av et basisk legemiddel og dets polare metabolitter fra urin · 2017. 12. 7. · V Sammendrag For...
Transcript of av et basisk legemiddel og dets polare metabolitter fra urin · 2017. 12. 7. · V Sammendrag For...
I
Parallel artificial liquid membrane extraction
av et basisk legemiddel og dets polare
metabolitter fra urin
Patryk Oskar Grafinski
Masteroppgave ved avdeling for farmasøytisk kjemi
Faggruppen for legemiddelanalyse
45 studiepoeng
Farmasøytisk institutt
Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet
UNIVERSITETET I OSLO
Mai/2017
II
III
Parallel artificial liquid membrane extraction av et basisk legemiddel og dets
polare metabolitter fra urin
Veiledere:
Stig Pedersen-Bjergaard
Professor ved seksjon for farmasøytisk kjemi
Farmasøytisk institutt
Universitetet i Oslo
Astrid Gjelstad
Førsteamanuensis ved seksjon for farmasøytisk kjemi
Farmasøytisk institutt
Universitetet i Oslo
Kristine Skoglund Ask
Stipendiat ved seksjon for farmasøytisk kjemi
Farmasøytisk institutt
Universitetet i Oslo
IV
© Patryk Oskar Grafinski
2017
Parallel artificial liquid membrane extraction av et basisk legemiddel og dets polare
metabolitter fra urin
Patryk Oskar Grafinski
http://www.duo.uio.no
Trykk: Reprosentralen, Universitetet i Oslo
V
Sammendrag
For første gang ble det vist at parallel artificial liquid membrane extraction (PALME) var i
stand til å ekstrahere et basisk legemiddel og tilhørende metabolitter med store forskjeller i
polaritet (-1.2 < log P < 2.5) fra urin i ett prøveopparbeidelsestrinn. Modellsubstansene i dette
prosjektet var legemidlet venlafaksin med tilhørende metabolitter, hvorav to av disse var
glukuronider med zwitterioniske egenskaper.
PALME ble utført fra kommersielle 96-brønnsplater. Modellsubstansene ble ekstrahert fra
alkalisk urinprøve (donorfase), gjennom en supported liquid membrane (SLM) av organisk
løsningsmiddel immobilisert i en porøs membran av polyvinylidenfluorid (PVDF), og inn i sur
vandig akseptorfase. Etter ekstraksjon ble akseptorfasen analysert direkte med ultra-high
performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC-MS).
Optimalisering av ekstraksjonsbetingelser fokuserte i stor grad på den kjemiske
sammensetningen av fasene i PALME. Donorfasen besto av 125 µl urinprøve som ble justert
med 115 µl 0.75 M bikarbonat-karbonatbuffer med pH 10.5 og 10 µl intern standard
(venlafaksin-D6 hydroklorid). SLM hadde et volum på 4 µl. Den var sammensatt av et helt nytt
organisk løsemiddel i PALME sammenheng, tripentylfosfat, som ble blandet sammen med 25%
av en bæremolekylløsning, Aliquat 336. Aliquat 336 er en teknisk blanding av alkylerte
ammoniumklorider med trioktylammoniumklorid som hovedkomponent. Akseptorfasen var 50
µl av en 20 mM maursyreløsning. Ekstraksjoner foregikk i 45 min og ble fremmet av et orbitalt
ristemønster med en hastighet på 900 rpm.
Metoden gjennomgikk en evaluering basert på retningslinjer fra de europeiske
legemiddelmyndighetene (EMA) der både intra- og interdaganalyse ble gjennomført.
Korrelasjonskoeffisienter (r2) for linearitet hadde verdier mellom 0.98 og 0.99. Over 90% av
resultatene fra evalueringen oppfylte krav med hensyn på presisjon og nøyaktighet. Det ble ikke
observert overdrag i systemet.
Resultatene bekreftet potensialet av PALME og åpnet veien for ytterligere applikasjoner med
polare analytter eller analytter innenfor et betydelig polaritetsvindu.
VI
Forord
Hei Kristine, Astrid og Stig.
Valideringsresultater vises i tabellen under.
Veiledningsvalidering
Oppfølging (r2) 1
Presisjon og nøyaktighet av
tilbakemeldinger
Alle QC godt innenfor krav
Tilgjengelighet over tid Stabilt på svært høyt nivå
Tilbakemeldingstid Svært kort
Overdrag av negative følelser eller andre
uønskede effekter
Aldri observert
Konklusjon: Valideringsresultater bekrefter ypperlig kvalitet av data. Det er derfor høyst
nødvendig å takke for den hyggelige og spennende tiden jeg hadde på legemiddelanalyse siden
det er vel fortjent. Tusen takk skal dere ha!
Dere som alltid er «alle andre på avdelingen», Cecilie, Trine, Øystein, Leon, Chuixiu, Elisabeth,
Inger, Marthe, Linda, Magnus og Maren takk for den trivelige tiden vi hadde sammen.
Clarissa og Ida, det var gøy og vet dere hva deres navn slutter på a - what a coincidence.
Elin Vyvy det ville vært altfor kjedelig og altfor stille uten deg.
Gladys 我的朋友,你是个非常独特人,非常荣幸认识你。
Så er det deg Bassem. Du gjorde de fem siste årene helt topp. Jeg kunne ha skrevet veldig mye
om deg og det ville ha vært kun positive ting. Jeg tror at å kalle deg for en bror fra en annen
mor oppsummerer alt.
Mamma, pappa TAKK!
Det er fint å bli ferdig men det var mange kule mennesker, mye lek på laben og med skrivingen
så det er også trist. Vel, jeg har i hvert fall kjennskap til venlafaksin… 😉
Oslo, mai 2017
Patryk
VII
Innholdsfortegnelse Forkortelser ................................................................................................................................ 1
1. Innledning ........................................................................................................................... 4
1.1. Bakgrunn ..................................................................................................................... 4
1.2. Hensikt ......................................................................................................................... 6
2. Teori .................................................................................................................................... 7
2.1. Analytter og matriks .................................................................................................... 7
2.1.1. Venlafaksin og dens metabolitter ......................................................................... 7
2.1.2. Urin som biologisk matriks .................................................................................. 8
2.2. Prøveopparbeidelse ...................................................................................................... 9
2.2.1. Væske-væske ekstraksjon .................................................................................... 9
2.2.2. Væske-fase mikroekstraksjon ............................................................................ 11
2.2.3. Parallel artificial liquid membrane extraction .................................................... 12
2.3. UHPLC ...................................................................................................................... 14
2.4. MS ............................................................................................................................. 17
2.4.1. Elektrospray-ionisering ...................................................................................... 18
2.4.2. To-dimensjonal ionefelle .................................................................................... 18
3. Materialer og metoder ....................................................................................................... 20
3.1. Fysikalsk-kjemiske egenskaper av analytter ............................................................. 20
3.2. Utstyr ......................................................................................................................... 20
3.3. Kjemikalier ................................................................................................................ 23
3.4. Løsninger og buffere ................................................................................................. 26
3.4.1. Tillaging av buffere ............................................................................................ 26
3.4.2. Løsninger ............................................................................................................ 28
3.4.3. Stamløsninger ..................................................................................................... 30
3.4.4. Arbeidsløsninger ................................................................................................ 30
3.4.5. Standarder ........................................................................................................... 30
3.4.6. Internstandard ..................................................................................................... 30
3.4.7. Biologisk matriks ............................................................................................... 31
3.4.8. Mobilfaser .......................................................................................................... 31
3.5. Instrumentelle betingelser .......................................................................................... 31
3.5.1. UHPLC ............................................................................................................... 31
3.5.2. MS/MS ............................................................................................................... 32
3.6. Utførelse av PALME ................................................................................................. 33
3.6.1. Vandige prøveløsninger ..................................................................................... 33
VIII
3.6.2. Biologiske prøveløsninger .................................................................................. 35
3.7. Utvelgelse av SLM .................................................................................................... 36
3.8. Optimalisering av ekstraksjonen ............................................................................... 37
3.8.1. Optimalisering av organisk fase ......................................................................... 37
3.8.2. Optimalisering av mengden til ionisk bærer ...................................................... 38
3.8.3. Optimalisering av buffer pH i donorfasen .......................................................... 38
3.8.4. Optimalisering av styrken i akseptorfasen ......................................................... 39
3.8.5. Optimalisering av ekstraksjonstid ...................................................................... 39
3.8.6. Optimalisering av bufferstyrken i donorfasen .................................................... 39
3.9. Evaluering av metoden .............................................................................................. 39
3.9.1. Laveste deteksjonsgrense og kvantifiseringsgrense ........................................... 39
3.9.2. Linearitet ............................................................................................................ 40
3.9.3. Overdrag ............................................................................................................. 40
3.9.4. Presisjon og nøyaktighet .................................................................................... 40
3.9.5. Matrikseffekter ................................................................................................... 40
3.9.6. Ekstraksjonsutbytte ............................................................................................ 41
3.10. Beregninger ............................................................................................................ 41
4. Resultater og diskusjon ..................................................................................................... 42
4.1. Innledende forsøk ...................................................................................................... 42
4.1.1. Utvelgelse av SLM – del 1 ................................................................................. 42
4.1.2. Utvelgelse av SLM – del 2 ................................................................................. 43
4.1.3. Utvelgelse av SLM – del 3 ................................................................................. 46
4.1.4. Testing av pH-betingelser i donorfasen.............................................................. 48
4.1.5. Utvelgelse av SLM – del 4 ................................................................................. 51
4.1.6. Utvelgelse av SLM – del 5 ................................................................................. 52
4.1.7. Utvelgelse av SLM ved samtidig testing av utvidede pH-betingelser i
donorfasen – del 6 ............................................................................................................. 53
4.1.8. Utvelgelse av ionisk bærer ................................................................................. 55
4.1.9. Testing av ulike løsemidler og styrker i akseptorfasen ...................................... 57
4.2. Optimaliseringsforsøk ............................................................................................... 59
4.2.1. Optimalisering av SLM ...................................................................................... 59
4.2.2. Optimalisering av buffer pH i donorfasen .......................................................... 61
4.2.3. Optimalisering av styrken i akseptorfasen ......................................................... 63
4.2.4. Optimalisering av ekstraksjonstid ...................................................................... 65
4.2.5. Optimalisering av bufferstyrken i donorfasen .................................................... 67
IX
4.2.6. Testing av motioner ............................................................................................ 69
4.3. Evaluering .................................................................................................................. 70
4.3.1. Laveste deteksjonsgrense og kvantifiseringsgrense ........................................... 70
4.3.2. Linearitet ............................................................................................................ 70
4.3.3. Overdrag ............................................................................................................. 73
4.3.4. Presisjon og nøyaktighet .................................................................................... 73
4.3.5. Matrikseffekter ................................................................................................... 75
4.3.6. Ekstraksjonsutbytte ............................................................................................ 75
5. Konklusjon ........................................................................................................................ 77
6. Referanseliste .................................................................................................................... 79
7. Appendix ........................................................................................................................... 83
1
Forkortelser
A336 Aliquat 336
Arb Arbitrary units
C18 Oktadecyl
Cl Klor
CYP450 Cytokrom P450
DBPi Dibenzylfosfitt
DCMA Dodecyltrimetylammoniumbromid
DMSO Dimetylsulfoksid
EMA European Medicines Agency
EME Electromembrane extraction (Elektromembranekstraksjon)
ESI Elektrospray-ionisering
HCl Hydrogenklorid
HCOOH Maursyre
HEPT Høydeekvivalenten til en teoretisk plate
HF-LPME Hollow-fiber liquid phase microextraction
HPLC High-pressure liquid chromatography
K Kalium
LC Liquid chromatography (Væskekromatografi)
LIT Linear ion trap (Lineær ionefelle)
LLE Liquid-liquid extraction (Væske-væske ekstraksjon)
LOD Laveste deteksjonsgrense
LOQ Laveste kvantifiseringsgrense
LPME Liquid-phase microextraction (Væske-fase mikroekstraksjon)
2
m/z Masse over ladning
MS Mass spectrometry (Massespektrometri)
MS2 Tandem massespektrometri
Na Natrium
NaCl Natriumklorid
NaOH Natriumhydroksid
NDV N-desmetyl venlafaksin
NNDODV N,N-didesmetyl O-desmetyl venlafaksin
NNDODVGLU N,N-didesmetyl O-desmetyl venlafaksin glukuronid
NODV N,O-didesmetyl venlafaksin
NODVGLU N,O-didesmetyl venlafaksin glukuronid
NPOE 2-nitrofenyloktyleter
ODV O-desmetyl venlafaksin
PALME Parallel artificial liquid membrane extraction
PVDF Polyvinylidenfluorid
QC-prøve Kvalitetskontrollprøve
r2 Korrelasjonskoeffisient
RF Radiofrekvens
rpm Omdreininger per minutt
RSD Relativt standardavvik
SDME Single drop microextraction
SLE Supported liquid extraction
SLM Supported liquid membrane
SNRI Serotonin-noradrenalin reopptakshemmer
3
SPE Solid phase extraction (Fast-fase ekstraksjon)
SRM Selected reaction monitoring
TBAP Tetrabutylammoniumfosfat
TBP Tributylfosfat
TDA Tetradecylammoniumbromid
TEAB Tetraetylammoniumbromid
TEHP Tris(2-etylheksyl)fosfat
TEHPi Tris(2-etylheksyl)fosfitt
TFA Trifluoreddiksyre
TIOPi Triisodecylfosfitt
TOA Trioktylamin
TPP Tripentylfosfat
UDPGT UDP-glukuronosyltransferase
UHPLC Ultra-high-pressure liquid chromatography
V Volt
VEN Venlafaksin
Å Ångstrøm
4
1. Innledning
1.1. Bakgrunn
Det er et stort behov for å måle legemidler, dopingmidler, narkotiske stoffer eller deres
metabolitter i biologiske væsker som blod, urin eller spytt. Nytten av slike målinger er spesielt
synlig i terapeutisk legemiddelmonitorering, dopingkontroll eller rettstoksikologi. Slike
målinger kan også ha høy relevans i legemiddelutvikling (drug discovery). Formålet med dem
er å identifisere og bestemme konsentrasjonen av de nevnte stoffgruppene (1).
Utfordringen er ofte en altfor kompleks sammensetning av matriks som forhindrer direkte
injeksjon av prøven i det analytiske instrumentet. Faren for forurensing av instrumentet eller
oppnåelse av unøyaktige resultater skaper behovet for et foregående trinn. Det er kjent som
prøveopparbeidelsestrinnet. Dets hovedformål er å gjøre prøven kompatibel med etterfølgende
separasjon og deteksjon (1, 2).
De veletablerte teknikkene som væske-væske ekstraksjon (liquid-liquid extraction: LLE) og
fast-fase ekstraksjon (solid phase extraction: SPE) er fortsatt mye brukt.
Ekstraksjonsmekanismene er godt kjent og begge har mange anvendelsesområder (1, 3).
Automatiseringspotensial, mindre prøvevolumer samt løsemiddel forbruk og forbedret
tidseffektivitet var faktorer som initierte interessen for å miniatyrisere teknikkene. LLE ble
videreutviklet til væske-fase mikroekstraksjon (liquid-phase microextraction: LPME) (4, 5).
Hollow-fibre liquid phase microextraction (HF-LPME) er en form av LPME som ble
introdusert på slutten av 1990-tallet (6). Den teknikken kan opereres i et tre-fase system som
gir muligheten for en selektiv ekstraksjon av analytter fra den vandige donorfasen via supported
liquid membrane (SLM) med organisk fase til den vandige akseptorfasen. Donorfasen
inneholder prøven mens akseptorfasen er løsningen som kan injiseres direkte i LC-MS (7).
Utfordringer knyttet til automatisering av den sistnevnte teknikken førte til utvikling av parallel
artificial liquid membrane extraction (PALME) som i stor grad ligner på HF-LPME (8).
PALME er konstruert av to 96-brønnsplater som klemmes sammen under ekstraksjon. Den ene
kalles for donor- mens den andre for akseptorplaten og inneholder henholdsvis donor- og
akseptorfasen. De separeres fra hverandre med en flat SLM som forsegler bunnen av
akseptorplaten (8). Ekstraksjonsprinsippet baseres på diffusjonen av analytter fra donorfasen
via SLM til akseptorfasen. Prosessen fremmes blant annet av riktig pH-justering som påvirker
distribusjonskoeffisienter og risting av platene. Det organiske løsemiddelforbruket i PALME
overskrider vanligvis ikke 500 µl for 96 prøver. Analytter, som for eksempel legemiddelstoffer,
5
i biologiske prøver med et volum på opptil 250 µl kan ekstraheres ved bruk av PALME (8). En
av de store fordelene med PALME er akseptorfasen som er kompatibel med LC-MS.
Fordampning av løsemiddel og gjenoppløsning i mobilfase før LC er således ikke nødvendig
(8).
Publikasjonen hvor PALME ble introdusert bekreftet at denne teknikken var egnet for
ekstraksjoner av hydrofobe basiske legemidler som petidin, nortriptylin, metadon og
haloperidol (8). De etterfølgende studier utvidet applikasjonsområdet med sure legemidler og
viste at PALME hadde potensialet for å rense plasmaprøven opp fra fosfolipider (9, 10). I nylig
publiserte artikler ble PALME benyttet for ekstraksjoner av analyttblandingen som besto av
nye psykoaktive substanser og polare legemiddelstoffer (11, 12). I den sistnevnte studiens
hadde de basiske legemidlene log P-verdier mellom 1.3 til -0.29. Deres ekstraksjonsutbytter var
mellom 50 og 89% (12). Disse studiene benyttet plasma eller fullblod som matriks og de
benyttede analyttene var stort sett upolare forbindelser med log P>2 (8, 9, 11, 12). I denne
masteroppgaven ble det benyttet en analyttblanding som hadde et bredere spekter av fysikalsk-
kjemiske egenskaper i forhold til tidligere forskningsprosjekter. Analyttene omfattet således
legemidlet venlafaksin (log P = 2.5), som var modersubstansen, og en rekke polare metabolitter.
Disse inkluderte glukuronidene (log P = -1.2) som var de mest polare analyttene med amfotære
egenskaper. Plasma og fullblod som matriks ble erstattet med urin.
Polare metabolitter og særlig glukuronider er vanskelige å ekstrahere via SLM. Grunnen til
dette er deres begrensede fordeling over i SLM (12). I et tidligere studie med HF-LPME ble det
benyttet bæremolekyler i SLM for å fremme ekstraksjonen av polare legemidler der atenolol
med log P på 0.01 var det mest hydrofile stoffet (13). Akseptorfasen besto av 50 mM HCl som
ikke var det optimale løsemidlet for LC-MS på grunn av lav pH. En annen publikasjon relaterte
til HF-LPME som studerte ekstraksjon av tre tetrasykliner som hadde log P-verdier mellom -
1.3 og -3.6 (14). Disse legemidlene hadde i likhet med glukuronider zwitterioniske egenskaper.
Ekstraksjon ble oppnådd med bruk av NaCl i akseptorfasen som ble etterfulgt av HPLC-UV
deteksjon, men i kombinasjon med LC-MS er dette systemet lite attraktivt. I tillegg tyder
tendenser på at ultra-high-pressure liquid chromatography (UHPLC) koblet med et
massespektrometer (MS) får enda større betydning i de kommende årene (15). Grunnen til det
er at UHPLC er en kostands- og tidseffektiv separasjonsmetode mens MS klarer å operere med
lavere konsentrasjonsnivåer og høyere selektivitet i forhold til andre deteksjonsteknikker (1).
Få HF-LPME studier har beskrevet ekstraksjoner av analyttblanding som ligner på den fra
denne studien ved samtidig bruk av LC-MS/MS. I en av dem ble østron, østradiol og
6
etinyløstradiol ekstrahert med tre tilhørende glukuronider. Denne analyttblandingen hadde log
P-verdier mellom 1.1 og 4.2 (16). De var dermed to enheter høyere i forhold til dette prosjektet.
Akseptorfasen besto i tillegg av høykonsentrert saltløsning. Det skapte dermed kompatibilitet
utfordringer med MS (16).
1.2. Hensikt
Som nevnt ovenfor, fokuserte de tidligere PALME forskningsprosjektene i stor grad på
blandinger av forholdsvis upolare legemidler eller narkotiske substanser. Det er også få HF-
LPME publikasjoner i dette tema. Hensikten med dette prosjektet var å utvide
applikasjonsområdet til PALME. Det var ønskelig å undersøke om denne teknikken kunne
ekstrahere enda mer polare analytter som i tillegg hadde amfotære egenskaper. Fokuset ble lagt
på ekstraksjoner av modersubstansen og de tilhørende metabolittene fra biologisk matriks for å
etterligne en reel situasjon. Ekstraktene skulle videre analyseres ved hjelp av UHPLC-MS/MS.
Dette konseptuelle arbeidet ble avsluttet med evaluering. Den hadde som formål å bekrefte
kvaliteten av data.
Hensikten med dette prosjektet oppsummeres i den punktvise oversikten:
• Utvikle en UHPLC-MS/MS-metode for identifikasjon og kvantifisering av analyttene
• Undersøke om PALME er egnet for ett-trinnsekstraksjon av et basisk legemiddel og
dets metabolitter med et bredt spekter av fysikalsk-kjemiske egenskaper
• Forbedre ekstraksjonen ved testing av ulike organiske løsemidler i SLM
• Optimalisere ekstraksjonsbetingelser for PALME fra urin
• Utføre evaluering av metoden
7
2. Teori
2.1. Analytter og matriks
2.1.1. Venlafaksin og dens metabolitter
Venlafaksin er en serotonin-noradrenalin reopptakshemmer (SNRI). Virkningen påvirker
hovedsakelig nevrotransmitterne serotonin og noradrenalin som blir værende i den synaptiske
spalten for lengre tidsperioder slik at signaloverføringen mellom nervene blir forbedret.
Venlafaksin er et legemiddel som brukes ofte ved behandling av depresjoner og angst (17, 18).
De terapeutiske dosene i plasma varierer mellom 100 og 400 ng/ml. De blir optimalisert
individuelt med hensyn til indikasjon og type pasient (19).
Venlafaksin er et basisk legemiddel på grunn av tertiært amin i sin struktur, som metaboliseres
i kroppen. Strukturen av venlafaksin og dens metabolitter er vist i figur 1. Cytokrom P450
(CYP450) systemet er en gruppe enzymer som er involvert i stor grad i de første trinnene av
denne prosessen. Disse enzymene finnes i stort omfang i hepatocytter (20). Enzymet CYP2D6
spiller en avgjørende rolle i metabolismen av venlafaksin selv om 3A4 og 2C19 også er
involvert. Individuelle genetiske variasjoner kan bidra til forandringer i metabolismeaktiviteten.
CYP450 demetylerer venlafaksin og gjør den dermed mer polar (17, 20). Metabolitter fra fase
I viser mindre potent farmakologisk effektivitet, der den mest virksomme er O-
desmetylvenlafaksin (18). De metaboliseres videre ved hjelp av UDPGT enzymer i fase II
metabolisme til glukuronider. Disse er enda mer polare forbindelser som i tillegg får amfotære
egenskaper (17). Over 90% av venlafaksin og dens metabolitter skilles ut med urinen (18).
8
Figur 1 Metabolismen av venlafaksin (17, 21)
2.1.2. Urin som biologisk matriks
Urin er et eksempel på en biologisk matriks. Den er enklere å samle opp enn blod, og
sammensetningen er mindre utfordrende. Det er ingen fosfolipider, og forekomsten av proteiner
er vanligvis svært liten. Det skyldes filtreringen i nyrene. I tillegg er den tilgjengelig i større
volumer (22). Til tross for enklere sammensetning av urin, som i hovedsak består av vann, urea,
kreatinin, ioner og en rekke organiske forbindelser, er den fortsatt uegnet for direkte injeksjon
i de fleste analytiske instrumentene som eksempelvis LC-MS (22, 23).
