AO-3958 – REVISÃO DO ORIGINAL EM INGLÊS – SUZANA GONTIJOPREPRINT_MARINA

Analysis of colostrum IgA against bacteria involved in neonatal infections

Análise de IgA do colostro contra bactérias envolvidas em infecções neonatais

Short title: Analysis of colostrum IgA against bacteria involved in neonatal infections

1 Elizabeth Moreira Dias1, Denise Bertulucci Rocha Rodrigues,1  Vinicius Rangel

Geraldo-Martins1 Ruchele Dias Nogueira,

1 Universidade de Uberaba, Uberaba, MG, Brazil.

Corresponding author: Ruchele Dias Nogueira - Avenida Nene Sabino, 1801 -

Universitário – Zip Code: 38055-500 – Uberaba, MG, Brazil - Phone: (55 34) 3319-

8800 - E-mail: ruchele_nogueira@yahoo.com.br

Received on: Dec 06, 2016 – Accepted on: May 4, 2017

Conflict of interest: none.

DOI: XXX

ABSTRACT

Objectives: To describe e compare the specificity of IgA antibodies against bacteria

extract of Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, and

Salmonella enteritidis. Methods: Colostrum samples were aseptically collected in the

first 12 hours after C-section delivery. The specificity of IgA against bacteria extracts

was analyzed by the Western blot. Results: The findings showed proteins of high

molecular weight frequently detectable in the samples. S. aureus was the most

frequently found bacterium in the samples (p<0.05). Approximately 93.8, 56.3, 62.5 e

60.4% of samples presented IgA reactive to S. aureus, K. pneumoniae, S. enteritidis,

and E. coli, respectively. Roughly 40% of samples showed no IgA reactive to K.

pneumoniae, S. enteritidis and E. coli. Conclusions: Clinical evidence of the

importance of breastfeeding for the immune protection of neonates was consistent

with the observed immunological findings, since most samples showed IgA reactive

against the species tested. The application and development of immunotherapies

during pregnancy, focused on frequently detected antigens, could be an important

tool to enhance the presence of IgA in colostrum.

KEYWORDS: Enterobacteriaceae; Staphylococcus aureus; Colostrum;

Immunoglobulin A; Infection

RESUMO

Objetivos: Descrever e comparar a especificidade de anticorpos IgA de amostras de

colostro contra extratos bacterianos de Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus

aureus, Escherichia coli e Salmonella enteritidis. Métodos: As amostras de colostro

foram coletadas assepticamente nas primeiras 12 horas após o nascimento por

cesariana. A especificidade de IgA contra extratos de bactérias foi analisada por

Western blot. Resultados: Os achados mostraram proteínas de alto peso molecular

frequentemente detectáveis nas amostras. S. aureus foi a bactéria mais encontrada

nas amostras (p<0,05). Cerca de 93,8, 56,3, 62,5 e 60,4% das amostras

apresentaram IgA reativa a S. aureus, K. pneumoniae, S. enteritidis e E. coli,

respectivamente. Aproximadamente 40% das amostras não apresentaram IgA

reativa contra K. pneumoniae, S. enteritidis e E. coli. Conclusões: A evidência

clínica da importância da amamentação para proteção imunológica ao recém-

nascido foi consistente com os achados imunológicos observados, uma vez que a

maioria das amostras mostrou IgA reativa contra as espécies testadas. A aplicação e

o desenvolvimento de imunoterapias durante a gestação, focada nos antígenos

frequentemente detectados, poderia ser um importante instrumento para aumentar a

presença de IgA no colostro.

DESCRITORES: Enterobactérias; Staphylococcus aureus; Colostro; Imunoglobulina

A; Infecção

INTRODUCTION

Neonatal bacterial infection remains a major cause of morbidity and mortality during

the neonatal period. According to the World Health Organization, 6.3 million children

under five years old died in 2013 - 45% of them during the neonatal period. (1) In

Brazil, about 60% of infant mortality is mainly due to bacterial infections.(2)

The greater susceptibility to neonatal bacterial infection is explained by the

relative immunological immaturity of newborns,(3) which is a direct consequence of

immune adjustment during the transitional period, from intra- to extra-uterine life. (4)

Ontogeny of the immune system begins in the embryo and continues during fetal life,

but it is completed only a few years after birth.(5) However, hospital, maternal and

obstetric practices may contribute to the occurrence of bacterial contamination that

may result in gastrointestinal and respiratory infections,(6) neonatal sepsis and

systemic involvement.(2)

Neonatal sepsis, the third most common cause of death in early life, results in

half a million deaths each year.(7,8) The pathogens most commonly isolated and

involved in neonatal infections are Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli,

Salmonella enteritidis and Staphylococcus aureus.(8)

Although E. coli colonizes the gastrointestinal tract of the neonate within a few

hours of life and develops a mutualistic relation with the host,(9) this species is the one

most frequently involved in neonatal sepsis.(10,11) Some serotypes of E. coli, such as

enteropathogenic, enterohaemorrhagic, enteroaggregative and enterotoxigenic, have

been reported as the main cause of diarrhea in children under one year of age. (12)

Also O6 E. coli serotype was detected in many cases of neonatal meningitis(13) and

sepsis.(14) Another relevant bacterium associated with neonatal gastrointestinal

infections is S. enteritidis, which usually appears after the first week of life, and

causes acute gastroenteritis and thus serious complications to the newborn, such as

sepsis and/or meningitis.(15)

Also, S. aureus has been linked to various infections during the neonatal

period, such as late-onset neonatal sepsis,(8) impetigo,(16) arthritis and osteomyelitis.(17)

