ANÁLISE DO CONTEÚDO BACTERIANO DE INFECÇÕES...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA

AUGUSTO RODRIGUES LIMA

ANÁLISE DO CONTEÚDO BACTERIANO DE INFECÇÕES

ENDODÔNTICAS PRIMÁRIAS SINTOMÁTICAS E ASSINTOMÁTICAS E

SUSCETIBILIDADE DE BACTÉRIAS ESPECÍFICAS A AGENTES

ANTIMICROBIANOS

Piracicaba

2017

AUGUSTO RODRIGUES LIMA

ANÁLISE DO CONTEÚDO BACTERIANO DE INFECÇÕES

ENDODÔNTICAS PRIMÁRIAS SINTOMÁTICAS E ASSINTOMÁTICAS E

SUSCETIBILIDADE DE BACTÉRIAS ESPECÍFICAS A AGENTES

ANTIMICROBIANOS

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia

de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas

como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do

título de Mestre em Clínica Odontológica, na área de

Endodontia.

Orientadora: Profa Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO

ALUNO AUGUSTO RODRIGUES LIMA, E

ORIENTADA PELA PROFA. DRA. BRENDA

PAULA FIGUEIREDO DE ALMEIDA GOMES.

Piracicaba

2017

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a ti, Senhor. Sem a tua permissão nada seria

concretizado. Agradeço por me proteger e por me conceber tantas alegrias.

Aos meus pais Luciana Herculina de Lima Lopes e Nelson Rodrigues

Soares Filho e ao meu segundo pai Tonismar Batista Lopes. O apoio incondicional

de vocês é a ponte para a minha felicidade. Todas as minhas conquistas são pautadas

na formação que eu obtive de vocês e, por isso, são também suas. Mais uma etapa

concluída graças ao suporte que a minha família me dá. Obrigado pela paciência,

dedicação, carinho e comprometimento com nossa família.

A meus irmãos Murillo Lima Rodrigues e Pedro Lima Lopes. O apoio de

vocês é essencial para que eu possa seguir minha jornada. Muito obrigado pela

compreensão e pela ajuda.

À minha namorada, Andrea Cardoso Pereira. Agradeço por ser minha

grande companheira. Você me acompanhou desde a prova de seleção para o

mestrado e sempre me incentivou a seguir nesta jornada. Eu sou muito grato pelo seu

respeito, carinho, cuidado e admiração. Este período foi composto por diversas

realizações de sonhos e você fez questão de participar de todos os momentos.

À minha orientadora, Profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida

Gomes. Agradeço por confiar em meu potencial e por todas as oportunidades que a

senhora me proporciona. Mais que orientadora, a senhora é uma formadora, isto é ser

verdadeiramente mestre. A senhora contribuiu muito para a minha formação

profissional e pessoal. Eu sou grato por seus ensinamentos e cuidados, pois eu sei

que é sempre pensando no meu bem. Este período foi muito importante em minha

vida e fico feliz por tê-la como referência.

AGRADECIMENTOS

À direção da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade

Estadual de Campinas, na pessoa do seu diretor, o Prof Dr. Guilherme Elias

Pessanha Henriques.

À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

pela concessão da bolsa de mestrado, processo nº 2014/27366-8 e pela concessão

da bolsa de estágio no exterior BEPE – Mestrado, processo nº 2016/18512-6.

À Profa. Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury, coordenadora do

Programa de Pós-Graduação da FOP/UNICAMP e à Profa Dra. Karina Gonzales

Silvério Ruiz, coordenadora do curso de Pós-Graduação em Clínica Odontológica.

Aos professores da área de Endodontia, Profa. Dra. Adriana de Jesus

Soares, Prof. Dr. Alexandre Augusto Zaia, Profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo

de Almeida Gomes, Prof. Dr. Caio Cezar Randi Ferraz e Prof. Dr. José Flávio

Affonso de Almeida.

Aos professores que participaram de minha banca de qualificação, Prof.

Dr. Carlos Augusto Moraes Souto Pantoja, Prof. Dr. Rafael Nóbrega Stipp e Prof.

Dr. Daniel Rodrigo Herrera Morante. Vocês contribuíram muito na correção de

minha dissertação. Todas as considerações foram pertinentes e ajudaram a

enriquecer meu trabalho.

Aos professores membros da banca de dissertação de mestrado, Profa.

Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes, Prof. Dr. Alexandre Augusto

Zaia e Prof. Dr. Francisco Montagner, pelas inestimáveis contribuições e

considerações dadas a este trabalho.

Aos professores Profa. Dra. Jacqueline Abranches e Prof. José Lemos,

e a todos os colegas que fiz durante o estágio na Universidade da Flórida. Vocês

proporcionaram um estágio muito proveitoso e muito importante para mim.

Ao Prof. Dr. Ricardo Della Coletta e Fabio Haach Téo, pela

disponibilidade em me ajudar e contribuir para a realização desta pesquisa. Todas as

vezes que eu precisei sempre fui muito bem recebido. Agradeço por todos os

ensinamentos.

As funcionárias Ana Cristina Godoy, Maria Helídia Neves Pereira e

Tifanny Abreu.

Ao meu grande amigo Maicon Ricardo Zieberg Passini que possui uma

personalidade ímpar e é referência de caráter e humildade. Muito obrigado por ter

extrapolado a relação de funcionário/aluno e de ter me dado a oportunidade de ser

seu amigo.

Aos colegas de mestrado Bruna Alves Taveira Ueno, Bruna Milaré

Angelieri, Eloá Cristina Bícego Pereira, Rafaela Casadei Chapola e Rodrigo

Arruda.

Aos meus dois grandes amigos do mestrado Diogo Henrique da Silva e

Priscila Amanda Franscisco pela grande parceria nessa jornada. A gente passou

por muitas coisas juntos e entre momentos difíceis, e outros muito agradáveis,

conseguimos fortalecer uma bela amizade. Tenho a certeza que a pós-graduação não

teria sido a mesma sem vocês. Obrigado pelo carinho, paciência, companheirismo e

amizade sincera.

As minhas amigas Flavia Saavedra e Jaqueline Lazzari pelo

companheirismo e apoio ao longo destes dois anos. Tive a sorte de poder contar com

cada uma de vocês e espero ter retribuído de alguma maneira tudo que vocês me

ajudaram.

Aos colegas de doutorado Aline Cristine Gomes, Ana Carolina Correia

Neto, Ariane Marinho, Erika Manuela Clavijo, Maria Cristina Carvalho, Mario Luis

Zuolo, Thais Mageste, Tiago Pereira Rosa.

Ao meu amigo Felipe Nogueira Anacleto que possui uma generosidade

incrível. Sua amizade é muito importante para mim e espero poder correspondê-la

sempre. Tenho certeza que nossa amizade se fortalecerá cada vez mais.

Ao meu amigo Marlos Barbosa Ribeiro que aceitou o desafio de me co-

orientar durante o meu estágio no laboratório e com muita dedicação me preparou

para o mestrado. Fico feliz por contar com sua parceria e, sobretudo, com a sua

amizade durante todo este período.

As minhas amigas Ana Carolina Pimentel, Aniele Carvalho Lacerda e

Daniela Cristina Miyagaki que me acompanham desde a graduação. Vocês são

importantes na minha trajetória profissional e com o tempo de convivência se

mostraram minhas amigas. Podem ter certeza que vocês fazem muita falta em

Piracicaba.

Ao meu amigo Daniel Rodrigo Herrera que também me acompanha desde

o período de graduação. Obrigada pelo carinho, atenção, pelos ensinamentos

transmitidos e por todos os momentos de alegria e diversão em churrascos, viagens

e congressos.

Ao meu amigo Carlos Augusto Pantoja por todo o incentivo e

oportunidade oferecidos na evolução da minha prática clínica e por todos os

ensinamentos. Tenho a certeza que vamos ter muitos mais momentos bacanas nesta

jornada.

Ao meu amigo Bruno Vilela Muniz. Obrigado pela agradável convivência,

pelos conhecimentos compartilhados e bons momentos vividos durante esses dois

anos.

A aluna da iniciação científica Ana Beatriz Safady Lopes por confiar em

mim. A cada dia eu aprendo mais com você e me esforço para poder corresponder às

suas expectativas.

Aos meus amigos de Goiânia, por me mostrarem que o tempo e a

distância não são capazes de acabar com uma amizade verdadeira. Vocês estão

presentes nas minhas melhores histórias e lembranças e são pessoas indispensáveis

na minha vida.

A minha avó Maria Madalena de Lima. Obrigada por todo o amor que

sempre dedicou a mim. E a toda minha família, que mesmo distante, sempre me

incentivou e vibrou com minhas conquistas.

A todos os pacientes que participaram da minha pesquisa, obrigado pela

confiança em mim. Vocês foram essenciais para a concretização deste sonho e dedico

esta vitória a cada um de vocês.

A todos que participaram direta ou indiretamente, contribuindo para

realização deste trabalho.

RESUMO

Dentes com necrose pulpar, sintomatologia dolorosa e destruição óssea

periapical tendem a ser colonizados por uma microbiota anaeróbica mais complexa

quando comparada aos casos assintomáticos. Bactérias de pigmento negro (BPN)

incluindo as espécies Prevotella e Porphyromonas e Fusobacterium ssp. têm sido

frequentemente isoladas/detectadas de casos sintomáticos. Entretanto, devido ao uso

indiscriminado de agentes antimicrobianos, elas têm desenvolvido resistência aos

mesmos. Assim, o presente estudo teve como objetivos: a) estudar a composição da

microbiota de dentes com necrose pulpar sintomáticos (i.e. com presença de

abscesso periapical) e assintomáticos através da técnica de checkerboard; b)

determinar a suscetibilidade das BPN e Fusobacterium ssp identificados através do

sequenciamento genético, frente aos antimicrobianos mais empregados na clínica

odontológica e c) correlacionar achados clínicos com o conteúdo microbiológico.

Foram selecionados pacientes com necessidade de intervenção endodôntica

apresentando ou não sintomatologia dolorosa. Amostras microbiológicas foram

coletadas de 20 canais radiculares e também do abscesso periapical (n=10). Parte

das amostras microbiológicas foi processada através do checkerboard, e outra parte

foi diluída, plaqueada e incubada, e os microrganismos isolados e identificados

através do sequenciamento genético. A suscetibilidade antimicrobiana das bactérias

BPN e Fusobacterium ssp foi determinada através do método E-test, utilizando os

antibióticos: benzilpenicilina, amoxicilina, amoxicilina + ácido clavulânico, eritromicina,

azitromicina, metronidazol e clindamicina. A microbiota dos três sítios investigados

revelou uma grande diversidade de espécies, incluindo bactérias do gênero Prevotella

e Porphyromonas, com associações positivas e negativas (p<0,05). Não houve

associações estatisticamente signficantes entre microrganismos e sinais e sintomas

clínicos observados (p> 0,05). Em relação ao E-test, todas as cepas isoladas se

mostraram sensíveis a amoxicilina associada ao ácido clavulânico. Azitromicina foi o

antibiótico menos efetivo. Concluiu-se que a microbiota presente nos casos

sintomáticos é mais complexa que a dos casos assintomáticos com lesão periapical,

com um maior número de associações positivas e negativas entre os microrganismos.

A maioria das espécies bacterianas demonstrou algum grau de resistência a todos os

agentes antimicrobianos testados.

Palavras-chaves: Endodontia. Abscesso. Microbiologia. Antibacterianos.