Venlafaksin
↙ ↘
NDV ODV
↘ ↙
→
NODV NNDODV
↙ ↓
NODVGLU NNDODVGLU
9
Urin kan forårsake matrikseffekter som enten øker eller undertrykker signalet i LC-MS fra
analytten når retensjonstiden er tilnærmet lik (2). Forandret desorpsjon av ioner i ionekilden,
eller konkurranse om ladninger er mulige forklaringer for slike effekter i massespektrometre
(1). Fortynningsgraden av urinen kan ha en viss effekt i denne prosessen. Kreatinin, som ofte
blir brukt i målinger av fortynningsgrad, gir ikke alltid pålitelige resultater (2). Stor variasjon i
betingelser mellom de ulike urinprøvene er også en utfordring ved måling av analytter.
Ionestyrken og pH er faktorer som raskt kan påvirkes av forandret kosthold eller væskeinntak
(1). Den store variabiliteten kan ha negative konsekvenser for nøyaktigheten av kvantitative
målinger.
2.2. Prøveopparbeidelse
Som nevnt ovenfor kan noen biologiske væsker ha en altfor kompleks sammensetning som
umuliggjør direkte injeksjon i det analytiske instrumentet. Det er derfor viktig å ha et trinn som
isolerer ønskede analytter og klargjør dem for analysen (1, 4). Prøveopparbeidelsestrinnet kan
enten fjerne de uønskede komponentene eller isolere analytter. Det er et viktig trinn i
analyseprosessen som bidrar til å minimere matrikseffekter på en mest mulig effektiv måte og
å hindre kontaminering av instrumentet. Opprensning av prøven er spesielt viktig hvis analytter
finnes i lave konsentrasjoner, typisk på nanogram per milliliter nivå (1, 3). Valg av riktig
prøveopparbeidelsesteknikk vil være avhengig av flere faktorer. De kjemiske egenskapene og
konsentrasjonsområde til analyttene, sammensetning av matriks eller type analyseinstrument er
noen eksempler (1).
2.2.1. Væske-væske ekstraksjon
LLE er en veletablert prøveopparbeidelsesteknikk og samtidig utgangspunktet for utviklingen
av den miniatyriserte versjonen som kalles for PALME (3, 8). Hovedprinsippet i LLE er å
ekstrahere ønskede analytter fra den vandige biologiske prøven til den organiske fasen.
Forutsetningen er at de to fasene ikke er blandbare med hverandre slik at det dannes to separate
lag (1). Ekstraksjonen er mest effektiv for ikke ladede analytter siden de har bedre løselighet i
den organiske fasen. For å gjøre dem mest mulig hydrofobe er det viktig å eliminere eventuelle
ladninger på funksjonelle grupper. Avhengig av de kjemiske egenskapene til analyttene kan
dette oppnås ved å holde prøven to pH-enheter under eller over i forhold til pKa-verdien for
henholdsvis syrer og baser (3).
10
Fordelingskoeffisienten (KD) beskriver distribusjonen av analytten basert på dens konsentrasjon
i den organiske og vandige fasen. Ligning 1 som representerer det forholdet, viser at høy
konsentrasjon i den organiske fasen krever en høy fordelingskoeffisient (1).
𝐾𝐷 =[𝐴𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑖𝑠𝑘]
[𝐴𝑣𝑎𝑛𝑑𝑖𝑔] (Ligning 1)
I tillegg til pH blir fordelingen avhengig av egenskaper til det organiske løsemidlet og dets
interaksjonsevner med analyttene. Blant de potensielle interaksjoner spiller hydrofobe van der
Waals krefter, dipol- og hydrogenbindingsinteraksjoner en sentral rolle (1). Valg av det beste
løsemidlet kan bli basert på Kamlet og Taft-parametere. De beskriver hydrogenakseptor,
hydrogendonor og polaritet egenskaper til en rekke løsemidler (24). Temperatur er enda en
faktor som kan påvirke fordelingen av analytten mellom to faser (25).
Ekstraksjonsutbytte i LLE er bestemt av fordelingskoeffisienten og volumet av begge faser som
vist i ligning 2. Flere etterfølgende ekstraksjoner med mindre volumer istedenfor en med større
volum gir bedre utbytter (1).
𝑅 =𝐾𝐷∗𝑉𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑖𝑠𝑘
𝐾𝐷∗𝑉𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑖𝑠𝑘+𝑉𝑣𝑎𝑛𝑑𝑖𝑔 (Ligning 2)
R = ekstraksjonsutbytte
Vorganisk = volum av organisk fase
Vvandig = volum av vandig fase
KD = fordelingskoeffisienten
For å forbedre selektiviteten kan det innføres et ekstra trinn som kalles for tilbake-ekstraksjon.
Analyttene ekstraheres først fra den vandige fasen til den organiske fasen. I det påfølgende
trinnet ekstraheres de tilbake til den andre vandige fasen som vanligvis er justert til en pH som
fremmer ionisering. Alle de nøytrale forbindelser blir værende igjen i den organiske fasen mens
de ioniserte vil diffundere ut. Tilbake-ekstraksjonen kan fjerne behovet for fordampning og
gjenoppløsning siden den vandige fasen med analyttene er kompatibel LC-MS (1).
De store fordelene med LLE er fleksibilitet og svært mange anvendelsesområder. Evnen til å gi
rene ekstrakter som fjerner de fleste forurensinger, muligheten for å oppnå konsentrerte prøver
og relativt god kostnadseffektivitet er andre eksempler på de positive sidene ved denne
teknikken. LLE er allikevel ikke fri for ulemper. Høyt forbruk av ofte toksiske løsemidler samt
problemer som emulsjonsdannelse er utfordringer som må overvinnes. Det er også fortsatt få
eksempler på automatisering av denne teknikken til tross for en del forsøk. Det gjør at teknikken
er arbeidskrevende (25). Et eksempel på automatisert LLE er supported liquid extraction (SLE).
11
Prøven overføres til brønner og adsorberes av kiselgur. Påfølgende tilsetting av organisk
løsemiddel tillater ekstraksjonen av analyttene. SLE kan utføres i 96-brønnsformat (1).
2.2.2. Væske-fase mikroekstraksjon
Disse ulempene var en av grunnene til utvikling av nye prøveopparbeidelsesteknikker i
miniatyrisert skala. LPME er en miniatyrisering av LLE og ble introdusert i midten av 1990-
tallet (5). Til tross for det var LLE og SPE fortsatt mye brukt i 2006 (4). Fra det tidspunktet ble
det publisert signifikant flere artikler som beskrev LPME for ekstraksjoner av legemidler fra
biologiske væsker (3). LPME kan utføres som single drop microextraction (SDME) og HF-
LPME. Den sistnevnte teknikken var et mellomtrinn i utviklingen av PALME (3, 8). Begrenset
forbruk av løsemidler, raskere opparbeidelse, automatiseringspotensiale og etter hvert grønn
kjemi var drivkraften bak utviklingen av disse nye teknikkene (3, 4).
HF-LPME er en teknikk som ble innført av Pedersen-Bjergaard og Rasmussen (6, 7). Den er
presentert i figur 2. I dette systemet omringer prøven, som kalles for donorfasen, et rør som er
laget av en porøs polymer. Polypropylen er et eksempel på materiale som brukes for slike
formål. Innsiden av røret er fylt med akseptorfasen som er fysisk adskilt fra donorfasen. En
egnet organisk løsning fanges i membranporene og danner en SLM (7). En organisk løsning
som akseptorfase brukes i to-fase-systemer mens en vandig løsning brukes i tre-fase-systemer.
Fordelingen av analytten i et tre-fase-system er representert i ligning 3 der kn er
ekstraksjonskonstanter (26).
𝐴𝑑𝑜𝑛𝑜𝑟
𝑘1
→←𝑘2
𝐴𝑆𝐿𝑀
𝑘3
→←𝑘4
𝐴𝑎𝑘𝑠𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟 (Ligning 3)
Figur 2 Illustrasjon av tre-fase HF-LPME
12
Justering av pH i donor- og akseptorfasen er påkrevet hvis en selektiv ekstraksjon av sure eller
basiske analytter er ønskelig. Løseligheten av analytten i donorfasen bør bli minst mulig for å
fremme distribusjonen til SLM. Analytten bør derimot bli godt løselig i akseptorfasen for å
fremme diffusjonen fra SLM. Riktig pH-justering hindrer også tilbake-ekstraksjon (7).
Konsentrasjon i akseptorfasen kan bli beskrevet av en kinetisk modell under forutsetning av at
massetransporten gjennom SLM er det hastighetsbegrensende trinnet som sikres av tilstrekkelig
omrøring av donorfasen. Det er representert i ligning 4. Det er en funksjon av tid som viser at i
tillegg til fordelingskoeffisienten og konsentrasjonen i donorfasen vil volumer i systemet spille
en avgjørende rolle på den endelige konsentrasjonen i akseptorfasen (27).
𝐶𝐴𝑖(𝑡) =
𝑉𝐷𝐶𝐷𝑖0 −𝐶𝐷𝑖
(𝑡)(𝑉𝐷+𝐾𝑑𝑖∗𝑉𝑚)
𝑉𝐴 𝑡 ≥ 𝑡𝑙𝑎𝑔 (Ligning 4)
CA = konsentrasjon i akseptorfasen
VD = volum av donorfasen
CD = konsentrasjon i donorfasen
Vm = volum av SLM
VA = volum av akseptorfasen
Kd = distribusjonskoeffisient
C0D = opprinnelig konsentrasjon i
donorfasen
t = tid
tlag = tidsforsinkelse
HF-LPME tillater flere modifikasjoner slik at denne teknikken åpner for mange
anvendelsesområder. Blant mange studier som beviste fleksibiliteten, fantes forsøk som
benyttet bæremolekyler for ekstraksjoner av polare stoffer eller belegg på membranen (kalt for
moleculary imprinted polymer coated hollow fibers) (13, 28, 29). Bæremolekyler komplekserer
med analyttene og danner et mer hydrofobt kompleks som er bedre løselig i den organiske fasen.
De dissosierer fra hverandre på grenseoverflaten mellom organisk- og akseptorfase slik at
analytten frigjøres mens bærer forblir i SLM (30).
HF-LPME krever små volumer av organisk løsemiddel, er relativt enkelt og billig i bruk og
ekstrakter egner seg for direkte injeksjon i kromatografiske instrumenter som eksempelvis LC-
MS. På tross av stor vitenskapelig interesse for HF-LPME har det vært utfordringer knyttet til
automatisering (31).
2.2.3. Parallel artificial liquid membrane extraction
PALME har mye felles med HF-LPME siden prinsipper bak transporten av analytten til
akseptorfasen er svært like. Den store forskjellen er geometrien til membranen som er tynnere
i forhold til HF-LPME og er flat. I tillegg er formatet av oppsettet basert på en plate med 96
brønner. De store fordelene med PALME er at teknikken er enklere å automatisere enn HF-
LPME og at mange prøver kan ekstraheres parallelt (8, 31).
13
PALME består av en donor- og en akseptorplate. Begge platene er i 96-brønnsformat.
Akseptorplaten er tildekket med et lokk for å hindre fordampning av akseptorfasen.
Illustrasjonen av utstyret er presentert i figur 3. Donorplaten er laget av polypropylen, og hver
brønn har et volum på 0,5 ml. Det optimale prøvevolumet ble funnet til å være 250 µl (8).
Akseptorplaten som finnes i samme format, har en porøs polyvinylidenfluorid (PVDF)
membran som forsegler bunnen av hver brønn. På denne måten blir begge fasene separert fra
hverandre når platene klemmes sammen (8). PVDF er ikke det optimale materialet, spesielt for
analytter i svært lave konsentrasjoner, siden utbytte og påliteligheten av resultater kan bli
forverret (8). Grunnen til det er ikke-spesifikke bindinger mellom analyttene og membranen.
For å dempe bidraget fra dem ble trioktylamin (TOA) tilsatt i noen av de tidligere prosjektene.
Det hadde som formål å hindre slike interaksjoner (8, 11). Andelen av TOA var ofte lav, for
eksempel 1% av den organiske fasen som immobiliseres i membranporene (11). Det vanlige
volumet av organisk løsemiddel som danner SLM, varierte i de fleste tilfeller mellom 3 og 5 µl
(32). Dets løselighet i de vandige fasene og flyktighet bør bli lavest mulig for å sikre høy
stabilitet av systemet. Det er relevant spesielt ved ekstraksjoner som kan ta opptil to timer (9,
32). Donorfasen er en blanding av en biologisk væske, en buffer som justerer til riktig pH og
demper ioniseringen av analyttene, og eventuelt en intern standard. Analyttene blir da ekstrahert
via SLM til akseptorfasen (32). Volum på 50 µl er vanlig siden det sikrer god oppkonsentrering
og er praktisk i bruk. Mindre volumer av akseptorfase er vanskeligere å håndtere ved pipettering
og øker faren for punktering av SLM med pipettespisser (8). Avhengig av egenskapene til
analyttene skal akseptorfasen bli riktig tilpasset for å sikre ionisering og diffusjon ut fra SLM.
For basiske analytter er det vanlig å bruke en sur akseptorfase der maursyre er en mulig kandidat
for slike formål. I tillegg til surgjøring har den god flyktighet og er dermed kompatibel med
LC-MS (32).
14
Figur 3 Illustrasjon av PALME til venstre og en enkel brønn til høyre
For å sikre kontakten mellom donorfasen og den organiske fasen blir de sammenklemte platene
ristet. Agitasjonen gjelder også akseptorfasen og sikrer tilstrekkelig masseoverføring i systemet
(8).
PALME er et nytt konsept innenfor prøveopparbeidelse som allerede har klart å bevise et bredt
spekter av anvendelsesområder. Denne teknikken klarte å ekstrahere både basiske og sure
legemidler (8, 9). Det ble også dokumentert at PALME var effektiv for opprensing av prøven
fra matrikskomponenter som eksempelvis fosfolipider (10). I likhet med HF-LPME er det en
utfordring å transportere polare analytter med log P under 1-2 enheter gjennom SLM. Nylig ble
det gjennomført forsøk med bæremolekyler som muliggjorde den transporten (12).
Elektromembranekstraksjon (Electromembrane extraction: EME) er en modifisert utvidelse av
PALME der den passive diffusjonen av analytter blir stimulert av elektrisk spenning som tillater
kortere ekstraksjonstider av analytter (33).
2.3. UHPLC
UHPLC er en type væskekromatografi som blir benyttet i stadig større grad (34). Den erstatter
gradvis sin forgjenger, high-pressure liquid chromatography (HPLC), som har den samme
oppbygningen. Mobilfasen fra reservoaret pumpes via injektor mot kolonnen der separasjonen
av analyttene finner sted. De separerte analyttene blir senere målt i en detektor som befinner
seg bak kolonnen (35). Den generelle oppbygningen av UHPLC instrumentet er vist i figur 4.
15
Figur 4 Generell oppbygning av UHPLC
Hovedfordelen med UHPLC ovenfor HPLC er mer robuste pumper som kan tåle trykk på inntil
1400 bar (1, 34). Muligheten for å pumpe med høyere trykk tillater bruk av
stasjonærfasepartikler i sub-2-µm størrelsesområde. Partiklene er således vesentlig mindre enn
i vanlig HPLC. Det er gunstig for oppnåelse av bedre effektivitet i systemet, som beskrives ved
hjelp av høydeekvivalenten til en teoretisk plate (HEPT) (36). Van Deemter plot i figur 5 viser
at mindre partikler selv ved høy hastighet av mobilfasen klarer å opprettholde relativt lave
HEPT-verdier.
Figur 5 van Deemter plot representerer endring av HEPT som en funksjon av økende mobilfasehastighet for ulike
partikkelstørrelser der 5 og 3.5 µm anvendes i HPLC, mens 1.5 µm i UHPLC (1)
16
De bør bli lave for å sikre høy effektivitet med mindre innflytelse av uønskede faktorer som
bidrar til båndspredning. Diffusjonen i mobilfasen (A), eddy diffusjon (B) og massetransporten
mellom stasjonær- og mobilfase (C), som er beskrevet nærmere i van Deemters ligning (ligning
5), er hovedfaktorer ved siden av mobilfasehastigheten (u) som kan påvirke HEPT (35).
𝐻𝐸𝑃𝑇 =𝐴
𝑢+ 𝐵 + 𝐶𝑢 (Ligning 5)
I UHPLC brukes ofte kolonner som er kortere, har mindre indre diameter og er pakket med
mindre partikler i forhold til kolonner i HPLC-instrumenter (34). Den radiale fortynningen blir
dermed mindre (ligning 6) i UHPLC slik at analytter blir eluert i mer konsentrerte bånd. Det vil
gi bedre signal på konsentrasjonsfølsomme detektorer (36, 37).
𝐷 =𝑐0
𝑐𝑚𝑎𝑥= 𝜀𝜋𝑟2(1 + 𝑘)√2𝜋𝐿𝐻/𝑣𝑖𝑛𝑗 (Ligning 6)
D = fortynning
c0 = konsentrasjonen i prøven
cmax = konsentrasjonen i detektoren
Ɛ = porøsitet
r = radius av kolonnen
L = lengden av kolonnen
H = platehøyden
Vinj = prøvevolumet som injiseres
k = konstant
I tillegg til forbedret sensitivitet oppnås lavere løsemiddelforbruk og kortere retensjonstider slik
at tiden som kreves for analyse, reduseres. Disse fordeler gjør at UHPLC separasjoner kan
utføres på kort tid, og at antall prøver som kan analyseres per time blir vesentlig høyere enn for
HPLC (38).
Begge instrumenter har utover det mange felles egenskaper. En av dem er stasjonærfasen. Det
finnes mange ulike materialer som kan gi forskjellige retensjonsmekanismer. Omvendt-fase-
kromatografi er et av de viktigste prinsippene. Den kan baseres på sfæriske partikler som er
laget av silika. De har ulike sidekjeder på overflaten. Oktadecyl, som også kalles for C18, er en
vanlig sidekjede. Det er en svært hydrofob stasjonærfase som har mange anvendelsesområder
(1, 36). Det er allikevel ikke mulig å feste C18-grupper på alle silanolgrupper på overflaten av
silikapartikler. Grunnen til det er sterisk hindring. Det resulterer i dannelsen av såkalte
restsilanolgrupper som kan føre til uønskede sekundære interaksjoner med basiske substanser.
Endcapping, det vil si derivatisering av disse gruppene, gjør at muligheten for slike reaksjoner
blir betydelig redusert (35). En annen viktig utfordring som er knyttet til silikabaserte materialer
17
er deres stabilitet i basisk eller svært surt miljø. Slike stasjonærfaser vil løses opp i pH under 2
og over pH 8. Det er dermed viktig å bruke mobilfaser som er justert til pH mellom 2 og 8 (35).
Mobilfasen inneholder dermed en buffer i lav konsentrasjon som gjør at miljøet blir surt og
stabiliteten til stasjonærfasen bevares. I tillegg spiller den en viktig rolle for retensjonen av
analytter med funksjonelle grupper som lar seg ionisere. De andre bestanddeler av mobilfasen
er vann og en organisk modifikator. Valg av organisk modifikator kan variere avhengig av
ønsket anvendelse og type detektor. Metanol er ofte brukt for slike formål på grunn av lave
kostnader og relativt lav toksisitet (1). Hvis stasjonærfasen baseres på C18-kjeder, bør det alltid
være minst 5% av organisk modifikator for å opprettholde tilstrekkelig påsetingskapasitet. På
denne måten sikres aktivisering av stasjonærfasen (36). Sammensetningen av mobilfasen kan
endres i løpet av analysen slik at elueringsstyrken blir påvirket. Det kalles for gradienteluering
og krever minst 2 reservoarer med mobilfasen og et egnet utstyr som kan blande dem sammen
i riktige proporsjoner. Den type eluering er egnet for analytter med lang retensjonstid. Ulempen
med gradienteluering er blant annet behov for reekvilibrering, det vil si at
mobilfasesammensetningen må tilbakeføres til den opprinnelige tilstanden for å sikre like
elueringsbetingelser for alle prøver (1).
Prøveløsninger injiseres i mobilfasen og separeres på kolonnen. Retensjonen og dermed
separasjonen er avhengig av fysikalsk-kjemiske egenskaper til analyttene. Retensjonen på
omvendt-fase-kromatografi blir i stor grad avhengig av svake men frekvente van der Waals-
krefter. De mest hydrofobe analyttene blir retardert kraftigere enn de mer hydrofile og vil
dermed ha lengre retensjonstider. Mengden av organisk modifikator kan økes for å bryte de
hydrofobe kreftene mellom analyttene og stasjonærfasen raskere slik at fordelingslikevekten
blir skyvet mot mobilfasen. Det vil bidra til kortere retensjonstider. På slutten av kolonnen bør
analyttene bli separert fra hverandre i smale bånd som overføres til detektor (1).
2.4. MS
UHPLC som er koblet sammen med MS er stadig mer brukt for bioanalyse deriblant
applikasjoner som er knyttet til legemiddelmetabolisme (15). De kromatografiske toppene som
dannes ved hjelp av UHPLC instrumenter, kan bli smale, og det er allment akseptert at en topp
bør bestå av minst 10 målepunkter for å gi grunnlag for pålitelige kvantifiseringsdata (34, 39).
Dette øker kravet til detektoren som må ha høyere dataoppsamlingsfrekvens (34).
18
Ionekilden, masseanalysator og detektor er tre hovedelementer i MS som muliggjør deteksjonen
av analytter (1). Hovedfokus i kommende avsnitt blir lagt på elektrospray-ionisering (ESI) som
ionekilden, lineær ionefelle (LIT) som masseanalysator og relevante deteksjonsmodus.
2.4.1. Elektrospray-ionisering
ESI er en vanlig ionekilde som benyttes for analytter som uttrykker polare egenskaper, og som
er mulige å ionisere. Den prosessen er vanligvis fremmet av riktig pH i mobilfasen som i tillegg
må bestå av flyktige komponenter for å kunne bli brukt i MS detektoren (1). Skjematisk
fremstilling av ESI er presentert i figur 6. Mobilfasen strømmer gjennom et kapillærrør som er
koblet til en spenningskilde. Vanligvis er det +5 eller -5 kV som gjør at aerosoldråpene som
dannes ved hjelp av nitrogengass, får ladning. Tilstrekkelig lav mobilfasehastighet må til for å
danne aerosol som vil bidra til optimal ionisering og sensitivitet. Disse dråpene vil gradvis
fordampe på sin vei mot masseanalysatoren. Det minkende overflatearealet vil ha samme antall
ladninger som den opprinnelige større dråpen. Prosessen vil fortsette helt frem til dråpen oppnår
Rayleigh-grensen. Det er det maksimale antall ladninger på en dråpe. Overskridelsen av denne
grensen fører til ustabilitet av dråpen og Coulomb-fisjon. I den prosessen dannes mindre dråper.
Til slutt er det kun ioner som er igjen når hele væsken fordamper. ESI blir brukt i positiv modus
for å detektere ioner som har positiv ladning (1, 40).
