ASP 2010 CECC - Les Antioxydants
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Les Antioxydants
Identification et adresse des auteurs du projet :
Jol Nron 795 boulevard Campbell, Chibougamau, QC [email protected]
Gabryelle Gagnon 130 rue Jaculet, Chibougamau, QC [email protected]
Abstract :
The objective of our project was to determinate the concentrations of phenols in red wines, white wines and many different types of tea. In order to do that, we needed to measure the absorbance of each sample at 765 nm. Before we could measure the absorbance, we needed to make a solution with 1.68 mL of water, 100 L of Folin-Ciocalteu reagent, 300 L of sodium carbonate solution and 20 L of the sample we wanted to measure. For white wines and teas, we directly added 20 L to the solution, but in the case of red wines, we needed to dilute the wine by 10 before we could add 20 L to the solution. We did this experiment with 3 different white wines, 3 different red wines and many different types of teas. The average concentration of phenol antioxidants in white wines is 317,73 mg/L, the average in red wines is 2177,04 mg/L, the average in green tea is 750,99 mg/L, the average in black tea is 663,68 mg/L, the average in white tea is 905,17 mg/L and the average in gray tea is 854,17 mg/L. To conclude, the sample that contains the greatest concentration of phenol antioxidants is the red wine, then the concentration decreases in the following order: white tea, gray tea, green tea, black tea and white wine. If you want to drink something that contains a lot of antioxidants, you can drink red wine but we also recommend the white tea because, although it contains less antioxidants, it does not contain alcohol, so it can be drunk in greater quantities without causing the problems that alcohol could cause.
Mots Cls :
Polyphnol (antioxydant) Spectrophotomtre UV Vin Th Biologie Chimie
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Introduction :
Lobjectif du projet tait de mesurer la concentration en antioxydants de diffrents vins rouges, vins blancs et ths de toutes sortes. La problmatique qui parle de limportance des antioxydants se lit comme suit :
De nos jours, de plus en plus de personnes souffrent de diffrents types cancers. Le cancer est une maladie cause par un drglement dune ou de plusieurs cellules qui se divisent beaucoup plus rapidement que les cellules normales. Ce drglement peut, entre autres, tre caus par les radicaux libres, des ions trs ractifs produits par de nombreuses ractions chimiques du corps. Les antioxydants aident prvenir les cancers causs par les radicaux libres. En effet, les antioxydants consomms ragissent avec les radicaux libres du corps pour les neutraliser et ainsi viter que ceux-ci ragissent avec les cellules en sant et les transforment en cellules cancreuses. Cest pourquoi il est trs important de consommer un nombre suffisant dantioxydants.
Les hypothses vrifier au sujet de la quantit dantioxydants dans les vins et les ths taient : (internet 4, 10,15)
1) La quantit dantioxydants de
type polyphnol dcroit dans
lordre suivant : Th, vin rouge,
vin blanc.
2) La source principale
dantioxydants de type
polyphnol du vin rouge est la
pellicule des raisins (Dufour,
2010).
Un antioxydant est une molcule qui
diminue ou empche loxydation
d'autres substances chimiques.