ABSTRACT

Teeth with pulp necrosis presenting symptomatology and periapical bone destruction

tend to be colonized by a more complex anaerobic microbiota compared to the

asymptomatic cases. Black pigmented bacteria (BPB), including Prevotella and

Porphyromonas ssp, and Fusobacterium ssp. have been frequently isolated/ detected

in symptomatic cases. However, due to the indiscrimated use of antimicrobial agents,

resistance to them has been developed. Thus, the aims of this study were: a) to

investigate the composition of the microbiota of symptomatic (ie the presence of

periapical abscess) and asymptomatic teeth with pulp necrosis by checkerboard; b) to

determine the antimicrobial susceptibility of BPB and Fusobacterium ssp., identified by

sequencing, in front of the most commonly used antimicrobial agents in the dental

clinics; and c) to correlate the clinical findings with the microbial date. Patients in need

of endodontic therapy due to pulp necrosis with the presence of symptomatology (n =

10) or asymptomatic (n = 10), were selected. Samples for microbiological analysis

were collected from 20 root canals, as well as from the dental abscess (n = 10). Part

of the microbial samples were processed by checkerboard, and another part was

diluted, plated and incubated, and the isolated microorganisms identified by genetic

sequencing. The antimicrobial susceptibility of BPB and Fusobacterium ssp was

determined by the E-test method using the antibiotics: benzylpenicillin, amoxicillin,

amoxicillin + clavulanic acid, erythromycin, azithromycin, clindamycin and

metronidazole. The microbiota of the three sites investigated revealed a great diversity

of species, including bacteria of the genus Prevotella and Porphyromonas, with

positive and negative associations (p <0.05). There was no statistically significance

diferences in the association between microorganisms and clinical signs and

symptoms (p> 0.05). The results of the E-test showed that all strains isolated were

sensitive to amoxicillin associated with clavulanic acid. Azithromycin was the least

effective antibiotic. In conclusion, the microbiota of symptomatic cases is more

complex than the asymptomatic cases with apical periododontitis, with a greater

number of positive and negative associations between the microorganisms. The

majority of the selected bacteria showed some resistance to all antimicrobial agents

tested.

Key words: Endodontics. Abscess. Microbiology. Anti-bacterial agents.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................................. 14

2 REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................................................... 17

2.1 Microbiota da infecção endodôntica primária ...................................................................... 17

2.2 A utilização da técnica do checkerboard DNA-DNA Hybridization em endodontia ....... 22

2.3 Suscetibilidade antimicrobiana (E-test) em endodontia ..................................................... 28

3 PROPOSIÇÃO ................................................................................................................................. 31

3.1 Objetivo: .................................................................................................................................... 31

3.2 Objetivos Específicos: ............................................................................................................. 31

4 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................................. 32

4.1 Local da pesquisa .................................................................................................................... 32

4.2 Seleção dos participantes da pesquisa ................................................................................ 32

4.3 Grupos experimentais ............................................................................................................. 32

4.4 Critérios de inclusão e exclusão, aspectos clínicos e radiográficos ................................ 32

4.5 Coleta de amostras ................................................................................................................. 33

4.6 Procedimentos Laboratoriais ................................................................................................. 35

4.6.1 Checkerboard DNA-DNA Hibridization ......................................................................... 35

4.6.2 Sequenciamento genético do gene 16S rRNA ............................................................ 39

4.6.3 Suscetibilidade antimicrobiana (E-test) ......................................................................... 40

4.7 Análise de dados ..................................................................................................................... 41

5 RESULTADOS ................................................................................................................................ 42

5.1 Caracterização da microbiota presente em canais radiculares de dentes com

necessidade de intervenção endodôntica, com lesão periapical e sem sintomatología ..... 42

5.2 Caracterização da microbiota presente em canais radiculares e abscessos apicais de

dentes com necessidade de intervenção endodôntica com necrose pulpar associado a

abscesso apical e sintomatologia dolorosa ................................................................................ 47

5.3 Suscetibilidade aos agentes antimicrobianos (E-test) ....................................................... 60

6 DISCUSSÃO .................................................................................................................................... 66


necessidade de intervenção endodôntica, com lesão periapical e sem sintomatologia ..... 66

6.2 Caracterização da microbiota presente em canais radiculares e abscessos apicais de

dentes com necessidade de intervenção endodôntica com necrose pulpar associado a

abscesso apical e sintomatologia dolorosa ................................................................................ 68

6.3 Suscetibilidade aos agentes antimicrobianos (E-test) ....................................................... 69

7 CONCLUSÃO .................................................................................................................................. 74

REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 75

Apêndice 1 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ................................................... 84

Apêndice 2 – Tabelas das Bacterias pelo Checkerboard em casos sintomáticos e

assintomáticos asociados a abscesos apicais .......................................................................... 87

Quadro 1. Bactérias identificadas pelo Checkerboard em canais radiculares de dentes

com necessidade de intervenção endodôntica, com lesão periapical e sem

sintomatologia ................................................................................................................................. 87

Quadro 2. Bactérias identificadas pelo Checkerboard em canais radiculares e abscessos

apicais de dentes com necessidade de intervenção endodôntica com necrose pulpar

associado a abscesso apical e sintomatologia dolorosa ......................................................... 90

Anexo 1 - Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa da FOP-UNICAMP ........................ 97

14

1 INTRODUÇÃO

Uma vez que a maioria das bactérias capazes de infectar os canais

radiculares é proveniente da cavidade oral (Gomes et al., 1994a), esses

microrganismos representam um importante papel no desenvolvimento e manutenção

de patologias pulpares e periapicais (Kakehashi et al., 1965); sendo sua sobrevivência

intra-radicular e suas propriedades patogênicas influenciadas por uma combinação de

fatores, incluindo: interação sinérgica entre espécies, capacidade de interferir e evadir

a resposta do hospedeiro e os fatores de virulência (Nair, 2004). Entretanto, os canais

radiculares formam um ambiente seletivo aos microrganismos, permitindo que apenas

algumas espécies sejam capazes de colonizar este sistema (Sundqvist, 1992; Gomes

et al., 1994b)

Em artigo de revisão da literatura, Sundqvist (1994) observou que cerca de

300 grupos bacterianos eram capazes de colonizar a cavidade oral. No entanto,

devido às restrições nutricionais e ambientais, apenas um seleto grupo de

microrganismos era capaz de se adaptar às condições impostas pelo ecossistema que

se desenvolve no canal radicular com necrose pulpar. Hoje em dia sabemos que o

número de bactérias é mais alto, com cerca de 916 espécies (Santos et al., 2011).

O terço apical dos canais radiculares é considerado uma área estratégica

com complexas características anatômicas onde o sistema imune não é capaz de

atuar durante a necrose e infecção pulpar. Se a agressão causada por bactérias

provenientes do canal radicular e protruindo pelo forame apical é de alta intensidade,

há uma resposta inflamatória aguda. Quando a resposta inflamatória não consegue

eliminar o agente agressor ou reduzir a intensidade da injúria, há uma exacerbação

caracterizada pela formação de uma inflamação com liquefação tecidual, gerando o

pus. Forma-se então um abscesso periapical agudo (Siqueira et al., 2004). Se o

abcesso não for tratado adequadamente, pode levar a perda dentária e ter

consequencias mais sérias tais como septicemia, em que há disseminação dos

microorganismos nocivos através dos sistemas linfático e arterial, quadro este que

pode levar o paciente à morte (Hsiao et al., 2012).

Estudos usando métodos de cultura ou métodos moleculares que não

dependem da cultura indicam que infecções endodônticas primárias são

polimicrobianas, dominadas por bactérias anaeróbias estritas (Gomes et al., 1994a;

15

Siqueira et al., 2001; Jacinto et al., 2003; Gomes et al., 2004, 2007; Sousa et al., 2013;

Sakamoto et al., 2006; Montagner et al., 2012). Achados indicam que nem todas as

espécies bacterianas anaeróbias estritas tais como Porphyromonas, Prevotella,

Fusobacterium e “Peptostreptococcus” estão envolvidas com sintomas clínicos, como

a dor, e exercem um papel significativo na patogênese das lesões inflamatórias

periapicais (Griffee et al., 1980; Gomes et al., 1994a, 1996; Baumgartner et al., 1999;

Siqueira et al., 2001; Jacinto et al., 2003; Sakamoto et al., 2006). No entanto acredita-

se que grande parte destes microrganismos ainda não tenha sido identificada, sendo

que têm surgido na literatura espécies bacterianas apontadas como possíveis

patógenos endodônticos, podendo ou não estar associados aos sinais e sintomas

endodônticos.

Bacilos produtores de pigmento negro (BPPN) são anaeróbios gram-

negativos, que colonizam as mucosas e são microrganismos indígenas da cavidade

oral. Quando cultivados em ágar, apresentam a capacidade de produzir pigmento

negro, caracterizado quimicamente como protohemina e protoporfirina (Shah e

Gharbia, 1993). Espécies pertencentes ao gênero Prevotella podem não ser

pigmentadas, tais como Prevotella bivia, Prevotella disiens, Prevotella buccae,

Prevotella bucalis, Prevotella oralis e Prevotella oris. Inicialmente, as espécies

estavam agrupadas em um único gênero, Bacteroides. Shah e Collins (1990)

propuseram sua divisão, baseando-se em características nutricionais, análises

químicas e bioquímicas. As espécies sacarolíticas foram agrupadas no gênero

Prevotella, enquanto que espécies assacarolíticas pertencem ao gênero

Porphyromonas. BPPN têm sido encontrados frequentemente em dentes com

sintomatologia dolorosa (Jacinto et al., 2003; Gomes et al., 2004; Sousa et al., 2013;

Montagner et al., 2012).

Estudos envolvendo métodos moleculares para diagnóstico, como PCR,

checkerboard DNA-DNA hybridization (Siqueira et al., 2002) e Denaturing gradient gel

eletrophoresis (DGGE) (Siqueira et al., 2004) têm permitido uma melhor compreensão

da composição da microbiota pulpar e periapical. A técnica do checkerboard DNA-

DNA hybridization ou hibridização DNA-DNA foi descrita inicialmente em 1994ª por

Socransky e colaboradores. Caracteriza-se por ser rápida, sensibilidade adequada e

relativamente barata, superando várias limitações de abordagens que empregam

cultura microbiana para o estudo das comunidades presentes em amostras clínicas

(Sakamoto et al., 2006). Socransky et al., (2004) relatam ainda que a amostra, em sua

16

totalidade, pode ser empregada, não havendo necessidade de amplificação prévia por

PCR. Este método permite a hibridização, em um mesmo momento, de 28 amostras

frente a 43 diferentes sondas de DNA. Ao permitir a detecção da ocorrência de várias

espécies em uma mesma reação, seu emprego torna-se interessante em estudos

epidemiológicos (Siqueira et al., 2004)

Finalmente, o uso indiscriminado dos antibióticos tem levado à seleção de

bactérias resistentes aos antimicrobianos principalmente as isoladas de abscesos

periapicais, incluindo as BPN (Gomes et al., 2011).

Testes de suscetibilidade antimicrobiana verificam a concentração de um

antibiótico necessária para inibir o crescimento microbiano in vitro (CLSI 2007, 2013).

O método E-test consiste em uma fita com gradientes de concentração de um

determinado antibiótico utilizado para teste de difusão em placas de ágar. Esse teste

tem a vantagem de determinar a CIM (concentração inibitória mínima), além de ser

um teste adequado para as bactérias anaeróbias estritas. Vários estudos (Sousa et

al., 2003, 2013; Gomes et al., 2011; Montagner et al., 2014) têm empregado esta

metodologia.

Baseados na literatura pesquisada, observamos que são poucos os

estudos que comparam simultaneamente a microbiota de dentes com necrose pulpar

e sintomatologia dolorosa (abscesso periapical), com a microbiota de dentes

assintomáticos com necrose pulpar e presença de lesão periapical. Nossa

contribuição nesta área foi de identificar possíveis candidatos a patógenos

endodônticos e também suscetibilidade de algumas bactérias anaeróbicas isoladas

dos canais radicularaes e dos abscessos periapicais a agentes antimicrobianos

frequentemente prescritos em endodontia, principalmente nos casos de abscessos.

Tal monitoramento é importante devido ao aumento de resistência das bactérias a

estes antibióticos.