Figur 6 Skjematisk fremstilling av ESI
2.4.2. To-dimensjonal ionefelle
Ionefelle er en av flere tilgjengelige masseanalysatorer. De kan deles i to undergrupper som
består av 3D og 2D ionefeller. LIT er et eksempel på en 2D ionefelle (1). Den har høyere
kapasitet og klarer å fange ionene i betydelig større omfang i forhold til 3D. Den er sammensatt
av fire staver som ligner på en kvadrupol med den forskjellen at de er separert fra hverandre i
tre deler. Det er vist i figur 7. Ioner som strømmer inn fra ionekilden, blir fanget i den sentrale
19
delen av LIT. Det er mulig ved hjelp av riktig spenning som anvendes på begge ender av
ionefellen (41). Radiofrekvent (RF) spenning er ansvarlig for å felle ioner radialt, mens
likestrøm virker i den aksiale retningen. Helium, som er en kollisjonsgass, bremser ionene og
hjelper til å fange dem i den sentrale delen (1, 41). Resonansen brukes for å skyte ut alle
uønskede ioner fra LIT. Ioner som blir igjen i ionefellen, aktiveres, og ved hjelp av
resonanseksitasjonen skjer det en fragmentering (41). Økende spenning skyter ut ionene fra
ionefellen mot detektor der ioner med lavest m/z forlater fellen først. De treffer en
elektronmultiplikator som er en detektor. Betydelig forsterket signal blir til slutt omdannet til
et massespektrum av en egnet programvare (1).
Figur 7 Lineær ionefelle med radial utskyting av ioner
Beskrevet virkning av LIT relaterer til tandem MS. I dette systemet utføres to m/z-analyser som
følger etter hverandre. Det ønskede molekylionet blir først isolert fra de andre ved hjelp av
endring i radiofrekvensen og likestrøm. Etter fragmentering blir de spesifikke produktioner
analysert på MS2. LIT er en tandem-i-tid MS slik at alle operasjoner mellom ionisering og
deteksjon av ionet foregår på samme sted. Instrumentet kan virke i ulike modus, men størst
fokus blir lagt på det som kalles på engelsk for selected reaction monitoring (SRM). I SRM
dannes et nytt massespektrum med helt unike fragmenter fra et bestemt ion slik at metoden
sikrer høy spesifisitet og mye strukturelle informasjoner. I tillegg oppnås et mer gunstig forhold
mellom signal og støy slik at bakgrunnsstøyen blir lavere (42).
20
3. Materialer og metoder
3.1. Fysikalsk-kjemiske egenskaper av analytter
Tabell 1 presenterer fysikalsk-kjemiske egenskaper av alle analytter som ble benyttet i dette
prosjektet. Molekylstrukturer er tilgjengelige i figur 1.
Tabell 1 Fysikalsk-kjemiske egenskaper av analytter
Analytt
Molekylvekt
(g/mol)
Molekylformel pKa log P
Venlafaksin 277.40 C17H27NO2 9.26±0.28 2.48±0.27
O-desmetyl venlafaksin 263.38 C16H25NO2 9.33±0.28 1.74±0.26
N-desmetyl venlafaksin 263.38 C16H25NO2 10.44±0.20 2.55±0.26
N,O-didesmetyl
venlafaksin
249.35 C15H23NO2 10.59±0.20 1.81±0.26
N,N-didesmetyl O-
desmetyl venlafaksin
235.32 C14H21NO2 10.38±0.10 1.31±0.25
N,O-didesmetyl
venlafaksin glukuronid
425.47 C21H31NO8 COOH
2.78±0.70
NH
10.24±0.20
-0.69±0.47
N,N-didesmetyl O-
desmetyl venlafaksin
glukuronid
411.45 C20H29NO8 COOH
2.78±0.70
NH2
9.85±0.10
-1.19±0.46
Opplysninger er hentet fra www.scifinder.cas.org [12.03.2017] (43)
3.2. Utstyr
Tabell 2 viser alle komponenter av PALME. Det omfatter begge platene og aluminiumsfolie
som tildekket akseptorplaten.
Tabell 2 Utstyr for PALME
Komponent Beskrivelse Produsent By/Land
Akseptorplate med
lokk
MultiScreen®-IP
96-brønnsfilterplate
MAIPN4550, klar
styren, ikke steril,
med Immobilon®-P
PVDF membran,
porestørrelse 0.45
µm
Millipore Darmstadt,
Tyskland
21
Aluminiumsfolie Platemax®
Pierceable
Aluminum Sealing
Film
Axygen Inc. Union City, CA,
USA
Donorplate 96-brønnsplate med
0.5 ml brønner,
polypropylen
Agilent Santa Clara, CA,
USA
Engangsutstyr som ble benyttet i løpet av prøveopparbeidelsen samt senere trinn av
analyseprosessen er vist i tabell 3.
Tabell 3 Forbruksmateriell og engangsutstyr
Utstyr Beskrivelse Produsent By/Land
Autosampler
glassvialer
Vial Screw Neck N10-1.5, c,
11.6x32, flat
Nerliens
Meszansky
AS
Oslo, Norge
Dramglass Vials, glass, rolled rim, with
plastic snap-cap, 10 ml
VWR
International
Radnor, PA, USA
Eppendorfrør Microcentrifuge tubes 1.5 ml
med lokk, polypropylen
BRAND
GMBH + CO
KG
Wertheim,
Tyskland
Filtreringsvialer Syringeless Filter Device Mini-
UniPrep™, PTFE filter media
with polypropylene housing,
porestørrelse 0.2 µm
GE Healthcare Buckinghamshire,
England
Glassvialer for
organisk fase
Clear 2ml Screw Top Vial
12 x 32
Supelco Bellefonte, PA,
USA
Innsats til vialer Mikroinnsats, klart glass,
15 mm topp, 0.1 ml, 31 x 6 mm
VWR
International
Radnor, PA, USA
Kork til vialer 9mm PPShrtThrdCp, trans,
PTFEvirginal, 53°D, 0.2mm
Nerliens
Meszansky
AS
Oslo, Norge
Kork til vialer
med organisk fase
8mm Open Top Screw Cap, 8-
425 thread, 5mm hole,
polypropylene, septum hvit
silikon/rød PTFE
Thermo
Scientific
San Jose, CA,
USA
Løsemiddel
reservoar
VWR Reagent Reservoir, 25
ml, PS, ikke steril
VWR
International
Radnor, PA, USA
pH-papir Universalindikator pH 0-14 Merck KGaA Darmstadt,
Tyskland
Urinbeger Steril, 100 ml, polypropylen VWR
International
Radnor, PA, USA
22
Pipetter og tilhørende utstyr som ble benyttet i dette prosjektet er vist i tabell 4.
Tabell 4 Pipetter
Utstyr Beskrivelse Produsent By/Land
Mekanisk multikanal
pipette med justerbart
volum og 8 kanaler
mLINE 5-100 µl, 30-300 µl Sartorius Göttingen,
Tyskland
Mekanisk pipette med
justerbart volum
Sartorius mLINE 0.5-10 µl, 2-20
µl, 10-100 µl, 20-200 µl, 100-
1000 µl, 500-5000 µl
Sartorius Göttingen,
Tyskland
Pipettespisser Optifit Refill Tips 0.1-10 µl, 0.5-
200 µl, 5-350 µl, 10-1000 µl,
100-5000 µl, ikke steril
Sartorius Göttingen,
Tyskland
Stepper Eppendorf Multipette® Plus Eppendorf AG Hamburg,
Tyskland
Tabell 5 presenterer analyseinstrumenter inkludert kolonnen, gass og programvaren som var
uforandrete variabler.
Tabell 5 Analyseutstyr
Utstyr Beskrivelse Produsent By/Land
Gass Helium 6.0 Ultra Plus Yara Praxair Oslo, Norge
Kolonne Acquity UPLC® HSS T3 kolonne, 100 mm
x 2.1 mm ID, partikkelstørrelse 1.8 μm og
porestørrelse 100 Å
Waters Wexford,
Irland
LC Dionex UltiMate 3000 RS Pump, Column
Compartment og Autosampler
Thermo
Scientific
San Jose,
CA, USA
MS Thermo Scientific LTQ XL Linear Ion Trap
Mass Spectrometer
Thermo
Scientific
San Jose,
CA, USA
Programvaren Xcalibur version 2.2. SP1.48 Thermo
Scientific
San Jose,
CA, USA
Elektroniske instrumenter som ble benyttet i ulike trinn av dette prosjektet er vist i tabell 6.
Tabell 6 Diverse utstyr
Utstyr Beskrivelse Produsent By/Land
Analysevekt Mettler AE200 Mettler-Toledo
International Inc.
Columbus, OH,
USA
Analysevekt 2 Mettler Toledo
XS205 Dual Range
Mettler-Toledo
International Inc.
Columbus, OH,
USA
23
Ovn Series FD Binder Tuttlingen, Tyskland
pH-meter 744 pH meter Metrohm Herisau, Sveits
Ristemaskin Heidolph Vibramax
100
Heidolph
Instruments GmbH
& Co.KG
Schwabach,
Tyskland
Vortexmaskin IKA® MS 3 digital IKA®-Werke GmbH
& Co. KG
Staufen, Tyskland
3.3. Kjemikalier
Tabell 7 presenterer identifikasjons- og kvalitetsdata av alle analyttene og intern standard.
Tabell 7 Referansestoffer
Analytt Chemical
Abstracts
Service (CAS)
nummer
Renhet Produsent By/Land
Venlafaksin
hydroklorid
99300-78-4 ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich St. Louis, MO,
USA
O-desmetyl
venlafaksin
93413-62-8 ≥98.5%
(HPLC)
Sigma-Aldrich St. Louis, MO,
USA
N-desmetyl
venlafaksin
149289-30-5 97% Toronto
Research
Chemicals
Toronto, ON,
Canada
N,O-didesmetyl
venlafaksin
135308-74-6 98% Toronto
Research
Chemicals
Toronto, ON,
Canada
N,N-didesmetyl
O-desmetyl
venlafaksin
hydroklorid
135308-76-8 98% Toronto
Research
Chemicals
Toronto, ON,
Canada
N,O-didesmetyl
venlafaksin
glukuronid
hydroklorid
1021933-99-2 80% Toronto
Research
Chemicals
Toronto, ON,
Canada
N,N-didesmetyl
O-desmetyl
venlafaksin
glukuronid
1799830-07-1 95% Toronto
Research
Chemicals
Toronto, ON,
Canada
Venlafaksin-D6
hydroklorid
1062606-12-5 Certified
reference
material
Sigma-Aldrich
St. Louis, MO,
USA
24
Alle organiske løsemidler og ioniske væsker som ble testet i dette prosjektet er vist i tabell 8.
Tabell 8 Organiske løsemidler og ioniske væsker
Kjemikalie CAS nummer Renhet Produsent By/Land
1-Butyl-1-metylpyrrolidinium
bis(trifluorometylsulfonyl)
imid
223437-11-4 High
purity
Merck
KGaA
Darmstadt,
Tyskland
1-Heksyl-3-
metylimidazolium
heksafluorofosfat
304680-35-1 99% Merck
KGaA
Darmstadt,
Tyskland
1-Heksyl-3-
metylimidazolium
tris(pentafluoroetyl)
trifluorofosfat
713512-19-7 High
pure
Merck
KGaA
Darmstadt,
Tyskland
1-Metyl-3-oktylimidazolium
heksafluorofosfat
304680-36-2 99% Merck
KGaA
Darmstadt,
Tyskland
1-Metyl-3-oktylimidazolium
tetrafluoroborat
244193-52-0 99% Merck
KGaA
Darmstadt,
Tyskland
2-nitrofenyloktyleter
(NPOE)
37682-29-4 99% Sigma-
Aldrich
St. Louis, MO,
USA
Bis(2-etylheksyl)fosfitt 3658-48-8 96% Sigma-
Aldrich
St. Louis, MO,
USA
Dekanol 112-30-1 min
98%
Sigma-
Aldrich
St. Louis, MO,
USA
Dibenzylfosfitt 17176-77-1 NA Sigma-
Aldrich
St. Louis, MO,
USA
Diheksyleter 112-58-3 97% Sigma-
Aldrich
St. Louis, MO,
USA
Dodecylacetat 112-66-3 ≥98% Sigma-
Aldrich
St. Louis, MO,
USA
Pentylbenzen 538-68-1 99% Sigma-
Aldrich
St. Louis, MO,
USA
Tributylfosfat 126-73-8 ≥99% Sigma-
Aldrich
St. Louis, MO,
USA
Triisodecylfosfitt 25448-25-3 NA Sigma-
Aldrich
St. Louis, MO,
USA
Trioktylamin 1116-76-3 NA Cognis
Corporation
Cincinnati,
OH, USA
Tripentylfosfat 2528-38-3 min
97%
STREM
Chemicals
Newburyport,
MA, USA
Tris(2-etylheksyl)fosfat 78-42-2 ≥98% Sigma-
Aldrich
St. Louis, MO,
USA
25
Tris(2-etylheksyl)fosfitt 301-13-3 NA Sigma-
Aldrich
St. Louis, MO,
USA
NA = verdien er ikke tilgjengelig
Tabell 9 presenterer alle ioniske bærere som ble benyttet i dette prosjektet.
Tabell 9 Ioniske bærere
Kjemikalie CAS nummer Renhet Produsent By/Land
Aliquat 336 68603-15-6 NA Cognis
Corporation
Cincinnati,
OH, USA
Dodecyltrimetyl
ammoniumbromid
1119-94-4 approx. 99% Sigma-Aldrich St. Louis, MO,
USA
Tetrabutyl
ammoniumfosfat
5574-97-0
>97% Sigma-Aldrich St. Louis, MO,
USA
Tetradecyl
ammoniumbromid
14937-42-9 >99% Sigma-Aldrich St. Louis, MO,
USA
Tetraetyl
ammoniumbromid
71-91-0 min 99% Sigma-Aldrich St. Louis, MO,
USA
NA = verdien er ikke tilgjengelig
Tabell 10 presenterer kjemikalier som ble benyttet ved tillaging av mobilfaser, buffere og
modifiserte akseptorfaser.
Tabell 10 Diverse stoffer
Kjemikalie CAS
nummer
Renhet Produsent By/Land
Dimetylsulfoksid 67-68-5 min 99.5% Merck KGaA Darmstadt,
Tyskland
Kaliumjodid 7681-11-0 min 99.5% Merck KGaA Darmstadt,
Tyskland
Kaliumklorid 7447-40-7 min 99.5% Merck KGaA Darmstadt,
Tyskland
Magnesiumnitrat
heksahydrat
13446-18-9 min 99% Merck KGaA Darmstadt,
Tyskland
Maursyre 64-18-6 For mass
spectrometry,
98%
Sigma-Aldrich St. Louis,
MO, USA
Metanol 67-56-1 Hypergrade
for LC-MS
Merck KGaA Darmstadt,
Tyskland
Natriumbikarbonat 144-55-8 Pro analysi
min 99.5%
Merck KGaA Darmstadt,
Tyskland
26
Natriumdihydrogenfosfat
monohydrat
10049-21-5 99-102%
ACS Reag Ph.
Eur
Merck KGaA Darmstadt,
Tyskland
Natriumhydrogenfosfat
dihydrat
10028-24-7 99-102%
ISO Reag Ph.
Eur
Merck KGaA Darmstadt,
Tyskland
Natriumhydroksid 1310-73-2 99.3% VWR
International
Radnor, PA,
USA
Natriumjodid 7681-82-5 NA Sigma Aldrich St. Louis,
MO, USA
Natriumkarbonat 497-19-8 Pro analysi
min 99.9%
Merck KGaA Darmstadt,
Tyskland
Natriumklorid 7647-14-5 min 99.5% Merck KGaA Darmstadt,
Tyskland
Trifluoreddiksyre 76-05-1 ReagentPlus®
99%
Sigma-Aldrich St. Louis,
MO, USA
Urea 57-13-6 min 99.5% Merck KGaA Darmstadt,
Tyskland
Renset vann MilliQ water
purification
system
Ultrapure
water (type 1)
Millipore Molsheim,
Frankrike
NA = verdien er ikke tilgjengelig
3.4. Løsninger og buffere
3.4.1. Tillaging av buffere
Det ble brukt fosfat og bikarbonat-karbonatbuffere i forsøk. De hadde som formål å tilpasse pH
til ønsket verdi i donorfasen. Buffere som er beskrevet i dette avsnittet ble tilberedt på bakgrunn
av tabeller som finnes i vitenskapelig litteratur (44).
Tillaging av bikarbonat-karbonatbuffer med bestemte pH-verdier
500 ml 0.1 M natriumkarbonat løsning
5.2992 g av natriumkarbonat ble oppløst til 500 ml med renset vann.
500 ml 0.1 M natriumbikarbonat løsning
4.2009 g av natriumbikarbonat ble oppløst til 500 ml med renset vann
Disse løsninger ble deretter blandet med hverandre i oppgitte forhold. Styrken på alle buffere i
Tabell 11 er 0.1 M.
27
Tabell 11 Bikarbonat-karbonatbuffer – pH
pH Natriumbikarbonat Natriumkarbonat
Buffer 1 9.4 80 ml 20 ml
Buffer 2 9.5 70 ml 30 ml
Buffer 3 9.8 60 ml 40 ml
Buffer 4 9.9 50 ml 50 ml
Buffer 5 10.1 40 ml 60 ml
Buffer 6 10.3 30 ml 70 ml
Buffer 7 10.5 20 ml 80 ml
Tillaging av fosfatbuffer
100 ml 0.2 M natriumdihydrogenfosfat
2.7802 g av natriumdihydrogenfosfat monohydrat ble oppløst til 100 ml med renset vann
100 ml 0.2 M natriumhydrogenfosfat
3.5629 g av natriumhydrogenfosfat dihydrat ble oppløst til 100 ml med renset vann
19 ml av natriumdihydrogenfosfat ble blandet med 81 ml av natriumhydrogenfosfat. Den
blandingen ble deretter fortynnet med 100 ml renset vann. Den endelige fosfatbufferen hadde
styrke på 0.1 M, 200 ml volum og 7.4 pH-enheter.
Tillaging av bikarbonat-karbonatbuffer med bestemte styrke
Det ble veid bestemte mengder av natriumbikarbonat og natriumkarbonat som vist i
tabell 12. De ble senere overført til målekolber som ble fylt til 100 ml med renset vann.
Buffer med styrke på 0.1 M ble ikke tatt med i betraktning siden den var tilgjengelig
fra før. Alle buffere representerer forhold 20:80 mellom henholdsvis natriumbikarbonat
og natriumkarbonat. De hadde dermed lik pH på 10.5 enheter.
Tabell 12 Bikarbonat-karbonatbuffer – styrke
Buffer styrke (M) Natriumbikarbonat (g) Natriumkarbonat (g)
0.25 0.4200 2.1175
0.5 0.8401 4.2354
0.75 1.2607 6.3555
1 1.6810 8.4779
28
3.4.2. Løsninger
Maursyreløsninger
I tabell 13 presenteres fremgangsmåten som ble brukt for tilbereding av alle maursyreløsninger.
Tabell 13 Maursyreløsninger med ulike styrker fra 1 mM til 200 mM
Styrke (mM) Tilberedelsesmetode
1 20 ml av 5 mM maursyreløsning ble blandet med 80 ml av renset vann
5 50 ml av 10 mM maursyreløsning ble blandet med 50 ml av renset vann
10 37.7 µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann
20 75.5 µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann
50 189 µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann
75 283 µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann
100 377 µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann
150 566 µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann
200 755 µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann
1 M NaOH-løsning
3.2555 g NaOH ble oppløst i 81.4 ml renset vann
Organiske løsninger
På grunn av et stort antall organiske løsemidler oppgis kun en generell beskrivelse av
fremgangsmåten som ble anvendt i alle tilfellene. Det gjelder både for blandinger av organiske
løsemidler samt blandinger med ioniske bærere. Alle blandinger baseres på (w/w) forholdet der
komponenten med lavest vekt ble veid først. Analysevekten (Mettler AE200) ble benyttet i alle
tilfeller.
Trifluoreddiksyreløsninger (TFA)
Tabell 14 presenterer fremgangsmåten for trifluoreddiksyreløsninger med tre ulike styrker.
Tabell 14 Trifluoreddiksyreløsninger med ulike styrker fra 50 mM til 150 mM
Styrke (mM) Tilberedelsesmetode
50 383 µl konsentrert TFA ble oppløst til 100 ml med renset vann
100 765 µl konsentrert TFA ble oppløst til 100 ml med renset vann
150 1148 µl konsentrert TFA ble oppløst til 100 ml med renset vann
29
Maursyreløsninger med DMSO
I tabell 15 presenteres forhold mellom maursyreløsninger og dimetylsulfoksid i en 10 ml
målekolbe.
Tabell 15 Løsninger av maursyre med DMSO i ulike forhold
DMSO (%) Tilberedelsesmetode
25 20 mM maursyreløsning tilsatt 25% DMSO (v/v)
50 20 mM maursyreløsning tilsatt 50% DMSO (v/v)
75 20 mM maursyreløsning tilsatt 75% DMSO (v/v)
«Kunstig urin»
«Kunstig urin» er en blanding av natrium- og kaliumklorid med eller uten urea. Det er
forbindelser som forekommer i størst mengde. Data i tabell 16 viser innveide mengder av
forbindelser som ble oppløst i 100 ml vann der mengden av Na+, Cl-, K+ og urea varierer.
Mengden av Na+, Cl- og K+ holdes konstant i løsninger med og uten urea. Mengder ble basert
på rapporten som ble utarbeidet av Putnam (23).
Tabell 16 Mengden av Na+, Cl-, K+ og urea i «kunstig urin»
Uten urea Med urea
Høy andel Na+, Cl- og K+ NaCl 0.9729 g 0.9695 g
KCl 0.4638 g 0.4647 g
Urea - 2.328 g
Middels andel Na+, Cl- og K+ NaCl 0.6444 g 0.6447 g
KCl 0.3150 g 0.3159 g
Urea - 1.630 g
Lav andel Na+, Cl- og K+ NaCl 0.2987 g 0.3006 g
KCl 0.1551 g 0.1562 g
Urea - 0.9286 g
Motioner i maursyreløsning
I tabell 17 presenteres fire motioner hvorav tre har ulike styrker. Løsninger ble forberedt ved å
oppløse den veide mengden av motioner med 20 mM maursyreløsning i en 10 ml målekolbe.
Hver konsentrasjon av hvert motion ble laget som en separat løsning.
30
Tabell 17 Mengden av motioner med ulik styrke i 20 mM maursyreløsning
Styrke (M) KI Mg(NO3)2*6H20 NaI NaCl
0.1 0.166 g 0.256 g 0.150 g -
0.5 0.830 g 1.28 g 0.750 g -
1 1.66 g 2.56 g 1.50 g 0.585g
3.4.3. Stamløsninger
Analytter ble veid ved hjelp av Mettler Toledo XS2015 Dual Range, og en bestemt mengde av
metanol ble brukt for å oppløse dem til en konsentrasjon på 1 mg/ml. N,O-didesmetyl
venlafaksin glukuronid er et unntak som ble oppløst til konsentrasjon på 0.8 mg/ml.
Disse løsninger ble oppbevart ved -24oC.
3.4.4. Arbeidsløsninger
Arbeidsløsninger ble laget direkte fra stamløsninger. 100 µl av hver analytt og 125 µl av N,O-
didesmetyl venlafaksin glukuronid ble pipettert til en målekolbe som ble deretter fylt opp til 10
ml med renset vann. Blandingen av analytter ble deretter fordelt i eppendorfrør. Hvert rør
inneholdt 500 µl av arbeidsløsningen med en konsentrasjon på 10 µg/ml.
Arbeidsløsninger ble benyttet for tillaging av analyttblandinger for både vandige og biologiske
prøveløsninger.
