Rivista Italiana di Genetica e Immunologia Pediatrica - Italian Journal of Genetic and Pediatric ImmunologyAnno III numero 3 - luglio 2011 | direttore scientifico: Carmelo Salpietro - direttore responsabile: Giuseppe Micali

L'evoluzione della genetica e dell'U.O.C. di Genetica ed Immunologia Pediatrica dell'Universitàdi MessinaThe evolution of genetics and U.O.C. Pediatric Genetics and Immunology, University of

MessinaSilvana Briuglia, Piera Vicchio, Caterina Cuppari, Valeria Ferraù, Carmelo SalpietroUOC Genetica ed Immunologia Pediatrica, Dipartimento Scianze Pediatriche Mediche e Chirurgiche, AOU Policlinico Universitario Messina

La scienza “dell’eredità e della variazione”. E’ questa la prima definizione digenetica, utilizzata per la prima volta nel 1906 da William Bateson, nel corso di unaconferenza sull’ibridazione tenutasi alla Royal Horticultural Society di Londra.Nei primi del Novecento gli studi di genetica hanno permesso di stabilire che la

trasmissione di caratteri familiari è controllata da unità chiamate geni e che lediverse forme di un carattere sono dovute a forme alternative dei geni che chiamatealleli. Nello stesso periodo sono stati introdotti i concetti di omozigoti ed eterozigotirispetto ad un carattere.Questi concetti, divenuti poi dei fondamentali della eredità e della variazione, hanno

permesso quella travolgente evoluzione che la genetica, come scienza, conosceràdai primi del Novecento ai giorni nostri.Nel primo decennio del Novecento il susseguirsi delle scoperte biologiche porta

all’individuazione di strutture intracellulari dette “cromosomi” che vengonosuccessivamente candidati ad essere i depositari di quei “fattori mendeliani”, i geni.La definizione di gene arriva nel 1909, ad opera di Vilhelm Johannsen (Fig. 1), “la

particella che possiede le proprietà mendeliane di segregazione e diricombinazione”.

Figura 1 Vilhelm JohannsenDa questo momento e fino agli anni ‘30 e ‘40, la genetica svilupperà quelle basi

fondamentali che verranno, in parte, confermate dalla citogenetica prima e dallagenetica molecolare poi. Fino al 1952 la citogenetica, ovvero l’osservazione almicroscopio di struttura, proprietà biochimiche, organizzazione, funzionamento edevoluzione del materiale ereditario, si avvaleva di tecniche di coltura cellulare chenon permettevano una separazione sufficiente dei cromosomi.Nel 1956 ha inizio la citogenetica moderna. In quell'anno, infatti, Tjio e Levan

riescono a determinare il numero dei cromosomi umani, ovverosia 46 cromosomi (22coppie identiche più 2 cromosomi sessuali). Inizia, così, il periodo della ricerca delleanomalie cromosomiche di numero, in cui i citogenetisti rivolsero la loro attenzione aipazienti che presentavano anomalie congenite. Lejeune e collaboratori scoprono, nel1959, che i pazienti affetti dalla sindrome descritta da Down possiedono 47cromosomi, invece di 46.Alla fine degli anni ‘60 inizia una nuova grande rivoluzione, la cosiddetta era del

bandeggio.Questo metodo consente di produrre bande orizzontali di differente intensità di

colorazione su tutti i cromosomi del corredo, per ottenere così una facileidentificazione e un preciso accoppiamento tra cromosomi omologhi.La prima definizione di cariotipo (Fig.2), fatta utilizzando criteri di lunghezza del

cromosoma e di posizione del centromero, fu formulata alla Conferenza di Denvernel 1960; ma è solo nel 1966, alla conferenza di Chicago, che i cromosomi sonoraggruppati in sette gruppi, nominati con le lettere maiuscole da A a G.Vengono messe a punto, nel corso di quegli anni, tecniche di bandeggio sempre più

raffinate.