L'oxydation fait partie d'une raction
d'oxydorduction, qui transfre des
lectrons d'une substance vers un agent
oxydant. Cette raction peut produire
des radicaux libres qui entranent des
ractions en chane destructrices. Les
antioxydants sont capables darrter ces
ractions en chane en s'oxydant avec
les radicaux libres et en inhibant ainsi
leur action. Ces proprits se trouvent
beaucoup dans les familles des thiols et
des phnols (internet 4). Les radicaux
libres sont des substances instables
surtout composes doxygne. Cest la
structure chimique des radicaux libres
qui fait en sorte quils endommagent les
autres atomes en les oxydant. Si les
radicaux libres deviennent plus
nombreux que la capacit de
lorganisme les neutraliser, ils
contribuent lapparition de maladies et
au vieillissement. Il existe plusieurs
sources dantioxydants, mais la
principale est les fruits et lgumes. De
plus, cest un peu pour cette raison que
le guide alimentaire canadien
recommande de 5 10 portions de fruits
et lgumes par jour. Du ct des fruits,
ce sont les petits qui sont les plus
antioxydants : bleuets, mres,
canneberges, framboises, fraises et
pruneaux. Pour les lgumes, ce sont
lartichaut, lasperge, le brocoli, le chou
rouge, le poivron jaune et les pommes
de terre. De plus, les lgumineuses
telles que les haricots blancs, pinto et
rognons sont trs antioxydantes
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(internet 5). Les molcules
antioxydantes que les organismes
vivants produisent ou utilisent sont par
exemple la vitamine C, la vitamine E, le
glutathion ou il y a certaines enzymes
comme la catalase, le superoxyde
dismutase etc. (internet 4) Lunit de
mesure utilise pour mesurer les
antioxydants quun aliment contient est
lORAC. ORAC est lacronyme de
oxygne radical absorbance capacity
(capacit dabsorption des radicaux
oxygne). Cette mthode provient de
recherche luniversit Tufts Boston
et elle consiste mesurer la quantit de
radicaux libres quune substance peut
absorber. Ainsi, la communaut
scientifique est capable de classer les
aliments en fonction de leur pouvoir
antioxydant (internet 8).
Figure 1 : Modle spatial de la molcule
du glutathion. La sphre jaune
reprsente l'atome rducteur de soufre
qui apporte la fonction antioxydante. Les
sphres rouges, bleues, blanches et
grises reprsentent respectivement les
atomes d'oxygne, d'azote, d'hydrogne
et de carbone.
Lors de lexprience ralise, les
antioxydants doss taient de type
polyphnol. Un phnol est un compos
cyclique 6 carbones portant une
fonction hydroxyle OH. Les drivs
portant plusieurs fonctions -OH sont
appels des polyphnols (internet 6).
Les polyphnols constituent une famille
de molcules organiques largement
prsente dans le rgne vgtal. Les
trois principaux antioxydants de type
polyphnol sont les catchines, les
thaflavines et les tharubigines. Ils sont
caractriss, comme lindique le nom,
par la prsence de plusieurs
groupements phnoliques associs en
structures plus ou moins complexes
(internet 5-7). Les vins et les ths
contiennent notamment de ce type
dantioxydant.
Figure 2 : Le phnol - Le plus simple des composs phnoliques
Figure 3 : Une molcule danthocyane
un polyphnol prsent dans le raisin
Cabernet-sauvignon.
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Les bienfaits des antioxydants sur le corps sont nombreux. La plupart de ces bienfaits sont lis aux maladies cardiovasculaires, aux cancers et dautres maladies lies au vieillissement. Voici quelques exemples de cela tir de la littrature. Un oxydant naturel, le Resvratrol, trouv dans les peaux de raisins et dans le vin rouge, peut aider dtruire les cellules cancreuses du pancras en paralysant la fonction des mitochondries des cellules (internet 9). Les antioxydants du th empchent le cholestrol de soxyder et dadhrer aux parois des artres alors, pour cette raison, ils diminuent les risques de maladies cardiaques (internet 10).
Le vin rouge est obtenu par la fermentation du mot de raisin noir avec sa pellicule et ses ppins tendis que le vin blanc est fabriqu partir de la fermentation alcoolique de raisins pulpe non colore et pellicule blanche ou noire. Pour le vin blanc, on ne garde pas la pellicule du raisin (internet 11 et 12) (Dufour, 2010). Le cpage, soit la varit de vigne utilise pour produire un vin, dtermine le genre de vin qui sera produit. Par exemple, si le cpage est un merlot, le vin sera du mme nom. Le vin est une bonne source dantioxydant et cest en grande partie grce au raisin qui le compose.