Virulence antigens of S. aureus are predominantly related to bacterial surface, such

as capsular polysaccharides, teichoic acid, peptidoglycans, adhesins, protein A, and

toxins.(18) Klebsiella pneumoniae is an opportunistic pathogen that causes

pneumonia, bacteremia and urinary tract infections(19) and has been reported as a

common agent in cases of neonatal sepsis.(20) It is also associated with high mortality,

often through strains multiresistant to antibiotics associated to the production of beta-

lactamase.(20)

After birth, with the interruption of IgG transfer via the umbilical cord, the

mother is able to offer to the newborn another form of passive protection,

represented by breastfeeding, which has indisputable protective attributes associated

to reduction of the risk of neonatal infection(3,21) because it contains several immune

components such as secretory IgA (IgAS).(22) The presence of IgAS represents the

first line of defense of the mucous membranes, conferring protection against

infections and coating mucosal surfaces, preventing the adhesion and invasion of

microorganisms in the tissues.(3,21,23)

Although exclusive breastfeeding is recommended and practiced, some

newborns that are breastfeeding can develop bacterial infection during the neonatal

period. There is evidence that children, although being breastfed, can develop

diarrhea by Campylobacter due to a lack of specific antibodies against virulence

antigens for this bacterium in colostrum.(23) Thus, it is necessary to determine, in

samples of colostrum, the presence and specificity of IgA against bacteria commonly

involved in neonatal infections, such as S. aureus, K. pneumoniae, S. enteritidis and

E. coli.

OBJECTIVE

To evaluate, in samples of healthy Brazilian parturients’ colostrum, the presence or

absence of IgA antibodies against species involved in neonatal infections such as S.

aureus, K. pneumoniae, S. enteritidis and E. coli.

METHODS

A total of 48 mothers were enrolled in this study upon consent. The Ethical

Committee approved this study (CAAE:  02166713.4.0000.5145). Only healthy

mothers, 12 hours after delivery, were included in standard collection. Information on

maternal and gestational background was obtained through interviews with the

mothers. Samples of colostrum were collected by manual expression into sterile

polypropylene Falcon Tubes. After collection, the maternal samples were transported

in ice to the laboratory, centrifuged at 1300 g for 7 min to remove lipid components

and stored at -80ºC until use.

Western blotting of colostrum IgA against bacteria

Extracts of S. aureus (ATCC 25923), K. pneumoniae (ATCC 13883), S. enteritidis

(ATCC 13076) and E. coli (ATCC 11303) were obtained from fresh culture as

previously described.(20) Seventeen micrograms of extracts were separated by 6%-

SDS-page and transferred to nitrocellulose membranes. The membranes were

incubated with colostrum (1:1000) samples. After washing, they received a solution of

antibody HRP- goat anti-human IgA (Sigma) revealed by the ECL system (Amersham

Biosciences Little Chalfont, Buckinghamshire, United Kingdom) and exposed in

biofilm for five minutes. The developed X-ray films were scanned in a scanning

densitometer (Bio-Rad GS-700 Imaging Densitometer) and the images were

evaluated with ImageQuant Software (Amersham Biosciences) to analyze patterns of

antigen recognition, including the number and intensity of reactive bands. Signals

were converted to absolute counts by comparison with the standards on the same

membrane. Failure to detect a signal was recorded as zero. A film blank value was

subtracted from the value of the reactive band. Some membranes were incubated

with blocking buffer without samples to obtain negative control. As positive control,

membranes were incubated with a saliva sample whose pattern of reaction with

antigen extracts had been previously measured. The reactive bands represent the

presence of IgA specific to proteins separated by the SDS page from each bacterium

extract.

Statistical analysis

The mean number of IgA bands and densitometry values of reactive Ags were

determined and compared between the bacteria by ANOVA. The frequencies of

positive IgA reactive to antigens were assessed by the chi-square test. The

correlations between IgA antibodies and specific to antigens were tested by Pearson

analysis. A p value < 0.05 was considered statistically significant.

RESULTS

The mothers were healthy and no complication during or after delivery was reported.

Their mean age was 25.2 ± 3.3 years. There were no differences in racial profile

(p >0.05). All babies were born full term (> 37 weeks of gestation). No associations

were found between immunoglobulin levels and racial, maternal age, type of birth

and socioeconomic data (Pearson, p>0.05). There were also no statistically

significant differences between immunoglobulin levels and types of delivery:

cesarean or vaginal (p > 0.05).

Specificity of IgA response against bacterial extracts

Examples of immunoassays of samples with positive IgA response against the

bacterial antigens are represented in Figure 1. The frequencies of samples with

positive (with at least one detectable band) and negative responses to the four

strains are represented in Table 1. The majority of samples showed reactive IgA

against S. aureus, followed by S. enteritidis, E. coli and K. pneumoniae (Table 1).

The number of samples with positive response to S. aureus was statistically higher

than for other bacteria (Table 1, p<0.05, q>15.00).

Figure 1. Patterns of IgA reactive against antigens from S. aureus, K.

pneumoniae, S. enteriditis and E. coli in samples of colostrum. Identities of antigen

extracts are above each lane. Standard molecular sizes (kDa) are indicated to the left

of the immunoblots.