17

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Microbiota da infecção endodôntica primária

Bacterias e seus subprodutos são os principais fatores etiológicos da

infecção endodôntica. Em 1976, Sundqvist utilizou métodos de cultura em

anaerobiose, com o objetivo de avaliar a microbiota de 32 dentes traumatizados e que

apresentavam necrose pulpar e coroas íntegras. A seleção criteriosa dos pacientes

permitiu a exclusão de fatores que pudessem gerar contaminações nas amostras.

Microrganismos anaeróbios estritos foram isolados em 90% dos casos, valor nunca

antes obtido em estudos empregando cultura de bactérias fastidiosas.

A microbiota encontrada nos canais radiculares infectados é geralmente

mista e constituída principalmente por espécies anaeróbias estritas, variando de

acordo com a via que os microrganismos chegaram ao sistema de canais radiculares

(Gomes et al., 1994a).

Fabricius et al. (1982) contaminaram dentes de macacos através da

exposição da polpa à cavidade oral e observaram que a microbiota presente nos

canais radiculares após 7, 90, 180 e 1060 dias sofreu alterações qualitativas e

quantitativas. Estabeleceu-se que a proporção de microrganismos anaeróbios

aumentou com o passar do tempo, e no final de 1060 dias, cerca de 50% das bactérias

isoladas eram anaeróbias estritas. Os autores sugeriram ainda que uma ampla

variedade de fenômenos interativos ocorrem na luz do canal radicular, favorecendo a

evolução para uma microbiota cada vez mais mais complexa. Ainda, houve

predominância de microrganismos fastidiosos na porção apical do canal radicular,

enquanto que nas porções mais coronárias microrganismos facultativos eram

isolados, principalmente nos períodos iniciais.

Finegold (1993), em revisão de literatura, descreve os fatores do organismo

hospedeiro que favorecem o desenvolvimento de uma infecção por patógenos

anaeróbios. Segundo o autor, estas infecções originam-se da flora indígena do corpo

humano, pois os microrganismos anaeróbios são abundantes nas mucosas e superam

em número as espécies aeróbias e facultativas em proporção similar a 10-1000:1.

18

Estruturalmente, a população microbiana encontra-se suspensa no lúmen

do canal radicular, com uma variedade imensa de tipos morfológicos consistindo em

cocos, bacilos e formas filamentosas, além de serem observados também densos

agregados bacterianos aderidos às paredes do canal radicular (Nair, 1987). As

bactérias podem ser encontradas também penetrando os túbulos dentinários,

atingindo profundidades próximas a 300 µm (Siqueira et al., 2002).

As populações microbianas raramente existem no ambiente em completo

isolamento. O confinamento de uma população por fatores químicos e físicos e as

ações das populações vizinhas afetam a dinâmica de desenvolvimento e o

comportamento fisiológico de um grupo de microrganismos (Gharbia e Shah, 1993).

Esse fato pode ser constatado também em estudo de Gomes et al. (1999), onde

demonstraram que em um mesmo indivíduo, quando diferentes elementos dentais são

afetados por infecções endodônticas, as características da microbiota são similares,

mas não totalmente iguais, sugerindo o desenvolvimento de nichos ecológicos

distintos.

Em algumas situações, os organismos comensais podem multiplicar-se,

atingindo número elevado de indivíduos, tornando impossível a atuação do sistema

de defesas (Sundqvist, 1992). A comunidade médica reconhece atualmente a

importância das doenças polimicrobianas e os principais tipos de interações

microbianas associadas com as condições humanas de saúde ou doença (Brogden et

al., 2005).

Para que os microrganismos superem as defesas do hospedeiro, eles

devem sofrer contínuas alterações com o objetivo de se adaptarem às mudanças no

meio onde se estabelecem (Ziembuhr et al., 1999). O canal radicular que contém uma

polpa necrótica é facilmente infectável, pois a defesa do hospedeiro passa a atuar

somente em uma pequena área restrita à região apical, o que faz com que as bactérias

estejam protegidas do sistema imune (Haapasalo, 1993).

A virulência dos microrganismos pode ser afetada pelas relações de

sinergismo que se estabelecem entre as bactérias, quando em infecções mistas

(Gomes et al., 1994b). van Dalen et al. (1998) inocularam no dorso de cobaias as

bactérias Peptostreptococcus micros e diferentes espécies de Prevotella ssp

19

isoladamente ou em associação. Observaram que a área média dos abscessos

induzidos pelos inóculos mistos foi maior que aqueles obtidos por monoinóculos.

A presença de bactérias aeróbias diminui a concentração local de oxigênio

e o potencial de óxido-redução resultando na criação de um ambiente físico

apropriado para a proliferação dos microrganismos anaeróbios estritos (Gharbia e

Shah, 1993; Finegold, 1993).

A ampla gama de relações nutricionais que existem entre as espécies pode

influenciar associações específicas, o que explica o fato de que bactérias

fermentadoras de aminoácidos e peptídeos são mais freqüentemente encontradas

nos canais radiculares do que bactérias sacarolíticas, devido às características de

restrição de nutrientes em seu interior (Sundqvist, 1992).

ter Steeg e van der Hoeven (1989), utilizando a cultura, estudaram a

sucessão de espécies presentes na placa bacteriana sub-gengival durante a adição

de nutrientes específicos em plasma. Inicialmente, o baixo conteúdo de carboidratos

do meio foi consumido por espécies sacarolíticas, originando ácidos fórmico e lático.

Em uma segunda etapa, ocorreu a hidrólise de proteínas, favorecendo a fermentação

de aminoácidos e utilização dos carboidratos restantes. As bactérias que se

desenvolveram nesse período foram Bacteroides intermedius, Veillonella parvula,

Eubacterium ssp e Fusobacterium nucleatum. Na fase final ocorreu um aumento

progressivo na degradação protéica e aumento da fermentação de aminoácidos. As

espécies predominantes nessa fase foram Peptostreptococcus micros, Fusobacterium

nucleatum, e Eubacterium ssp.

Shah e Gharbia (1993) demonstraram que as espécies sacarolíticas

Prevotella melaninogenica, Prevotella denticola, Prevotella loescheii e Prevotella

intermedia são associadas freqüentemente à placa bacteriana supra-gengival,

enquanto que as espécies assacarolíticas Porphyromonas gingivalis e

Porphyromonas endodontalis colonizam preferencialmente sítios onde não há

presença de carboidratos.

Em 2002, Munson et al. empregaram simultaneamente técnicas de cultura

microbiana e técnicas moleculares para estudar a microbiota do canal radicular de

dentes associados a abscessos, sugerindo uma maior diversidade em sua

20

composição. Os autores destacaram que uma média de 20,2 espécies foi detectada

através dos métodos moleculares, enquanto que apenas 12,6 foram isoladas.

Gomes et al. (2004), utilizando a cultura, relataram que existe uma

diferença das características da composição da microbiota dos canais radiculares de

dentes com necrose pulpar (infecção primária) e de dentes tratados

endodonticamente que apresentam insucesso (infecção secundária/persistente). A

presença de uma microbiota mista formada por microrganismos Gram-negativos e

Gram-positivos, principalmente anaeróbios, com no máximo dez espécies diferentes

por canal radicular é encontrada em infecções primárias. Já nos casos de insucesso

do tratamento endodôntico, os autores observaram a predominância de

microrganismos anaeróbios facultativos e Gram-positivos, com uma média de uma ou

duas espécies por canal radicular. Os autores sugerem que as interações entre

diferentes grupos bacterianos permitem o estabelecimento de uma patologia,

dificilmente encontrada quando os mesmos microrganismos estão isolados.

A introdução de métodos moleculares de diagnóstico representou uma

ferramenta importante para a identificação de patógenos, para o estudo da relação

parasita-hospedeiro e para determinação da posição taxonômica dos microrganismos

envolvidos no processo de doença. Entre estes métodos, “polymerase chain reaction”

(PCR), Reação em Cadeia da Polimerase, é o que apresenta maior sensibilidade para

detecção de microrganismos. PCR é um método in vitro para replicação de

seqüências específicas de DNA. Começando com uma pequena quantidade de DNA,

cerca de uma célula bacteriana, PCR amplia a um bilhão de vezes uma seqüência

específica conhecida do DNA microbiano e permite sua detecção por eletroforese em

gel de agarose. Por sua alta sensibilidade e habilidade de detectar microrganismos de

difícil cultivo, vários autores têm preferido este método (Dix et al., 1990). Siqueira e

Roças (2005a) relatam as vantagens das técnicas moleculares, tais como: detecção

de espécies cultiváveis e de espécies difíceis de serem cultivadas; alta especificidade

na detecção de espécies com fenótipos similares; detecção direta de espécies sem a

necessidade de cultivo laboratorial; alta sensibilidade; maior rapidez; fornece

diagnósticos rápidos, necessários principalmente em doenças ou infecções que

podem causar morte ou detecção de espécies de lento crescimento; as técnicas de

coleta e transporte são menos críticas quanto à manutenção da anaerobiose.

21

Em Endodontia, os resultados fornecidos pelos métodos de cultura foram

confirmados e significantemente complementados pelas técnicas moleculares. Dessa

maneira, ocorreu uma redefinição da composição da microbiota dos canais radiculares

(Siqueira e Roças, 2005b).

A partir da análise comparativa de seqüências de RNA ribossomal, três

linhagens celulares filogeneticamente distintas foram identificadas. Essas linhagens,

denominadas domínios evolutivos, foram estratificadas nos grupos Bacteria, Archea e

Eukarya (Woese et al., 1990). Paster et al. (2001) relataram que cerca de 700

diferentes espécies, pertencendo a 11 filos do domínio Bacteria, foram detectadas na

cavidade oral de humanos e cerca de 50% destas bactérias não foram ainda isoladas,

sendo somente conhecidas através de suas sequências de 16S rRNA.

Aas et al. (2005), empregando avaliação do 16S rRNA através de

metodologia de clonagem e seqüenciamento gênico, determinou a divisão das

espécies microbianas presentes na cavidade oral em 6 filotipos: Firmicutes

(Streptococcus, Gemella, Eubacterium, Selenomonas, Veillonella), Actinobacteria

(Atopobium, Rothia), Proteobacteria (Neisseria, Eikenella, Campylobacter),

Bacteroidetes (Porphyromonas, Prevotella, Capnocytophaga), Fusobacteria

(Fusobacterium, Leptotrichia) e Filo TM7 de microrganismos ainda não cultiváveis.

Aproximadamente 13 novos filotipos foram detectados pela primeira vez no estudo,

mesmo não se estabelecendo ainda sua real importância clínica.

Montagner et al. (2010) estudaram a presença de espécies de treponemas

em casos de abscessos apicais agudos. Amostras de 20 pacientes foram coletadas e

analisadas através de Nested PCR. Os autores concluíram que existe uma alta

incidência de espécies de Treponema em amostras dos canais radiculares e dos

abscessos apicais agudos do mesmo dente, indicando que os treponemas são

patógenos importantes em infecções endodônticas agudas.

Nobrega et al. (2016a) estudaram a microbiota de infecções endodônticas

primárias agudas através de clonagem. Um total de 689 clones foram analisados e 76

filotipos identificados, dos quais 47 (61,84%) eram espécies diferentes e 29 (38,15%)

eram táxons reportados como ainda incultiváveis ou ainda não caracterizados.

Prevotella ssp., Fusobacterium nucleatum, Filifactor alocis e Peptostreptococcus

stomatis foram as espécies mais freqüentemente detectadas, seguindo-se Dialister

22

invisus, Phocaeicola abscessus, o clone oral não caracterizado Lachnospiraceae,

Porphyromonas ssp., e Parvimonas micra. Oito filos foram detectados e os táxons

mais freqüentemente identificados pertenciam ao filo Firmicutes (43,5%), seguido por

Bacteroidetes (22,5%) e Proteobacteria (13,2%). Concluiu-se que a infecção

endodôntica primária aguda é caracterizada por ampla diversidade bacteriana e

observou-se alta variabilidade intersubjetiva. As bactérias Gram-negativas

anaeróbicas pertencentes ao filo Firmicutes, seguidas por Bacteroidetes, foram os

microrganismos mais freqüentemente detectados.