Camellia sinensis, ou plus
communment appel le th, est un
arbuste de la famille des thaces. Il
est largement cultiv pour ses feuilles
qui une fois sches et plus ou moins
oxydes, servent la prparation par
infusion du th. (internet 5-13). Il existe
plusieurs sortes de th comme le th
vert, le th gris, le th blanc, le th noir
et bien dautre. Ils proviennent tous de la
mme varit darbustes, mais ce qui
crer les diffrentes sortes de th cest
la faon de le cultiver, lendroit o la
plante a pouss, le temps que lon a
laiss les plants dans le champ, la sorte
de fermentation que lon fait subir aux
feuilles, la saison, sa fracheur etc. Le
th contient plusieurs antioxydants de
type polyphnol comme les catchines,
les thaflavines et les tharubigines. Il
contient galement dautres sortes
dantioxydants comme la thanine, la
cafine et les flavonols
Matriel et mthode :
Pour la liste du matriel et des solutions,
voir lannexe 1.
Mthode de Folin-Ciocalteu
Cette mthode est habituellement employe pour mesurer les phnols totaux dans les vins. Ce procd peut galement tre employ pour l'analyse des phnols totaux dans le th. Le protocole emploi le volume minimum de ractifs et limine le gaspille de ceux-ci. Une micropipette doit tre utilise pour faire lexprience. Des cuvettes en plastique ou en verre peuvent tre utilises lors de la mesure de lchantillon dans le spectrophotomtre UV. Ce protocole est bas sur la mthode rapporte dans : (Slinkard, 1977); seulement les volumes ont t rduits.
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Ractif de Folin-Ciocalteu : Ce ractif est dcrit comme tant du tungstate de sodium, du molybdate de sodium, du sulfate de lithium, du brome, de lacide chlorhydrique concentre et de lacide phosphorique (Singleton et Rossi, 1965) (internet 14). Lorsquils sont en prsence de phnols, les acides prsents dans le ractif sont rduits en un mlange doxydes bleus de tungstne (W8O23) et de molybdne (Mo8O23) (internet 14). Solution courante d'acide gallique ou acide 3,4,5-trihydroxybenzoque (internet 16):
Figure 4 : Molcule dacide gallique. Lacide gallique est un acide organique de couleur jaune qui se retrouve de faon naturelle dans les galles de sumac, dhamamlis, les feuilles de th, lcorce de chne entre autres plantes. Cest un polyphnol et sa formule chimique est C6H2(OH)3COOH (internet 16). Pour prparer cette solution, la procdure suivante a t effectue. Dans un ballon jaug de 100 mL, 0,5 g d'acide gallique sec ont t dissous dans 10 mL d'thanol puis le volume a t complt avec de leau distille. Il peut tre ouvert quotidiennement, mais au magasin ils le maintiennent ferm dans un rfrigrateur jusqu' deux semaines.
Solution de carbonate de sodium. 200 g de carbonate de sodium anhydre ont t ajouts dans 800 mL d'eau distille puis la solution a t porte bullition. Aprs refroidissement, quelques cristaux de carbonate de sodium ont t ajouts, et aprs 24 heures, la solution a t filtre et son volume a t ajust 1 L. Courbe talon : Pour prparer une courbe talon, 0, 1, 2, 3, 5, et 10 ml de la solution courante dacide gallique ont t ajouts dans un ballon jaug de 100 mL, puis le volume a t complt 100 mL deau distille. Ces solutions avaient des concentrations en phnol de 0, 50, 100, 150, 250, et 500 mg/l d'acide gallique. chantillons : Dans chaque solution de calibrage, 20 L dchantillon ont t ajouts avec la micropipette dans des cuvettes spares, et chacun, 1.58 mL d'eau distille ont t ajouts, puis, 100 L du ractif de Folin-Ciocalteu ont t ajouts avant le brassage de la solution. Puis, 300 L de la solution de carbonate de sodium ont t ajouts aprs avoir attendu de 30 secondes 8 minutes. Ensuite, la solution a t brasse une nouvelle fois. Les solutions sont restes 20 C pendant 2 heures avant quil soit possible de dterminer l'absorbance de chacun dentre eux 765 nm contre le blanc (la solution de 0 ml ) et de tracer une courbe de l'absorbance en fonction de la concentration en antioxydants. Pour les vins blancs, 20 L ont t ajouts dans les solutions de calibrage,
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mais dans le cas des vins rouges, les vins ont t dilus par 10 avant dajouter les 20 L. Une courbe talon a t cre avec les valeurs pour dterminer les niveaux de concentration de polyphnol dans les chantillons. Les valeurs ont t mesures avec le spectrophotomtre UV. Les concentrations des vins rouges ont t multiplies par 10, en raison des dilutions.