Table 1. Intensity and frequency of IgA reactive to S. aureus, K. pneumoniae, S.

enteriditis and E. coli and antigens detected in colostrum samples

Bacterial extracts and molecular weight (kDa)

Numbers of samples with response:

Mean of total intensity of colostrum IgA reactivity ± SD

Positive n(%)

Negative n(%)

Staphylococcus aureus

45 (93.8)*#† 3 (6.2)*#† 410.7 ± 186.3$≠π

230 26 (57.8) 48.5 ± 41.9

221 18 (40.0) 33.6 ± 41.6

208 25 (55.6) 46.7 ± 42.2

185 17 (37.8) 31.7 ± 41.2Salmonella enteritidis 30 (62.5) † 18 (37.5) † 217.8 ± 186.3$≠π

244 16 (53.4) 31.6 ± 30.3

220 16 (53.4) 30.2 ± 29.7

176 14 (46.7) 27.0 ± 29.4

144 15 (50.0) 28.4 ± 29.6Klebsiella pneumoniae

27 (56.3)# 21 (43.7)# 133.2 ± 101.9≠ ¶

244 10 (37.0) 16.7 ± 22.2

229 7 (25.9) 12.0 ± 20.7

203 7 (25.9) 10.9 ± 19.6

194 7 (25.9) 12.5 ± 21.9

73 8 (29.6) 13.9 ± 22.4

46 8 (29.6) 13.3 ± 20.9

Escherichia coli 29 (60.4)* 19 (39.6)* 251.8 ± 129.9π ¶

238 12 (41.4) 27.7 ± 33.6

216 15 (51.7) 34.6 ± 34.0

202 15 (51.7) 32.7 ± 23.8

162 13 (44.8) 30.0 ± 33.9

*chi-square: p = 0.001, q = 15.10; #chi-square: p = 0.001, q = 18.00; †chi-square: p = 0.001, q=17.10; $ANOVA: p < 0.001; ≠ANOVA: p < 0.001; πANOVA: p < 0.05; ¶ANOVA: p < 0.05.

Complexity of the IgA response against bacterial antigens

The number of IgA bands reactive against S. aureus ranged from 2 to 11 (mean:

4.89±2.19), K. pneumoniae, from 1 to 11 (mean: 2.93 ± 2.19), S. enteritidis from 1 to

11 (mean: 3.73 ± 2.21) and against E. coli from 1 to 8 (mean: 3.76 ± 1.911). Mean

number of IgA-reactive bands to microbial antigens from S. aureus, E. coli, K.

pneumoniae and S. enteritidis are represented in Figure 2. The mean number of

bands reactive to S. aureus was elevated and there were statistically significant

differences in comparison to other bacteria (Figure 2, p < 0.05). There were no

differences in the mean number of bands between K. pneumoniae, S. enteritidis and

E. coli (p > 0.05).

 Figure 2. Mean numbers of bands of IgA reactive with the bacterial antigens of S.

aureus, E. coli, K. pneumoniae and S. enteritidis in colostrum

IgA specific against the bacterial extracts bands separated by SDS-PAGE

IgA bands recognized and detected in bacterial extracts were analyzed, and their

molecular weight (kDa) was calculated by the equation obtained by the analysis of

the molecular weight standard bands. The number of samples with positive IgA to

antigens and their respective molecular weight with S. aureus. K. pneumoniae, S.

enteritidis and E. coli are represented in Figure 3. There was a great variation in the

bands recognized by IgA for each bacterial extract, and the majority of them showed

a high molecular weight ranging between 247-109 kDa. Approximately 59 bands of

different molecular weights were detected. A 244-kDa band was common in samples

of S. aureus, K. pneumoniae and S. enteritidis but there was no correlation between

them (p > 0.05, r < 0.28).

Figure 3. Number of samples with IgA reactive to specific bacterial antigens

and their molecular weights (kDa)

The most detected frequencies of samples with positive response to antigens

are represented in Table 1. The IgA response against S. aureus showed the greatest

diversity; more than 20 types of different bands were detected (p < 0.05). The

reactivity of IgA against S. aureus showed a prevalence of bands with high molecular

weight (p < 0.05, Figure 3). Over 55% of samples with positive response to S. aureus

showed IgA reactive to 230 kDa and 208 kDa. Twelve different bands were found

among samples with positive IgA to S. enteritidis (n = 30). Bands of 244 and 220 kDa

were recognized in 53.4% of samples and were statistically more detected than the

others (Table 1, p < 0.05).

The analysis of IgA against K. pneumoniae revealed 14 distinct bands (Figure

3 and Table 1). The frequency of positive response against the most detected bands

(Table 1) did not differ (p > 0.05). The immunoblots of IgA against E. coli showed 13

different bands (Figure 3 and Table 1), but there were no differences in the frequency

of IgA response between these bands (p > 0.05).

There were variations in the intensities of IgA antibody reactions with the

recognized bands among children in both groups. Table 1 shows the sums of

intensities of IgA reactions with all bands detected for each species (total intensities).

In general, the intensity of IgA response was higher to S. aureus than other bacteria

(p < 0.05). In addition, the total intensity of IgA response to E. coli was decreased in

comparison to K. pneumoniae (p < 0.05).