Nobrega et al. (2016b) caracterizaram a microbiota presente em canais

radiculares associados a abscesso apical agudo através de sequenciamento do gene

16S rRNA. Alem disso, associações de achados microbiológicos com características

clínicas e associação entre espécies microbianas também foram investigadas.

Cinquenta e nove diferentes bactérias cultiváveis foram identificadas por

sequenciamento do gene 16S rRNA, pertencente a 6 filos, com um número médio de

6 espécies por canal radicular. Abordagens moleculares permitiram a identificação de

99% dos isolados. As bactérias mais frequentemente identificadas foram Prevotella

ssp., Pseudoramibacter alactolyticus, Parvimonas micra, Dialis invisus, Filifactor alocis

e Peptostreptococcus stomatis. Foi encontrada associação positiva entre Prevotella

buccae e Pseudoramibacter alactolyticus e entre Parvimonas micra e Prevotella

nigrescens (ambos p <0,05). Concluiu-se que a microbiota de canais radiculares

infectados associados ao abscesso apical agudo é diversa e heterogênea, composta

principalmente de bactérias Gram-negativas anaeróbicas, sendo a grande maioria

pertencente às linhagens Firmicutes e Bacteroidetes.

2.2 A utilização da técnica do checkerboard DNA-DNA Hybridization em

endodontia

Considerando o fundamental papel das bactérias e seus subprodutos

particularmente na infecção endodôntica, torna-se importante conhecer o perfil da

comunidade microbiana e seus fatores de virulência através da identificação das

espécies mais frequentemente detectadas, para melhor entendimento da

patogenicidade do conteúdo infeccioso e das manifestações clínicas da infecção.

Desde as últimas décadas, métodos moleculares têm sido utilizados para identificação

23

bacteriana em espécimes clínicos, sem a necessidade de cultura. Com a aplicação

dessas metodologias houve uma expansão do conhecimento da microbiologia

endodôntica, avançando com segurança em termos de diagnóstico, prognóstico e

tratamento de doenças infecciosas.

Socransky et al. em 1994a introduziram um método para hibridizar um

grande número de amostras de DNA contra um grande número de sondas de DNA

numa única membrana de suporte. O DNA desnaturado de até 43 amostras foi fixado

em pistas separadas numa única membrana montada num Miniblotter 45. A

membrana foi então rodada 90 graus no mesmo dispositivo, o que permitiu a

hibridação simultânea com 43 sondas de DNA diferentes. As hibridizações foram

também realizadas em lisados de células bacterianas transferidas para membranas.

Um dispositivo MiniSlot permitiu que os lisados carregados em canais paralelos

fossem aspirados através da membrana, depositando pistas horizontais na superfície

da membrana. As hibridizações foram realizadas em pistas verticais com sondas

genômicas inteiras marcadas com digoxigenina ou sondas oligonucleotídicas

baseadas em rRNA 16S diretamente conjugadas com fosfatase alcalina. O método

permitiu a determinação simultânea da presença de múltiplas espécies bacterianas

em amostras de placas dentárias simples ou múltiplas, sugerindo assim a sua utilidade

para uma gama de amostras clínicas ou ambientais.

Siqueira et al. em 2000 foram os primeiros a utilizar a metodologia

molecular do Checkerboard para caracterizar a microbiota endodôntica. Foram

coletadas amostras microbiológicas de 28 canais unirradiculares necrosados e com

presença de lesão periapical radiográfica. Os resultados mostraram que 22 sondas

foram positivas com uma ou mais amostras. As espécies mais encontradas foram:

Bacteroides forsythus (39. 3% of the cases); Haemophilus aphrophilus (25%);

Corynebacterium matruchotii (21.4%); Porphyromonas gingivalis (17.9%); and

Treponema denticola (17.9%). Os autores concluíram que os dados microbiológicos

indicaram que os métodos genéticos moleculares podem fornecer conhecimento

adicional significativo sobre a microbiota endodôntica através da detecção de

espécies bacterianas que são difíceis ou impossíveis de cultivar. Além disso, suportam

o conceito de que as infecções endodônticas primárias são infecções mistas de

etiologia polimicrobiana.

24

Sunde et al. também em 2000 estudaram através de Checkerboard a

microbiota presente em lesão endodôntica periapical de dentes tratados

endodonticamente. Foram selecionados 34 casos de dentes obturados e presença de

lesão periapical que foram divididos em 2 grupos de acordo com o tipo de incisão de

terapia endodôntica cirúrgica (marginal e submarginal) que foi realizada. A maioria das

bactérias detectada pela sonda estava presente em mais lesões do Grupo 1 do que

no Grupo 2. As diferenças foram mais notáveis para Campylobacter gracilis,

Porphyromonas endodontalis, Propionibacterium acnes, Capnocytophaga gingivalis,

Fusobacterium nucleatum ssp. Nucleatum, Fusobacterium nucleatum ssp. Foram

detectadas espécies bacterianas como Actinobacillus actinomycetemcomitans e

Bacteroides forsythus em mais de 60% das lesões de ambos os grupos. Os resultados

apoiaram a idéia de que, após uma incisão marginal, as bactérias da bolsa periodontal

poderiam atingir os tecidos subjacentes pela bacteremia liberada pelo cirurgião. O

estudo forneceu evidências sólidas de que as bactérias invadem o tecido periapical

de dentes assintomáticos com periodontite apical.

Em 2001, Zehnder relatou um caso clínico raro de lesão endodôntica

induzida periodontalmente em paciente saudável de 28 anos. O paciente apresentava

perda grave de inserção nas faces palatina e distal do segundo pré-molar superior

direito, e o caso foi diagnosticado como uma periodontite agressiva localizada. O

paciente nunca tinha recebido tratamento periodontal, o dente se encontrava

necrosado e com a coroa clínica hígida. Todos os achados clínicos sugeriram

claramente que o problema endodôntico foi causado pela doença periodontal

agressiva. Foram coletadas amostras da bolsa periodontal e do canal radicular, que

foram analisadas microbiologicamente através da hibridização DNA-DNA

checkerboard. Os resultados revelaram diversidade microbiológica nos dois sítios. A

amostra obtida do canal radicular exibiu um número limitado de espécies, incluindo

anaeróbias pigmentadas de preto. Todas as bactérias encontradas no canal foram

encontradas na bolsa periodontal. O autor concluiu que a periodontite agressiva foi

capaz de causar a necrose do canal radicular.

Vianna et al. (2008) utilizaram o método de hibridização Checkerboard e a

cultura microbiana para investigar a microbiota de canais radiculares de 24 dentes que

receberam 3 tipos de medicação intracanal. As espécies mais freqüentemente

identificadas pelo Checkerboard nas amostras iniciais (S1) foram: Fusobacterium

25

nucleatum ssp. polymorphum, Treponema socranskii ssp. socranskii, Parvimonas

micra e Enterococcus faecalis. Nas amostras após o preparo químico-mecânico (S2)

e após a medicação intracanal (S3) um total de oito espécies diferentes foram

identificadas, sendo apenas um Gram-positivo (E. faecalis). Não foram identificados

microrganismos no grupo em que a clorexidina 2% gel foi utilizada como medicação

intracanal. A quantificação obtida em placas de ágar variou de 4x 105 a 2,6x106 S1,

a UFC média foi reduzida em 99,96% em S2, e não houve diferença estatística entre

a UFC em S2 e S3. Os autores puderam concluir que as duas técnicas testadas são

capazes de detectar a diminuição do conteúdo infeccioso em canais radiculares e que

as infecções endodônticas primárias são caracterizadas por uma grande variedade de

espécies bacterianas.

Roças et al. (2008) estudaram através do checkerboard lesões periapicais

de infecções persistentes/secundárias. Foram analisadas amostras de 17 dentes de

13 pacientes diferentes que apresentavam lesão periapical radiográfica associado a

um dente tratado endodonticamente. Os autores concluíram que as infecções

persistentes/secundárias são mistas e que o E. faecalis, quando presente, não é a

espécie mais dominante.

Em 2009, Siqueira e colaboradores caracterizaram a microbiota presente

em lesões periapicais de infecções primárias. Foram coletadas amostras de 20 dentes

extraídos por diversas razões que estavam necrosados e que tinham lesão periapical

associada. Com o auxilio de um bisturi, a lesão periapical e outros tecidos moles

ligados a porção apical foram removidos. Swabs estéreis foram utilizados para a

coleta, evitando o forame apical. Essas amostras foram analisadas através do

checkerboard, e as espécies encontradas foram Pseudoramibacter alactolyticus

(32%), Bacteroidetes clone X083 (26%), Streptococcus species (21%), Olsenella uli

(10.5%), Synergistes clone BA121 (10.5%), Fusobacterium nucleatum (10.5%),

Porphyromonas endodontalis (10.5%), Dialister clone BS016 (5%), Filifactor alocis

(5%), Parvimonas micra (5%), e Treponema denticola (5%). Os autores concluíram

que a presença dessas bactérias na região periapical dos canais radiculares

infectados indica seu potencial papel patogênico na etiologia da periodontite apical.

Em 2011, Roças e Siqueira, compararam o efeito de duas soluções

irrigadoras (Hipoclorito de sódio 2,5% e Clorexidina 0,12%) através da técnica de

26

hibridização DNA-DNA Checkerboard. Foram selecionados 47 dentes assintomáticos

e que apresentavam lesão periapical radiograficamente. Amostras biológicas foram

coletadas antes do preparo químico-mecânico (S1) e após do preparo químico-

mecânico (S2) utilizando duas soluções irrigadoras diferentes. Os autores

encontraram bactérias em 100% das amostras iniciais (S1) e após o preparo químico-

mecânico as bactérias mais encontradas no grupo do NaOCl foram Propionibacterium

acnes, Streptococcus species, Porphyromonas endodontalis e Selenomonas

sputigena. No grupo da clorexidina, as bactérias mais prevalentes foram Dialister

invisus, Actinomyces israelii, Prevotella baroniae, Propionibacterium acidifaciens e

Streptococcus species. A conclusão do estudo foi que as duas soluções irrigadoras

são capazes de reduzir o conteúdo infeccioso dos canais radiculares, sem diferença

significante entre elas.

Também em 2011, com o objetivo de avaliar o efeito da terapia

fotodinâmica (PDT) em canais infectados de humanos, Ng e colaboradores

selecionaram 22 dentes recém-extraídos com polpa necrosada e evidencia

radiográfica de lesão periapical. As amostras iniciais e após a utilização de PDT com

os dentes já instrumentados foram avaliadas através do checkerboard. Os autores

concluíram que a PDT reduz significantemente as bactérias residuais dentro do

sistema de canais radiculares.

Ito et al. (2011) lançaram mão da técnica de Hibridização DNA-DNA

Checkerboard para avaliar o efeito da pasta de hidróxido de cálcio com clorexidina em

canais radiculares de dentes decíduos. Das 35 sondas utilizadas para hibridização

DNA-DNA Checkerboard, 31 (88,57%) estavam presentes nas amostras iniciais. Após

o curativo do canal radicular, o número de sondas positivas reduziu para 13 (37,14%).

Os autores puderam concluir que a periodontite apical é causada por uma infecção

polimicrobiana e que a pasta de hidróxido de cálcio com clorexidina é eficaz na

redução do número de bactérias dentro dos canais radiculares quando aplicada como

medicação intracanal.

