesis structure

The thesis concluded 105 pages (including references), involved: Introduction: 4 pages: Chapter 1: Overview, 32 pages; Chapter 2: Research objects, contents and methods, 7 pages; Chapter 3: Results

26

sesquiterpen are capable of inhibiting the formation of TNF-α of activated macrophages, which has therefore the anti-inflammatory effects. Besides, curcumin is also an antioxidant that is capable of cells protection. Essential oil has the high capacity of antimicrobial and mutation resistance. In addition, its polysaccharide effectively inhibited the growth of sarcoma (sarcoma 180), preventing chromosome mutation, as well as has macrophages stimulating activity.

In the nature, Zedoary is propagated by rhizome. The growth of bulb takes place in a long time, leading to the less multiplier coefficient and lower yield. On top of that, it especially depends greatly on the conditions of weather, seasons, labor costs and production materials. On the other hand, the natural Zedoary is also susceptible to diseases such as root rot and leaf spot. It is, therefore, very difficult to have a stable and abundant raw materials for the production of a large number of precious activities used in pharmaceutical preparations.

In the light of the above facts, we do the thesis of “Study on cell culture of Zedoary (Curcuma Zedoaria Roscoe) and investigate the accumulation of some bioactive compounds”. 2. Research purposes

Study to propose suitable culture conditions and medium for quick production of cell biomass, simultaneously for identification of the ability in accumulating some bioactive compounds in cells of Curcuma zedoaria Roscoe that were from suspension culture.

3. Research contents - Callus induction from in vitro leaf-base explants of Zedoary; - Suspension culture of Zedoary cells; - Study the accumulation of some bioactive compounds in in

vitro Zedoary cells; - Investigate of antibacterial activity of essential oil in in vitro

Zedoary cells.

23

thu được từ tế bào nghệ đen có khả năng kháng khuẩn cao nhất thể hiện qua đường kính vòng ức chế (Hình 3.14). Tinh dầu tế bào nuôi cấy ức chế mạnh nhất đối với S. aureus (đường kính vô khuẩn 31 mm), sau đó đến B. cereus (22,33 mm) và kém nhất đối với E. coli (18,33 mm). Trong khi đó, khả năng ức chế sinh trưởng của tinh dầu củ nghệ đen tự nhiên đối với B. cereus và E. coli là tương đương nhau (16 mm và 17,67 mm), kém nhất là đối với S. aureus chỉ đạt 14 mm. Bảng 3.18. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen

Đường kính vòng vô khuẩn D-d (mm) Vi khuẩn Đối chứng Tinh dầu tế bào Tinh dầu củ nghệ B. cereus ATCC 11778 0 22,33b 16,00a

E. coli ATCC 25922 0 18,33b 17,67a S. aureus ATCC 6538 0 31,00a 14,00a

Đối chứng: không có tinh dầu nghệ đen

Hình 3.14. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen. A: E. coli ATCC 25922. B: B. cereus ATCC 11778. C: S. aureus ATCC 6538. ĐC: đối chứng. TN: tinh dầu củ nghệ đen tự nhiên. TB: tinh dầu của tế bào nghệ đen

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN

1. Môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose, 0,8% agar, bổ sung thêm BA 0,5 mg/L và 2,4-D 0,5 mg/L thích hợp cho nuôi cấy callus từ bẹ lá cây nghệ đen in vitro. Callus được tạo thành có màu có màu vàng, rắn và rời rạc được dùng làm nguyên liệu để thiết lập nuôi cấy tế bào huyền phù.

2. Môi trường cơ bản MS có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm BA 0,5 mg/L và 2,4-D 1,5 mg/L, tốc độ lắc 120 vòng/phút thích hợp cho sinh

24

trưởng của tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml. Sinh khối đạt cực đại là 10,44 g tươi (0,66 g) sau 14 ngày khi nuôi cấy với cỡ mẫu là 3 g.

3. Môi trường cơ bản MS có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm BA 0,5 mg/L và 2,4-D 1,5 mg/L, tốc độ khuấy 150 vòng/phút, tốc độ sục khí 2,5 L/phút thích hợp cho sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L. Sinh khối đạt cực đại là 603 g tươi (53,25 g khô) sau 14 ngày nuôi cấy với cỡ mẫu là 200 g.

4. Hàm lượng tinh dầu trong tế bào đạt cao nhất là 2,57% khối lượng khô sau 14 ngày nuôi cấy, gấp khoảng 1,6 lần tinh dầu ở củ nghệ đen tự nhiên 1 năm tuổi. Hàm lượng curcumin trong tế bào đạt cao nhất là 1,16% sau 14 ngày nuôi cấy, gấp khoảng 2,7 lần curcumin ở củ nghệ đen tự nhiên 1 năm tuổi. Đã có chuyển hóa sinh học curcuminoid trong nuôi cấy tế bào. Hàm lượng polysaccharide trong tế bào cao nhất là 6,55% khối lượng khô sau 10 ngày nuôi cấy, thấp hơn ở củ nghệ tự nhiên khoảng 1,4 lần. Có sự tích lũy các hợp chất sesquiterpene trong tế bào nuôi cấy. Thành phần sesquiterpene hiện diện trong tế bào huyền phù ít hơn so với củ nghệ 1 năm tuổi. Trong tế bào có 3-4 peak của sesquiterpene giống như tế bào củ nghệ. Đã có chuyển hoá sinh học sesquiterpene trong nuôi cấy tế bào.

5. Tinh dầu tế bào cây nghệ đen có khả năng ức chế mạnh sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn B. cereus ATCC 11778 (đường kính vô khuẩn 31 mm), S. aureus ATCC 6538 (22,33 mm) và E. coli ATCC 25922 (18,33 mm). Nhìn chung, khả năng kháng khuẩn của tinh dầu thu hồi từ tế bào nuôi cấy khá cao.

ĐỀ NGHỊ 1. Nghiên cứu cải thiện khả năng tích lũy các hợp chất có hoạt

tính sinh học trong tế bào nghệ đen. 2. Nghiên cứu thành phần và hoạt tính của curcuminoid,

sesquiterpenes, polysaccharides được sản xuất từ tế bào nghệ đen.

25

INTRODUCTION 1. The necessity of the thesis

Plants are the source of carbohydrate, protein and food fat. Furthermore, they are also a diversified source of natural compounds used in pharmaceuticals, agrochemicals and flavors... These products are known as secondary metabolites, which are also considered as the product of the chemical reactions of the plants with the environment or its chemical protections against microorganisms and animals.

The studies on the plant - originated sub compounds have developed from the late 50s of the 20th century. To date, there are about more than 80,000 compounds published. The exploitation of natural resources of medicinal plants is becoming an important issue globally as they are more increasingly commercialized. The question is now that the natural habitats of medicinal plants are rapidly disappearing due to fluctuations in environmental conditions and geography, as well as the indiscriminate exploitation of human beings. That is the reason why scientists must take into account the potential of plant tissue culture technique as an alternative to a stable supply of raw materials for the pharmaceutical industry.

Plant tissue culture has been researched since the 1950s. Many studies showed that it is an effective method in producing bioactive substances or their metabolites. Based on the method, a wide variety of valuable compounds has been produced successfully, such as anthraquinone, vincristine, berberine, diosgenin, taxol, ginsenoside, and so on.

Zedoary is a non-toxic herb, containing the substances such as curcumin, terpenoids and essential oils. Curcumin is capable of inhibiting tumors, which helps to against some forms of cancer in mice, such as colon cancer, stomach cancer, breast cancer and ovarian cancer. It has also the effects of anti-clotting and hypotension. Both curcuminoid and