DISCUSSION

Results showed that the majority of colostrum samples had IgA reactive to bacterial

antigens, thus corroborating several studies that emphasize the importance of breast

milk, which provides protection against infection by Haemophilus influenzae and

Escherichia coli, (21) and enteric infections caused by E. coli, Vibrio cholerae,

Campylobacter, Shigella spp and Giardia lamblia. (24-26) Thus, breastfeeding can

protect neonates against the oral invasion of a large number of microorganisms.(21)

The majority of samples (94%) had antibodies IgA reactive against S. aureus

accompanied by intense and complex responses, since the number of reactive bands

was higher than for other bacteria. This high frequency of reactive IgA probably

occurred because this bacterium is part of the normal human microbiota in various

regions of the human body, which does not exclude the possibility of this

microorganism causing disease under immunosuppression, or when epithelial

barriers are violated, which can be limited to the mucosal surface or spread

throughout the body.(9)

  Although the majority of samples had reactive IgA against these bacteria,

about 40% of samples did not present IgA reactive to K. pneumoniae, S. enteritidis or

E. coli, which suggests that some newborns may develop infections from these

microorganisms even though they are breastfed. One of the reasons suggested to

explain breastfed children with diarrhea by Campylobacter is a lack of specific

antibodies against common antigens of virulence of Campylobacter in samples of

colostrum.(23) Thus the importance of not only of studying the presence of IgA against

bacteria, but also of evaluating and identifying immunodominant antigens of these

species in the natural immune response.

The reasons for lower or higher detection of antibodies in the samples may be

associated to the antigenic stimulation. Thus, it is necessary to implement a strategic

stimulation to enhance the immune protection of newborns in their neonatal period

against such microorganisms, and increase immunogenic antigens, which occurs in

meningococcal infection. Prenatal women immunization, with a single dose of

meningococcal vaccine, results in an increase in specific IgG levels in the newborn

serum for 2 to 3 months after birth, and an increase of the specific IgA levels to the

microorganism in the milk for at least 6 months.(23)

The results showed a great diversity of the antigen species tested, with a

predominance of high molecular weight protein. The most common bands can be

related to the pathogenic action and/or antigenic stimulation of these bacteria, such

as 230 and 289 kDa S. aureus; and the four most prevalent bands of S. enteritidis

and E. coli are shown in Table 1. K. pneumoniae showed a great variability in IgA

response, but did not show a specific pattern of response. The literature provides

some information about several antigens of these bacteria that are involved in their

pathogenic capacities, but little is known about the high molecular weight antigens

widely recognized by the samples of this study.

An antigen of 94 kDa called “intimin” and other antigens recognized by IgA of

70, 80 and 110 kDa were associated in the injury process “attaching and effacing” by

enteropathogenic E. coli in human milk.(6) Also, Rck is a 17-kDa outer membrane

protein, expressed in E. coli and S. enteritidis, which inhibits complementary

pathways, thereby preventing opsonization through this route.(27) No sample showed

IgA reactive to intimin (94 kDa) and 17 kDa band, but about 38 and 17% of samples

responded to a band of 72 and 117 kDa, respectively, probably the same as

previously reported.(6) K. pneumoniae antigens of 35 and 36 kDa opsonizing induce

antibodies(28) and were recognized by 29% of the present study samples.

The 106 kDa antigen (fibronectin type A) is one of the most important

molecules involved in the adhesion in the early stages of infection by S. aureus.(29) In

addition to those, protein constituents of S. aureus membrane of 30 and 36 kDa may

play an important role in infections caused by this bacterium.(30) These antigens were

detected in 17% of samples with positive responses.

The present study shows evidence that the majority of colostrum samples can

protect newborns against neonatal bacterial infection. It is important to understand

how those antibodies provided by breastfeeding could help the mucosal immune

system against the colonization and the challenge offered by those species, in order

to develop prevention strategies to avoid such infections. The natural response to

bacterial extracts tested shows a promising way for the development of vaccines

containing antigens that could be applied during pregnancy, increasing the specific

IgA levels in colostrum.

ACKNOWLEDGMENTS:

This study was supported by the National Council for Scientific and Technological

Development (CNPq), process no. 472928/2007-4.

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AO-3958 – TRADUÇÃO PARA PORTUGUÊS – SUZANA GONTIJO

Analysis of colostrum IgA against bacteria involved in neonatal infections

Análise de IgA do colostro contra bactérias envolvidas em infecções neonatais

Título curto: Análise de IgA do colostro contra bactérias envolvidas em infecções

neonatais

 1 Elizabeth Moreira Dias, 1Denise Bertulucci Rocha Rodrigues, ,1 Vinicius Rangel

Geraldo-Martins,1 Ruchele Dias Nogueira,

1 Universidade de Uberaba, Uberaba, MG, Brasil.

Autor para correspondência: Ruchele Dias Nogueira - Avenida Nene Sabino, 1801 -

Universitário – CEP: 38055-500 – Uberaba, MG, Brasil - Tel: (55 34) 3319-8800 - E-

mail: ruchele_nogueira@yahoo.com.br

Data de submissão: 06/12/2016 – Data de aceite: 04/05/2017

Conflitos de interesse: não há.

DOI: XXX

ABSTRACT

Objectives: To describe e compare the specificity of IgA antibodies against bacteria

extract of Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, and

Salmonella enteritidis. Methods: Colostrum samples were aseptically collected in the

first 12 hours after C-section delivery. The specificity of IgA against bacteria extracts

was analyzed by the Western blot. Results: The findings showed proteins of high

molecular weight frequently detectable in the samples. S. aureus was the most

frequently found bacterium in the samples (p<0.05). Approximately 93.8, 56.3, 62.5 e

60.4% of samples presented IgA reactive to S. aureus, K. pneumoniae, S. enteritidis,

and E. coli, respectively. Roughly 40% of samples showed no IgA reactive to K.

pneumoniae, S. enteritidis and E. coli. Conclusions: Clinical evidence of the

importance of breastfeeding for the immune protection of neonates was consistent

with the observed immunological findings, since most samples showed IgA reactive

against the species tested. The application and development of immunotherapies

during pregnancy, focused on frequently detected antigens, could be an important

tool to enhance the presence of IgA in colostrum.