Figure 4 : Spectrophotomtre UV. Interfrences. Les sucres rducteurs tels que le glucose et le fructose pouvaient causer des interfrences mineures et devaient tre corrigs. Les sulfites pouvaient galement causer une interfrence, mais la grandeur tait variable. Ce n'est habituellement pas un facteur important except pour les vins blancs avec un milieu aux niveaux levs de sulfite (mg/l >50) et aux niveaux bas de phnols (mg/l
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Puis, la concentration dantioxydants
dans deux chantillons de vin rouges et
deux de vins blancs a t calcule.
Comme montre dans le tableau ci-
dessous, la concentration dantioxydants
tait environ sept fois plus leve dans
les vins rouges que dans les vins
blancs.
Tableau 2 : Absorbance et concentration
des vins rouges et blancs :
Nom des vins A
(765 nm) [ ]
(mg/L)
Clos de la coutale (rouge) 0,314 2807
Wallaroo trail (rouge) 0,180 1691
Wyndham estate (blanc) 0,378 334
Wallaroo trail (blanc) 0,304 272
Par la suite, la concentration
dantioxydants des mmes chantillons
de vin ainsi que celle de trois
chantillons de th vert de marque
Legend of China infus pendant
1 minute, 3 minutes et 5 minutes, de
trois chantillons de th noir cha de
marque Stash infus pendant 1 minute,
3 minutes et 5 minutes, dun chantillon
de th vert la menthe infus pendant
5 minutes, dun chantillon de th vert
au jasmin infus pendant 5 minutes et
dun autre chantillon de th vert de
marque Legend of China infus pendant
5 minutes ont t calcules.
Tableau 3 : Absorbance et concentration
des vins et des ths lors du premier
essai.
Nom des chantillons A
(765 nm) [ ]
(mg/L)
Wallaroo trail (blanc) 0,318 284
Wyndham estate (blanc) 0,326 291
Wallaroo trail (rouge) 0,185 732
Clos de la coutale (rouge) 0,337 2999
Th vert LOC 1min 0,569 493
Th vert LOC 3min 0,872 746
Th vert LOC 5min 0,917 783
Thnoir stash 1min 0,533 463
Thnoir stash 3min 0,762 654
Thnoir stash 5min 0,804 689
Th vert menthe 0,947 808
Thvert jasmin 0,784 672
Th vert LOC 5min 0,941 803
Puis, la concentration dantioxydants
des vins a t calcule une nouvelle
fois, mais cette fois les vins rouges nont
pas t dilus par 10 avant de mesurer
leur absorbance afin de vrifier la
pertinence de cette tape du protocole.