Figura 2 CariotipoLe possibilità diagnostiche per la genetica aumentano con gli anniNel 1968 viene mappato il primo locus cromosomico mediante studi di linkage ad

opera di Donahue, il gene del gruppo sanguigno.Il concetto di linkage (associazione) era già noto dal 1906, quando Bateson e

Punnett scoprono che geni associati sullo stesso cromosoma non segreganoindipendentemente ma insieme; un’importante eccezione alla leggedell’assortimento indipendente di Mendel.L’analisi di linkage permette di determinare la posizione cromosomica di un locus

responsabile di una determinata malattia/carattere genetico rispetto a marcatoripolimorfici la cui localizzazione è nota. Inoltre per mezzo dell’analisi di linkage sipossono avere informazioni sull’ordine lineare e la distanza dei geni sullo stessocromosoma. Solitamente vengono studiati geni che, se mutati, sono responsabili diun fenotipo patologico.L’analisi di concatenazione nell’uomo si basa sullo studio degli alberi genealogici e

sulla ricerca delle meiosi informative (quando si può identificare se il gamete è omeno ricombinante).Gli anni 1953 e 1957 costituiscono la vera rivoluzione della genetica molecolare,

con James Watson e Francis Crick (Fig. 3), che presentano sulla rivista Nature,quello che oggi è accertato come il primo modello della struttura del DNA, quellodella doppia elica.Nel 1957 Crick propose il dogma centrale della biologia molecolare, secondo il

quale l'informazione genetica parte dagli acidi nucleici per arrivare alle proteine,seguendo questa direzione.

Figura 3 Watson e CrickNel 1992 si verifica la seconda rivoluzione della citogenetica, che diventa

molecolare, con l’avvento dell’ibridazione in situ con sostanze fluorescenti (FISH)(Fig. 4), ad opera di Lichter. Questa tecnica consiste nel mettere a contatto acidinucleici a singolo filamento provenienti da due fonti differenti: una sonda marcata diacido nucleico e un DNA bersaglio non marcato. In questo modo è possibile lalocalizzazione di una specifica sequenza di acido nucleico su preparati fissati dicromosomi metafasici, di nuclei interfasici o di sezioni di tessuto con l'utilizzo di unasonda, rappresentata dal tratto di DNA complementare al tratto cromosomico che sivuole evidenziare.

Figura 4 FISHLa possibilità di utilizzo su larga scala di tecniche diagnostiche raffinate e precise,

ha portato ad una conoscenza sempre più approfondita, dal punto eziopatogeneticooltre che clinico delle malattie genetiche, con la possibilità di effettuare diagnosisempre più corrette e correlazioni tra genotipo e fenotipo sempre più accurate. Nellapratica clinica, la possibilità di accesso a tali tecniche diagnostiche, è diventataeffettiva negli anni ’90, epoca in cui la rivoluzione diagnostica in genetica è arrivatasul territorio nazionale.

La U.O.C. di Genetica e Immunologia Pediatrica dell’A.O.U. “G. Martino” di Messinaha seguito negli anni la vertiginosa evoluzione della genetica e delle sue tecniche.Dall’inizio degli anni 2000 la diagnosi delle malattie genetiche rare, nell’area delloStretto, è stata possibile mediante la creazione di laboratori dove si effettuanoquotidianamente indagini di citogenetica e di genetica molecolare. Il risultato è lapossibilità di offrire una diagnosi a pazienti con patologia cromosomica e genica,evitandone, in molti casi, i pellegrinaggi sanitari. La possibilità di effettuare ilcariotipo ha permesso di poter fare diagnosi di alterazioni numeriche dei cromosomi(Sindrome di Down, trisomia 13 e 18, sindrome di Turner, Sindrome di Klinefelterecc.) (Figg 5, 6) o di delezioni cromosomiche (Sindrome di Wolf-Hirschhorn,Sindrome du cri du chat, ecc.) (Figg 7, 8).

Figura 5 Sindrome di Down - trisomia 21

Figura 6 Sindrome di Klinefelter – 47, XXY

Figura 7 Sindrome di Wolf- Hirschhorn. Delezione braccio corto cromosoma 4

Figura 8 Sindrome 5pLa stretta collaborazione con altri centri italiani, in particolare con l’Istituto Mendel di