KEYWORDS: Enterobacteriaceae; Staphylococcus aureus; Colostrum;

Immunoglobulin A; Infection

RESUMO

Objetivos: Descrever e comparar a especificidade de anticorpos IgA de amostras de

colostro contra extratos bacterianos de Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus

aureus, Escherichia coli, and Salmonella enteritidis. Métodos: As amostras de

colostro foram coletadas assepticamente nas primeiras 12 horas após o nascimento

por cesariana. A especificidade de IgA contra extratos de bactérias foi analisada por

Western blot. Resultados: Os achados mostraram proteínas de alto peso molecular

frequentemente detectáveis nas amostras. S. aureus foi a bactéria mais encontrada

nas amostras (p<0,05). Cerca de 93,8, 56,3, 62,5 e 60,4% das amostras

apresentaram IgA reativa a S. aureus, K. pneumoniae, S. enteritidis e E. coli,

respectivamente. Aproximadamente 40% das amostras não apresentaram IgA

reativa contra K. pneumoniae, S. enteritidis e E. coli. Conclusões: A evidência

clínica da importância da amamentação para proteção imunológica ao recém-

nascido foi consistente com os achados imunológicos observados, uma vez que a

maioria das amostras mostrou IgA reativa contra as espécies testadas. A aplicação e

o desenvolvimento de imunoterapias durante a gestação, focada nos antígenos

frequentemente detectados, poderia ser um importante instrumento para aumentar a

presença de IgA no colostro.

DESCRITORES: Enterobactérias; Staphylococcus aureus; Colostro; Imunoglobulina

A; Infecção

INTRODUÇÃO

Infecções bacterianas neonatais ainda são a principal causa de

morbimortalidade no período neonatal. De acordo com a Organização Mundial de

Saúde, 6,3 milhões de crianças com menos de 5 anos morreram em 2013 – 45%

dos óbitos ocorreram no período neonatal.(1) No Brasil, cerca de 60% da mortalidade

infantil deve-se a infecções bacterianas.(2)

A maior susceptibilidade a infecções bacterianas neonatais é justificada pela

imaturidade imunológica relativa de recém-nascidos,(3) consequência direta do ajuste

imunológico no período de transição entre as vidas intra- e extrauterina.(4) A

ontogenia do sistema imunológico começa no embrião e continua durante a vida

fetal, mas apenas se completa alguns anos após o nascimento.(5) Porém, certas

práticas hospitalares, maternais e obstétricas podem contribuir para a ocorrência de

contaminação bacteriana, que resulta em infecções gastrointestinais e respiratórias,

(6) sepse neonatal e envolvimento sistêmico.(2)

A sepse neonatal, terceira causa mais comum de morte precoce, é

responsável por 500 mil mortes por ano.(7,8) Os patógenos isolados com mais

frequência, envolvidos em infecções neonatais são a Klebsiella pneumoniae,

Escherichia coli, Salmonella enteritidis e Staphylococcus aureus.(8)

Embora E. coli colonize o trato gastrointestinal no neonato dentro de algumas

horas de vida e desenvolva uma relação mutualista com seu hospedeiro,(9) esta

espécie é a mais frequentemente envolvida na sepse neonatal.(10,11) Alguns sorotipos

de E. coli, como a enteropatogênica, enterohemorrágica, enteroagregativa e

enterotoxigênica, já foram descritas como a principal causa de diarreia em crianças

com menos de 1 ano de idade.(12) O sorotipo O6 da E. coli também já foi detectado

em diversos casos de meningite neonatal (13) e sepse neonatal.(14) Outra relevante

bactéria associada a infecções gastrointestinais neonatais é a S. enteritidis, que

geralmente aparece após a primeira semana de vida e causa gastroenterite aguda, e

portanto sérias complicações para o recém-nascido, como sepse e/ou meningite.(15)

S. aureus também está associada a inúmeras infecções durante o período

neonatal, como sepse neonatal de início tardio,(8) impetigo,(16) artrite e osteomielite.(17)

Antígenos de virulência da S. aureus estão predominantemente relacionados à

superfície bacteriana, como polissacarídeos capsulares, ácido teicóico,

peptidoglicanos, adesinas, proteína A e toxinas.(18) Klebsiella pneumoniae é um

patógeno oportunista causador de pneumonia, bacteremia e infecções do trato

urinário(19) e já foi relatada como um agente comum em casos de sepse neonatal.(20)

Também está associada a alta mortalidade, muitas vezes por meio de cepas

multirresistentes a antibióticos associados à produção de beta-lactamase.(20)

Após o nascimento, com a interrupção da transferência de IgG via cordão

umbilical, a mãe pode fornecer outra forma de proteção passiva ao recém-nascido

por meio do aleitamento materno, que possui atributos protetores inquestionáveis

associados à redução do risco de infecção neonatal,(3,21) já que contém diversos

componentes imunes, como a IgA secretora (IgAS).(22) A presença de IgAS

representa a primeira linha de defesa das membranas mucosas, oferecendo

proteção contra infecções e revestimento às superfícies mucosas, prevenindo assim

a adesão e invasão de microrganismos nos tecidos.(3,21,23)

Embora a amamentação exclusiva seja recomendada e praticada, alguns

recém nascidos em amamentação podem desenvolver infecções bacterianas

durante o período neonatal. Há evidências de que as crianças, apesar de serem

amamentadas, podem desenvolver diarreia por Campylobacter devido à falta de

anticorpos específicos contra antígenos de virulência para esta bactéria no colostro.