Arbeidsløsninger ble oppbevart ved -24oC.
3.4.5. Standarder
Standarder ble laget fra arbeidsløsninger. Et bestemt volum av arbeidsløsningen ble pipettert
over til målekolben med et volum på 5 eller 10 ml. Kolben ble deretter fylt med renset vann
opptil målestreken. Etter at løsningen ble ristet godt, ble den pipettert til innsats som ble plassert
inn i vialer til UHPLC.
Standarder ble oppbevart ved -24oC.
3.4.6. Internstandard
Venlafaksin-D6 hydroklorid representert i figur 8 var en ferdiglaget kommersielt tilgjengelig
intern standard som ble benyttet i dette prosjektet. Det var en løsning i metanol med en
konsentrasjon på 100 µg/ml.
31
Intern standard ble oppbevart ved -24oC.
Figur 8 Molekylstruktur til venlafaksin-D6 hydroklorid
3.4.7. Biologisk matriks
Urin ble samlet fra forskjellige donorer på Farmasøytisk Institutt. Urinen ble enten umiddelbart
brukt eller oppbevart i kjøleskapet mellom 2oC og 8oC.
3.4.8. Mobilfaser
Mobilfase A
716 µl konsentrert maursyre blandes med 950 ml renset vann. 950 ml 20 mM av
maursyreløsning blandes deretter med 50 ml metanol.
Mobilfase B
38 µl konsentrert maursyre blandes med 50 ml renset vann. 50 ml 20 mM av
maursyreløsning blandes deretter med 950 ml metanol.
Mobilfase C/D
500 ml renset vann blandet sammen med 500 ml metanol.
Seal wash
450 ml renset vann blandet sammen med 50 ml metanol.
3.5. Instrumentelle betingelser
3.5.1. UHPLC
UHPLC, kolonnen og programvaren som ble benyttet i dette prosjektet, er beskrevet i tabell 5.
Metoden benyttet gradienteluering av mobilfase A og B. Den er beskrevet i tabell 18.
Temperaturen var innstilt til 40oC i løpet av hele sekvensen. Injeksjonsmetoden var partial loop
og injeksjonsvolumet var 2 µL.
32
Tabell 18 Forholdet mellom mobilfase A og B i løpet av gradienteluering
Tid (min) Mobilfase A
(%)
Mobilfase B
(%)
Mobilfase
hastighet
(mL/min)
Kurve
0 70 30 0.3 5
1.5 55 45 0.3 5
1.6 40 60 0.3 5
3.5 35 65 0.3 5
3.6 0 100 0.3 5
6.5 0 100 0.3 5
6.6 70 30 0.3 5
10 70 30 0.3 5
3.5.2. MS/MS
Deteksjon med MS/MS som nevnes i tabell 5, var innstilt til følgende parametere fra tabell 19.
Tabell 19 Innstillinger av MS/MS
Kapillærspenning Segment 1 Segment 2 Segment 3
38 V 32 V 35 V
Tube lens Segment 1 Segment 2 Segment 3
110 V 105 V 145 V
Kapillærtemperatur 275oC
Sheath gas flow rate 26 arb
Sprayspenning 4.5 kV
Forstøvergass Nitrogen
Tørkegass Nitrogen
Ionisering Positiv modus
Type scan SRM
Deteksjonen ble delt opp i tre segmenter. Oppdeling hjelper å oppnå flere punkter som danner
en topp. Grunnen til det er at kun valgte overganger blir scannet i bestemte segmenter mens det
ikke blir tatt hensyn til de andre. Første segment falt mellom 0 min og 1.80 min, den andre
mellom 1.80 min og 3 min og den tredje mellom 3 min og 10 min. Mobilfasen ble ikke
introdusert til MS i løpet av de første 0.5 min og etter 6.5 min.
SRM-overganger for alle analytter er presentert i tabell 20.
33
Tabell 20 SRM-overganger
Analytt SRM overgang Kollisjonsenergi
(%)
Segment
Forløper Fragment
Venlafaksin
hydroklorid
278.17 260.14 24 3
O-desmetyl
venlafaksin
264.16 246.10 34 2
N-desmetyl
venlafaksin
264.16 246.10 34 3
N,O-didesmetyl
venlafaksin
250.12 232.08 24 2
N,N-didesmetyl
O-desmetyl
venlafaksin
hydroklorid
236.06 218.05 22 2
N,O-didesmetyl
venlafaksin
glukuronid
hydroklorid
426.25 408.21 20 1
N,N-didesmetyl
O-desmetyl
venlafaksin
glukuronid
412.20 364.15 25 1
Venlafaksin-D6
hydroklorid
284.28 266.70 19 3
3.6. Utførelse av PALME
PALME ble benyttet for å utføre ekstraksjoner av analytter fra vandige (analyttblanding i vann)
og biologiske (analyttblanding i urin) prøveløsninger. De biologiske prøveløsninger var urin.
Illustrasjon av PALME er vist i figur 3 mens utstyrs detaljer er beskrevet i tabell 2.
3.6.1. Vandige prøveløsninger
Donorfasevolumet var alltid 250 µl. Intern standard ble ikke brukt i forsøk med vandige
prøveløsninger. Arbeidsløsningen med en konsentrasjon på 10 µg/ml ble fortynnet med renset
vann og NaOH-løsning til 200 ng/ml. Styrken av NaOH var justert til 10 mM. Løsningen ble
deretter overført til et løsemiddelreservoar, og denne blandingen ble pipettert over i
donorbrønnene ved hjelp av en multikanalpipette. Etter hvert ble NaOH erstattet med
bikarbonat-karbonatbuffer. Da ble det tilsatt 125 µl buffer til 125 µl av analyttblandingen.
Analyttkonsentrasjoner i donorfasen forble som før på 200 ng/ml.
34
Den organiske fasen ble pipettert ut på PVDF-membranen fra donorplatesiden. Tabell 21
representerer løsemidler som ble testet i SLM. Volumet på 4 µl ble pipettert på membranen.
Det gjaldt alle løsemidler som ble brukt for å danne SLM. De fordelte seg og ble immobilisert
innen 60 sek. Etter den tiden ble SLM klar for bruk.
Akseptorfasen var maursyre med og uten DMSO og trifluoreddiksyre. De ulike styrkene og
forhold er presentert i tabell 21. Akseptorfasene ble også overført til et løsemiddelreservoar og
pipettert ved hjelp av en multikanalpipette i akseptorbrønnene. De ble fylt med 50 µl.
Volumforskjellen mellom donor og akseptor muliggjorde oppkonsentrering av analyttene med
faktor fem når overnevnte volumer ble brukt. Aluminiumsfolie ble limt nøye på toppen av
akseptorplaten. Det hadde som formål å begrense eventuell fordampning av akseptorfasen.
Donorplaten som ble klemt godt sammen med akseptorplaten med aluminiumsfolien på toppen,
ble festet på ristemaskinen Vibramax 100 slik at platene var ubevegelige. Ristefrekvensen var
alltid innstilt til 900 rpm. Alle ekstraksjoner foregikk i 45 min.
Ristingen ble stoppet nøyaktig etter 45 min. Aluminiumsfolien ble fjernet, og
multikanalpipetten med volum innstilt til 50 µl ble brukt for å pipettere mest mulig av
akseptorfasen over i innsats. Akseptorplaten ble holdt på skrå for å gjøre pipetteringen enklere
og redusere sjansen for punktering av membranen, noe som ville medført tap av akseptorfasen.
Innsats ble deretter plassert i UHPLC vialer.
Tabell 21 Oversikt over betingelser som ble brukt for vandige prøveløsninger
Donorfasen 250 µl analyttblanding i 10 mM NaOH
125 µl 0.1 M buffer + 125 µl analyttblanding
Buffer pH: 9.4, 9.5, 9.8, 9.9, 10.1, 10.3, 10.5
Akseptorfasen 20, 100, 200 mM maursyreløsning
20 mM maursyreløsning med 25, 50 eller 75% DMSO
50, 100, 150 mM trifluoreddiksyreløsning
Organisk fase Dodecylacetat
Diheksyleter
Pentylbenzen
NPOE
Bis(2-etylheksyl)fosfitt
Tributylfosfat
Dekanol
1-Butyl-1-metylpyrrolidinium bis(trifluorometylsulfonyl)
imid
35
1-Heksyl-3-metylimidazolium heksafluorofosfat
1-Metyl-3-oktylimidazolium heksafluorofosfat
1-Metyl-3-oktylimidazolium tetrafluoroborat
1-Heksyl-3-metylimidazolium tris(pentafluoroetyl)
trifluorofosfat
Tris(2-etylheksyl)fosfat
Tris(2-etylheksyl)fosfitt
Triisodecylfosfitt
Dibenzylfosfitt
Tripentylfosfat
Ioniske bærere Tetradecylammoniumbromid
Dodecyltrimetylammoniumbromid
Tetraetylammoniumbromid
Tetrabutylammoniumfosfat
Aliquat 336
3.6.2. Biologiske prøveløsninger
Urin erstattet renset vann i optimaliseringsfasen av prosjektet samt evaluering. Intern standard
ble benyttet i tillegg. Det endelige donorfasevolumet var 250 µl i likhet med vandige
prøveløsninger. Det var sammensatt av 115 µl buffer, 10 µl intern standard og 125 µl av en
analyttblanding som ble laget i urin. Analyttene og intern standard hadde en konsentrasjon på
200 ng/ml i donorfasen. I noen forsøk ble konsentrasjonen av analytter endret. Konsentrasjonen
av dem ble senket ned til 0.05 ng/ml i donorfasen. Bikarbonat-karbonatbuffer hadde som formål
å justere pH fra 9.8 til 10.5, og den hadde varierende styrke fra 0.1 M til 1 M. Ristefrekvensen
var 900 rpm i alle forsøk. Ekstraksjonstiden var 45 min for de fleste forsøk.
Unntaket var forsøk som dannet grunnlaget for tidskurven. De syv målepunktene var spredt
mellom 15 og 180 min. Både akseptor- og donorfasen ble analysert. Siden donorfasen besto
delvis av urin, måtte den filtreres før overføring til innsats. Det ble gjort ved hjelp av vialer med
filter fra GE Healthcare (Buckinghamshire, England).
Maursyre i konsentrasjonsområdet 1-200 mM ble testet. Volumet forble 50 µl. I enkelte forsøk
ble det tilsatt NaCl, KI, Mg(NO3)2 eller NaI til akseptorfasen. De tre sistnevnte hadde ulike
styrker som varierte mellom 0.1 M og 1 M. NaCl styrken var 1 M.
36
I et enkelt forsøk ble urinen i donorfasen erstattet av «kunstig urin», som beskrevet under avsnitt
3.4.2. om løsninger. Den hadde samme volum og analyttblandingen ble tilsatt på samme måte
som til urinen.
Volumet av den organiske fasen forble uendret i forhold til ekstraksjoner fra vandig miljø. Den
ble blandet med ioniske bærere for å finne det optimale forholdet.
Alle andre operasjoner ble lik som ved ekstraksjoner fra vandige prøveløsninger.
Tabell 22 Oversikt over betingelser som ble brukt for biologiske prøveløsninger
Donorfasen 115 µl (bikarbonat-karbonat eller fosfat) buffer + 10 µl intern
standard + 125 µl analyttblanding
115 µl NaOH + 10 µl intern standard + 125 µl analyttblanding
125 µl buffer + 125 µl analyttblanding
Akseptorfasen 1, 5, 10, 20 ,50, 75, 100, 150, 200 mM maursyreløsning
1 M NaCl, 0.1, 0.5, 1 M KI, Mg(NO3)2 og NaI
Organisk fase Tripentylfosfat med og uten 1% trioktylamin
Ioniske bærere Aliquat 336
Tetradecylammoniumbromid
Ekstraksjonstid 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180 min
3.7. Utvelgelse av SLM
Valg av det mest egnete løsemidlet for SLM ble gjennomført med vandige prøveløsninger. De
ulike delforsøk er presentert i tabell 23. Suksesskriteriet var utbytte av analyttene. Den største
vekten ble lagt på utbytter av de mest hydrofile stoffene som er vanskeligst å ekstrahere.
Konsentrasjonen av analyttene i alle forsøk ble justert til 200 ng/ml i donorfasen.
Standarder hadde konsentrasjonene på 50, 200, 500 og 1000 ng/ml. Hver konsentrasjon besto
av fire paralleller.
Delforsøk ble kjørt på ulike dager.
Tabell 23 Organiske løsemidler som ble brukt for å finne den optimale SLM
Med 1% trioktylamin (w/w) Uten trioktylamin
Delforsøk 1 (n=5) Dodecylacetat Dodecylacetat
Delforsøk 2 (n=5) Dodecylacetat
Diheksyleter Diheksyleter
Pentylbenzen Pentylbenzen
NPOE NPOE
37
Bis(2-etylheksyl)fosfitt Bis(2-etylheksyl)fosfitt
Tributylfosfat Tributylfosfat
Dekanol Dekanol
Delforsøk 3 (n=5) Dodecylacetat
1-Butyl-1-metylpyrrolidinium
bis(trifluorometylsulfonyl)
imid
1-Heksyl-3-metylimidazolium
heksafluorofosfat
1-Heksyl-3-metylimidazolium
heksafluorofosfat
1-Metyl-3-oktylimidazolium
heksafluorofosfat
1-Metyl-3-oktylimidazolium
heksafluorofosfat
1-Metyl-3-oktylimidazolium
tetrafluoroborat
1-Metyl-3-oktylimidazolium
tetrafluoroborat
1-Heksyl-3-metylimidazolium
tris(pentafluoroetyl)
trifluorofosfat
Delforsøk 4 (n=4) Tributylfosfat
Tris(2-etylheksyl)fosfat Tris(2-etylheksyl)fosfat
Tris(2-etylheksyl)fosfitt Tris(2-etylheksyl)fosfitt
Triisodecylfosfitt Triisodecylfosfitt
Dibenzylfosfitt Dibenzylfosfitt
Delforsøk 5 (n=4) Tributylfosfat
Tripentylfosfat
Delforsøk 1, 2 og 3 hadde fem paralleller av hver SLM. I delforsøk 2 og 3 ble dodecylacetat
med 1% trioktylamin valgt som et sammenligningssystem. Alle analyser i disse forsøkene ble
gjort med vandige løsninger der donorfasen inneholdt 10 mM NaOH.
Delforsøk 4 og 5 brukte tributylfosfat som et sammenligningssystem. De ble utført med fire
paralleller. Donorfasen i disse analysene var justert med bikarbonat-karbonatbuffer istedenfor
NaOH. Akseptorfasen var 50 µl 20 mM maursyre i alle delforsøk.
3.8. Optimalisering av ekstraksjonen
De optimaliserte parameterne ble benyttet i de etterfølgende forsøkene til tidspunktet der alle
testede ekstraksjonsbetingelser ble bestemt.
3.8.1. Optimalisering av organisk fase
Standarder hadde konsentrasjonene 50, 200, 500 og 1000 ng/ml. De var blandet sammen med
intern standard som hadde konsentrasjonen på 200 ng/ml.
38
Donorfasen besto av en 125 µl analyttblanding justert med 115 µl 0.1 M bikarbonat-
karbonatbuffer med pH 9.7 og 10 µl intern standard. Konsentrasjonen av analytter og intern
standard i donorfasen var 200 ng/ml. Akseptorfasen var 50 µl 20 mM maursyre.
I dette forsøket ble det undersøkt ulike sammensetninger av SLM som fremstilt i tabell 24.
Tabell 24 Optimalisering av sammensetning til SLM (n=4)
SLM 1 Tripentylfosfat
SLM 2 Tripentylfosfat 1% trioktylamin
SLM 3 Tripentylfosfat 1% trioktylamin 20% Aliquat 336
SLM 4 Tripentylfosfat 1% trioktylamin 3% Tetradecyl
ammoniumbromid
SLM 5 Tripentylfosfat 1% trioktylamin 20% Tetradecyl
ammoniumbromid
SLM 6 Tripentylfosfat 1% trioktylamin 3% Tetradecyl
ammoniumbromid
20%
Aliquat 336
SLM 7 Tripentylfosfat 3% Tetradecyl
ammoniumbromid
SLM 8 Tripentylfosfat 20% Aliquat 336
SLM 9 Tripentylfosfat 3% Tetradecyl
ammoniumbromid
20% Aliquat 336
3.8.2. Optimalisering av mengden til ionisk bærer
Andelen av den ioniske bæreren var 0, 10, 15, 20, 25 og 30 prosent i det organiske løsemidlet.
Alle andre variabler ble holdt uforandret i forhold til det forrige optimaliseringstrinnet fra
avsnitt 3.8.1. Hvert forhold ble analysert med fire paralleller.
3.8.3. Optimalisering av buffer pH i donorfasen
Det ble gjennomført to delforsøk som undersøkte ulike pH-verdier brukt til modifikasjonen av
miljøet i donorfasen. Det var fosfat- og bikarbonat-karbonatbuffer i tillegg til NaOH som ble
testet i de forsøkene. Konsentrasjonen av buffere var 0.1 M og 10 mM for NaOH. De testede
pH-verdiene er representert i tabell 25.
Tabell 25 pH-verdier av fosfatbuffer, bikarbonat-karbonatbuffer og NaOH-løsning (n=4)
Buffer/løsning pH
Delforsøk 1 Fosfatbuffer 7.4
Bikarbonat-karbonatbuffer 9.5, 9.7, 9.9, 10.1
NaOH-løsning 12.3
39
Delforsøk 2 Fosfatbuffer 7.4
Bikarbonat-karbonatbuffer 9.8, 9.9, 10.1, 10.3, 10.5
NaOH-løsning 12.3
3.8.4. Optimalisering av styrken i akseptorfasen
Den optimale maursyrestyrken ble valgt på bakgrunn av to delforsøk som ble vurdert i forhold
til utbyttene. Verdier som ble testet, er presentert i tabell 26.
Tabell 26 Styrke av maursyreløsning i akseptorfasen (n=4)
Styrke (mM)
Delforsøk 1 20, 50, 75, 100, 150, 200
Delforsøk 2 1, 5, 10, 20, 50
3.8.5. Optimalisering av ekstraksjonstid
Ekstraksjonen av analyttene ble undersøkt ved ulike tidspunkter. Målinger ble foretatt ved 15,
30, 45, 60, 90, 120 og 180 min både fra akseptor- og donorfasen. Forsøket ble vurdert i forhold
til oppnådde utbytter og tidspunkter for innstilling av likevekt i tillegg til fordelingen av
analyttene i systemet.
3.8.6. Optimalisering av bufferstyrken i donorfasen
Bikarbonat-karbonatbuffere med styrke på 0.1, 0.25, 0.5, 0.75 og 1 M ble undersøkt. Alle
buffere hadde pH 10.5.
3.9. Evaluering av metoden
Det ble utført en evaluering av denne metoden som var basert på retningslinjer fra europeiske
legemiddelmyndigheter (EMA) (45). Parametere fra avsnitt 3.9.1. til 3.9.6 ble undersøkt. Alle
forsøk benyttet biologiske prøveløsninger.
3.9.1. Laveste deteksjonsgrense og kvantifiseringsgrense
For å finne den laveste deteksjonsgrensen ble det laget seks fortynninger av analyttblandingen
i urinen som hadde konsentrasjon på henholdsvis 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5 og 10 ng/ml. Hver
konsentrasjon ble analysert med fire paralleller. Intern standard ble ikke brukt i dette forsøket.
40
Etter avsluttet analyse ble topphøyden av hver analytt sammenlignet manuelt med støyhøyden.
Den laveste konsentrasjonen som kunne detekteres, ble bestemt på bakgrunn av forholdet på
tre mellom signal og støy.
Den laveste kvantifiseringsgrensen ble bestemt til å bli signal/støy = 10. Konsentrasjonen ble
funnet ut ved hjelp av data som var tilgjengelige fra beregninger av den laveste
deteksjonsgrensen.
3.9.2. Linearitet
Kalibreringskurven besto av ti punkter med konsentrasjoner på 2, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500,
750 og 1000 ng/ml i urin. Hver konsentrasjon ble analysert med fire paralleller. En kvadratisk
kurve med 1/x vekting ble benyttet for å finne r2-verdien. Hver analytt hadde sin egen
kalibreringskurve. Lineariteten for NNDODV, NODVGLU og NNDODVGLU var undersøkt i
konsentrasjonsområdet 20 til 1000 ng/ml. For alle andre analytter var det 2 til 1000 ng/ml.
3.9.3. Overdrag
For å undersøke mulige overdrag fra påfølgende paralleller ble det gjennomført forsøk der to
blanke prøver ble plassert bak de høyeste standardene som ble brukt for kalibreringskurven. De
blanke prøvene var akseptorfaser etter ekstraksjon fra 250 µl urin uten analytter eller intern
standard.
3.9.4. Presisjon og nøyaktighet
Presisjon og nøyaktighet ble undersøkt i intradag- og interdaganalyse ved hjelp av QC-prøver.
De hadde en konsentrasjon på 2, 6, 20, 60, 400 og 850 ng/ml. De ble laget uavhengig av
standarder som ble brukt for kalibreringskurven. Hver konsentrasjon ble analysert med fem
paralleller i serie 1 og ti i serie 2. Resultater ble sammenlignet med kalibreringskurven og
eventuelle avvik ble vurdert i henhold til EMAs retningslinjer (45). For intradaganalyse ble det
benyttet resultater fra serie 1 mens for interdaganalyse fra serie 1 og 2.
3.9.5. Matrikseffekter
Dette forsøket benyttet Matuszewskis metode for vurdering av eventuelle matrikseffekter (46).
Det ble ekstrahert 15 urinparalleller uten analytter. Deretter ble akseptorfasen av fem paralleller
slått sammen. Til 120 µl av denne løsningen ble det tilsatt 30 µl analyttblandingen til
konsentrasjonen på 6 ng/ml. Samme fremgangsmåte ble brukt for konsentrasjoner på 60 og 340
ng/ml. For å bestemme matrikseffekter ble det laget samme volum i samme konsentrasjoner
41
som benyttet ren akseptorfase istedenfor den som ble utsatt ekstraksjon. Matrikseffekter ble
senere bestemt ved å finne forholdet mellom areal av analytt fra akseptorfasen utsatt for
ekstraksjon og areal fra den intakte akseptorfasen. Matrikseffekter ble uttrykt i prosent.
3.9.6. Ekstraksjonsutbytte
Ekstraksjonsutbytte ble beregnet ved å dele gjennomsnittlig areal av analyttene i QC-prøvene
med gjennomsnittlig areal av analyttene som stammet fra akseptorfasen der analyttblandingen
ble tilsatt etter ekstraksjonen. Gjennomsnittlige verdier ble basert på fem paralleller. De
endelige resultatene ble funnet for tre konsentrasjonsnivåer 6, 60 og 340 ng/ml for VEN, ODV,
NDV og NODV. De resterende analyttene hadde to konsentrasjonsnivåer 60 og 340 ng/ml.
Ekstraksjonsutbyttene ble uttrykt i prosent.
3.10. Beregninger
Avvik fra de nominelle verdiene som ble brukt ved vurdering av presisjon og nøyaktighet samt
ved tillaging av kalibreringskurven, ble beregnet av Xcalibur-programvaren.
Utbytte ble benyttet i avsnitt 4.1. og 4.2. De ble funnet ved å dele gjennomsnittet av alle
paralleller med et tall som representerte 100% utbytte. Hensyn ble tatt til oppkonsentrering på
grunn av volumforskjeller mellom fasene i PALME. Verdien ble uttrykt i prosent.