Roças et al. (2011), utilizando o checkerboard, investigaram as amostras

microbiológicas de canais radiculares radiculares de dentes necrosados com

periodontite apical sintomática (n = 13) ou assintomática (n = 21); de abscesso apical

crônico (n = 9), em pacientes noruegueses. Microrganismos estavam presentes em

27

todos os dentes com periodontite apical assintomática. As bactérias mais frequentes

foram Dialister invisus (71%), Fusobacterium nucleatum (62%) e Porphyromonas

endodontalis (62%). Nos abscessos apicais crônicos, as bactérias mais prevalentes

foram P. endodontalis (100%), D. invisus (89%), Parvimonas micra (78%) e

Solobacterium moorei (78%). Em dentes com periodontite apical sintomática, as

bactérias mais prevalentes foram D. invisus, P. endodontalis, S. moorei,

Propionibacterium acnes e Streptococcus (todos em 69%). Os autores concluíram que

embora as mesmas espécies fossem altamente prevalentes nas diferentes condições

examinadas, e que nenhuma bactéria teve associação com a sintomatologia, os

resultados revelaram que as espécies formaram diferentes associações em amostras

de dentes com ou sem dor. Portanto, é possível que comunidades mais virulentas

multiespécies possam se formar como resultado de combinações bacterianas globais

e dar origem a uma inflamação aguda.

Em 2012, Roças e colaboradores avaliaram a microbiota de canais

radiculares submetidos ao retratamento. As bactérias mais prevalentes detectados

pelo Checkerboard foram Propionibacterium, Fusobacterium nucleatum, streptococci,

e Pseudoramibacter alactolyticus. PCR quantitativa em tempo real detectou

Enterococcus faecalis e Streptococos em 38% e 41% dos casos, representando

9,76% e 65,78% das contagens bacterianas, respectivamente. Os achados põem em

questão o status do E. faecalis como o principal patógeno e sugerem que outras

espécies podem ser patógenos candidatos associados com infecções endodônticas

persistentes / secundárias.

Neves et al. (2014) avaliaram a efetividade do sistema de limas Self-

Adaptive File através do checkerboard. Os resultados mostraram que não só os

estreptococos, mas também algumas bactérias anaeróbias e até mesmo ainda não

cultivadas podem resistir aos efeitos do preparo químico mecânico realizados com

este tipo de lima.

Martinho e colaboladores também estudaram em 2014, o conteúdo

infecioso e endotóxico de infecções endodônticas primárias através do Checkerboard

e encontraram uma maior prevalência de Parvimonas micra (16/21), Fusobacterium

nucleatum ssp. nucleatum (15/21) e Porphyromonas endodontalis (14/21).

28

2.3 Suscetibilidade antimicrobiana (E-test) em endodontia

Citron et al. (1991) avaliaram a suscetibilidade antimicrobiana de 105

espécies de bactérias anaeróbias isoladas de amostras clínicas contra cefoxitina,

cefotaxima, imipenem, pencilina, metronidazol e clindamicina comparando o método

de E-test e o método de diluição em ágar. Os resultados mostraram que os dois

métodos apresentaram correlação positiva em 78% e 86% entre uma diluíção e em

89% e 97% entre duas diluições, após 24 horas e 48 horas de incubação

respectivamente. Os autores afirmaram que o E-test é um método fácil de se utilizar

e interpretar, pode ser utilziado para isolados individuais de pacientes, além de ser um

método confiável realizado em laboratório para testar a suscetibilidade de bactérias

anaeróbias.

Sousa et al. (2003) avaliaram a suscetibilidade antimicrobiana de

Peptostreptococcus prevotii e Fusobacterium necrophorum isolados de abscessos

periapicais através do método de E-test frente aos antibóticos penicilina G,

amoxicilina, amoxicilina + ácido clavulânico, metronidazol e clindamicina. Todas as

cepas testadas foram suscetíveis ao antibióticos testados.

Chan e Chan (2003) constataram que a microbiota das infecções

odontogênicas é constituída principalmente por anaeróbios facultativos Gram-

positivos e anaeróbios estritos Gram-negativos. Foram testadas diversas

concentrações de antibióticos presentes nas fitas de E-test frente aos isolados clínicos

e observaram-se altas taxas de suscetibilidade à clindamicina para os microrganismos

anaeróbios, exceto Eikenella corrodens. A amoxicilina e a associação

amoxicilina/ácido clavulânico foram bastante efetivas frente a Fusobacterium

nucleatum (88,6% e 91,4%), Prevotella intermedia (86,2% e 96,6%) e Porphyromonas

gingivalis (95,7% e 95,7%). Dentre os antibióticos com maiores taxas de resistência

encontra-se a eritromicina, com valores de 48,6% para Fusobacterium nucleatum;

55,2% para Prevotella intermedia; 55,6% para Peptostreptococcus micros; e, 43,4%

para Porphyromonas gingivalis. Concluiu-se que a atividade dos antimicrobianos

empregados freqüentemente em Odontologia teve sua ação diminuída frente aos

patógenos endodônticos em Taiwan.

29

Jacinto et al. (2006) avaliaram a suscetibilidade antimicrobiana de P.

gingivalis isoladas de 20 canais radiculares de dentes com abscesso frente aos

antibióticos: Amoxicilina, Amoxicilina + ácido clavulânico, azitromincina,

benzilpenicilina, cefaclor, clindamicina, ertitromicina, metronidazol e tetraciclina

utilizando o método do E-test. Todas as cepas foram sensíveis a amoxicilina,

amoxicilina + ácido clavulânico, cefaclor, clindamicina, benzilpenicilina, metronidazol

e tetraciclina. Os valores mais baixos referentes as concentração inibitória mínima

variaram entre 0,026-0,123 µg mL-1 para amoxicilina + ácido clavulânico e

clindamicina. Os menores valores de MIC 90 foram observados para clindamicina

(0,0064 µg mL-1 ). Uma cepa mostrou resistência à eritromicina e 8 foram resistentes

a azitromicina. Os autores concluíram que a amoxicilina assim como amoxicilina +

ácido clavulânico e benzilpenicilina foram eficazes contra P. gingivalis.

Gomes et al. (2011) estudaram a suscetibilidade de espécies anaeróbias

isoladas de uma população brasileira em diferentes períodos de tempo, determinando

o padrão de desenvolvimento de resistência aos antibióticos freqüentemente

prescritos em endodontia. Amoxicilina e amoxicilina + clavulanato foram eficazes

contra a maioria das espécies nos diferentes períodos de estudo. Em geral, houve

baixas diferenças estatísticas quanto à suscetibilidade microbiana entre os períodos

experimentais. Contudo, os autores observaram um aumento na resistência

anaeróbica à penicilina G e à clindamicina. A resistência à eritromicina foi observada

em todas as espécies e houve diferenças estatisticamente significativas entre os

períodos de 2000-2002 e 2003-2005 para F. nucleatum (P <0,05) e entre os períodos

de 2003-2005 e 2007-2008 para P. intermedia / nigrescens e P. oralis (P <0,05). Com

esse estudo os autores concluíram que a resistência antimicrobiana de anaeróbios

isolados de infecções endodônticas primárias apresentou aumento ao longo de um

período de tempo em relação a uma população brasileira específica.

Montagner et al. (2014) estudaram a resistência de Prevotella disiens,

Prevotella oralis, Porphyromonas gingivalis e Parvimonas micra aos seguintes

agentes antimicrobianos benzilpenicilina, amoxicilina e amoxicilina+acido clavulânico

utilizando a metodologia do E-test. Todas as cepas do estudo foram suscetíveis aos

agentes antimicrobianos testados.

30

Desta forma, revendo a literatura, podemos observar que são poucos os

estudos que comparam simultaneamente a microbiota de dentes com necrose pulpar,

sintomatologia dolorosa e abscesso periapical com a microbiota de dentes com

necrose pulpar e presença de lesão periapical sem sintomatologia dolorosa. Alem

disso, devido ao uso indiscriminado de antibióticos, tem ocorrido o desenvolvimento

de resistencia bacteriana e esta deve ser constantemente monitorada.

31

3 PROPOSIÇÃO

Diante disto, são objetivos desta pesquisa:

3.1 Objetivo:

Analisar o conteúdo infeccioso de canais radiculares em casos

assintomáticos e sintomáticos, a microbiota do exsudato apical nos casos

sintomáticos e a suscetibilidade de bactérias específicas aos antimicrobianos mais

empregados na clínica odontológica.

3.2 Objetivos Específicos:

1. Estudar a composição da microbiota de canais radiculares infectados

sintomáticos e assintomáticos, e dos abscessos periapicais, por meio da

técnica de hibridização DNA-DNA.

2. Determinar a suscetibilidade antimicrobiana das bactérias produtoras de

pigmento negro (BPN), identificadas através do sequenciamento genético, por

meio do método E-test, utilizando os antibióticos: benzilpenicilina, amoxicilina,

amoxicilina + ácido clavulânico, eritromicina, azitromicina, metronidazol e

clindamicina.

3. Correlacionar estes achados com os sinais e sintomas clínicos

32

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Local da pesquisa

A pesquisa foi realizada na Clínica de Pós-Graduação, Laboratório de

Patologia Oral e Laboratório de Microbiologia da área de Endodontia da Faculdade de

Odontologia de Piracicaba, Universidade Estadual de Campinas (FOP/UNICAMP).

4.2 Seleção dos participantes da pesquisa

Foram selecionados pacientes com necessidade de intervenção

endodôntica por necrose do tecido pulpar e presença de lesão periapical que não

apresentavam sintomatologia dolorosa expontânea (n=10) e pacientes com

sintomatologia dolorosa e presença de abscesso periapical agudo (n=10), totalizando

20 pacientes. O trabalho segue a Resolução 466/12 do Conselho Nacional de Saúde

para pesquisa envolvendo seres humanos e foi submetido e aprovado pelo Comitê de

Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de Piracicaba – UNICAMP

(CEP/FOP-UNICAMP) (Anexo 1), sob o protocolo 119/2015. Todos os pacientes

assinaram o termo de consentimento elaborado de acordo com as normas (Apêndice

1).

4.3 Grupos experimentais

a) Necrose pulpar com sintomatología dolorosa e abscesso periapical

associado (n=10), de acordo com Sousa et al. 2013.

Ausência de resposta aos testes de sensibilidade pulpar (teste térmico ao

frio). Dor espontânea no momento do atendimento; dor à palpação/percussão;

presença de edema e ponto de flutuação.

b) Necrose pulpar e lesão periapical sem sintomatología espontânea

(n=10)

Ausência de resposta aos testes de sensibilidade pulpar (teste térmico ao

frio). Os dentes deverão apresentar evidência radiográfica de lesão periapical.

4.4 Critérios de inclusão e exclusão, aspectos clínicos e radiográficos

33

Critérios de inclusão: a) dentes necrosados, com sintomatologia dolorosa e

com abscesso periapical associado; b) dentes com necrose dentes assintomáticos

com necrose pulpar e presença de lesao periapical visível radiograficamente.

Critérios de exclusão: Serão descartados casos com antibioticoterapia

prévia nos últimos 3 meses, canais expostos a cavidade oral, casos onde o isolamento

absoluto não foi conseguido, casos com doença periodontal avançada; pacientes

jovens com histórico de traumatismos dentais recentes, dentes com rizogênese

incompleta, dentes com presença de curativos de demora na câmara pulpar e de

tratamentos endodônticos anteriores.

Aspectos clínicos e radiográficos: Para cada paciente foram anotados:

idade, sexo, estado pulpar, profundidade da bolsa periodontal, mobilidade dental,

presença de edema dos tecidos periodontais, história de medicação e os achados

radiográficos. Foram anotados os aspectos físicos do canal durante a coleta da

amostra, tais como canal seco, presença de exsudado claro, purulento ou

hemorrágico. Aspectos clínicos do abscesso também foram anotados (ex. coloração).

Os aspectos clínicos do dente envolvido, tais como presença ou não de cáries e

restaurações serão também anotados.

4.5 Coleta de amostras

O atendimento aos pacientes foi realizado na Clínica de Pós-Graduação da

FOP-UNICAMP e as amostras processadas no Laboratório de Microbiologia –

Endodontia.

Foram coletadas amostras iniciais dos canais radiculares assim como do

exsudato periapical associado aos casos de abscessos periapicais.