(23) Portanto, é necessário determinar, em amostras de colostro, a presença de IgA

específica contra extratos de bactérias geralmente envolvidas em infecções

neonatais, como S. aureus, K. pneumoniae, S. enteritidis e E. coli.

OBJETIVO

Avaliar, em amostras de colostro de parturientes brasileiras saudáveis, a presença

ou ausência de anticorpos IgA contra espécies envolvidas em infecções neonatais

como S. aureus, K. pneumoniae, S. enteritidis e E. coli.

MÉTODOS

Um total de 48 mulheres foram incluídas mediante consentimento. O Comitê de

Ética aprovou o estudo (CAAE: 02166713.4.0000.5145). Apenas mães saudáveis,

12 horas após o parto, foram incluídas na coleta amostral. Informações sobre dados

médicos e socioeconômicos sobre as gestantes e sobre o período gestacional foram

obtidas por meio de entrevistas. As amostras de colostro foram coletadas por

expressão manual diretamente em tubos de polipropileno estéreis do tipo Falcon. As

amostras foram obtidas e transportadas em gelo para o laboratório, centrifugadas e

mantidas a -80°C até o momento do uso.

Western blotting da IgA do colostro contra bactérias

Extratos de S. aureus (ATCC 25923), K. pneumoniae (ATCC 13883), S. enteritidis

(ATCC 13076) e E. coli (ATCC 11303) foram obtidos de culturas recentes, conforme

previamente descrito.(20) Dezessete microgramas de extratos foram separados por

SDS-page 6% e transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas

foram incubadas com as amostras de colostro (1:1000). Após a lavagem, receberam

uma solução de IgA anti-humana de cabra conjugada a HRP (Sigma), revelada pelo

sistema ECL (Amersham Biosciences Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido)

e exposta em biofilme por cinco minutos. Os filmes de Raio X revelados foram

escaneados em um densitômetro (Bio-Rad GS-700 Imaging Densitometer) e as

imagens foram avaliadas com o software ImageQuant (Amersham Biosciences) para

analisar padrões de reconhecimento de antígenos, incluindo o número e intensidade

das bandas reativas. Os sinais foram convertidos em contagens absolutas por

comparação com os padrões na mesma membrana. Sinais não detectados foram

registrados como zero. Um valor do filme em branco foi subtraído do valor da banda

reativa. Algumas membranas foram incubadas com tampão de bloqueio sem

amostras para obtenção do controle negativo. Como controle positivo, as

membranas foram incubadas com amostras de saliva, cujos padrões de reação com

extratos de antígeno haviam sido previamente medidos. As bandas reativas

representam a presença de IgA específica para proteínas separadas pela SDS-page

de cada extrato de bactéria.

Análise estatística

O número médio de bandas de IgA e valores de densitometria da Ags reativa foram

determinados e comparados entre as bactérias por meio de ANOVA. As frequências

de IgA reativa positiva para antígenos foram avaliadas pelo teste do qui-quadrado.

As correlações entre anticorpos IgA e a específica para antígenos foram testadas

pela análise de Pearson. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente

significativo.

RESULTADOS

As mães estavam saudáveis e não houve complicações durante nem após o parto.

A idade média das pacientes era 25,2 ± 3,3 anos. Não houve diferenças entre perfis

raciais (p > 0,05). Todos os bebês nasceram a termo (> 37 semanas de gestação).

Não foram achadas associações entre níveis de imunoglobulina e dados sobre etnia,

idade da mãe, tipo de parto e de caráter socioeconômico (Pearson, p>0,05).

Também não foram achadas diferenças estatisticamente significativas entre níveis

de imunoglobulina e tipo de parto: cesariana ou normal (p > 0,05).

Especificidade da resposta da IgA contra extratos bacterianos

Exemplos de imunoensaios de amostras com resposta positiva da IgA contra os

antígenos bacterianos estão representados na Figura 1. As frequências de amostras

com respostas positivas (com pelo menos uma banda detectável) e negativas às

quatro cepas estão demonstradas na Tabela 1. A maioria das amostras mostrou IgA

reativa contra S. aureus, seguida de S. enteretidis, E. coli e K. pneumoniae (Tabela

1). O número de amostras com respostas positivas à S. aureus mostrou-se

estatisticamente mais alto do que a outras bactérias (Tabela 1, p<0,05, q>15,00)

Figura 1. Padrões de IgA reativa contra antígenos de S. aureus, K.

pneumoniae, S. enteriditis e E. coli em amostras de colostro. Identidades dos

extratos de antígeno estão acima de cada coluna. Tamanhos moleculares padrão

(kDa) estão indicados à esquerda dos imunoblots.

Tabela 1. Intensidade e frequência de IgA reativa a S. aureus, K. pneumoniae, S.

enteriditis e E. coli e antígenos detectados nas amostras de colostro.