RSD ble funnet ved å dele standardavviket av alle paralleller med gjennomsnittet. Verdien ble
uttrykt i prosent.
Matrikseffekter (ME), vist i ligning 7, ble beregnet ved å dele gjennomsnittlige areal av
analyttene tilsatt til akseptorfasen etter ekstraksjon (B) med tilsvarende gjennomsnittlige areal
fra en ren akseptorfase tilsatt analyttene (A) (46). Sluttresultatet ble uttrykt i prosent.
𝑀𝐸 =𝐵
𝐴∗ 100% (Ligning 7)
Ekstraksjonsutbytte (RE), vist i ligning 8, ble benyttet i avsnitt 4.3. De ble beregnet ved å dele
gjennomsnittlige areal av analytter fra QC-prøvene (C) med gjennomsnittlige areal av analytter
fra akseptorfasen som ble tilsatt analyttblanding etter ekstraksjonen (C) (46).
𝑅𝐸 =𝐶
𝐵∗ 100% (Ligning 8)
42
4. Resultater og diskusjon
4.1. Innledende forsøk
De innledende forsøkene ble utført fra vandige prøveløsninger, og den generelle
fremgangsmetoden fra avsnitt 3.6.1. ble brukt.
4.1.1. Utvelgelse av SLM – del 1
I det første forsøket var det ønskelig å undersøke ekstraksjonseffektiviteten for alle analyttene.
Fokuset ble dermed rettet mot SLM. Den ble ansett som en av de mest sentrale faktorene i
ekstraksjonsprosessen. På bakgrunn av tidligere PALME-publikasjoner ble det bestemt at
dodecylacetat var et hensiktsmessig valg (8, 11, 12). Grunnen til denne beslutningen var dens
evne til å ekstrahere analytter med ulik polaritet og med lave RSD-verdier. Dodecylacetat ble
testet med og uten 1% trioktylamin. Trioktylamin var benyttet i tidligere studier som en
substans med maskeringseffekter på ikke-spesifikke bindingsseter i membranen (11).
Analyttene ble ekstrahert via SLM fra basisk miljø i donorfasen som var dannet med 10 mM
NaOH og til sur 20 mM løsning av maursyre. Den største vekten ved vurderingen av resultatene
ble lagt på utbyttene av analyttene.
Dodecylacetat med 1% trioktylamin viste høyere ekstraksjonsutbytter i forhold til SLM som
besto av ren dodecylacetat. Utbyttene samt RSD-verdier for alle analytter er vist i tabell 27. Det
er i samsvar med påstanden at trioktylamin kan redusere de ikke-spesifikke bindinger til PVDF
membranen (11). Allikevel ble kun venlafaksin og N-desmetylvenlafaksin ekstrahert i større
grad med utbytter på henholdsvis 84% og 52%. O-desmetylvenlafaksin hadde utbytte på 6%
mens alle andre analytter var ikke detektert i akseptorfasen. Resultatene viste dermed at
analyttene med de høyeste log P-verdiene ble ekstrahert i størst grad. De mer polare substansene
hadde muligens svært liten fordeling over i den organiske fasen slik at de forble i den vandige
donorfasen.
43
Tabell 27 Utbytter og tilhørende RSD-verdier fra ekstraksjoner med SLM som besto av
dodecylacetat med og uten 1% trioktylamin
Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i tabell
27. Donorfase: 250 µl 10 mM NaOH med analyttblanding med konsentrasjon i donorfasen på
200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=5.
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
Dodecylacetat med 1%
TOA
84%
(7%)
6%
(5%)
52%
(6%)
2%
(1%)
1%
(2%)
NA NA
Dodecylacetat 24%
(14%)
3%
(3%)
26%
(14%)
2%
(6%)
NA NA NA
NA = ikke tilgjengelig på grunn av ingen målbare signaler
Systemet med trioktylamin ble valgt til sammenligningsformål med andre organiske løsemidler
som ble testet i etterfølgende forsøk.
4.1.2. Utvelgelse av SLM – del 2
Det neste målet var testing av ulike organiske løsemidler. Spesiell interesse var knyttet til om
noen av dem ville gi høyere utbytte for de mer polare analyttene. Som vist i avsnitt 3.7. tabell
23 ble det testet seks ulike løsemidler i delforsøk 2 både med og uten trioktylamin. De ble
sammenlignet med SLM som besto av dodecylacetat og 1% trioktylamin. Alle andre
ekstraksjonsbetingelser unntatt SLM var uforandret i forhold til avsnitt 4.1.1.
Hensikten med dette forsøket var å velge løsemidler som hadde et bredt spekter av fysikalsk-
kjemiske egenskaper. Mange av dem var benyttet i tidligere PALME- og EME-prosjekter (9,
11, 47). Hvert løsemiddel ble testet med og uten TOA for å få ytterligere erfaringer med dette
reagenset.
Utfra de ulike løsemidlene klarte bis(2-etylheksyl)fosfitt og tributylfosfat, begge med tilsatt
trioktylamin, å ekstrahere de fleste analyttene som fremstilt i figur 9. Utbyttene av VEN, ODV
og NDV var over 60%. De skilte seg særlig fra utbytter av de mer polare metabolittene NODV
og NNDODV. De var på opptil 20%. Ingen av disse systemene klarte dog å ekstrahere de mest
polare glukuronidene. SLM med trioktylamin viste generelt bedre utbytter i forhold til sine
korresponderende systemer som besto av rene løsemidler. Bis(2-etylheksyl)fosfitt var unntaket
44
i denne sammenhengen. Grunnen var uklar, men en mulig forklaring var at dette løsemidlet
besatt egenskaper som dempet ikke-spesifikke bindinger til PVDF-membranen..
Enkelte utbytter overskred 100%. Den registrerte konsentrasjonen i akseptorfasen var dermed
høyere enn 1000 ng/ml som var representativ for 100% utbytte etter en fem gangers
oppkonsentrering forårsaket av volumforskjellen mellom donor- og akseptorfasen. Dette kunne
skyldes fordampningen av akseptorfasen som bidro til en litt høyere konsentrasjon, et lite avvik
i beregningen fra kalibreringskurven eller avvik i beregningen av topparealet som gjorde at
konsentrasjonen ble over 1000 ng/ml.
De tilhørende RSD-verdiene fra dette forsøket er representert i tabell 28. SLM med bis(2-
etylheksyl)fosfitt hadde RSD-verdier som ikke overskred 7% for noen av de ekstraherte
analyttene. Verdiene fra systemer med og uten trioktylamin var lignende. Ren tributylfosfat
hadde høyere RSD-verdier spesielt for mer polare metabolitter som ODV, NODV og
NNDODV. Tilsetting av trioktylamin bidro til en reduksjon av dem.
Figur 9 Ekstraksjonsutbytter som ble oppnådd med ulike organiske løsemidler i innledende faser av prosjektet
Ekstraksjonsbetingelser, unntatt organisk fase, var uforandret i forhold til tabell 27.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
Utb
ytte
VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU
45
Tabell 28 Tilhørende RSD-verdier for forsøk fra figur 9
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
Dodecylacetat + 1% TOA 5% 4% 2% 9% NA NA NA
2-nitrofenyloktyleter 5% 32% 12% NA 11% NA NA
2-nitrofenyloktyleter + 1%
TOA
13% 17% 19% NA 23% NA NA
Bis(2-etylheksyl)fosfitt 7% 6% 6% 4% 4% NA NA
Bis(2-etylheksyl)fosfitt + 1%
TOA
7% 7% 6% 5% 4% NA NA
Dekanol 13% 13% 12% 37% 40% NA NA
Dekanol + 1% TOA 6% 14% 9% 29% 40% NA NA
Diheksyleter 13% 25% 38% 39% 82% NA NA
Diheksyleter + 1% TOA 5% 13% 5% 3% 12% NA NA
Pentylbenzen 10% 30% 8% NA NA NA NA
Pentylbenzen + 1% TOA 11% 22% 3% NA NA NA NA
Tributylfosfat 8% 16% 2% 22% 15% NA NA
Tributylfosfat + 1% TOA 3% 7% 6% 15% 14% NA NA
NA = ikke tilgjengelig på grunn av ingen målbare signaler
Det var ønskelig å karakterisere disse løsemidlene og undersøke om det var sammenheng
mellom deres fysikalsk-kjemiske egenskaper og deres ekstraksjonsevne. Tettheten, log P, antall
hydrogenakseptor/donor og arealet av den polare overflaten var tatt i betraktning. Ingen av dem
alene så ut til å ha særlig stor innflytelse på utbyttene. Kamlet og Taft-parametere derimot hadde
et mer synlig mønster som ble ansett som relevant for oppnådde resultater.
Disse parametere kategoriserer løsemidler med α, β og π* variabler som står for henholdsvis
hydrogendonor, hydrogenakseptor og polaritet egenskaper (24). Tabeller som er tilgjengelige i
vitenskapelig litteratur, tilbyr kun oversikten over et begrenset antall substanser. Bestemmelsen
av verdier som er representert i tabell 29, ble dermed gjort på bakgrunn av stoffer med lignende
strukturelle egenskaper.
46
Tabell 29 Estimerte Kamlet og Taft-parametere
Organisk løsemiddel Kamlet og Taft-parametere
α β π*
Dodecylacetat 01 0.51 0.51
Diheksyleter 02 0.52 0.32
Pentylbenzen 03 0.13 0.63
NPOE 04 0.34 14
Bis(2-etylheksyl)fosfitt NA NA NA
Tributylfosfat 05 0.85 0.75
Dekanol 0.75 0.85 0.55
NA = ikke tilgjengelig 1 Utgangspunktet ble tatt i etylacetat, propylacetat og butylacetat. β ser ut til å bli større med økende
kjedelengde mens π blir litt lavere med økende kjedelengde. α-verdien forblir lik 0 (24). 2 Basert på dietyleter og dibutyleter. α er 0. β kan bli marginalt større med økende kjedelengde. π holder seg
stabil på 0.3. 3 Basert på benzen, dimetylbenzen og trimetylbenzen. α er 0. β verdien ser ut til å bli veldig nært 0.1. π kan bli
litt lavere. 4 Basert på nitrobenzen.
Tall fra 2 til 5 er hentet den [28.03.2017] fra http://www.stenutz.eu/chem/solv26.php (48)
Basert på tilgjengelige tall ble det antatt at organiske løsemidler som hadde null verdi for α, høy
verdi for β og moderat π* uttrykte potensiale til å ekstrahere venlafaksin og dens metabolitter
mer effektivt.
Grunnen til bedre utbytter med bis(2-etylheksyl)fosfitt kan være dens evne til
hydrogenbindingsinteraksjoner. Dette løsemidlet ble nylig brukt i EME-studier og bekreftet at
det var anvendelig for ekstraksjoner av polare analytter med log P-verdier mellom -0.40 og 1.3
(49, 50).
4.1.3. Utvelgelse av SLM – del 3
Ioniske væsker, oppgitt i tabell 23 delforsøk 3, var en annen gruppe av løsemidler som ble testet
ut. Neglisjerbar flyktighet og lav toksisitet er blant de viktige fordelene (51, 52). Ioniske væsker
har allerede blitt benyttet i HF-LPME der analytter med log P mellom -0.09 og 1.63 ble
ekstrahert til akseptorfasen (53). Det var en av grunnene for å teste dem ut i dette PALME-
prosjektet.
Det praktiske arbeidet avslørte utfordringer knyttet til viskositeten av disse væskene.
Diffusjonen på PVDF-membranen ble betydelig redusert. I tillegg var det vanskelig å utføre
repeterbare pipetteringer. De ioniske væsker ble dermed oppvarmet til 50oC for å redusere
47
viskositeten. Det reduserte allikevel kontrollen over betingelser. Avkjølingshastigheten av
væsken samt potensiell dekomponering var faktorer som kunne kreve en nøye overvåking.
Ekstraksjonen ble utført under samme betingelser som i avsnitt 4.1.1. med den forskjellen at
ioniske væsker ble brukt for å danne SLM. Hver SLM ble testet med fem parallelle forsøk. Data
(ikke vist her) viste ingen målbare topper for analyttene eller svært lave ekstraksjonsutbytter,
ofte under 5%. 1-metyl-3-oktylimidazolium tetrafluoroborat med 1% trioktylamin ga
ekstraksjon av begge glukuronidene med utbytte omtrentlig på 3%.
Kamlet og Taft-parametere av disse væsker kan være en del av årsaken til de lave utbyttene. De
har lave β, moderate α og høye π* verdier (54, 55). Det sto i kontrast til trender som ble
observert i tabell 29. De antydet at løsemidler med høye verdier for hydrogenakseptor og
fraværende hydrogendonor egenskaper klarte å ekstrahere flere analytter. Samtidig kunne den
høye viskositeten bidratt til betydelig forlenget ekstraksjonstid. Tidligere studier fra HF-LPME
viste at 8-12 timer var nødvendig for oppnåelse av likevekt av ekstraksjoner som stabiliserte
seg på utbytter rundt 50-70% (53). Det var ansett som uakseptabelt langt i dette prosjektet.
Ekstraksjonen av glukuronider kunne skyldes en interaksjon mellom kationet av den ioniske
væsken og den ladede karboksylsyregruppen på analyttmolekylet. På denne måten kunne det
være dannet et kompleks som diffunderte lettere inn i SLM. På overflaten mellom SLM og
akseptorfasen ble det komplekset brutt slik at analytten ble frigjort i akseptorfasen.
Den eneste ioniske væsken som ekstraherte glukuronidene ble testet i en blanding med bis(2-
etylheksyl)fosfitt og tributylfosfat i forhold 1:1 og 1% TOA for å undersøke om de hadde
supplerende effekt. Dette forholdet ble ansett som et forstandig utgangspunkt med potensiale
for videre optimalisering. Ekstraksjonsutbytter viste allikevel at kun tre analytter (ODV, NODV
og NNDODV) ble ekstrahert hvorav to under 8% (se Appendix II). Videreføring av denne ideen
ble dermed forkastet i dette prosjektet.
48
4.1.4. Testing av pH-betingelser i donorfasen
Analyttens polaritet er avhengig av hvilken pH de er oppløst i. Vanligvis justeres miljøet til et
pH-område som fremmer fullstendig uionisert tilstand av analyttene i donorfasen (3).
Sammenligning av hver enkelt profil tydet på at pH rundt 10 kunne gjøre analyttene mer
upolare. De er presentert i figur 10 til 13 og viser log D-verdien (y-aksen) til analytten som en
funksjon av pH (x-aksen). Alle profiler var baserte på estimerte algoritmer. Det var forventet
at forandringen av pH-betingelser ville forbedre diffusjonen gjennom membranen.
Figur 10 log D til VEN (blå), ODV (oransje) og NDV (grå) fremstilt som en funksjon av pH [hentet fra
chemicalize.com den 29.03.17] (56)
Figur 11 log D til NODV som en funksjon av pH [hentet fra chemicalize.com den 29.03.17] (56)
49
Figur 12 log D til NNDODV som en funksjon av pH [hentet fra chemicalize.com den 29.03.17] (56)
Figur 13 log D til NODVGLU (grønn) og NNDODVGLU (rød) som en funksjon av pH [hentet fra chemicalize.com
den 29.03.17] (56)
50
Bikarbonat-karbonatbuffer med pH 9.5 ble tilsatt til den vandige prøveløsningen i
donorbrønnene istedenfor 10 mM NaOH. Alle andre ekstraksjonsbetingelser forble uendret i
forhold til forrige forsøk. Utbyttene var høyere når buffer med lavere pH ble benyttet. Det gjaldt
for alle analytter unntatt glukuronidene som ikke ble ekstrahert i vesentlig grad med de fire
valgte organiske løsemidlene. Søylediagrammet i figur 14 viser at SLM med tributylfosfat
hadde høyere ekstraksjonsutbytter enn de andre testede systemene. Samtidig var RSD-verdier,
presentert i tabell 29, for dette systemet godt under 15% i motsetning til bis(2-etylheksyl)fosfitt
som hadde verdier opp mot 100%.
Figur 14 Utbyttene av analyttene etter ekstraksjoner med 4 ulike SLM og bikarbonat-karbonatbuffer pH 9.5 i
donorfasen
Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i figur 14. Donorfase: 125 µl
0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer pH 9.5 + 125 µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen
på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=5.
Tabell 29 RSD-verdier for ekstraksjoner via fire ulike SLM med bikarbonat-karbonat buffer
pH 9.5 i donorfasen
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
Dodecylacetat + 1% TOA 5% 5% 9% 9% 5% NA NA
Bis(2-etylheksyl)fosfitt + 1%
TOA
84% 11% 105% 19% 28% NA NA
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU
Utb
ytte
Dodecylacetat + 1% TOA Bis(2-etylheksyl)fosfitt + 1% TOA
Tributylfosfat + 1% TOA 1-metyl-3-oktylimidazolium tetrafluoroborat + 1% TOA
51
Tributylfosfat + 1% TOA 2% 11% 5% 9% 7% NA NA
1-metyl-3-oktylimidazolium
tetrafluoroborat + 1% TOA
NA 24% NA 15% 24% 41% 31%
NA = ikke tilgjengelig på grunn av ingen målbare signaler
4.1.5. Utvelgelse av SLM – del 4
Registrerte ekstraksjonsutbytter og RSD-verdier, spesielt ved bruk av tributylfosfat, gjorde at
SLM med fosfater og fosfitter ble ansett som gode kandidater for videre utforskning.
Løsemidler fra delforsøk 4 i tabell 23 ble testet i forhold til ekstraksjonsutbytter. I dette forsøket
ble NaOH erstattet med 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer med pH 9.5. Alle andre
ekstraksjonsbetingelser var uendret. Utvalget av disse løsemidlene ble tatt blant annet på
bakgrunn av løseligheten i vann, som bør være lavere enn 1.2 g/l, og HMS-informasjon
tilgjengelig fra sikkerhetsdatablader (57). Dodecylacetat som var tidligere brukt for
sammenligningsformål ble erstattet med tributylfosfat. Grunnen til det var at det sistnevnte
løsemidlet klarte å ekstrahere flere analytter med høyere utbytter og samtidig hadde avvik
mellom paralleller innenfor krav som stilles av internasjonale retningslinjer for validering av
bioanalytiske metoder (45).
Figur 15 Utbytter etter ekstraksjoner med ulike SLM basert på fosfater og fosfitter
Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i figur 14. Donorfase: 125 µl
0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer pH 9.5 + 125 µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen
på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.
Figur 15 indikerer at ingen av de testede løsemidlene klarte å ekstrahere analyttene med høyere
utbytter i forhold til tributylfosfat. Triisodecylfosfitt (TIOPi) har en log P-verdi høyere enn 12.
Utbytter på under 20% kunne indikere at denne SLM var altfor upolar for de fleste analyttene.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
TBP + 1%TOA
DBPi DBPi + 1%TOA
TEHP TEHP + 1%TOA
TEHPi TEHPi + 1%TOA
TIOPi TIOPi + 1%TOA
Utb
ytte
VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU
52
Det var også en mulig forklaring for utbyttene som ble oppnådd med tris(2-etylheksyl)fosfat
(TEHP) og tris(2-etylheksyl)fosfitt (TEHPi), som har log P rundt 9. Forskjellen mellom de to
løsemidlene var en fosfat- og en fosfittgruppe. Resultater viste at fosfitt ga bedre utbytter for
den mest upolare analytten VEN mens fosfat ga høyere utbytter av de mer polare metabolittene
NODV og NNDODV. Noen av tidligere EME-studier beskrev bruk av både bis(2-
etylheksyl)fosfitt og bis(2-etylheksyl)fosfat som kan relateres til TEHP og TEHPi (50, 58, 59).
Begge disse løsemidlene ble brukt i EME for ekstraksjoner av polare analytter med log P på
henholdsvis -0.4 og -1.3. Fosfat i motsetning til fosfitt blir ladet ved basisk pH på det ene
oksygen atomet og dermed kan delta i ioniske interaksjoner. Det kan være en hypotetisk
forklaring av høyere ekstraksjonsutbytter for NODV og NNDODV. Ekstraksjonsutbytter under
30% ble observert for alle analytter unntatt VEN med SLM som besto av dibenzylfosfitt
(DBPi). Dette løsemidlet hadde lavest log P-verdi i dette forsøket. Aromatiske sidekjeder kunne
være mulige årsaken på grunn av bidrag til lavere Kamlet og Taft β-verdi (49). Det ble samtidig
observert at trioktylamin ikke nødvendigvis var gunstig for ekstraksjonsutbytter av mer polare
analytter. Utbyttene for NODV og NNDODV fra figur 15 viste at de var like eller litt høyere i
systemer uten trioktylamin. En mulig forklaring var at de mer upolare analyttene hadde større
affinitet til ikke-spesifikke bindingsseter på PVDF-membranen slik at trioktylamin hadde større
effekt i disse tilfellene.
4.1.6. Utvelgelse av SLM – del 5
Det var ønskelig å se om høyere andel av TOA i tributylfosfat kunne bidra til å maskere enda
flere bindingsseter på PVDF-membranen og forbedre ekstraksjoner, og om utbytter av mer
polare metabolitter ble påvirket. Tributylfosfat ble blandet i med 1, 10 og 20% trioktylamin.
Resultatene fra tabell 30 viste at jo mer trioktylamin i SLM desto lavere utbytter av de mer
polare metabolittene. Det ble dermed besluttet å bruke 1% i kommende forsøk.
53
Tabell 30 Utbytter og tilhørende RSD-verdier fra ekstraksjoner der SLM hadde ulik mengde
av trioktylamin
Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i tabell
30. Donorfase: 125 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer pH 9.5 + 125 µl analyttblanding med
den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm.
Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
Tributylfosfat + 1%
TOA
124%
(10%)
122%
(16%)
105%
(15%)
79%
(24%)
62%
(19%)
NA NA
Tributylfosfat + 10%
TOA
121%
(9%)
101%
(5%)
88%
(4%)
61%
(7%)
46%
(6%)
NA NA
Tributylfosfat + 20%
TOA
130%
(7%)
103%
(4%)
84%
(7%)
53%
(5%)
38%
(2%)
NA NA
NA = ikke tilgjengelig på grunn av ingen målbare signaler
4.1.7. Utvelgelse av SLM ved samtidig testing av utvidede pH-betingelser i donorfasen –
del 6
Tripentylfosfat var et helt nytt løsemiddel i PALME-sammenheng. Det ble testet i forhold til
tributylfosfat, som presentert i tabell 23 delforsøk 5. Tripentylfosfat har lavere løselighet i vann
og høyere kokepunkt slik at fordampning fra membranen var redusert (43). SLM med dette
løsemidlet ble dermed ansett som mer stabil. I tillegg hadde det mer gunstige HMS-egenskaper
(57). Tripentylfosfat er blant annet ikke kreftfremkallende i motsetning til tributylfosfat, ifølge
sikkerhetsdatablader.
Formålet med dette forsøket var å undersøke ekstraksjonsutbytter og RSD-verdier med SLM
som besto av tripentylfosfat i forhold til tributylfosfat. Samtidig var det ønskelig å teste flere
buffere (beskrevet i tabell 21). Unntatt de nevnte forandringer i donorfasen og SLM ble andre
ekstraksjonsparametere holdt konstant.