Coleta dos abscessos periapicais

Inicialmente foi realizada anestesia local por bloqueio regional e

desinfecção da mucosa oral adjacente ao dente com digluconato de clorexidina 2% e

neutralização da região com uma solução de tween 80 + lecitina de soja. Após, o

exsudato do abscesso periapical foi coletado através de aspiração utilizando uma

seringa estéril. A punção foi realizada no momento que precede a execução do

tratamento do abscesso, que constitui na realização de uma incisão com lâmina de

34

bisturi, divulsão dos tecidos e ordenha manual da coleção purulenta. Uma alíquota de

100µL do exsudato foi transferida para um microtubo estéril contendo 1,0 mL de Tris

Buffer para posterior processamento molecular, e outra alíquota de 100µL para

microtubo previamente esterilizado, contendo 1,0 mL do meio de transporte pré-

reduzido VMGA III (cultura), como descrito anteriormente por Montagner et al. 2012 e

Sousa et al. 2013.

Coleta dos canais radiculares

Inicialmente o dente envolvido recebeu polimento coronário com pedra-

pomes e isolado com lençol de borracha (isolamento absoluto). A seguir, foi realizado

o vedamento da interface coroa/lençol com cianocrilato (Super Bonder; Loctite, SP-

Brasil) e TopDam (FGM, Joinville, SC-Brasil), para evitar infiltração de saliva. A

antissepsia do campo operatório (superfície externa da coroa, grampo, lençol de

borracha e arco) foi realizada com swabs estéreis umedecidos primeiramente em

H2O2 a 30% e depois em NaOCl 5,25% por 30 segundos cada, subsequentemente

neutralizado com solução estéril de tiossulfato de sódio a 5% (Möller, 1966).

A fase de acesso coronário foi realizada em duas etapas operatórias. A

água proveniente do equipo é cessada, sendo a irrigação realizada manualmente com

solução salina estéril. São utilizadas brocas de alta rotação diamantadas estéreis. Na

primeira etapa operatória é realizada a remoção dos contaminantes coronários

(restaurações, tecido cariado). Na segunda etapa, na fase de confecção da cavidade

de acesso, uma nova broca estéril foi utilizada. Após a confecção da cavidade de

acesso, uma nova desinfecção foi realizada. Prosseguindo, com o completo acesso

ao canal radicular com uma nova broca esférica diamantada estéril.

Coleta microbiológica

`Para a coleta microbiológica, 5 cones de papel absorvente, um de cada

vez, foram introduzidos no interior dos canais. Três destes cones foram transferidos

para tubos do tipo eppendorfs previamente esterilizados, contendo 1,0 mL do meio de

transporte pré-reduzido VMGA III (cultura) e dois foram transferidos para um tubo

contendo 300 uL de Tris Buffer, o qual foi congelado em freezer -20°C para análise

molecular, como descrito por Gomes et al. 2011.

35

4.6 Procedimentos Laboratoriais

4.6.1 Checkerboard DNA-DNA Hibridization

A metodologia empregada para a Técnica de Checkerboard DNA-DNA

hybridization seguiu a descrição feita por Socransky et al. (1994a).

Extração do DNA microbiano

Tubos tipo Eppendorf com 150 uL de TE foram agitados no Vortex (Agitador

de Tubos). Após esse procedimento, os tubos foram centrifugados a 12.000 RPM por

5 minutos. O sobrenadante neles contido foi então descartado e o pellet

ressuspendido com 150 μL de solução TE e 100 μL de solução de hidróxido de sódio

(NaOH). As suspensões contendo as amostras coletadas foram aquecidas em banho-

maria por dez minutos e em seguida neutralizadas pela adição de 0,8 mL de 5 M de

acetato de amônia (C2H7NO2). Com isto, as células bacterianas foram lisadas e o DNA

ficou suspenso na solução.

Colocação das amostras na membrana de Nylon

Uma membrana de nylon (15 x15cm) com carga positiva (Amersham

Biosciences, Chicago, IL - USA) foi montada no Minislot 30® (Immunetics, Cambridge,

MA - USA). Cada suspensão de amostra contendo DNA livre foi depositada nas fendas

do Minislot 30® e o DNA concentrado permaneceu depositado na membrana de nylon.

A membrana foi removida do aparato e o DNA, previamente depositado na mesma,

foi fixado por intermédio de aquecimento em forno a 120°C, por 20 minutos. As duas

últimas canaletas do Minislot 30® foram reservadas para a colocação dos controles,

contendo uma mistura das espécies dos micro-organismos que foram investigados

pelas sondas de DNA, em duas concentrações, 105 e 106 células bacterianas.

Hibridização da membrana com as sondas de DNA

Após a fixação do DNA na membrana, esta foi pré-hibridizada a 42°C, por

uma hora, numa solução de 50% formamida, 1% caseína, 5 X SSC (Solução Salina

Citratada), 25 mM de fosfato de sódio (pH 6,5) e 0,5 mg/mL de RNA de levedura. A

membrana foi então colocada sob a placa acrílica do Miniblotter 45® (Immunetics,

36

Cambridge, MA - USA), rotacionada a 90° de sua posição original, com as linhas

contendo o DNA fixado, perpendiculares às canaletas do Miniblotter 45®. O Miniblotter

45® contém 45 canaletas que servem, cada uma, para a colocação de uma sonda de

DNA.

As sondas de DNA específicas para as espécies que foram usadas nesse

estudo (Tabela 1) foram confeccionadas usando o random primer digoxigenin labeling

Kit (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN - USA), como descrito por Feinberg e

Vogelstein (1983).

37

Tabela 1- Relação das cepas empregadas para o desenvolvimento das sondas de DNA

bacteriano.

* ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD)

a Cepas do Instituto Forsyth

T Cepas padrão

Espécies Cepas Espécies Cepas

Aggregatibacter

actinomycetemcomitans A e B

ATCC 43718*

ATCC 29523*

Filifactor alocis ATCC 35896*T

Actinomyces israelii ATCC 12102* Fusobacterium periodonticum ATCC 33693*T

Actinomyces odontoloyticus I ATCC 17929* Neisseria mucosa ATCC 19696*T

Actinomyces oris ATCC 43146* Parvimonas micra ATCC 33270*T

Campylobacter showae ATCC 1146*T Porphyromonas endodontalis ATCC 35406*T

Campylobacter rectus ATCC 33238*T Porphyromonas gingivalis ATCC 33277*T

Capnocytophaga gingivalis ATCC 33624* Prevotella intermedia ATCC 25611*T

Capnocytophaga ochracea ATCC 33596*T Prevotella melaninogenica ATCC 25845*T

Capnocytophaga sputigena ATCC 33612*T Prevotella nigrescens ATCC 33563*T

Dialister pneumosintes ATCC 51894 Propionibacterium acnes (I +II) ATCC 11827*

ATCC 11828*

Gemella morbillorum ATCC 27829*T Staphylococcus epidermidis ATCC 43541*T

Eikenella corrodens ATCC 23834*T Streptococcus gordonii ATCC 10558*T

Enterococcus faecalis ATCC 29212* Streptococcus intermedius ATCC 27335*T

Enterococcus faeccium 6569 Treponema denticola B1a

Enterococcus hirae 10541 Streptococcus mitis ATCC 49456*T

Eubacterium nodatum ATCC 33099* Streptococcus mutans ATCC 25175

Fusobacterium periodonticum ATCC 33693*T Streptococcus oralis ATCC 35037

Eubacterium nodatum ATCC 33099*T Tannerella forsythia ATCC 43037

F.nucleatum ssp nucleatum ATCC 25586*T Treponema Socranskii S1 a

F.nucleatum ssp polymorphum ATCC 10953*T Eubacterium saburreum ATCC 33271*T

F nucleatum ssp vincentii ATCC 49256*T Veillonella parvula ATCC10790

38

Anteriormente ao seu uso, as sondas foram testadas com uma mistura

controle contendo as espécies investigadas, numa concentração de 104 células

bacterianas. Suas concentrações foram ajustadas de tal modo que a intensidade dos

sinais de todas as sondas fossem semelhantes.

Cada sonda de DNA contida numa solução de hibridização (45%

formamida, 5 X SSC, 20 mM de fosfato de sódio (pH 6,5), 0,2 mg/mL de RNA de

levedura, 10% de sulfato de dextrano, 1% caseína e 20 mg/mL de sonda de DNA) foi

removida com pipeta e colocada em canaleta do Miniblotter 45®. De modo que cada

canaleta do Miniblotter 45® seja preenchida com 135 μL de uma determinada sonda.

As sondas hibridizaram perpendicularmente às linhas contendo o DNA bacteriano

fixado, propiciando um formato de xadrez com as linhas de DNA na horizontal, e as

sondas na vertical. O aparato, contendo o Miniblotter 45® e a membrana com as

sondas, e o DNA das amostras bacterianas fixado, foram acondicionados de maneira

que pudessem manter umedecidos e evitar a desidratação das mesmas. O conjunto

foi incubado a 42° para que a hibridização ocorresse, o que aconteceu num período

mínimo de 12 horas (overnight).

Detecção das espécies

Após a hibridização com as sondas, as membranas foram removidas do

Miniblotter 45® e lavadas por 40 minutos a 65°C, numa solução adstringente de PO4

Buffer (tampão de fosfato), a fim de remover sondas que não hibridizaram

completamente. Em seguida, as membranas foram imersas por 1 hora, sob agitação,

numa solução bloqueadora contendo 0,1 M ácido maleico, 3 M NaCl, 0,2 M NaOH,

0,3% Tween 20, 0,5% caseína, pH 8,0 e por 30 minutos na mesma solução contendo

o anticorpo anti-digoxigenina (Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments-Roche Diagnostics

GmbH, Manheim-Germany) conjugado à fosfatase alcalina numa diluição de

1/25.0008. As membranas foram lavadas com uma solução de 0,1 M ácido maleico, 3

M NaCl, 0,2 M NaOH, 0,3% Tween 20, pH 8,0, duas vezes por 20 minutos, e uma vez

por 5 minutos em 0,1 M Tris HCl, 0,1 NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9,5. Em seguida, as

membranas foram incubadas em uma solução detectora, CDP-Star Detection

Reagent® (Amershan Biosciences UK Limited, Buckinghamshire - UK), por 60 minutos

a 37°C. Finalmente, as membranas foram colocadas num cassete sob um filme

radiográfico (Kodak® X-OMAT Kodak Brasileira Com. e Ind. Ltda, São José dos

Campos, SP) por aproximadamente 40 minutos, e os filmes revelados logo em

39

seguida. Cada sinal produzido por uma determinada sonda na amostra dos canais

radiculares foi comparado em intensidade ao sinal produzido pela mesma sonda nos

dois controles 105 e 106. Assim sendo, o número (0) foi registrado quando não houve

detecção de sinal; (1) quando houve um sinal menos intenso que o controle de 105

células; (2) a aproximadamente 105 células; (3) entre 105 e 106 células; (4) a

aproximadamente 106 células e (5) a mais que 106 células. Esses registros foram

utilizados para determinar os deferentes níveis das espécies investigadas em cada

amostra.

4.6.2 Sequenciamento genético do gene 16S rRNA

O DNA de cada bactéria previamente isolada foi extraído utilizando QIAamp

DNA Minikit (Qiagen, Valência, CA, EUA) de acordo com a instruções do fabricante.

Após a extração, a amplificação universal por reação em cadeia da polimerase (PCR)

foi realizada num volume total de 50 μl contendo: 5 μl de DNA da amostras, 5 μL de

tampão de PCR 10X, 1,5 μL de MgCl2 25 mmol / μL, 4,0 μl de DNTP Soluções (25

mmol / μL cada), 1 μL de 25 pmol do primer universal foward (D88-5

GAGAGTTTGATYMTGGCTCAG 3') e do primer universal reverse (E94-5'

GAAGGAGGTGWTCCARCCGCA 3 '), 0,5 μL de 5U / mL Platinum Taq Polymerase e

32 μL de água destilada estéril (23). Os reagentes foram sintetizados e fornecidos pela

Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). DNA de P. gingivalis (ATCC 3277) e água destilada

estéril foram utilizados como controlos positivos e negativos, respectivamente. A

reação foi realizada num termociclador de DNA (GenePro, BioerTechnology,

Hangzhou, China) ajustado para o passo de desnaturação inicial a 94ºC durante 4

Minutos seguidos por 30 ciclos a 94 ° C durante 45 segundos (desnaturação), 60 ° C

durante 45 segundos (anelamento), 72 ° C durante 90 segundos (extensão), e um

passo de extensão final A 72 ° C durante 15 minutos.