Roma, anche grazie al progetto REGEM (REte GEnetica Messina), ha permesso dipoter usufruire di indagini più complete, quali la FISH, di formulare diagnosi piùprecise e, in definitiva di offrire una consulenza genetica adeguata. La FISH ci hapermesso di capire, ad esempio, il perché della presenza, nell’ambito di sindromigenetiche note, di condizioni associate. È questo il caso della coesistenza, in unapaziente con delezione cromosomica 18q-, di un deficit di IgA legato proprio alledimensioni della delezione che coinvolgeva il locus 18q22.3-q23, regione dovemappano i geni di questa classe di immunoglobuline. Un altro nostro caso in cui laFISH è stata dirimente, è quello di un soggetto di sesso maschile ma con cariotipo46, XX. In questo caso peculiare la FISH è riuscita, ancora una volta, a fornirci larisposta, ovvero la presenza del gene SRY (Sex Determining Region, Yp11.3)traslocato sul cromosoma X (Fig. 9).

Figura 9 Cariotipo e FISHTalvolta le risposte diagnostiche ai pazienti sono state affiancate da scoperte in

campo genetico e immunologico. Le analisi di linkage condotte su una grandefamiglia dell’entroterra messinese, ad esempio, hanno permesso di associare un tipodi candidiasi muco cutanea cronica familiare (CMC) ad un deficit di molecoleintercellulari di adesione – 1 (ICAM-1) [1] e di trovarne il locus [2], a livello dellaregione 11p12–q12.1 (1, 2). (Fig. 10).

Figura 10 Analisi di linkage. CMCContestualmente all’evoluzione della citogenetica molecolare vengono creati i

microarray, sonde di DNA attaccate ad una superficie solida (vetro, plastica, o chip disilicio). Tali array vengono usati per analizzare il profilo d’espressione di un gene oper identificare la presenza di un gene o di una breve sequenza all'interno di unamiscela del patrimonio genetico di un organismo. La Comparative GenomicHybridation array (Fig. 5) consente di valutare contemporaneamente e con altaspecificità più regioni cromosomiche, in modo da poter evidenziare sbilanciamenticromosomici. Con questa metodica si analizza la presenza di variazionisubmicroscopiche nel patrimonio genetico e si effettua un mappaggio simultaneo adalta risoluzione di queste variazioni nella sequenza genomica. Migliora, pertanto, larilevazione di piccole anomalie cromosomiche, avendo un livello di risoluzione oltrequello del microscopio ottico (5-10 Mb) e permettendo l’analisi molecolare di tutto ilgenoma.

Figura 11 Array-CGHNegli ultimissimi anni è diventato possibile effettuare l’exome sequencing. Si tratta

di una strategia diagnostica che permette di ottenere la sequenza delle regionicodificanti dell’intero genoma umano, al fine di identificare nuovi geni associati amalattie rare o patologie comuni. Questa indagine è però ancora effettuata solo inpochi laboratori al mondo.La possibilità di effettuare e di usufruire delle tecniche di diagnosi più moderne ha

prodotto anche un altro effetto positivo: la riduzione dei pellegrinaggi sanitari. Comeil caso di chi, a 8 anni ha già ricevuto una decina di diagnosi nel suo peregrinare eche, solo grazie all’ausilio e all’impiego di analisi moderne, è stato possibile giungerealla diagnosi di sindrome di Chudley-Lowry, una malattia X-linked recessiva,caratterizzata da: ritardo mentale, dimorfismi facciali, bassa statura, obesità eipogonadismo. Nonostante le possibilità di diagnosi in genetica, negli anni ’90,diventassero sempre più precise, molti casi di ritardo mentale rimanevano senza unaspiegazione e senza la possibilità di poter offrire a questi pazienti un follow-upadeguato o una consulenza genetica completa. In questo senso, la scoperta deiriarrangiamenti telomerici ha dato una svolta allo studio del ritardo mentale e dellesue cause genetiche. Le regioni subtelometiche sono regioni ricche di geni,pseudogeni e sequenze ripetute che facilitano l’appaiamento anomalo alla meiosi. Iriarrangiamenti più comuni si localizzano in 1p, 22q, Xq e nel 50% dei casi siverificano de novo. Anche in una nostra paziente affetta da ritardo mentale edismorfismi facciali, grazie all’impiego ancora una volta della FISH, si è riusciti a

dimostrare una delezione della regione subtelomerica del braccio lungo delcromosoma 18 ed una duplicazione della regione subtelomerica del braccio corto delcromosoma 9, da malsegregazione di traslocazione bilanciata materna (9:18)(pter;qter).Infine la collaborazione internazionale, espressa anche in termini di ricerca, si è

concretizzata ad esempio, nella descrizione prima clinica [3] poi molecolare [4], disindromi rarissime quali la sindrome di Nablus. In particolare, nel 2003, il nostrogruppo ha descritto il secondo caso al mondo di sindrome di Nablus (Fig. 12),caratterizzata fenotipicamente da: ipertelorismo, blefarofimosi bilaterale, sopraccigliarade, sottili, arcuate ed altri dimorfismi (3).