Utbyttene av analyttene, vist i tabell 31, var bedre eller minst like gode for VEN, ODV, NDV
og NODV med SLM som var basert på tripentylfosfat. Ekstraksjoner av den mer polare
metabolitten NNDODV gav derimot høyere utbytte med tributylfosfat. Dette kunne skyldes
høyere log P-verdi og dermed mer lipofile egenskaper for tripentylfosfat. Det sistnevnte
løsemidlet ga RSD-verdier under 10%, og i mange tilfeller var RSD selv under 5%. Det ble
54
bestemt at optimaliseringsforsøk skulle utføres med tripentylfosfat. Begrunnelsen for den
avgjørelse var større stabilitet av SLM i løpet av ekstraksjonen. Det var synlig ved hjelp av
RSD-verdier som i signifikant flere tilfeller var lavere for SLM som besto av tripentylfosfat i
forhold til tributylfosfat. I tillegg var det et mer operatør- og miljøvennlig løsemiddel.
Den andre delen av dette forsøket skulle undersøke om andre pH-betingelser kunne ha en effekt
på ekstraksjonsutbyttene. Til sammen ble syv forskjellige bikarbonat-karbonatbuffer testet med
pH mellom 9.4 til 10.5.
Ekstraksjonen av VEN og ODV var nesten fullstendige i alle tilfeller og så ikke ut til å bli
påvirket av de små pH-endringene i signifikant grad. NDV derimot ble ekstrahert i betydelig
større grad ved mer basisk pH. En mulig forklaring var høyere pKa-verdi av denne analytten.
Det kreves mer basisk miljø for at analytten skulle eksistere i sin uladede form. Ekstraksjonene
av NODV og NNDODV via tripentylfosfat-baserte membraner viste at buffer med høyere pH
kunne øke utbytter med henholdsvis 20 og 10%. Dette forsøket indikerte at selv en liten endring
i pH på rundt en enhet kunne gi vesentlige forandringer av ekstraksjonsutbyttene. Forandring
av pH-betingelser bidro ikke til signifikante forskjeller i RSD-verdier som forble under 15%.
Tabell 31 Sammenligning av utbytter og tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner med
tripentylfosfat og tributylfosfat i et pH-område mellom 9.4 til 10.5
Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i tabell
31. Donorfase: 125 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer med pH-verdier fra tabell 31 + 125
µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml.
Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
Buffer 1 pH 9.4 TBP + 1%
TOA
110%
(5%)
97%
(9%)
81%
(8%)
61%
(17%)
50%
(11%)
NA NA
Buffer 1 pH 9.4 TPP + 1%
TOA
113%
(6%)
107%
(6%)
74%
(3%)
59%
(4%)
40%
(6%)
NA NA
Buffer 2 pH 9.5 TBP + 1%
TOA
106%
(4%)
92%
(6%)
85%
(2%)
60%
(5%)
49%
(3%)
NA NA
Buffer 2 pH 9.5 TPP + 1%
TOA
104%
(4%)
108%
(3%)
86%
(2%)
67%
(3%)
42%
(5%)
NA NA
Buffer 3 pH 9.8 TBP + 1%
TOA
112%
(5%)
93%
(6%)
97%
(11%)
68%
(7%)
55%
(8%)
NA NA
55
Buffer 3 pH 9.8 TPP + 1%
TOA
108%
(5%)
111%
(3%)
95%
(5%)
71%
(3%)
47%
(5%)
NA NA
Buffer 4 pH 9.9 TBP + 1%
TOA
106%
(4%)
89%
(5%)
91%
(2%)
66%
(4%)
53%
(1%)
NA NA
Buffer 4 pH 9.9 TPP + 1%
TOA
104%
(9%)
108%
(5%)
101%
(5%)
76%
(3%)
47%
(4%)
NA NA
Buffer 5 pH 10.1 TBP +
1% TOA
106%
(3%)
99%
(7%)
102%
(6%)
77%
(14%)
62%
(17%)
NA NA
Buffer 5 pH 10.1 TPP +
1% TOA
99%
(8%)
108%
(4%)
100%
(3%)
77%
(5%)
49%
(5%)
NA NA
Buffer 6 pH 10.3 TBP +
1% TOA
105%
(7%)
95%
(5%)
102%
(4%)
74%
(7%)
59%
(5%)
NA NA
Buffer 6 pH 10.3 TPP +
1% TOA
106%
(4%)
108%
(3%)
107%
(6%)
77%
(2%)
50%
(2%)
NA NA
Buffer 7 pH 10.5 TBP +
1% TOA
110%
(6%)
94%
(7%)
104%
(8%)
73%
(12%)
60%
(11%)
NA NA
Buffer 7 pH 10.5 TPP +
1% TOA
106%
(3%)
113%
(7%)
109%
(5%)
81%
(3%)
50%
(4%)
NA NA
NA = ikke tilgjengelig på grunn av ingen målbare signaler
4.1.8. Utvelgelse av ionisk bærer
Ekstraksjon av glukuronidene var fortsatt ikke mulig med rene løsemidler til tross for at
utbyttene av de andre analyttene var betydelig forbedret i forhold til det opprinnelige
utgangssystemet som besto av dodecylacetat. De amfotære egenskapene var muligens en av
hovedutfordringene. Karboksylsyregruppen i glukuronidstrukturen var ladet i det basiske
miljøet i donorfasen. For å utnytte denne negative ladningen under ekstraksjon ble det bestemt
å teste tilsetning av ioniske bærere med en positiv ladning til SLM. Aliquat 336 ble valgt på
bakgrunn av tidligere erfaring fra en annen prøveopparbeidelsesteknikk (14). I tillegg ble fire
andre forbindelser valgt der to av dem, tetradecylammoniumbromid (TDA) og
dodecyltrimetylammoniumbromid (DCMA), ble oppløst i organisk fase mens de to andre,
tetraetylammoniumbromid (TEAB) og tetrabutylammoniumfosfat (TBAP), ble løst i den
vandige donorfasen. De ioniske bærerne er nevnt i tabell 21. Alle disse stoffene var kvartære
aminer, og forskjellen mellom dem var oppbygningen av sidekjedene. TDA og DCMA ble
blandet sammen med tributylfosfat og utgjorde 5% av den organiske fasen (ikke fullstendig
oppløst). TEAB og TBAP utgjorde 2% av den vandige donorfasen
56
Analyttblandingen var oppløst i donorfasen som ble justert med bikarbonat-karbonatbuffer til
pH 9.5. I to tilfeller ble det tilsatt ioniske bærere til donorfasen som nevnt ovenfor. Analyttene
ble deretter ekstrahert til 20 mM maursyre via SLM. Alle andre ekstraksjonsbetingelser ble
uforandret.
Figur 16 Ekstraksjonsutbytter i systemer med ioniske bærere
Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i figur 16. Donorfase: 125 µl
0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer pH 9.5 + 125 µl analyttblanding med og uten ioniske bærere. Analyttenes
endelige konsentrasjon i donorfasen var 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.
Tabell 32 Tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner med ioniske bærere fra figur 16
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
TBP + 1% TOA 12% 23% 12% 26% 18% NA NA
TBP + A336 (80:20) 54% 54% 55% 48% 50% 10% 20%
TBP + DCMA + 1% TOA 3% 10% 8% 10% 9% NA NA
TBP + TBAP + 1% TOA 9% 14% 6% 20% 18% NA NA
TBP + TDA + 1% TOA 9% 9% 4% 5% 13% 9% 8%
TBP + TEAB + 1% TOA 5% 3% 6% 7% 11% NA NA
NA = ikke tilgjengelig på grunn av ingen målbare signaler
Ekstraksjoner av glukuronidene var vellykket med to systemer. Det gjaldt Aliquat 336 og TDA.
Mekanismen bak var trolig en kompleksdannelse mellom negativt ladet analytt og ionisk bærer
med positiv ladning. Komplekset var lipofilt nok til å distribueres over i SLM. På
grenseoverflaten mellom SLM og akseptorfasen hadde det sure miljøet muligens bidratt til at
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU
Utb
ytte
TBP + 1% TOA TBP + A336 (80:20) TBP + DCMA + 1% TOA
TBP + TBAP + 1% TOA TBP + TDA + 1% TOA TBP + TEAB + 1% TOA
57
karboksylsyren mistet ladningen slik at komplekset dissosierte, og glukuronider som i tillegg
fikk ladning på aminogruppen, ble oppløst i akseptorfasen mens den ioniske bæreren forble i
SLM. De andre ioniske bærerne fungerte ikke tilfredsstillende.
Aliquat 336 bidro til en ekstraksjon på 16% for NODVGLU og 11% for NNDODVGLU.
Ekstraksjonsutbyttene for de andre mindre polare analyttene var derimot lavere i forhold til
SLM som ikke hadde tributylfosfat. En mulig forklaring bak det var viskositeten av Aliquat 336
som gjorde at ekstraksjonshastigheten ble forsinket. I tillegg kunne de fysikalsk-kjemiske
egenskapene til SLM være forandret slik at fordelingskoeffisienten fra donorfasen ble redusert.
SLM med TDA klarte å ekstrahere begge glukuronidene med utbytter på omkring 1%. Samtidig
var utbyttene for alle de andre analyttene forbedret i forhold til SLM som besto av tributylfosfat
med 1% trioktylamin. Grunnen til det var ukjent siden den kationiske bæreren ikke burde ha
effekt på de basiske analyttene. Alle RSD-verdier med TDA var under 15%.
4.1.9. Testing av ulike løsemidler og styrker i akseptorfasen
Tabell 21 viser at ulike løsemidler ble testet i akseptorfasen der både maursyre og
trifluoreddiksyre hadde tre ulike konsentrasjoner. Hensikten med dette forsøket var
undersøkelse av potensielle effekter av akseptorfasen på ekstraksjonsutbyttene av analyttene.
Disse løsemidlene var valgt på bakgrunn av tidligere studier av PALME (12). Utvalg av
potensielle kandidater var begrenset siden akseptorfasen måtte danne et surt miljø for å fremme
ioniseringen av analyttene og samtidig være flyktig for å bli kompatibel med LC-MS.
Figur 17 Ekstraksjonsutbytter med maursyre og trifluoreddiksyre som akseptorfaser
Akseptorfase: 50 µl av løsninger vist i figur 17. Organisk fase: 4 µl TBP + 20% A336. Donorfase: 125 µl 0.1 M
bikarbonat-karbonatbuffer pH 9.5 + 125 µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på
200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU
Utb
ytte
20mM HCOOH 100mM HCCOH 200mM HCOOH 50mM TFA 100mM TFA 150mM TFA
58
Donorfasen i dette forsøket var justert til pH 9.5 med bikarbonat-karbonatbuffer. De organiske
løsemidlene i SLM var tributylfosfat med 20% Aliquat 336.
Resultatene i figur 17 viser at de laveste konsentrasjonene av trifluoreddiksyre ga lignende
ekstraksjonsutbytter i forhold til systemer som benyttet maursyre. Det gjaldt for de mest upolare
analyttene. Ekstraksjonen av glukuronider med trifluoreddiksyre var derimot under 5% for alle
konsentrasjoner av akseptorfasen. Grunnen til det kunne være redusert dissosiasjon av analytter
fra komplekser med den ioniske bæreren. Resultatene viste at maursyre var den akseptorfasen
som ga høyere utbytter. De så ut til å bli avhengige av konsentrasjonen til maursyre der 100
mM fungerte bedre for de fleste analyttene i forhold til de andre konsentrasjonene.
Tabell 33 Tilhørende RSD-verdier for figur 17
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
20mM HCOOH 9% 8% 7% 18% 7% 6% 6%
100mM HCCOH 23% 23% 13% 16% 17% 10% 7%
200mM HCOOH 6% 9% 9% 6% 6% 24% 11%
50mM TFA 9% 2% 9% 10% 10% 16% 18%
100mM TFA 8% 8% 19% 15% 13% 30% 51%
150mM TFA 68% 71% 64% 62% 61% 119% 120%
Den andre hypotesen var at DMSO, som er et organisk løsemiddel blandbar med vann, kunne
bidra til høyere utbytter av analytter ved å øke deres fordelingskoeffisienter over i
akseptorfasen. DMSO ble tilsatt til maursyre i tre ulike forhold som vist i tabell 21.
Data (se Appendix III) viste at ekstraksjonsutbytter var lavere for alle analytter i forhold til
akseptorfaser uten DMSO. Økende mengde av dette løsemidlet resulterte i redusert utbytte.
DMSO er et løsemiddel som klarer å løse opp flere organiske forbindelser (60). Grunnen til
reduksjonen av ekstraksjonsutbytter var dermed ukjent.
59
4.2. Optimaliseringsforsøk
4.2.1. Optimalisering av SLM
De innledende forsøkene viste at sammensetningen av SLM var en av de mest sentrale
parameterne som påvirket ekstraksjonsprosessen av analyttene. Hensikten med forsøkene i
dette avsnittet var å finne hvilke løsemidler og ioniske bærere som ga de høyeste utbyttene og
RSD-verdier under 15%. Sammensetningen av de ni testede SLM er beskrevet i tabell 24.
Ekstraksjonsbetingelser er beskrevet i avsnitt 3.8.1. Den største vekten ved vurderingene av
data ble lagt på de mest polare metabolittene.
Ren løsning av tripentylfosfat både uten og med tilsetning av trioktylamin var ikke i stand til å
ekstrahere glukuronidene. Det bekreftet behovet for en ionisk bærer. TDA var ikke fullstendig
oppløst i noen av de testede SLMene. Tilsetningen av den ioniske bæreren i fast form ble derfor
forkastet på grunn av begrenset løselighet.
Figur 18 Ekstraksjonsutbytter med ulike SLM-sammensetninger
Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i figur 18. Donorfase: 115 µl
0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer pH 9.7 + 125 µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen
på 200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet
900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.
SLM som besto av tripentylfosfat i en blanding med 20% Aliquat 336 klarte å ekstrahere alle
analytter. Ekstraksjonsutbyttet av glukuronidene var opp mot 17 og 19%. Alle RSD-verdier for
dette systemet var under 15%. Resultatene fra figur 18 viser i tillegg at tilsetning av trioktylamin
bidro til reduserte utbytter. På bakgrunn av tilgjengelige data ble det konkludert med at videre
trinn av optimaliseringsprosessen ble utført med SLM som besto av tripentylfosfat og Aliquat
336.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
TPP TPP + 1%TOA
TPP + 1%TOA + 20%
A336
TPP + 1%TOA + 3%
TDA
TPP + TOA1% + TDA
20%
TPP + TOA1% + TDA3% + A336
20%
TPP + TDA3%
TPP + A33620%
TPP + TDA3% + A336
20%
Utb
ytte
VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU
60
I det neste steget i optimalisering av SLM ble det fokusert på mengden av ionisk bærer i SLM.
De eksperimentelle betingelsene er beskrevet i flere detaljer i avsnitt 3.8.2.
Figur 19 Ekstraksjonsutbytter med varierende mengde av Aliquat 336 i SLM
Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i figur 19. Donorfase: 115 µl
0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer pH 9.7 + 125 µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen
på 200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet
900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.
Ekstraksjonsutbyttene var økende i takt med høyere andel av Aliquat 336. Økningen var
kontinuerlig for glukuronider mens utbyttene til de andre analyttene begynte å falle når
mengden av Aliquat 336 ble økt fra 25 til 30 %. Ekstraksjonsutbytter er vist i figur 19 med
tilhørende RSD-verdier i figur 20. En mulig forklaring var økende viskositet av den organiske
fasen og redusert diffusjonshastighet til analyttene som ikke var avhengige av
kompleksdannelsen.
Figur 20 RSD-verdier for tilhørende forsøk fra figur 19
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
A336 0% A336 10% A336 15% A336 20% A336 25% A336 30%
Utb
ytte
Mengde av A336 i blanding med TPP
VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU
RSD
-ver
die
r
TPP + A336 0% TPP + A336 10% TPP + A336 15% TPP + A336 20% TPP + A336 25% TPP + A336 30%
61
Basert på resultatene fra begge forsøk ble det bestemt at den optimale sammensetningen av
SLM for venlafaksin og dens metabolitter var tripentylfosfat blandet med 25% A336.
4.2.2. Optimalisering av buffer pH i donorfasen
De innledende forsøk antydet at pH i donorfasen kunne påvirke ekstraksjonsutbyttene. Det var
dermed ønskelig å finne den optimale pH-verdien som ville sikre de høyeste utbyttene for alle
analytter.
Fosfat- og bikarbonat-karbonatbuffer i tillegg til NaOH ble testet som nevnt i avsnitt 3.8.3.
Resultatene er vist i tabell 34. Fosfatbuffer ga utbytter på under 10% for de fleste analyttene
unntatt venlafaksin. Grunnen til det var sannsynligvis at analyttene var til stede i ladet form ved
pH 7.4 slik at de ikke kunne diffundere fra donorfasen til SLM. Bikarbonat-karbonatbuffer ga
bedre utbytter enn fosfat og NaOH. Utbyttene økte i mer basisk miljø. Det ble allikevel
observert et fall når NaOH-løsningen ble brukt. Det gjaldt hovedsakelig glukuronidene. Den
hadde pH som var over to enheter høyere enn den mest basiske bikarbonat-karbonatbufferen
fra dette delforsøket. Det var i samsvar med endring av polariteten som en variabel av endrende
pH beskrevet i figur 10-13. En nøye kontroll av pH-betingelser ble dermed ansett som
nødvendig.
Tabell 34 Ekstraksjonsutbyttene med tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner med ulike pH-
verdier i donorfasen - delforsøk 1
Akseptorfasen: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336.
Donorfasen: 115 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer pH som vist i tabell 34 + 125 µl
analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml + 10 µl
interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet
900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
Buffer pH 7.4 12%
(5%)
10%
(4%)
1%
(6%)
1%
(5%)
2%
(8%)
0.2%
(4%)
0.4%
(7%)
Buffer pH 9.5 70%
(12%)
63%
(13%)
35%
(9%)
33%
(10%)
37%
(8%)
2%
(30%)
5%
(22%)
Buffer pH 9.7 73%
(6%)
67%
(7%)
40%
(6%)
37%
(7%)
43%
(5%)
2%
(4%)
6%
(4%)
62
Buffer pH 9.9 72%
(13%)
67%
(13%)
44%
(19%)
38%
(14%)
47%
(17%)
3%
(29%)
6%
(25%)
Buffer pH 10.1 56%
(12%)
49%
(14%)
40%
(12%)
36%
(15%)
38%
(19%)
4%
(13%)
8%
(10%)
Buffer pH 12.3 70%
(4%)
69%
(6%)
40%
(13%)
34%
(13%)
37%
(22%)
2%
(21%)
3%
(53%)
Siden den mest basiske bikarbonat-karbonatbufferen fra tabell 34 ga høyest utbytte for
glukuronidene, ble det gjennomført et supplerende forsøk som undersøkte et utvidet spekter av
pH-verdier som var mulige å oppnå med den bufferen.
Forsøk ble utført på ulike dager. Dermed har delforsøket fra tabell 35 inkludert en del like pH-
styrker for å bidra til større sikkerhet i den endelige beslutningen. Bikarbonat-karbonatbuffer
med pH 10.5 viste de høyeste ekstraksjonsutbyttene for glukuronidene i forhold til andre
systemene. Ekstraksjonsutbyttene av de andre polare metabolittene NODV og NNDODV var
rundt 50% som er høyere enn med de fleste andre betingelser. Samtidig var RSD-verdiene
mellom 0 og 6%. Disse betingelser ble ansett som optimale til tross for at pH 10.5 var igjen den
ytre grenseverdien. Det betyr at de målte ekstraksjonsutbyttene hadde økende tendenser,
spesielt for glukuronidene. Samtidig ble det observert at forskjeller mellom utbyttene var lave
ved sammenligning av pH 10.1 eller 10.3 med 10.5 Det tydet på at kurvene for
ekstraksjonsutbytter flatet ut og eventuell utforskning av mer basisk pH ikke ville ført til en
vesentlig gevinst. Denne bufferen ble dermed brukt i de kommende forsøk.
Tabell 35 Ekstraksjonsutbyttene med tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner med ulike pH-
verdier i donorfasen - delforsøk 2
Ekstraksjonsbetingelser forble uendret i forhold til de som er beskrevet i tabell 34. Den eneste
forskjellen var buffer pH. Tabell 35 viser de testede pH-verdier.
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
Buffer pH 7.4 14%
(6%)
11%
(6%)
1%
(2%)
1%
(2%)
2%
(2%)
0.2%
(6%)
0.2%
(4%)
Buffer pH 9.8 64%
(17%)
61%
(18%)
38%
(19%)
34%
(14%)
41%
(19%)
2%
(21%)
5%
(17%)
Buffer pH 9.9 56%
(38%)
55%
(45%)
40%
(42%)
34%
(39%)
40%
(43%)
3%
(22%)
6%
(18%)
63
Buffer pH 10.1 68%
(5%)
66%
(8%)
54%
(6%)
48%
(4%)
52%
(2%)
4%
(6%)
8%
(4%)
Buffer pH 10.3 70%
(14%)
63%
(18%)
54%
(14%)
47%
(10%)
50%
(13%)
5%
(13%)
9%
(10%)
Buffer pH 10.5 68%
(6%)
64%
(5%)
57%
(1%)
49%
(3%)
50%
(1%)
6%
(4%)
10%
(0%)
Buffer pH 12.3 72%
(5%)
68%
(8%)
54%
(5%)
38%
(3%)
36%
(3%)
3%
(8%)
4%
(8%)
4.2.3. Optimalisering av styrken i akseptorfasen
Avsnitt 3.8.4. gir oversikt over betingelser som ble undersøkt for å finne den optimale styrken
av maursyre i akseptorfasen. I likhet med de forrige forsøk ble den største vekten lagt på
ekstraksjoner av glukuronidene. Konsentrasjonen av maursyre i et område mellom 20 og 200
mM ble undersøkt. Generelt økte utbyttene for de mest polare analyttene med minkende
konsentrasjon av maursyreløsningene. På grunn av dette og siden 20 mM var den laveste
konsentrasjonen testet i forsøket, var det ønskelig å undersøke om maursyreløsningene med
lavere styrker kunne gi enda høyere utbytter.
Figur 21 Ekstraksjonsutbytter med akseptorfaser som hadde styrker mellom 20-200 mM
Akseptorfasen: 50 µl som vist i figur 21. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336. Donorfasen: 115 µl 0.1 M
bikarbonat-karbonatbuffer pH 10.5 + 125 µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på
200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900
rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.
Delforsøk 2 vist i figur 22 hadde til hensikt å studere konsentrasjonen av maursyre i området 1-
50 mM. Økning av ekstraksjonsutbyttene fra 1 mM til 20 mM kunne skyldes at akseptorfasen
ble surere og dermed sikret ladning av analyttene i økende grad. Følgende nedgang av
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
20 mM HCOOH 50 mM HCOOH 75 mM HCOOH 100 mM HCOOH 150 mM HCOOH 200 mM HCOOH
Utb
ytte
VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU
64
ekstraksjonsutbyttene ved høyere styrke av akseptorfasen kunne være en utsaltningseffekt som
begrenset løseligheten av analyttene. Tabell 36 viser at RSD-verdier var under 15% i de fleste
tilfeller. 20 mM maursyreløsning ble valgt til å bli den optimale akseptorfasen.
Figur 22 Ekstraksjonsutbytter med akseptorfaser som hadde styrker mellom 1-50 mM
Ekstraksjonsbetingelser forble uendret i forhold til de som er beskrevet i figur 21. Den eneste forskjellen var styrke
av akseptorfasen. Figur 22 viser de testede styrker av akseptorfasen.