Tableau 4 : Absorbance et concentration
des vins rouges et blancs sans dilution.
nom des vins A
(765 nm) [ ]
(mg/L)
Chardonnay (blanc) 0,483 401
Wyndham (blanc) 0,396 331
Wallaroo trail (blanc) 0,348 292
Bourgogne (rouge) 1,817 1472
Wallaroo trail (rouge) 1,855 1503
Clos de la coutale (rouge) 2,490 2013
Ensuite, la concentration dantioxydants
dun chantillon de th noir cha de
marque four Oclock infus pendant
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5 minutes, dun chantillon de th gris
de marque Vogue teas infus pendant
5 minutes, dun chantillon de th noir
lrable infus pendant 5 minutes, dun
chantillon de th blanc imprial infus
pendant 5 minutes, dun chantillon de
th blanc la grenade infus pendant
5 minutes, dun chantillon de th robos
de marque Four Oclock infus pendant
5 minutes, de trois chantillons de th
noir cha de marque stash infuss
pendant 1 minute, 3 minutes et
5 minutes, de neuf chantillons de th
vert de marque legend of china infuss
de 1 minute 5 minutes par intervalles
de 30 secondes, ainsi que des mmes
chantillons de vin numrs plus haut
ont t calculs.
Tableau 5 : Absorbance et concentration
des vins et des ths lors du deuxime
essai.
Nom des vins et des ths
A (765 nm)
[ ] (mg/L)
Th vert jasmin 0,682 561
Th vert menthe 0,910 744
Th noir chai 0,717 589
Th gris 1,047 854
Th noir rable 0,804 659
Th blanc imprial 1,322 1075
Th blanc grenade 0,899 735
Th roibos 0,395 331
Thnoir stash 1min 0,620 511
Thnoir stash 3min 0,869 711
Thnoir stash 5min 0,871 713
Th vert LOC 1min 0,604 498
Th vert LOC 1,5min 0,707 581
Th vert LOC 2min 0,771 633
Th vert LOC 2,5min 0,879 719
Th vert LOC 3min 0,954 779
Th vert LOC 3,5min 0,884 723
Th vert LOC 4min 0,927 758
Th vert LOC 4,5min 0,992 810
Th vert LOC 5min 1,057 862
Bourgogne (rouge) 0,236 2029
Wallaroo trail (rouge) 0,250 2141
Clos de la coutale (rouge) 0,337 2840
Wyndham estate (blanc) 0,392 328
Chardonnay (blanc) 0,445 371
Wallaroo trail (blanc) 0,322 272
Pour dterminer le lien entre le temps dinfusion et la concentration dantioxydants de type polyphnol prsent dans le th, un graphique de la concentration en polyphnol du th noir de marque Stash en fonction de son temps dinfusion a t trac.
Figure 5 : Graphique de la concentration dantioxydants dans le th noir en fonction de son temps dinfusion. Discussion : Les rsultats de ces exprimentations sont que parmi tous les chantillons ayant t mesurs, celui qui contient le plus dantioxydants est le vin rouge de marque Clos de la Coutale, soit 2882 mg/L dantioxydants de type polyphnol. Rtroactivement, lchan-tillon qui en contient le moins est le vin
0
200
400
600
800
0 2 4 6
Co
nce
ntr
atio
n d
'an
tio
xyd
ants
(m
g/L)
Temps d'infusion (min)
Th noir stash
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blanc de marque Wallaroo trail, soit 276 mg/L dantioxydants de type polyphnol. Il est possible de dire, d'aprs les rsultats, que les trois vins rouges qui ont t mesurs contiennent plus dantioxydants que les chantillons de vins blancs et de th vert. La premire hypothse qui se lit comme suit : La quantit dantioxydants de type polyphnol dcroit dans lordre suivant : th vert, vin rouge, vin blanc a donc t infirme. Le rel ordre dcroit comme suit : vin rouge, th vert, vin blanc. De plus, avec des recherches plus approfondie sur internet, il a t possible de conclure que lordre qui avait t tabli au dbut tait faux. Par contre, il tait possible daffirmer que la deuxime hypothse mise est vraie soit que la source principale dantioxydants de type polyphnol du vin rouge est la pelure des raisins. Elle tait vraie, car le vin rouge est ferment avec le raisin avec sa pelure et le vin blanc avec le raisin sans pelure. Puisque les rsultats taient que le vin rouge