Extratos bacterianos

e peso molecular

(kDa)

Número de amostras

com respostas:

Média da intensidade total

da reatividade da IgA do

Colostro ± DPPositiva

n(%)

Negativa

n(%)

Staphylococcus

aureus

45 (93,8)*#† 3 (6,2)*#† 410,7 ± 186,3$≠π

230 26 (57,8) 48,5 ± 41,9

221 18 (40,0) 33,6 ± 41,6

208 25 (55,6) 46,7 ± 42,2

185 17 (37,8) 31,7 ± 41,2

Salmonella enteritidis 30 (62,5) † 18 (37,5) † 217,8 ± 186,3$≠π

244 16 (53,4) 31,6 ± 30,3

220 16 (53,4) 30,2 ± 29,7

176 14 (46,7) 27,0 ± 29,4

144 15 (50,0) 28,4 ± 29,6

Klebsiella pneumoniae

27 (56,3)# 21 (43,7)# 133,2 ± 101,9≠ ¶

244 10 (37,0) 16,7 ± 22,2

229 7 (25,9) 12,0 ± 20,7

203 7 (25,9) 10,9 ± 19,6

194 7 (25,9) 12,5 ± 21,9

73 8 (29,6) 13,9 ± 22,4

46 8 (29,6) 13,3 ± 20,9

Escherichia coli 29 (60,4)* 19 (39,6)* 251,8 ± 129,9π ¶

238 12 (41,4) 27,7 ± 33,6

216 15 (51,7) 34,6 ± 34,0

202 15 (51,7) 32,7 ± 23,8

162 13 (44,8) 30,0 ± 33,9

*qui-quadrado: p = 0,001, q = 15,10; #qui-quadrado: p = 0,001, q = 18,00; †qui-quadrado: p=0,001, q = 17,10; $ANOVA: p < 0,001; ≠ANOVA: p < 0,001; πANOVA: p < 0,05; ¶ANOVA: p<0,05.

Complexidade da resposta da IgA contra antígenos bacterianos

O número de bandas de IgA reativas a S. aureus variou entre 2 e 11 (média:

4,89 ± 2,19), K. pneumoniae, entre 1 e 11 (média 2,93 ± 2,19), S. enteretidis entre 1

e 11 (média 3,73 ± 2,21) e contra E. coli entre 1 e 8 (média: 3,76 ± 1,911). O número

médio das bandas reativas a antígenos microbianos de S. aureus, E. coli, K.

pneumoniae e S. enteritidis está representado na Figura 2. O número médio de

bandas reativas a S. aureus mostrou-se elevado, e havia diferenças estatisticamente

significativas em comparação a outras bactérias (Figura 2, p < 0,05). Não houve

diferenças significativas no número médio de bandas entre K. pneumoniae, S.

enteritidis e E. coli (p > 0,05).

S. aureus K. pneumoniae E. coli S. enteritidis0

1

2

3

4

5

6

Extratos bacterianos

Núm

ero

méd

io d

e ba

ndas

IgA

rea

tivas

_______________*

_________________________________**

___________________________________________________***

*p=0,02 **p=0,02 ***p=0,04

 Figura 2. Número médio de bandas reativas de IgA com antígenos bacterianos de

S. aureus, E. coli, K. pneumoniae e S. enteritidis no colostro.

IgA específica contra bandas de extratos bacterianos separados por SDS-

PAGE

As bandas de IgA reconhecidas e detectadas nos extratos bacterianos foram

analisadas, e seu peso molecular (kDa) foi calculado pela equação obtida pela

análise das bandas padrão de peso molecular. O número de amostras com IgA

positiva para antígenos e seu peso molecular respectivo com S. aureus. K.

pneumoniae, S. enteritidis e E. coli estão representados na Figura 3. Foi observada

grande variação nas bandas reconhecidas pela IgA para cada extrato bacteriano, e a

maioria delas mostrou grande peso molecular, variando entre 247 e 109 kDa. Cerca

de 59 bandas de diferentes pesos moleculares foram detectadas. Uma banda de

peso molecular de 244 kDa mostrou-se comum em amostras de S. aureus. K.

pneumoniae e S. enteritidis, mas não houve correlação entre elas (p > 0,05, r <0,28).

SUBSTITUIR NA FIGURA ABAIXO: (OK)

Figura 3. Número de amostras com IgA reativa para antígenos bacterianos

específicos e seu peso molecular (kDa).

Peso Molecular (kDa)Peso Molecular (kDa)

Peso Molecular (kDa)Peso Molecular (kDa)

Número de amostras com resposta positiva

Número de amostras com resposta positiva

Número de amostras com resposta positiva

Número de amostras com resposta positiva

As frequências de amostras com resposta positiva a antígenos mais

detectadas estão representadas na Tabela 1. A resposta da IgA contra S. aureus

apresentou a maior diversidade; mais de 20 tipos de bandas diferentes foram

detectadas (p < 0,05). A reatividade da IgA contra S. aureus demonstrou uma

prevalência de bandas com grande peso molecular (p < 0,05, Figura 3). Mais de

55% das amostras com resposta positiva à S. aureus mostrou IgA reativa a 230 kDa

e 208 kDa. Entre amostras com IgA positiva para S. enteritidis (n = 30), 12 bandas

diferentes foram encontradas. Bandas de 244 e 220 kDa foram reconhecidas em

53,4% das amostras e foram estatisticamente mais frequentemente detectadas do

que as outras (Tabela 1, p < 0,05).

A análise da IgA contra K. pneumoniae revelou 14 bandas distintas (Figura 3

e Tabela 1). A frequência da resposta positiva contra as bandas mais detectadas

(Tabela 1) não diferiu (p > 0,05). Os imunoblots de IgA contra E. coli apresentou 13

bandas diferentes (Figura 3 e Tabela 1), mas não houve diferenças na frequência da

resposta de IgA entre essas bandas (p > 0,05).