Foram realizados dois PCRs independentes para cada amostra e os

produtos dos PCRs foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1% corado

com EZ-Vision® In-Gel Solution e utilizando uma escada de DNA de 1 kb como

marcador de tamanho molecular. As reações positivas foram determinadas pela

presença de bandas de tamanho apropriado (1500 pares de bases). Depois os

produtos de PCR foram purificados utilizando QIAquick Gel Extracção (Qiagen, Hiden,

Alemanha).

40

Os produtos de PCR purificados foram sequenciados utilizando o DNA ABI

3730 Analisador, com o BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied

Biosystems, Carlsbad, CA, EUA) utilizando o primer 533R (5 'TKACCGCGGCTGCTG

3'). Seqüências de aproximadamente 600 bases foram obtidas, inspecionadas e

editadas usando o software BioEdit (www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html), e a

identidade / aproximação filogenética foi obtida por comparação com as sequências

do gene 16S rRNA Da base de dados de GenBank do centro nacional da informação

da biotecnologia (www.ncbi.nlm.nih.gov) através da ferramenta básica de pesquisa de

alinhamento local (BLAST). Sequências com mais de 4 caracteres ambíguos ou

inferiores a 500 bases foram descartados, sendo considerada pelo menos 97% de

similaridade.

4.6.3 Suscetibilidade antimicrobiana (E-test)

O sistema do E-test consiste em uma fita plástica inerte e não porosa de

50 mm de comprimento e 5 mm de largura, que contém em um lado um gradiente de

concentração de antibiótico, e do outro, uma escala numérica que indica a

concentração do medicamento. A fita do E-test pode detectar uma concentração

inibitória mínima (CIM) que varia de 0.016 a 256 g/mL, com um total de 29 diferentes

CIMs, que são agrupadas de duas em duas, representando 15 níveis de diluição

(Bolmström 1993).

As bactérias produtoras de pigmento negro do gênero Porphyromonas e

Prevotella, (bastonetes Gram-negativos anaeróbios estritos), espécies de Prevotella

não pigmentadas e espécies do grupo dos Fusobacterium (bastonetes Gram-

negativos anaeróbios estritos) que foram isoladas dos casos estudados, foram

submetidas ao método do E-test (AB BIODISK, Solna, Suécia). Os agentes

antimicrobianos testados foram: benzilpenicilina (PG), amoxicilina (AC), amoxicilina +

ácido clavulânico (XL), clindamicina (CM), eritromicina (EM), Metronidazol (MZ) e

azitromicina (AZ).

Placas contendo 4 mm de espessura de Brucella Agar (OXOID, Hampshire,

Inglaterra) + 5% de sangue de carneiro desfibrinado, 1% de vitamina K + 0,5% de

hemina foram utilizadas para o repique das cepas com inoculo de 24-48 hrs. Após a

secagem das placas (10 a 15 minutos), as fitas de E-test serão distribuídas nas placas

41

com o auxílio de pinça estéril. O experimento foi executado em duplicata e sempre em

fluxo laminar.

As placas contendo as bactérias anaeróbias estritas foram imediatamente

incubadas na câmara de anaerobiose, e a leitura realizada após 24-48 hrs de

incubação. Os valores das CIMs foram determinados pela leitura no ponto de

intersecção entre o halo de inibição e a fita, considerando o ponto de inibição completa

de crescimento. A interpretação dos valores das CIMs foi realizada seguindo o guia

de interpretação da Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).

4.7 Análise de dados

Análise estatística foi realizada com auxilio do software SPSS for Windows,

considerando um nível de significância de 5%. O Teste Qui-quadrado de Pearson ou

Teste Exato de Fischer, quando apropriado, foi utilizado para testar a hipótese nula

de que não há associação entre sinais e sintomas clínicos e a presença de

determinada bactéria; e entre bactérias específicas.

Nos casos em que a hipótese foi descartada, ou seja, quando houve

diferenças entre as espécies (p< 0,05), o teste de Odds ratio foi realizado.

Associações positivas foram aquelas em que Odds ratio foi maior que 2 e para

associações negativas aquelas em que os valores de Odds ratio foram menores que

0,5.

42

5 RESULTADOS


necessidade de intervenção endodôntica, com lesão periapical e sem

sintomatología

As características clínicas dos pacientes com necessidade de intervenção

endodôntica de dentes associados à lesão periapical visível radiograficamente que

participam do estudo estão apresentadas na Tabela 2. No momento do atendimento,

os pacientes não relataram presença de sintomatologia dolorosa (10/10). Ao teste de

sensibilidade térmica e palpação nenhum dos pacientes relatou sesnsibilidade no

dente em questão (00/10). Ao teste de percussão vertical, em dois casos os pacientes

relataram um desconforto (02/10). Os dentes apresentavam-se cariados (2/10) ou

restaurados (8/10). Nenhum dos pacientes apresentou gengivite ou mobilidade

associada ao elemento dental e os canais radiculares não apresentavam exsudato.

43

Tabela 2. Perfil amostral dos pacientes que participaram do estudo, pertencentes ao grupo

com necrose pulpar e presença de lesão periapical sem sintomatologia dolorosa.

Caso Idade Gênero Dente Sensibilidade Coroa Period. Canal Mobil.

SP PV P

1 43 M 45 - - - Cariado Saudável Seco Não

2 29 M 22 - - - Cariado Saudável Seco Não

3 58 F 21 - - - Restaurado Saudável Seco Não

4 21 M 12 - + - Restaurado Saudável Seco Não

5 37 M 44 - - - Restaurado Saudável Seco Não


7 46 F 24 - + - Restaurado Saudável Seco Não




Period. – Condição periodontal; Mobil. – Mobilidade dentária; SP – Suscetibilidade pulpar; PV

– Dor a percussão vertical; P – Dor a palpação

Bactérias foram detectadas em todas as amostras microbiológicas dos

pacientes com necessidade de intervenção endodôntica de dentes associados à lesão

periapical visível radiograficamente (10/10). Dentre as bactérias investigadas as mais

encontradas foram: Actinomyces oris (10/10), Prevotella nigrescens (10/10),

Actinomyces israelii (09/10), Campylobacter showae (09/10), Dialister pneumosintes

(09/10), Enterococcus faecium (09/10), Filifactor aloci (09/10), Fusobacterium

periodonticum (09/10), Streptococcus oralis (09/10) e Veillonella parvula (09/10), como

mostram os dados apresentados na Figura 1.

44

Figura 1. Bactérias detectadas nos canais radiculares de pacientes pertencentes ao grupo

com necrose pulpar e presença de lesão periapical que não apresentavam

sintomatologia dolorosa, por meio do checkerboard.

45

Com relação à morfologia bacteriana das espécies alvos investigadas

(Figura 2) pelo checkerboard, no grupo de pacientes com necrose pulpar associadas

a lesão periapical e sem sintomatologia, foi possível observar um maior número de

bactérias em forma de bastonetes, Gram-negativas e anaeróbias estritas.

Figura 2. Caracterização bacteriana (Gram, requerimento gasoso e forma) das bactérias

investigadas pelo Checkerboard de pacientes com necessidade de tratamento

endodôntico associados a lesão periapical e sem sintomatologia.

A distribuição do número de espécies bacterianas por casos (Figura 3)

possibilitou observar que os casos 9 e 6 foram os que apresentaram um maior número

de espécies diferentes e que os casos 4 e 1 foram os que apresentaram um menor

número de espécies diferentes comparados aos outros casos investigados.

46

Figura 3. Número de diferentes espécies por cada canal radicular coletado de dentes com


sintomatologia investigado pelo Checkerboard.

Com relação às associações entre as diferentes espécies bacterianas

investigadas no grupo de pacientes com necrose pulpar associadas a lesão periapical

e sem sintomatologia, observou-se associações positivas significantes (p<0,05) em

13 pares de espécies bacterianas (Tabela 3) no grupo com necessidade de

intervenção endodôntica, com lesão periapical e sem sintomatologia, todos com

valores de ODDS > 2.

Nenhuma associação negativa entre as diferentes espécies bacterianas

investigadas no grupo de pacientes com necrose pulpar associadas à lesão periapical

e sem sintomatologia foi encontrada.

47

Tabela 3. Associações positivas significantes (p<0,05) entre espécies bacterianas presentes

em canais radiculares de pacientes pertencentes ao grupo com necrose pulpar e

presença de lesão periapical que não apresentavam sintomatologia dolorosa.

Espécie Espécie

Significância

(valor de p)

Valor do

ODDS

Porphyromonas endodontalis Treponema denticola 0,033 7

Porphyromonas endodontalis Gemella morbillorum 0,033 7

Porphyromonas endodontalis Streptococcus gordonii 0,033 7

Porphyromonas endodontalis Tannerella forsythia 0,033 7

Porphyromonas endodontalis Staphylococcus epidermidis 0,033 7

Enterococcus faecalis Streptococcus intermedius 0,048 6

Enterococcus faecalis F.nucleatum sp. polymorphum 0,048 6

Eubacterium saburreum Parvimonas micra 0,048 6

Eubacterium saburreum Streptococcus intermedius 0,048 6

Streptococcus gordonii F.nucleatum sp. polymorphum 0,048 6

Treponema denticola F.nucleatum sp. polymorphum 0,048 6

F. nucleatum sp. nucleatum Prevotella melaninogenica 0,048 5

F. nucleatum sp. nucleatum Streptococcus mitis 0,048 5

Não houve diferença estatística na associação entre espécies bacterianas

investigadas e sinais e sintomas clínicos observados no grupo com necrose pulpar e

presença de lesão periapical que não apresentavam sintomatologia dolorosa (p>

0,05).

5.2 Caracterização da microbiota presente em canais radiculares e abscessos

apicais de dentes com necessidade de intervenção endodôntica com necrose

pulpar associado a abscesso apical e sintomatologia dolorosa

As características clínicas dos pacientes com necrose pulpar associada a

abscesso periapical estão representadas na Tabela 4. No momento do atendimento,

os pacientes relataram presença de sintomatologia dolorosa (10/10). Ao teste de

sensibilidade térmica nenhum dos pacientes relatou sensibilidade no dente em

questão. Ao teste de percussão vertical todos os pacientes relataram desconforto

(10/10) durante a realização do teste. Ao teste de palpação todos os pacientes

relataram desconforto (10/10) no momento da palpação na região do periápice do

48

dente envolvido. Os dentes apresentavam-se cariados (4/10) ou restaurados (6/10).

Os dentes coletados apresentavam secos (1/10) ou com presença de exsudato (9/10).

Nenhum dos pacientes apresentou gengivite associada ao elemento dental.

Tabela 4. Perfil amostral dos pacientes que participam do estudo pertencentes ao grupo com

necrose pulpar associados a abscesso apical e sintomatologia dolorosa.

Caso Idade Gênero Dente Sensibilidade Coroa Period. Canal Mobil.