contient beaucoup plus dantioxydants de type polyphnol que le vin blanc, il tait donc possible de conclure que la principale source dantioxydant du vin rouge est la pelure des raisins, (voir tableau 3). Il y a certaine des interfrences qui ont pu biaiser les rsultats obtenus comme les sucres rducteurs, les sulfites et lascorbate (internet 1). Par contre, ils nont pas t pris en compte, car tant donn le temps restreint, il na pas t possible de faire les tests ncessaires pour savoir si les chantillons contenaient des substances crant de linterfrence. En revanche, ces interfrences taient minimes alors elles ne drangeaient pas les rsultats finaux, soit lordre de dcroissance. Les vins et certains des ths contenaient des armes de fruits et les fruits peuvent
contenir des antioxydants de types polyphnols ce qui a pu fausser les rsultats la hausse. Conclusion :
En rsum, la mthode de Folin-
Ciocalteu est assez simple raliser et
elle est donc idale pour le niveau
collgial. De plus, lutilisation du
Spectrophotomtre UV a grandement
facilit la tche du sa facilit
dutilisation et sa rapidit. Par contre,
le dfaut majeur de cette mthode tait
quil ne mesurait que les antioxydants
de type polyphnol. Il y a dautres
familles dantioxydants, tel que les
thiols, et ils ne pouvaient pas tre
mesurs lors de cette exprience. Cest
un peu en raison de cela quil y a eu des
erreurs lors de la rdaction de
lhypothse de dpart, car lordre
dcroissant a t tabli en fonction des
antioxydants totaux. Le th vert contient
plus dantioxydants totaux, mais le vin
rouge contient plus dantioxydants de
type polyphnol. Il y a galement
certaines substances qui ont pu causer
des interfrences lors de la prise de
mesure et ces interfrences sont donc
une source derreur supplmentaire
(internet 1). Pour terminer, mme si
cette mthode contient certaines
lacunes, elle reste assez fiable et elle
est utilise un peu partout et considre
comme une bonne mthode. La
mthode de Folin-Ciocalteu est
considre comme plus efficace que la
mthode de dosage par HPLC qui sous
estime la quantit dantioxydants et est
-
10
galement plus efficace que la mthode
de dosage par spectrophotomtre UV
visible qui, elle, surestime la quantit
dantioxydants (internet 3). Ainsi, il a t
possible de conclure quen raison du
matriel qui tait disponible, la mthode
de Folin-Ciocalteu tait la meilleure
utiliser.
Suggestions et perspectives
davenir :
Pour tous ceux et celles qui voudraient
poursuivre ce projet, il vous est conseill
dutiliser la mthode de Folin-Ciocalteu
mais pour doser autre chose. Il a t
trouv en faisant des recherches quil
est mme possible, laide de cette
mthode, de mesurer les antioxydants
de certains aliments durs comme la
laitue et les pinards (internet 2). Une
autre alternative qui pourrait tre
intressante serait de faire votre propre
ractif de Folin-Ciocalteu. Il y a
galement possibilit deffectuer les
expriences un grand nombre de fois et
dtablir des statistiques avec les
donnes. Pour terminer, si vous vouliez
refaire exactement la mme exprience,
il vous serait suggr de mettre les
chantillons dans ltuve, car lorsquils
sont 40 C, ils nont besoin que de 30
minutes pour faire ragir les
antioxydants de lchantillon (au lieu de
2 heures 20 C) (internet 1). Pour finir,
les antioxydants pourraient tre les
molcules de lavenir et elles gagnent
tre connues, car elles pourraient viter
bien des problmes de sant, comme
les cancers, car elles inhibent certaines
ractions chimiques nfastes qui se
produisent dans le corps humain comme
par loxydation. Il y a ici certainement
beaucoup faire.
Remerciements :
Laide de certaines personnes
grandement influenc le droulement de
cette exprience il est donc important de
les remercier pour leur aide.