Figura 12 Paziente con sindrome di NablusL’impiego della CGH-array in due dei tre pazienti al mondo con sindrome di Nablus,

tra cui il nostro caso, ha permesso l’individuazione di una delezione a livello delcromosoma 8 al locus q22.3q22.1 (Fig. 10); la diagnosi è poi stata confermata con lacitogenetica molecolare (FISH) (4). Tale delezione era assente nei genitori. Lacollaborazione con l’Università di Standford ha permesso di confrontare il genoma di2 dei 3 casi di sindrome di Nablus descritti al mondo, delezione che è statasuccessivamente riscontrata in un paziente americano, terzo caso individuato dellasindrome (Shieh JT et al., 2006).

Figura 13 CGH-array. Del 8q22.3q22.1La CGH-array ha reso possibile l’individuazione di alterazioni genomiche sempre

più “piccole”, ma capaci di dare vita a fenotipi particolari, come ad esempio 3 casi dimicrodelezioni a carico, rispettivamente del braccio lungo del cromosoma 1, 11 e delbraccio corto del cromosoma 6, tutte associate a specifici quadri dismorfologici. LaCGH-array e la successiva conferma con la FISH, hanno permesso di fare diagnosidi sindrome di Smith- Magenis (Microdelezione interstiziale in 17p11.2) in unpaziente con ritardo mentale, disturbi del linguaggio, criptorchidismo, brachidattilia ealtri segni dismorfici.E’ evidente quindi come allo stato attuale, la corsa all’evoluzione iniziata dalla

genetica come scienza, appena un secolo fa, ha già prodotto risultati importanti siain termini di conoscenza delle basi eziopatogenetiche di molte patologie geneticherare, che in termini di possibilità diagnostiche. Avere a disposizione tecniche capacidi dare risposte precise e affidabili diventa cruciale nell’evoluzione della genetica.Bibliografia1) Familial Chronic Nail Candidiasis with ICAM-1 deficiency: a new form of Chronic

Mucocutaneous Candidiasis . Zuccarello D, Salpietro DC, Gangemi S, Toscano V,Merlino MV, Briuglia S, Bisignano G, Mangino M, Mingarelli R, Dallapiccola B JMedical Genetics, 39 (9): 671-75, 20022) A gene for familial isolated chronic nail candidiasis (CMC) maps to chromosome

11p12-q12.1. Mangino M, Salpietro DC, Zuccarello D, Gangemi S, Rigoli L, MerlinoMV, Briuglia S, Bisignano G, Mingarelli R, Dallapiccola B. European Journal ofHuman Genetics, 11 (6):433-6, 20033) Confirmation of NablusMask-like Facial Syndrome. CD Salpietro, S Briuglia, MV

Merlino, L Rigoli, B DallapiccolaAm J Med Genet, 20034) Nablus mask-like facial syndrome is caused by a microdeletion of 8q detected by

array-based comparative genomic hybridization. Shieh JT, Aradhya S, Novelli A,Manning MA, Cherry AM, Brumblay J, Salpietro CD, Bernardini L, Dallapiccola B,Hoyme HE. Am J Med Genet A. 2006 Jun 15;140 (12):1267-73.

Trimestrale di divulgazione scientifica dell'Associazione Pediatrica di Immunologia e GeneticaLegge 7 marzo 2001, n. 62 - Registro della Stampa Tribunale di Messina n. 3/09 - 11 maggio 2009

Direttore scientifico Carmelo Salpietro - Direttore responsabile Giuseppe Micali - Segreteria redazione Basilia Piraino - Piera Vicchio Direzione-Redazione: UOC Genetica e Immunologia Pediatrica - AOU Policlicnico Messina

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