Houve variações nas intensidades das reações de anticorpos de IgA com as

bandas reconhecidas entre as crianças dos dois grupos. A Tabela 1 mostra a soma

das intensidades das reações de IgA com as bandas detectadas para cada espécie

(intensidades totais). Em geral, a intensidade da resposta de IgA foi mais alta para

S. aureus do que para outras bactérias (p < 0,05). Além disso, a intensidade total da

resposta da IgA para E. coli estava diminuída em relação à da K. pneumoniae

(p<0,05).

DISCUSSÃO

Os resultados mostraram que a maioria das amostras de colostro

apresentava IgA reativa a antígenos bacterianos, corroborando diversos estudos que

enfatizam a importância do leite materno, que protege contra infecções por

Haemophilus influenzae e Escherichia coli,(21) e infecções entéricas causadas por E.

coli, Vibrio cholerae, Campylobacter, Shigella spp e Giardia lamblia.(24-26) Portanto, o

aleitamento materno pode proteger neonatos contra a invasão oral de diversos

microrganismos.(21)

A maioria das amostras (94%) apresentava anticorpos IgA reativos contra S.

aureus acompanhados de respostas intensas e complexas, já que o número de

bandas reativas mostrou-se maior do que para outras bactérias. Esta alta frequência

de IgA reativa provavelmente ocorreu porque esta bactéria é parte da microbiota

humana normal em diversas regiões do corpo humano, o que não exclui a

possibilidade desse microrganismo causar doenças sob imunossupressão, ou

quando barreiras epiteliais são violadas, o que pode ser limitado à superfície mucosa

ou espalhado pelo corpo.(9)

Apesar de a maioria das amostras apresentar IgA contra essas bactérias,

cerca de 40% não apresentaram IgA reativa para K. pneumoniae ou E. coli,

sugerindo que alguns recém-nascidos podem desenvolver infecções a partir desses

microrganismos mesmo sendo amamentados. Uma das razões sugeridas para

explicar crianças amamentadas com diarreia por Campylobacter é a falta de

anticorpos específicos contra antígenos de virulência comuns de Campylobacter em

amostras de colostro.(23) Eis então a importância, não apenas de estudarmos a

presença de IgA contra bactérias, mas também de avaliarmos e identificarmos os

antígenos imunodominantes dessas espécies na resposta imune natural.

As razões para a maior ou menor detecção de anticorpos nas amostras

podem estar associadas à estimulação antigênica. Portanto, é necessário

implementar uma estimulação estratégica para aumentar a proteção imune de

recém-nascidos em seu período neonatal contra tais microrganismos e aumentar

antígenos imunogênicos, o que ocorre com a infecção meningocócica. A imunização

de mulheres no período pré-natal, com uma dose única de vacina meningocócica,

resulta em um aumento de níveis de IgG específica no soro do recém-nascido por 2

a 3 meses após o nascimento, e um aumento de níveis de IgA específica para o

microrganismo no leite por até 6 meses.(23)

Esses resultados mostram uma grande diversidade das espécies testadas de

antígenos, com predominância de proteínas com alto peso molecular. As bandas

mais comuns podem estar relacionadas à ação patogênica e/ou estimulação

antigênica dessas bactérias, como S. aureus de 230 e 289 kDa, e as quatro bandas

mais prevalente de S. enteritidis e E. coli são mostradas na Tabela 1. A K.

pneumoniae mostrou grande variabilidade na resposta da IgA, mas não apresentou

padrão específico de resposta. A literatura oferece algumas informações sobre

diversos antígenos dessas bactérias que estão envolvidos em suas capacidades

patogênicas, mas sabe-se pouco sobre antígenos de alto peso molecular, que

apareceram expressivamente nas amostras deste estudo.

Um antígeno de 94 kDa chamado “intimina” e outros antígenos reconhecidos

pela IgA de 70, 80 e 110 kDa estavam associados no processo de lesão “attaching

and effacing” (A/E) pelo E. coli enteropatogênico no leite humano.(6) Além disso, a

Rck é uma proteína da membrana externa de 17 kDa, expressa em E. coli e S.

enteritidis, inibidora de vias complementares, que assim impede a opsonização por

essas vias.(27) Nenhuma amostra apresentou IgA reativa para intimina (94 kDa) e

banda 17 kDa, mas cerca de 38 e 17% das amostras responderam a uma banda de

72 e 117 kDa, respectivamente, provavelmente, da mesma forma que previamente

reportado.(6) Antígenos de K. pneumoniae de 35 e 36 kDa induzem anticorpos na

opsonização(28) e foram reconhecidos por 29% das amostras do presente estudo.

O antígeno de 106 kDa (fibronectina tipo A) é uma das mais importantes

moléculas envolvidas na adesão em estágios precoces da infecção por S. aureus.(29)

Além dessas moléculas, constituintes protéicos da membrana da S. aureus de 30 e

36 kDa podem cumprir um importante papel em infecções causadas por esta

bactéria.(30) Esses antígenos foram detectados em 17% das amostras com respostas

positivas.

O presente estudo mostra evidências de que a maioria das amostras de

colostro pode proteger os recém-nascidos de infecções bacterianas neonatais. É

importante entender como esses anticorpos proporcionados pelo aleitamento podem

ajudar o sistema imunológico da mucosa contra a colonização e o desafio

apresentado por essas espécies, para desenvolvermos estratégias de prevenção e

evitarmos essas infecções. A resposta natural aos extratos bacterianos testados

mostra um caminho promissor para o desenvolvimento de vacinas contendo

antígenos que poderiam ser aplicadas durante a gravidez, aumentando assim os

níveis de IgA específica no colostro.

AGRADECIMENTOS:

Este estudo teve o apoio do Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq), processo

472928/2007-4.

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