Premirement, merci Laurent Bazinet,
professeur lInstitut des
Nutraceutiques et des Aliments
Fonctionnels (INAF) luniversit Laval,
car cest lui qui a fourni le protocole
utilis. Ensuite, merci Steve Gamache,
notre tuteur, qui a grandement aid
dans ce projet, et ce, plusieurs
niveaux. Merci galement Marc
Dufour, qui a tout particulirement aid
pour la partie biologique du projet et
dans llaboration dune des
hypothses. Pour terminer, merci
Marie Lefranois, qui a grandement aid
pour tout ce qui est du matriel et de la
commande des produits utiliss lors de
lexprimentation.
Rfrences :
Internet 1:http://waterhouse.ucdavis.edu
/phenol/folinmicro, Folin-Ciocalteau
Micro Method for Total Phenol in Wine,
consult le 3 fvrier 2010.
Internet 2:lpva.snv.jussieu.fr/.../TP%20p
hnols%20LV213.doc, Consult le 11
mai 2010.
-
11
Internet 3 : http //www.valdevire-
bioactives.com/francais/produits/dosage
.php, consult le 11 mai 2010.
Internet 4:http://fr.wikipedia.org/wiki/Antioxydant, consult le 3 fvrier 2010.
Internet 5: www.passeportsante.net, consult le 21 mars 2010.
Internet 6:http://fr.wikipedia.org/wiki/Ph%C3%A9nol_(groupe), consult le 11 mai 2010.
Internet 7:http://fr.wikipedia.org/wiki/Polyph%C3%A9nol, consult le 11 mai 2010.
Internet 8: www.planetezen.net, consult le 21 mars 2010.
Internet 9:www.medicms.be/dt4/vinrouge.htm , consult le 21 mars 2010.
Internet 10:www.selection.ca/mag/2005/11/aliments_sant.php, consult le 21mars 2010.
internet 11:http://fr.wikipedia.org/wiki/Vin_blanc, consult le 11 mai 2010.
internet 12 :http://fr.wikipedia.org/wiki/Vin_rouge, consult le 11 mai 2010.
internet 13 :http://fr.wikipedia.org/wiki/Camellia_sinensis,consult le 11 mai 2010.
Internet 14 :http://news.reseau-concept.net/images/oiv/Client/MA-F-AS2-10-INDFOL.pdf, consult le 12 mai 2010.
Internet 15 : www.ispc-int.com/.../other.../ispc_workshop_carnaval_in_venice_bentobox_fr.ppt, consult le 3 fvrier 2010.
Internet 16 : http://fr.wikipedia.org/wiki/Acide_gallique, consult le 12 mai 2010.
Slinkard: Singleton, V. L. Total Phenol Analysis: Automation and Comparison with Manual Methods. American Journal of Enology and Viticulture 1977, 28: 49-55
Singleton et Rossi: AJEV 1965, 16: 144 158
Dufour 2010: Marc Dufour, professeur de biologie au centre dtudes collgiales Chibougamau.
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Annexe 1
(Liste du matriel et des solutions)
Matriel :
Micropipette 10 cuvettes de plastiques ou de verre 10 ballons jaugs de 100 mL Balance analytique Nacelles Pipette de 10 mL Plaque chauffante Bcher de 1000, 500, 100 mL Ballon jaug de 1000 mL Entonnoir Papier filtre Spectrophotomtre UV Bouteille de verre Tige de verre
Solutions :
Eau distille Ractif de Folin-Ciocalteu Solution courante dacide gallique Solution de carbonate de sodium Vins rouges Vins Blancs Ths
-
13
Annexe 2
(Courbe talon)
y = 803,01x + 13,326 R = 0,9935
0
100
200
300
400
500
600
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
con
cen
trat
ion
d'a
cid
e g
alliq
ue
(an
tio
xyd
ants
)
absorbance a 765nm
courbe talon
-
14
Annexe 3
(Protocole de Folin-Ciocalteu)
Folin-Ciocalteau Micro Method for Total Phenol in Wine
Andrew Waterhouse Department of Viticulture & Enology
University of California, Davis
This method is used routinely in our lab to measure total phenol. The procedure is also used for analysis of total phenol in tea. It uses the minimum volume of reagents and almost eliminates wasted reagent. Good micro pipets must be used for reproducibility. Plastic or glass cuvettes can be used. It is based on the method reported in Slinkard, K.; Singleton, V. L. Total Phenol Analysis: Automation and Comparison with Manual Methods. American Journal of Enology and Viticulture 1977, 28: 49-55; only the volumes have been reduced. If you cannot reproducibly measure such small volumes, try to reduce the volumes to the smallest you can. This reduces waste and disposal volume. http://www.milonic.com/removelink.php Folin Ciocalteu Reagent. This is usually purchased as the 2N reagent available from Sigma (F9252) or from Fisher Scientific (ICN19518690), and presumably others.