Tabell 36 Tilhørende RSD-verdier for delforsøk 1 og 2 fra figur 21 og 22
Delforsøk 1
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
20 mM HCOOH 13% 8% 10% 4% 6% 12% 6%
50 mM HCOOH 11% 10% 11% 11% 9% 14% 12%
75 mM HCOOH 6% 6% 4% 8% 5% 16% 13%
100 mM HCOOH 3% 5% 2% 6% 7% 23% 19%
150 mM HCOOH 5% 8% 5% 5% 7% 9% 11%
200 mM HCOOH 5% 7% 5% 4% 6% 7% 6%
Delforsøk 2
1 mM HCOOH 9% 9% 5% 4% 7% 2% 4%
5 mM HCOOH 12% 10% 6% 6% 6% 4% 6%
0.00%
10.00%
20.00%
30.00%
40.00%
50.00%
60.00%
70.00%
1 mM HCOOH 5 mM HCOOH 10 mM HCOOH 20 mM HCOOH 50 mM HCOOH
Utb
ytte
VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU
65
10 mM HCOOH 5% 3% 7% 4% 2% 4% 4%
20 mM HCOOH 8% 8% 8% 3% 8% 9% 4%
50 mM HCOOH 3% 7% 7% 5% 13% 4% 4%
4.2.4. Optimalisering av ekstraksjonstid
Tidskurve ble laget for å kunne bestemme den optimale ekstraksjonstiden. I avsnitt 3.8.5.
nevnes tidspunkter for målinger i dette forsøket. Både akseptorfasen og donorfasen ble
analysert med UHPLC-MS i dette forsøket. Grunnen til det var et ønske om å ha større
kjennskap til fordelingen av analyttene mellom de ulike fasene som funksjon av tid.
De fleste kurvene steg kraftig til 30 min for så å jevne ut mellom 45 og 60 min. VEN og ODV
konsentrasjonen i akseptorfasen falt deretter betydelig. Glukuronidene hadde en konstant og
sakte økning av utbyttene som funksjon av tid, som flatet ut etter 90 min.
Figur 23 Ekstraksjonsutbytter i akseptorfasen som en funksjon av tid
Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µlTPP + 25% A336. Donorfase: 115 µl 0.1 M
bikarbonat-karbonatbuffer pH 10.5 + 125 µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på
200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900
rpm. Ekstraksjonstid: 15, 30, 45, 60, 90, 120 og 180 min. n=4.
Kurvene fra donorfasen viste at mesteparten av alle analyttene ble fjernet fra denne fasen innen
15 min og holdt seg ganske jevnt over de tre kommende timene til tross for en liten økning etter
120 min for de mest upolare metabolittene. Dette kunne tyde på svak tilbake-ekstraksjon etter
lang tid.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Utb
ytte
VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU
66
Resultatene tydet på at analyttene som ikke ble registrert verken i akseptor- eller donorfasen,
befant seg andre steder. De kunne blitt fanget i SLM eller på brønnveggene. Den optimale
ekstraksjonstiden ble valgt til 45 min. Ved dette tidspunktet var ekstraksjonsutbyttene på det
høyeste for de fleste analytter, og det var ingen store forandringer i forhold til 60 min. Valg av
45 min fremfor 60 min bidro i tillegg til forbedret tidseffektivitet av prøveopparbeidelsestrinnet.
RSD-verdier for disse forsøkene presenteres i tabell 37 og 38. Gjennomsnittlige relative
standardavvik for analyttene i akseptorfasen var høyeste ved de to tidligste målingspunktene.
De ble fulgt av lavere verdier spesielt ved 45 min der alle RSD verdier var under 6%.
Figur 24 Ekstraksjonsutbytter i donorfasen som en funksjon av tid
Ekstraksjonsbetingelser forble uendret i forhold til de som er beskrevet i figur 23.
Tabell 37 RSD-verdier for akseptorfasen fremstilt i figur 23
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
15 min 15% 16% 18% 15% 17% 16% 13%
30 min 18% 19% 15% 9% 7% 14% 12%
45 min 3% 6% 3% 3% 6% 6% 6%
60 min 7% 11% 1% 5% 3% 17% 12%
90 min 13% 17% 5% 5% 7% 4% 2%
120 min 15% 17% 5% 3% 5% 7% 5%
180 min 9% 11% 10% 6% 13% 2% 6%
0%
2%
4%
6%
8%
10%
12%
-5 10 25 40 55 70 85 100 115 130 145 160 175 190
Utb
ytte
VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU
67
Tabell 38 RSD-verdier for donorfasen fremstilt i figur 24 V
EN
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
15 min 4% 5% 8% 5% 12% 5% 3%
30 min 8% 16% 33% 6% 3% 4% 4%
45 min 5% 8% 13% 6% 6% 4% 4%
60 min 8% 15% 16% 6% 5% 1% 3%
90 min 8% 14% 9% 9% 9% 5% 4%
120 min 23% 25% 41% 15% 14% 2% 4%
180 min 4% 5% 7% 2% 7% 5% 4%
4.2.5. Optimalisering av bufferstyrken i donorfasen
Ekstraksjonen av glukuronidene og de andre polare metabolittene varierte avhengig av prøven
som de befant seg i. Det ble bekreftet ved hjelp av ekstraksjoner fra ulike urinprøver. Oppnådde
ekstraksjonsutbytter er vist i figur 25. For å redusere denne variasjonen ble effekten av ulike
bufferstyrker i donorfasen undersøkt. Høyere bufferstyrke reduserte innflytelsen av
matrikskomponenter og bidro til en utsaltingseffekt i donorfasen. Til sammen ble det undersøkt
fem ulike styrker som beskrevet i avsnitt 3.8.6. Bikarbonat-karbonatbuffer med styrke på 0.75
M viste de høyeste ekstraksjonsutbyttene med hensyn til glukuronider og ble dermed valgt for
videre arbeid. Det er presentert i tabell 39. Utbyttene av de andre metabolittene var
sammenlignbare med buffere som hadde styrker på 0.5 og 1 M.
Det ble utført et tilsvarende forsøk i forhold til det presentert i figur 25. Bikarbonat-
karbonatbuffer med styrke på 0.1 M ble erstattet med 0.75 M. Det er vist i figur I i Appendix
IV. Resultatene tydet på at variasjonen i ekstraksjonsutbytter var redusert med høyere
bufferstyrke spesielt for de fem mest upolare analyttene. RSD-verdier (ikke vist her) for de to
forsøkene var under 15% i de fleste tilfellene.
68
Figur 25 Sammenligning av ekstraksjonsutbytter oppnådd fra ekstraksjoner med ulike urin prøver
Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336. Donorfase: 115 µl 0.1 M
bikarbonat-karbonatbuffer pH 10.5 + 125 µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på
200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900
rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.
Tabell 39 Ekstraksjonsutbytter og tilhørende RSD verdier for systemer med ulik styrke av
buffer i donorfasen
Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336.
Donorfase: 115 µl bikarbonat-karbonatbuffer pH 10.5 med bufferstyrke som vist i tabell 39 +
125 µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml + 10 µl
interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet
900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
0,1M 44%
(8%)
41%
(9%)
17%
(13%)
14%
(10%)
17%
(9%)
0.1%
(35%)
0.5%
(29%)
0,25M 47%
(3%)
44%
(7%)
36%
(7%)
27%
(5%)
26%
(4%)
0.8%
(17%)
1%
(12%)
0,5M
(n=3)
47%
(1%)
44%
(6%)
42%
(7%)
31%
(1%)
27%
(3%)
1%
(18%)
2%
(17%)
0,75M 43%
(8%)
42%
(6%)
38%
(6%)
32%
(1%)
27%
(8%)
2%
(6%)
2%
(4%)
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
Urin 1 Urin 2 Urin 3 Urin 4
Utb
ytte
Venlafaxine ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU
69
1M 44%
(7%)
44%
(10%)
39%
(6%)
33%
(3%)
27%
(5%)
2%
(19%)
2%
(12%)
Hypotesen bak variasjonen i utbyttene av glukuronider gjaldt mengden av salt i urinen som
burde bli høyere hvis den var konsentrert. Forsøk med såkalt «kunstig urin», beskrevet i avsnitt
3.6.2., viste at salt mengden kunne ha en betydelig effekt hovedsakelig på ekstraksjonen av
glukuronidene. Det er presentert i figur 26. Forsøk med urea viste tilsvarende utbytter og
ekstraksjonsmønster som tydet på at saltkonsentrasjonen hadde større relevans.
Figur 26 Ekstraksjonsutbytter fra kunstig urin som simulerte tre saltkonsentrasjonsnivåer
Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4µl TPP + 25% A336. Donorfase: 115 µl 0.1 M
bikarbonat-karbonatbuffer pH 10.5 + 125 µl «kunstig urin» i tre saltkonsentrasjoner med analyttblanding med
den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen
i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.
4.2.6. Testing av motioner
Figur 23 viser at glukuronidene hadde betydelig lavere ekstraksjonsutbytter i forhold til de
andre analyttene. Samtidig tydet kurvene fra figur 24 på at glukuronidforekomsten i donorfasen
var under 10%. En mulig forklaring var at de var fortsatt i SLM og klarte ikke å dissosiere fra
komplekset med bæremolekyler. Det var dermed ønskelig å undersøke om tilsetting av et
motion i akseptorfasen kunne forbedre ekstraksjonsutbytter. Motionet skulle ha større affinitet
til de funksjonelle gruppene på bæremolekylet og analytten for å fremme dissosiasjonen. De
var valgt på bakgrunn av den relative selektiviteten som de hadde (61). Til sammen var fire
motioner testet som vist i tabell 22. Ingen av dem klarte å forbedre ekstraksjonsutbytter.
Grunnen til det var ukjent.
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
45%
50%
Høy NaClK Medium NaClK Lav NaClK
Utb
ytte
VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU
70
4.3. Evaluering
De endelige ekstraksjonsparameterne var 125 µl urin som ble justert med 115 µl 0.75 M
bikarbonat-karbonatbuffer med pH 10.5 og 10 µl intern standard i donorfasen. SLM besto av 4
µl tripentylfosfat med 25% Aliquat 336 som ble immobilisert i PVDF-membranen.
Akseptorfasen var 50 µl av en 20 mM maursyreløsning. Ekstraksjonstiden var 45 min og
ristehastigheten var 900 rpm. Antall paralleller er beskrevet i avsnitt 3.9. Overnevnte
ekstraksjonsbetingelser var like for tabeller 41 til 47.
4.3.1. Laveste deteksjonsgrense og kvantifiseringsgrense
Avsnitt 3.9.1. beskriver betingelser ved bestemmelsen av LOD og LOQ. Gjennomsnittlig høyde
av hver analytt ble sammenlignet med gjennomsnittlig støyhøyde og på bakgrunn av det ble
signal/støy forholdet funnet. Verdiene ble omregnet til konsentrasjoner oppgitt i ng/ml. LOQ
var beregnet ved hjelp av LOD som ble multiplisert med 3.3. Signal/støy forholdet var da lik
10. Verdier presenteres i tabell 40.
Tabell 40 Analyttens laveste deteksjons- og kvantifiseringsgrense
Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336.
Donorfase: 125 µl 0.75 M bikarbonat-karbonatbuffer pH 10.5 + 125 µl analyttblanding som
vist i avsnitt 3.9.1. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.
VEN NNDODV
LOD 0.26 ng/ml LOD 4.25 ng/ml
LOQ 0.87 ng/ml LOQ 14.15 ng/ml
ODV NODVGLU
LOD 0.23 ng/ml LOD 2.56 ng/ml
LOQ 0.76 ng/ml LOQ 8.53 ng/ml
NDV NNDODVGLU
LOD 0.42 ng/ml LOD 3.68 ng/ml
LOQ 1.40 ng/ml LOQ 12.26 ng/ml
NODV
LOD 0.55 ng/ml
LOQ 1.82 ng/ml
4.3.2. Linearitet
Serie 1 representerte intradaganalyse mens serie 1 og 2 var brukt for interdaganalyse. Analyse
av lineariteten i serie 2 var nødvendig for beregninger av nøyaktighet og presisjon. R2-verdier
for alle analyttene i begge serier var over 0.99.. Det eneste unntaket var NODVGLU i serie 2
som hadde en verdi over 0.98. Det er presentert i tabell 41. Verdier over 0.99 er viktige når
71
metoden skal brukes til kvantifisering (35). Verdier i nærheten av 1 tyder på god korrelasjon
mellom toppareal og konsentrasjon. Kalibreringskurver for NNDODVGLU, NODVGLU og
NNDODV var laget for et konsentrasjonsområde mellom 20 og 1000 ng/ml med syv ulike
konsentrasjonsnivåer. Hvert nivå besto av fire paralleller. De resterende analytter hadde ti
konsentrasjonsnivåer mellom 2 og 1000 ng/ml. Det oppfylte krav som stilles fra EMA
retningslinjer (45). De krever minst seks konsentrasjonsnivåer. Minst 75% av alle tilbake
kalkulerte konsentrasjoner oppfylte krav som stilles i forhold til avvik fra nominelle verdier.
Tabell 41 Kalibreringskurver med tilhørende ligninger og r2-verdier for alle analyttene
Serie 1 Serie 2
VEN 2 – 1000 ng/ml
R^2 = 0.9940 Y=-0.000735804+0.0016478*X-1.3285e-008*X^2
VEN 2 – 1000 ng/ml
R^2 = 0.9979 Y=-2.32071e-005+0.00178545*X-7.25281*X^2
ODV 2 – 1000 ng/ml
R^2 = 0.9968 Y=0.00214864+0.0048334*X-1.15407e-006*X^2
ODV 2 – 1000 ng/ml
R^2 = 0.9950 Y=0.006859+0.00486698*X-1.30346e-006*X^2
NDV 2 – 1000 ng/ml
R^2 = 0.9924 Y=-0.000961599+0.00151653*X-6.89745e-008*X^2
NDV 2 – 1000 ng/ml
R^2 = 0.9933 Y=0.00070075+0.00153775*X-6.49619e-008*X^2
VENY = -0.000735804+0.0016478*X-1.3285e-008*X^2 R^2 = 0.9940 W: 1/X
0 200 400 600 800 1000
ng/mL
0.0
0.5
1.0
1.5
Are
a R
atio
VENY = -2.32071e-005+0.00178545*X-7.25281e-008*X^2 R^2 = 0.9979 W: 1/X
0 200 400 600 800 1000
ng/mL
0.0
0.5
1.0
1.5
Are
a R
atio
ODVY = 0.00214864+0.0048334*X-1.15407e-006*X^2 R^2 = 0.9968 W: 1/X
0 200 400 600 800 1000
ng/mL
0
1
2
3
Are
a R
atio
ODVY = 0.006859+0.00486698*X-1.30346e-006*X^2 R^2 = 0.9950 W: 1/X
0 200 400 600 800 1000
ng/mL
0
1
2
3
Are
a R
atio
NDVY = -0.000961599+0.00151653*X-6.89745e-008*X^2 R^2 = 0.9924 W: 1/X
0 200 400 600 800 1000
ng/mL
0.0
0.5
1.0
1.5
Are
a R
atio
NDVY = 0.00070075+0.00153775*X-6.49619e-008*X^2 R^2 = 0.9933 W: 1/X
0 200 400 600 800 1000
ng/mL
0.0
0.5
1.0
1.5
Are
a R
atio
72
NODV 2 – 1000 ng/ml
R^2 = 0.9932 Y=0.000472237+0.00284025*X-3.40321e-007*X^2
NODV 2 – 1000 ng/ml
R^2 = 0.9908 Y=0.00321006+0.00286773*X-3.28882e-007*X^2
NNDODV 20 – 1000 ng/ml
R^2 = 0.9918 Y=0.00110324+0.00059385*X-2.51865e-008*X^2
NNDODV 20 – 1000 ng/ml
R^2 = 0.9926 Y=0.00043401+0.000642472*X-8.26168e-008*X^2
NODVGLU 20 – 1000 ng/ml
R^2 = 0.9921 Y=-0.000596131+0.000272586*X+5.80109e-
008*X^2
NODVGLU 20 – 1000 ng/ml
R^2 = 0.9856 Y=-0.000896059+0.000264512*X+5.52243e-
008*X^2
NNDODVGLU 20 – 1000 ng/ml
R^2 = 0.9923 Y=-0.000661663+0.00018261*X+2.11402e-
008*X^2
NNDODVGLU 20 – 1000 ng/ml
R^2 = 0.9902 Y=-00042814+0.000170422*X+2.65345e-008*X^2
NODVY = 0.000472237+0.00284025*X-3.40321e-007*X^2 R^2 = 0.9932 W: 1/X
0 200 400 600 800 1000
ng/mL
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Are
a R
atio
NODVY = 0.00321006+0.00286773*X-3.28882e-007*X^2 R^2 = 0.9908 W: 1/X
0 200 400 600 800 1000
ng/mL
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Are
a R
atio
NNDODVY = 0.00110324+0.00059385*X-2.51865e-008*X^2 R^2 = 0.9918 W: 1/X
0 200 400 600 800 1000
ng/mL
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Are
a R
atio
NNDODVY = 0.00043401+0.000642472*X-8.26168e-008*X^2 R^2 = 0.9926 W: 1/X
0 200 400 600 800 1000
ng/mL
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Are
a R
atio
NODVGLUY = -0.000596131+0.000272586*X+5.80109e-008*X^2 R^2 = 0.9921 W: 1/X
0 200 400 600 800 1000
ng/mL
0.0
0.1
0.2
0.3
Are
a R
atio
NODVGLUY = -0.000896059+0.000264512*X+5.52243e-008*X^2 R^2 = 0.9856 W: 1/X
0 200 400 600 800 1000
ng/mL
0.0
0.1
0.2
0.3
Are
a R
atio
NNDODVGLUY = -0.000661663+0.00018261*X+2.11402e-008*X^2 R^2 = 0.9923 W: 1/X
0 200 400 600 800 1000
ng/mL
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Are
a R
atio
NNDODVGLUY = -0.00042814+0.000170422*X+2.65345e-008*X^2 R^2 = 0.9902 W: 1/X
0 200 400 600 800 1000
ng/mL
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Are
a R
atio
73
4.3.3. Overdrag
Det ble gjennomført en visuell inspeksjon av kromatogrammer. Hensyn ble tatt til
retensjonstider av analyttene og topper ble sammenlignet med den laveste
kvantifiseringsgrensen. Det ble ikke observert tegn til overdrag for intern standard eller noen
av analyttene.
4.3.4. Presisjon og nøyaktighet
Tabell 42 presenterer RSD verdier som ble beregnet på bakgrunn av QC-prøver fra serie 1. Alle
verdier var innenfor krav som stilles av EMA (45). Det tydet på at spredningen i resultatene var
liten.
Tabell 42 Evaluering - Presisjon fra intradaganalyse
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
2 ng/ml 4% 4% 7% 9%
6 ng/ml 7% 5% 4% 4%
20 ng/ml 8% 5% 6% 5% 13% 10% 11%
60 ng/ml 7% 6% 4% 8% 6% 7% 6%
400 ng/ml 5% 7% 4% 3% 6% 5% 6%
850 ng/ml 5% 5% 10% 8% 7% 9% 9%
Nøyaktigheten fra serie 1 er presentert i tabell 43. QC-prøvene for VEN, NDV og NODV
overskred kravene. Alle andre resultater plasserte seg innenfor kravene fra retningslinjer. Til
sammen hadde 6 av 36 verdier ikke oppfylt EMA kravene. De er markert med understreking.
Tabell 43 Evaluering - Nøyaktighet fra intradaganalyse
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
2 ng/ml 123% 93% 131% 116%
6 ng/ml 104% 107% 114% 118%
74
20 ng/ml 105% 115% 117% 125% 109% 119% 120%
60 ng/ml 98% 104% 107% 116% 108% 109% 100%
400 ng/ml 96% 96% 98% 100% 103% 109% 101%
850 ng/ml 104% 105% 109% 112% 111% 112% 108%
ODV, NDV og NODV fra interdaganalyse overskred 20% grensen for presisjon for de laveste
QC-prøvene. Dette kunne skyldes en liten avstand fra LOQ. Alle andre verdier var innenfor
krav som vist i tabell 44.
Tabell 44 Evaluering - Presisjon fra interdaganalyse
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
2 ng/ml 18% 41% 27% 36%
6 ng/ml 6% 11% 10% 12%
20 ng/ml 10% 10% 10% 12% 14% 12% 14%
60 ng/ml 7% 6% 8% 11% 11% 13% 12%
400 ng/ml 5% 5% 7% 7% 7% 9% 10%
850 ng/ml 7% 5% 10% 12% 9% 11% 10%
De laveste QC-prøvene for ODV var under (under 20%) mens var over (over 20%) kravene for
NODVGLU. EMA stiller krav til ± 20% avvik for de laveste QC-prøvene og 15% for de med
høyere konsentrasjoner (45). Det er presentert i tabell 45. Alle andre verdier var innenfor
grensene.
Tabell 45 Evaluering - Nøyaktighet fra interdaganalyse
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
2 ng/ml 109% 64% 102% 86%
6 ng/ml 101% 96% 103% 104%
20 ng/ml 96% 105% 107% 114% 110% 121% 118%
60 ng/ml 93% 101% 102% 108% 104% 109% 101%
75
400 ng/ml 94% 95% 102% 100% 101% 107% 102%
850 ng/ml 100% 103% 103% 104% 108% 105% 103%
For 72 presisjonsmålinger i evaluering var 69 innenfor EMA kravene mens tre målinger var
utenfor. For nøyaktighetsmålingene var 64 av resultatene innenfor kravene mens åtte målinger
var utenfor. Dette prosjektet var konseptuelt og dermed anses disse resultatene som akseptable
på nåværende stadium.
4.3.5. Matrikseffekter
De to laveste konsentrasjonene for NDV og alle for VEN var under kravet på 15% i forhold til
nøyaktighet. Det er presentert i tabell 46. Alle andre verdier var innenfor kravene. VEN og
NDV hadde lignende retensjonstider som differensierte fra hverandre med 0.03 min. Det kan
skje at litt av SLM lekket ut i akseptorfasen som funksjon av tiden, og at dette koeluerte med
VEN og NDV under LC-MS analysene. På denne måten bidro den til ioneundertrykkelse i MS.
Alternativt skyldes det noen ikke karakteriserte endogene forbindelser fra urinen som klarte å
diffundere gjennom SLM. Dette bør undersøkes nærmere på et senere tidspunkt.
Tabell 46 Matrikseffekter
6 ng/ml 60 ng/ml 340 ng/ml
VEN 73% 78% 84%
ODV 110% 102% 99%
NDV 77% 83% 86%
NODV 106% 100% 99%
NNDODV
95% 96%
NODVGLU
97% 98%
NNDODVGLU
91% 94%
4.3.6. Ekstraksjonsutbytte
Bestemmelsen av ekstraksjonsutbytte er ikke et krav fra retningslinjer (45). Resultater er
allikevel rapportert siden det er anbefalt for teknikker der analytter befinner seg i ulike faser
under prøveopparbeidelsestrinnet (1). Det er tilfelle med PALME. Ekstraksjonsutbytter vises i
tabell 47.
76
Tabell 47 Ekstraksjonsutbytte
6 ng/ml 60 ng/ml 340 ng/ml1
VEN 42% 40% 44%
ODV 42% 45% 47%
NDV 49% 50% 52%
NODV 49% 53% 53%
NNDODV
45% 46%
NODVGLU
14% 15%
NNDODVGLU 12% 12% 1 I motsetning til 6 og 60 ng/ml ble 340 ng/ml ikke beregnet i forhold til en tilsvarende QC-prøve konsentrasjon.
Utgangspunktet ble tatt i en QC-prøve på 400 ng/ml som ble ganget med 0.85 som ga 340 ng/ml.