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Singleton and Rossi AJEV 1965, 16: 144-158, describe the preparation of the reagent from sodium tungstate, sodium molybdate, lithium sulfate, bromine, and some acids.
Gallic Acid Stock Solution. In a 100-mL volumetric flask, dissolve 0.500 g of dry gallic acid in10 mL of ethanol and dilute to volume with water. Can be opened daily, but to store, keep closed in a refrigerator up to two weeks.
Sodium Carbonate Solution. Dissolve 200 g of anhydrous sodium carbonate in 800 mL of water and bring to a boil. After cooling, add a few crystals of sodium carbonate, and after 24 hr, filter and add water to 1 L.
To prepare a calibration curve, add 0, 1, 2, 3, 5, and 10 mL of the above phenol stock solution into 100 mL volumetric flasks, and then dilute to volume with water. These solutions will have phenol concentrations of 0, 50, 100, 150, 250, and 500 mg/L gallic acid, the effective range of the assay.
From each calibration solution, sample, or blank, pipet 20 L into separate cuvettes, and to each add 1.58 mL water, and then add 100 L of the Folin-Ciocalteu reagent, and mix well. Wait for between 30 sec and 8 min, and then add 300 L of the sodium carbonate solution , and shake to mix. Leave the solutions at 20C for 2 hr and determine the absorbance of each solution at 765 nm against the blank (the "0 mL" solution) and plot absorbance vs. concentration. Alternatively, they can be left at 40C for 30 min before reading the absorbance.
For white wines, add 20 L as for the calibration solutions, but in the case of red wines, dilute the wines by 10 first, then add 20 L (or skip the dilution and add 2 L if you have precise micro pipettors).
Create a calibration curve with the standards and determine the levels in the samples. Do not neglect to multiply the observed concentrations by any dilution factor of the original sample. Results are reported at Gallic Acid Equivalent, GAE, because the phenols in wine contain mostly other phenols, and only small amounts of gallic acid.
Interferences. Reducing sugars such as glucose and fructose cause minor interferences and must be corrected. Sulfites also cause an interference but the magnitude is variable. It is usually not an important factor except for white wines with medium to high sulfite levels (>50 mg/L) and low phenol levels (
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the stability of gallic acid standard solutions and we can say they lose less than 5% of their value over two weeks when refrigerated and kept tightly closed.
You MUST make up your own standard curve each time the analysis is run. Do not use this data as a standard curve. It is here only as an example of a typical standard curve.
For more details on the Folin Ciocalteau analysis procedure, please see: Waterhouse,
A.L., Determination of Total Phenolics, in Current Protocols in Food Analytical
Chemistry, I1.1.1-I1.1.8, Wrolstad, R.E., Wiley, 2001, or Singleton, V. L.; Orthofer, R.;
Lamuela-Raventos, R. M. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and
antioxidants by means of Folin-Ciocalteu Reagent. Methods in Enzymology 1999, 299,
152-178.
http://waterhouse.ucdavis.edu/phenol/folinmicro