Ekstraksjonsutbytter varierte fra 12% til 53%. Utbytter av glukuronidene var omtrent tre ganger
lavere i forhold til de andre analyttene. Forskjeller mellom de ulike konsentrasjonene var
neglisjerbare i de fleste tilfellene. Dette tydet på ekstraksjoner ikke var
konsentrasjonsavhengige.
77
5. Konklusjon
Resultatene fra dette prosjektet viste at PALME klarte å ekstrahere legemiddelet venlafaksin
med tilhørende metabolitter i ett prøveopparbeidelsestrinn fra urin. Metabolitter inkluderte
glukuronider som hadde amfotære egenskaper. PALME viste dermed for første gang at det var
en egnet teknikk for ekstraksjoner av analyttblandinger med et bredt spekter av log P-verdier
fra -1.2 til 2.5.
Det var mulig ved hjelp av en omfattende optimalisering av ekstraksjonsbetingelser. Det
innebar bruk av tripentylfosfat som var et helt nytt organisk løsemiddel i PALME-sammenheng.
Det var blandet sammen med Aliquat 336 siden dens bæreregenskaper muliggjorde
ekstraksjonen av glukuronidene. Denne blandingen var brukt for å danne SLM. En forsiktig
justering av pH-betingelser i donorfasen med bikarbonat-karbonatbuffer fremfor en NaOH-
løsning var også nytt og tillot oppnåelsen av høyere ekstraksjonsutbytter. Akseptorfasen
bestående av maursyreløsning ble til slutt injisert direkte i UHPLC-MS/MS.
Ekstraksjonsutbytter var mellom 12 og 53% for henholdsvis polar NNDODVGLU og NODV.
Evaluering av metoden var basert på retningslinjer fra europeiske legemiddelmyndigheter
(EMA). Testing av linearitet, presisjon, nøyaktighet, overdrag og matrikseffekter var blant de
undersøkte parameterne. Mange av de oppnådde verdiene var innenfor krav. Alle
kalibreringskurver hadde r2-verdier over 0.99 unntatt en enkel måling av NODVGLU som
plasserte seg over 0.98. Over 90% av QC-prøver var i samsvar med retningslinjer.
Evalueringsresultater var ansett som akseptable på grunn av den konseptuelle naturen av dette
prosjektet.
Videreutvikling av dette prosjektet kunne rette sitt fokus mot stabilitetsstudier for å få større
kontroll over eventuell degradering av analytter ved brukte betingelser. Matrikseffekter for de
mest upolare analyttene VEN og NDV burde også undersøkes nærmere i forhold til
komponenter fra urinen eller lekkasje av SLM ut i akseptorfasen som kunne bidra til
ioneundertrykkelse.
Disse resultatene bekreftet igjen potensialet av PALME. Den teknikken er egnet for
ekstraksjoner av analyttblandinger med et bredt område av log P-verdier. I tillegg tillater
PALME ekstraksjoner av både basiske og zwitterioniske analytter i ett
prøveopparbeidelsestrinn. Det åpner veien for nye anvendelsesområder som kan etter hvert
78
utnyttes for legemiddelmetabolismestudier i drug discovery eller monitorering av legemidler
og tilhørende metabolitter på rutinelaboratorier.
79
6. Referanseliste
1. Hansen SH, Pedersen-Bjergaard S. Bioanalysis of Pharmaceuticals: Sample
Preparation, Separation Techniques and Mass Spectrometry. Hoboken: Wiley; 2015. 318 s.
2. Schlittenbauer L, Seiwert B, Reemtsma T. Matrix effects in human urine analysis
using multi-targeted liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Journal of
Chromatography A. 2015;1415:91-99.
3. Bylda C, Thiele R, Kobold U, Volmer DA. Recent advances in sample preparation
techniques to overcome difficulties encountered during quantitative analysis of small
molecules from biofluids using LC-MS/MS. Analyst. 2014;139(10):2265-2276.
4. Pawliszyn J, Pedersen-Bjergaard S. Analytical Microextraction: Current Status and
Future Trends. Journal of Chromatographic Science. 2006;44(6):291-307.
5. Jeannot MA, Cantwell FF. Solvent Microextraction into a Single Drop. Analytical
Chemistry. 1996;68(13):2236-2240.
6. Pedersen-Bjergaard S, Rasmussen KE. Liquid−Liquid−Liquid Microextraction for
Sample Preparation of Biological Fluids Prior to Capillary Electrophoresis. Analytical
Chemistry. 1999;71(14):2650-2656.
7. Sarafraz-Yazdi A, Amiri A. Liquid-phase microextraction. Trends in Analytical
Chemistry. 2010;29(1):1-14.
8. Gjelstad A. Parallel artificial liquid membrane extraction: micro-scale liquid–liquid–
liquid extraction in the 96-well format. Bioanalysis. 2013;5(11):1377-1385.
9. Roldán-Pijuán M, Pedersen-Bjergaard S, Gjelstad A. Parallel artificial liquid
membrane extraction of acidic drugs from human plasma. Analytical and Bioanalytical
Chemistry. 2015;407(10):2811-2819.
10. Ask KS, Bardakci T, Parmer MP, Halvorsen TG, Øiestad EL, Pedersen-Bjergaard S, et
al. Parallel artificial liquid membrane extraction as an efficient tool for removal of
phospholipids from human plasma. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.
2016;129:229-236.
11. Vårdal L, Askildsen H-M, Gjelstad A, Øiestad EL, Edvardsen HME, Pedersen-
Bjergaard S. Parallel artificial liquid membrane extraction of new psychoactive substances in
plasma and whole blood. Journal of Chromatography B. 2017;1048:77-84.
12. Pilarova V, Sultani M, Ask KS, Novakova L, Pedersen-Bjergaard S, Gjelstad A. One-
step extraction of polar drugs from plasma by parallel artificial liquid membrane extraction.
Journal of Chromatography B. 2017;1043:25-32.
13. Ho TS, Egge Reubsaet JL, Anthonsen HS, Pedersen-Bjergaard S, Rasmussen KE.
Liquid-phase microextraction based on carrier mediated transport combined with liquid
chromatography–mass spectrometry: New concept for the determination of polar drugs in a
single drop of human plasma. Journal of Chromatography A. 2005;1072(1):29-36.
14. Shariati S, Yamini Y, Esrafili A. Carrier mediated hollow fiber liquid phase
microextraction combined with HPLC–UV for preconcentration and determination of some
tetracycline antibiotics. Journal of Chromatography B. 2009;877(4):393-400.
15. Rodriguez-Aller M, Gurny R, Veuthey J-L, Guillarme D. Coupling ultra high-pressure
liquid chromatography with mass spectrometry: Constraints and possible applications. Journal
of Chromatography A. 2013;1292:2-18.
16. Kim HY, Yoon SH, Jeong T-Y, Yu S, Kim SD. Determination of conjugated estrogens
in human urine using carrier-mediated hollow-fiber liquid phase microextraction and LC-
MS/MS. Desalination and Water Treatment. 2016;57(34):16024-16033.
17. Magalhães P, Alves G, Llerena A, Falcão A. Venlafaxine pharmacokinetics focused
on drug metabolism and potential biomarkers. Drug Metabolism and Drug Interactions.
2014;29(3):129-141.
80
18. Holliday SM, Benfield P. Venlafaxine: A review of its pharmacology and therapeutic
potential in depression. Drugs. 1995;49(2):280-294.
19. Hiemke C, Baumann P, Bergemann N, Conca A, Dietmaier O, Egberts K, et al. AGNP
Consensus Guidelines for Therapeutic Drug Monitoring in Psychiatry: Update 2011.
Pharmacopsychiatry. 2011;21(06):195-235.
20. Nemeroff CB, DeVane CL, Pollock BG. Newer antidepressants and the cytochrome
P450 system. American Journal of Psychiatry. 1996;153(3):311-20.
21. Howell SR, Husbands GEM, Scatina JA, Sisenwine SF. Metabolic disposition of 14C-
venlafaxine in mouse, rat, dog, rhesus monkey and man. Xenobiotica. 1993;23(4):349-359.
22. Kohler I, Guillarme D. Multi-target screening of biological samples using LC-MS/MS:
focus on chromatographic innovations. Bioanalysis. 2014;6(9):1255-73.
23. Putnam DF. Composition and concentrative properties of human urine. Technical
Report. Washington: McDonnell Douglas Astronautics Company; 1971. Report No.: NASA-
CR-1802 Contract No.: NAS1-8954.
24. Jessop PG, Jessop DA, Fu D, Phan L. Solvatochromic parameters for solvents of
interest in green chemistry. Green Chemistry. 2012;14(5):1245-1259.
25. Clement RE, Hao C. Liquid–Liquid Extraction: Basic Principles and Automation. I:
Pawliszyn J, red. Comprehensive Sampling and Sample Preparation. Oxford: Academic Press;
2012. s. 51-63.
26. Pedersen-Bjergaard S, Rasmussen KE. Liquid-phase microextraction with porous
hollow fibers, a miniaturized and highly flexible format for liquid–liquid extraction. Journal
of Chromatography A. 2008;1184(1):132-142.
27. Gjelstad A, Jensen H, Rasmussen KE, Pedersen-Bjergaard S. Kinetic aspects of
hollow fiber liquid-phase microextraction and electromembrane extraction. Analytica
Chimica Acta. 2012;742:10-16.
28. Bello-López MÁ, Ramos-Payán M, Ocaña-González JA, Fernández-Torres R,
Callejón-Mochón M. Analytical Applications of Hollow Fiber Liquid Phase Microextraction
(HF-LPME): A Review. Analytical Letters. 2012;45(8):804-830.
29. Chimuka L, Cukrowska E, Michel M, Buszewski B. Advances in sample preparation
using membrane-based liquid-phase microextraction techniques. Trends in Analytical
Chemistry. 2011;30(11):1781-1792.
30. Ho TS, Halvorsen TG, Pedersen-Bjergaard S, Rasmussen KE. Liquid-phase
microextraction of hydrophilic drugs by carrier-mediated transport. Journal of
Chromatography A. 2003;998(1):61-72.
31. Carasek E, Merib J. Membrane-based microextraction techniques in analytical
chemistry: A review. Analytica Chimica Acta. 2015;880:8-25.
32. Gjelstad A, Andresen AT, Dahlgren A, Gundersen TE, Pederson-Bjergaard S. High-
Throughput Liquid–Liquid Extraction in 96-Well Format: Parallel Artificial Liquid
Membrane Extraction. LCGC Europe. 2017;30(1):10–17.
33. Eibak L, Parmer M, Rasmussen K, Pedersen-Bjergaard S, Gjelstad A. Parallel
electromembrane extraction in a multiwell plate. Analytical and Bioanalytical Chemistry.
2014;406(2):431-440.
34. Fekete S, Schappler J, Veuthey JL, Guillarme D. Current and future trends in UHPLC.
Trends in Analytical Chemistry. 2014;63:2-13.
35. Pedersen-Bjergaard S, Rasmussen KE. Legemiddelanalyse. 2. utg. Bergen:
Fagbokforlaget; 2010. 505 s.
36. Lundanes E, Reubsaet L, Greibrokk T. Chromatography : basic principles, sample
preparations and related methods. Weinheim: Wiley-VCH; 2014. 207 s.
37. Vissers JPC, Claessens HA, Cramers CA. Microcolumn liquid chromatography:
instrumentation, detection and applications. Journal of Chromatography A. 1997;779(1):1-28.
81
38. Nováková L, Matysová L, Solich P. Advantages of application of UPLC in
pharmaceutical analysis. Talanta. 2006;68(3):908-918.
39. Steuer AE, Poetzsch M, Koenig M, Tingelhoff E, Staeheli SN, Roemmelt AT, et al.
Comparison of conventional liquid chromatography–tandem mass spectrometry versus
microflow liquid chromatography–tandem mass spectrometry within the framework of full
method validation for simultaneous quantification of 40 antidepressants and neuroleptics in
whole blood. Journal of Chromatography A. 2015;1381:87-100.
40. Bruins AP. Mechanistic aspects of electrospray ionization. Journal of Chromatography
A. 1998;794(1–2):345-357.
41. Schwartz JC, Senko MW, Syka JEP. A two-dimensional quadrupole ion trap mass
spectrometer. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2002;13(6):659-669.
42. Ando DJ, red. Mass spectrometry. 2. utg. Chichester: Wiley; 1999. 509 s.
43. American Chemical Society. Substance Identifier. [hentet 12.03.2017]. Tilgjengelig
fra: http://www.scifinder.cas.org.
44. Stoll VS, Blanchard JS. Buffers: Principles and practice. Methods in Enzymology.
1990;182:24-38.
45. Committee for Medicinal Products for Human Use - European Medicines Agency.
Guideline on bioanalytical method validation: 2011 [hentet 20.03.2017]. Tilgjengelig fra:
http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2011/08/WC5
00109686.pdf.
46. Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Strategies for the assessment of
matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS. Analytical
Chemistry. 2003;75(13):3019.
47. Seip K, Gjelstad A, Pedersen-Bjergaard S. The potential of electromembrane
extraction for bioanalytical applications. Bioanalysis. 2015;7:463-480.
48. Stenutz R. Kamlet-Taft solvent parameters. [hentet 28.03.2017]. Tilgjengelig fra:
http://www.stenutz.eu/chem/solv26.php.
49. Huang C, Gjelstad A, Pedersen-Bjergaard S. Electromembrane extraction with
alkylated phosphites and phosphates as supported liquid membranes. Journal of Membrane
Science. 2017;526:18-24.
50. Huang C, Seip KF, Gjelstad A, Pedersen-Bjergaard S. Electromembrane extraction of
polar basic drugs from plasma with pure bis(2-ethylhexyl) phosphite as supported liquid
membrane. Analytica Chimica Acta. 2016;934:80-87.
51. Spietelun A, Marcinkowski Ł, de la Guardia M, Namieśnik J. Green aspects,
developments and perspectives of liquid phase microextraction techniques. Talanta.
2014;119:34-45.
52. Pabby AK, Sastre AM. State-of-the-art review on hollow fibre contactor technology
and membrane-based extraction processes. Journal of Membrane Science. 2013;430:263-303.
53. Tao Y, Liu J-F, Hu X-L, Li H-C, Wang T, Jiang G-B. Hollow fiber supported ionic
liquid membrane microextraction for determination of sulfonamides in environmental water
samples by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A.
2009;1216(35):6259-6266.
54. Lee J-M, Ruckes S, Prausnitz JM. Solvent Polarities and Kamlet−Taft Parameters for
Ionic Liquids Containing a Pyridinium Cation. The Journal of Physical Chemistry B.
2008;112(5):1473-1476.
55. Ab Rani MA, Brant A, Crowhurst L, Dolan A, Lui M, Hassan NH, et al.
Understanding the polarity of ionic liquids. Physical Chemistry Chemical Physics.
2011;13(37):16831-16840.
56. ChemAxon. logD vs pH. [hentet 29.03.2017]. Tilgjengelig fra:
http://www.chemicalize.com/.
82
57. EcoOnline AS. Sikkerhetsdatablad. [hentet 15.08.2016-15.05.2017]. Tilgjengelig fra:
http://www.ecoonline.no/.
58. Gjelstad A, Rasmussen KE, Pedersen-Bjergaard S. Electrokinetic migration across
artificial liquid membranes: Tuning the membrane chemistry to different types of drug
substances. Journal of Chromatography A. 2006;1124(1–2):29-34.
59. Arjomandi-Behzad L, Yamini Y, Rezazadeh M. Pulsed electromembrane method for
simultaneous extraction of drugs with different properties. Analytical Biochemistry.
2013;438(2):136-143.
60. Balakin KV, Savchuk NP, Tetko IV. In silico approaches to prediction of aqueous and
DMSO solubility of drug-like compounds: Trends, problems and solutions. Current Medicinal
Chemistry. 2006;13(2):223-241.
61. Simpson N, van Horne KC. Sorbent extraction technology. 2. utg. Harbor City, CA:
Varian Sample Preparation Products; 1993. 138 s.
83
7. Appendix I. Sammenligning av ulike ristemønstre og volumer i donor- og akseptorfasen
Tabell I Utbytter og tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner utført med Vibramax 100 og
Reax 2 ristemaskiner med ulike volum av donor- og akseptorfasen
Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl dodecylacetat + 1% TOA.
Donorfase: 250 µl 10 mM NaOH-løsning med analyttblanding med den endelige
konsentrasjonen i donorfasen på 250 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min.
n=5.
OD
V
Ven
lafa
ksi
n
Cit
alo
pra
m
Paro
kse
tin
Flu
ok
seti
n
Flu
vok
sam
in
Norf
luok
seti
n
Ser
trali
n
Vibramax
200 µl Donor
100 µl Akseptor
9%
(8%)
82%
(6%)
74%
(14%)
77%
(20%)
68%
(26%)
83%
(10%)
58%
(15%)
49%
(22%)
Vibramax
200 µl Donor
75 µl Akseptor
10%
(6%)
79%
(3%)
67%
(9%)
72%
(11%)
64%
(17%)
78%
(7%)
54%
(11%)
46%
(23%)
Vibramax
200 µl Donor
50 µl Akseptor
9%
(8%)
74%
(4%)
63%
(8%)
71%
(12%)
61%
(14%)
77%
(6%)
52%
(7%)
45%
(11%)
Vibramax
150 µl Donor
50 µl Akseptor
18%
(9%)
86%
(2%)
81%
(2%)
88%
(7%)
94%
(3%)
90%
(3%)
66%
(7%)
71%
(5%)
Vibramax
250 µl Donor
50 µl Akseptor
12%
(13%)
68%
(6%)
58%
(9%)
64%
(15%)
55%
(15%)
69%
(9%)
46%
(7%)
36%
(16%)
Reax
200 µl Donor
100 µl Akseptor
14%
(6%)
92%
(6%)
85%
(6%)
95%
(8%)
92%
(3%)
89%
(8%)
71%
(3%)
79%
(7%)
Reax
200 µl Donor
75 µl Akseptor
10%
(24%)
76%
(18%)
70%
(23%)
72%
(29%)
76%
(29%)
72%
(28%)
56%
(27%)
70%
(24%)
Reax
200 µl Donor
50 µl Akseptor
11%
(16%)
77%
(6%)
70%
(10%)
81%
(10%)
82%
(7%)
81%
(10%)
57%
(11%)
73%
(9%)
Reax
150 µl Donor
50 µl Akseptor
15%
(13%)
78%
(5%)
75%
(10%)
86%
(12%)
92%
(10%)
79%
(12%)
60%
(16%)
71%
(14%)
Reax
250 µl Donor
50 µl Akseptor
9%
(27%)
62%
(12%)
58%
(14%)
69%
(15%)
64%
(21%)
70%
(14%)
47%
(23%)
49%
(38%)
84
Tabell I viser resultater som ble oppnådd med en annen analyttblanding bestående av basiske
legemidler. Den ble brukt i påvente av modellsubstansen venlafaksin og dens metabolitter.
Formålet med dette forsøket var å finne ut om PALME kunne brukes med andre ristemønster
og om ekstraksjonsutbytter ble betydelig påvirket. Vibramax 100 og Reax 2 begge fra Heidolph
Instruments (Schwabach, Tyskland) ble brukt.
Resultatene viste at PALME var mulig å bruke med en Reax 2. De tydet også på at optimale
volumer burde justeres individuelt til hver ristemaskin.
I tillegg ble det utført forsøk av tilsvarende omfang med andre ristemønstre. HulaMixer®
Sample Mixer fra Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA), festing av PALME-platen
med 25o på Vibramax 100 og bruk av magnetomrøring i både akseptor- og donorfasen ble testet.
De førte allikevel til lavere ekstraksjonsutbytter, lekkasjer av fasene fra plater og perforasjon
av membranen.
Reax 2 og Vibramax 100 var testet for omvendte systemer. Det innebar at noen systemer ble
snudd slik at donorfasen ble fylt i akseptorbønner og akseptorfasen i donorbrønner. Reax 2 viste
at ekstraksjonsutbytter kunne oppnå samme nivå som for ikke omvendte systemer og samtidig
bevarte RSD-verdier under 15%. Vibramax 100 ga lavere ekstraksjonsutbytter for omvendte
systemer.
Det ble også utført sammenligning av ekstraksjonstider mellom Vibramax og Reax.
Tidskurvene hadde fem måletidspunkter fra 15 til 90 min. Både akseptor- og donorfasen ble
testet. Resultatene har ikke vist tydelige forskjeller i ekstraksjonstid profiler.
Til tross for høyere ekstraksjonsutbytter med Reax 2 i noen systemer ble det bestemt at
Vibramax 100 var den foretrukne ristemaskinen. Grunnen til det var muligheten for oppnåelsen
av høyere oppkonsentreringsfaktor, enklere bruk og redusert fare for lekkasjer.
85
II. Blanding av bis(2-etylheksyl)fosfitt og tributylfosfat med 1-metyl-3-
oktylimidazolium tetrafluoroborat
Tabell II Utbytter og tilhørende RSD-verdier oppnådde med blanding av bis(2-
etylheksyl)fosfitt og tributylfosfat med 1-metyl-3-oktylimidazolium tetrafluoroborat i forhold
1:1.
Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i tabell
II. Alle organiske faser inneholdt 1% TOA. Donorfase: 250 µl 10 mM NaOH-løsning med
analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 250 ng/ml. Ristehastighet
900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=5.
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
Dodecylacetat 96%
(8%)
7%
(8%)
63%
(10%)
NA 1%
(7%)
NA NA
Bis(2-etylheksyl)fosfitt +
1-metyl-3-oktyl
imidazolium
tetrafluoroborat (1:1)
NA 26%
(14%)
NA 8%
(13%)
4%
(12%)
NA NA
Tributylfosfat +
1-metyl-3-oktyl
imidazolium tetrafluoroborat
(1:1)
NA 6%
(57%)
NA 5%
(17%)
3%
(9%)
NA NA
NA = ikke tilgjengelig på grunn av ingen målbare signaler
86
III. Tilsetting av DMSO til akseptorfasen
Tabell III Utbytter og tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner med varierende mengde av
DMSO i akseptorfasen
Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TBP + 20% A336.
Donorfasen: 125 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer pH 9.5 + 125 µl analyttblanding med
den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm.
Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.
VE
N
OD
V
ND
V
NO
DV
NN
DO
DV
NO
DV
GL
U
NN
DO
DV
GL
U
20mM HCOOH 69%
(15%)
53%
(7%)
60%
(17%)
49%
(21%)
51%
(12%)
8%
(14%)
15%
(11%)
20mM HCOOH +
25% DMSO
34%
(10%)
21%
(8%)
38%
(5%)
17%
(7%)
11%
(12%)
7%
(18%)
9%
(8%)
20mM HCOOH +
50% DMSO
9%
(33%)
6%
(29%)
12%
(49%)
5%
(37%)
3%
(34%)
2%
(44%)
2%
(56%)
20mM HCOOH +
75% DMSO
4%
(21%)
2%
(26%)
2%
(18%)
1%
(21%)
1%
(118%)
NA NA
NA = ikke tilgjengelig på grunn av ingen målbare signaler
87
IV. Sammenligning av flere urinprøver med 0.75M bikarbonat-karbonatbuffer
Figur I Sammenligning av ekstraksjonsutbytter oppnådd fra ekstraksjoner med ulike urin prøver
Akseptorfase: 50 µl 20 mM maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336. Donorfase: 115 µl 0.75 M
bikarbonat-karbonatbuffer pH 10.5 + 125 µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på
200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900
rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
Urin 1 Urin 2 Urin 3 Urin 4
Utb
ytte
VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU
88
V. Poster presentert på det 16. norske seminar i massespektrometri