SP PV P

1 29 M 16 - + + Cariado Saudável Seco Não

2 48 F 26 - + + Restaurado Saudável Pus Não

3 18 M 46 - + + Restaurado Saudável Sangue/Pus Não

4 56 F 34 - + + Restaurado Saudável Sangue/Pus Não

5 28 M 46 - + + Cariado Saudável Pus Não

6 32 M 26 - + + Restaurado Saudável Pus Não



9 54 F 12 - + + Cariado Saudável Sangue/Pus Não

10 42 F 11 - + + Cariado Saudável Sangue/Pus Não

Period. – Condição periodontal; Mobil. – Mobilidade dentária; SP – Sensibilidade pulpar; PV –

Dor a percussão vertical; P – Dor a palpação

Bactérias foram detectadas em todas as coletas microbiológicas dos

abscessos apicais dos pacientes com necrose pulpar associados a abscesso apical e

sintomatologia dolorosa. Dentre as bactérias investigadas as mais encontradas foram:

Prevotella intermedia (9/10), Streptococcus mutans (9/10), Prevotella melaninogenica

(09/10), Veillonella parvula (09/10), Prevotella nicrescens (08/10), Dialister

pneumosintes (08/10), Enterococcus faecalis (08/10), Fusobacterium nucleatum (sp

vincentii) (09/10) e Enterococcus hirae (08/10). Como mostram os dados

apresentados na Figura 4.

49

Figura 4. Bactérias detectadas nos abscessos apicais de pacientes pertencentes ao grupo

com necrose pulpar associados a abscesso apical e sintomatologia dolorosa, por

meio do Checkerboard.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Fusobacterium nucleatum sp. polymorphum

Gemella morbillorum

Propionibacterium acnes

Campylobacter showae

Eikenella corrodens

Capnocytophaga ochracea

Fusobacterium nucleatum sp. nucleatum

Eubacterium nodatum

A actinomycetencomytans

Eubacterium saburreum

Parvimonas micra

Actinomyces oris

Actinomyces odontolyticus I

Fusobacterium periodonticum

Neisseria mucosa

Tannerella forsythia

Enterococcus faecium

Porphyromonas gingivalis

Campylobater rectus

Streptococcus oralis

Actinomyces israelii

Streptococcus intermedius

Staphylococcus epidermidis

Streptococcus mitis

Capnocytophaga sputigena

Leptotrichia buccalis

Treponema Socranskii

Porphyromonas endodontalis

Treponema denticola

Capnocytophaga gingivalis

Streptococcus gordonii

Enterococcus hirae

Fusobacterium nucleatum sp. vincentii

Enterococcus faecalis

Dialister pneumosintes

Prevotella nigrescens

Veillonella parvula

Prevotella melaninogenica

Streptococcus mutans

Prevotella intermedia

1

2

3

4

5

50

Bactérias foram detectadas em todas as coletas microbiológicas dos canais

radiculares dos pacientes com necrose pulpar associados a abscesso apical e

sintomatologia dolorosa. Dentre as bactérias investigadas as mais encontradas foram:

Streptococcus gordonii (07/10), Capnocytophaga gingivalis (07/10), Actinomyces oris

(07/10), Enterococcus hirae (07/10). Como mostram os dados apresentados na Figura

5.

51

Figura 5. Bactérias detectadas nos canais radiculares de pacientes pertencentes ao grupo

com necrose pulpar associados a abscesso apical e sintomatologia dolorosa, por meio do

Checkerboard.

52

Com relação à morfologia bacteriana das espécies alvos investigadas

(Figura 6) pelo checkerboard no grupo de pacientes com necrose pulpar associados

a abscesso apical e sintomatologia dolorosa, foi possível observar um maior número

de bactérias em forma de bastonetes, Gram-negativas e anaeróbias estritas nas

coletas dos abscessos apicais quando comparados com as coletas dos canais

radiculares.

Figura 6. Caracterização bacteriana (Gram, requerimento gasoso e forma) das bactérias

investigadas pelo Checkerboard de pacientes com necrose pulpar associados a

abscesso apical e sintomatologia dolorosa das coletas dos canais radiculares e

abscesos apicais.

A distribuição do número de espécies bacteriana por casos no grupo de

pacientes com necrose pulpar associados a abscesso apical e sintomatologia

dolorosa (Figura 7) possibilitou observar que os casos 2 e 9 foram os que

apresentaram um maior número de espécies diferentes nas coletas dos abscessos

apicais e os casos 2 e 10 foram os que apresentaram um maior número de espécies

diferentes nas coletas dos canais radiculares. É possivel observar também e que o

caso 3 foi o que apresentou um menor número de espécies diferentes das coletas dos

53

abscessos apicais e os casos 5 e 6 foram os que apresentaram um menor número de

espécies diferentes das coletas dos canais radiculares comparados aos outros casos

investigados.

Figura 7. Número de diferentes espécies bacterianas presentes nas coletas de abscessos

apicais e canais radiculares de dentes com necessidade de intervenção

endodôntica com necrose pulpar associados a abscesso apical e sintomatologia

dolorosa.


investigadas das coletas dos abscessos apicais no grupo de pacientes com

necessidade de intervenção endodôntica com necrose pulpar associado a abscesso

apical e sintomatologia dolorosa, observou-se associações positivas significantes

(p<0,05) em 28 pares de espécies bacterianas (Tabela 5), todos com valores de

ODDS > 2.

54


nos abscessos apicais de dentes com necessidade de intervenção endodôntica

com necrose pulpar associado a abscesso apical e sintomatologia dolorosa.

Espécie Espécie

Significância

(valor de p)

Valor do

ODDS

Streptococcus gordonii Porphyromonas gingivalis 0,033 7

Streptococcus gordonii Campylobater rectus 0,033 7

Streptococcus gordonii Streptococcus oralis 0,033 7

Porphyromonas endodontalis Porphyromonas gingivalis 0,033 7

Porphyromonas endodontalis Campylobater rectus 0,033 7

Porphyromonas endodontalis Streptococcus oralis 0,033 7

Treponema Socranskii Campylobater rectus 0,033 7

Treponema denticola Streptococcus intermedius 0,033 7

Enterococcus faecium Eubacterium nodatum 0,048 6

Enterococcus faecium Actinomyces odontolyticus 0,048 6

Porphyromonas gingivalis Tannerella forsythia 0,048 6

Campylobater rectus Eubacterium saburreum 0,048 6

Campylobater rectus Parvimonas micra 0,048 6

Campylobater rectus Actinomyces oris 0,048 6

Streptococcus oralis Tannerella forsythia 0,048 6

Actinomyces israelii Actinomyces oris 0,048 6

Actinomyces israelii F. periodonticum 0,048 6

Streptococcus intermedius F. periodonticum 0,048 6

Streptococcus mitis A actinomycetencomytans 0,048 6

Capnocytophaga sputigena A actinomycetencomytans 0,048 6

Capnocytophaga sputigena Tannerella forsythia 0,048 6

Leptotrichia buccalis A actinomycetencomytans 0,048 6

Eubacterium saburreum F.nucleatum sp. nucleatum 0,048 5

Parvimonas micra F.nucleatum sp. nucleatum 0,048 5

Actinomyces oris F.nucleatum sp. nucleatum 0,048 5

A actinomycetencomytans Capnocytophaga ochracea 0,048 5

Fusobacterium periodonticum Capnocytophaga ochracea 0,048 5

Fusobacterium periodonticum Campylobacter showae 0,033 4

55

Com relação às associações negativas entre as diferentes espécies

bacterianas investigadas das coletas dos abscessos apicais no grupo de pacientes

com necessidade de intervenção endodôntica com necrose pulpar associado a

abscesso apical e sintomatologia dolorosa, observou-se associações negativas

significantes (p<0,05) em 6 pares de espécies bacterianas (Tabela 6) , todos com

valores de ODDS < 0,2.

Tabela 6. Associações negativas significantes (p<0,05) entre espécies bacterianas presentes

nos abscessos apicais de dentes com necessidade de intervenção endodôntica

com necrose pulpar associados a abscesso apical e sintomatologia dolorosa.

Espécie Espécie

Significância

(valor de p)

Valor do

ODDS

Capnocytophaga ochracea A actinomycetencomytans 0,048 0,167

Capnocytophaga ochracea F. periodonticum 0,048 0,167

F. nucleatum sp. nucleatum Eubacterium saburreum 0,048 0,167

F. nucleatum sp. nucleatum Parvimonas micra 0,048 0,167

F. nucleatum sp. nucleatum Actinomyces oris 0,048 0,167

Campylobacter showae F.nucleatum sp. nucleatum 0,033 0,143


investigadas nas coletas dos canais radiculares no grupo de pacientes com


apical e sintomatologia dolorosa, observou-se associações positivas significantes

(p<0,05) em 45 pares de espécies bacterianas (Tabela 7), todos com valores de

ODDS > 2.

56


em canais radiculares de dentes com necessidade de intervenção endodôntica com

necrose pulpar associado a abscesso apical e sintomatologia dolorosa.

(Continua)

Espécie Espécie Significância (valor de p)

Valor do ODDS

Enterococcus hirae Streptococcus intermedius 0,033 7

Enterococcus hirae Prevotella nigrescens 0,033 7

Capnocytophaga gingivalis Treponema socranskii 0,033 7

Capnocytophaga gingivalis Dialister pneumosintes 0,033 7

Capnocytophaga gingivalis Treponema denticola 0,033 7

Streptococcus gordonii Treponema socranskii 0,033 7

Streptococcus gordonii Streptococcus intermedius 0,033 7

Streptococcus gordonii Treponema denticola 0,033 7

Streptococcus gordonii Neisseria mucosa 0,033 7

Actinomyces oris Treponema socranskii 0,033 7

Actinomyces oris Streptococcus intermedius 0,033 7

Actinomyces oris Treponema denticola 0,033 7

Actinomyces oris Prevotella nigrescens 0,033 7

Actinomyces oris Neisseria mucosa 0,033 7

Neisseria mucosa F. nucleatum sp. vincentii 0,048 6

Neisseria mucosa Streptococcus mutans 0,048 6

Treponema socranskii Actinomyces israelii 0,048 6

Treponema socranskii Actinomyces odontolyticus 0,048 6

Dialister pneumosintes Porphyromonas endodontalis 0,048 6

Streptococcus intermedius F. nucleatum sp. vincentii 0,048 6

Streptococcus intermedius Streptococcus mutans 0,048 6

Treponema denticola Actinomyces israelii 0,048 6

Treponema denticola Actinomyces odontolyticus 0,048 6

Prevotella nigrescens F. nucleatum sp. vincentii 0,048 6

Prevotella nigrescens Streptococcus mutans 0,048 6

F. nucleatum sp. vincentii Campylobater rectus 0,048 5

F. nucleatum sp. vincentii Eubacterium saburreum 0,048 5

F. nucleatum sp. vincentii Propionibacterium acnes 0,048 5

Streptococcus mutans Eubacterium nodatum 0,048 5

Streptococcus mutans Campylobater rectus 0,048 5

Streptococcus mutans Eubacterium saburreum 0,048 5

Porphyromonas endodontalis Parvimonas micra 0,048 5

Actinomyces israelii Parvimonas micra 0,048 5

Streptococcus mutans Fusobacterium nucleatum sp.

nucleatum 0,048 5

Streptococcus mutans Propionibacterium acnes 0,048 5

Prevotella intermedia Eubacterium nodatum 0,048 5

57


em canais radiculares de dentes com necessidade de intervenção endodôntica com

necrose pulpar associado a abscesso apical e sintomatologia dolorosa

(Conclusão)


Valor do ODDS

Prevotella intermedia Porphyromonas gingivalis 0,048 5

F. nucleatum sp. nucleatum Capnocytophaga ochracea 0,033 4

F. nucleatum sp. nucleatum Streptococcus mitis 0,033 4

Campylobater rectus Capnocytophaga ochracea 0,033 4

Campylobater rectus Streptococcus mitis 0,033 4

Parvimonas micra Enterococcus faecalis 0,033 4

Veillonella parvula Streptococcus mitis 0,033 4

Streptococcus oralis Enterococcus faecalis 0,033 4

Propionibacterium acnes F.nucleatum sp. polymorphum 0,033 4

Com relação às associações negativas entre as diferentes espécies

bacterianas investigadas das coletas dos canais radiculares no grupo de pacientes

com necessidade de intervenção endodôntica com necrose pulpar associado a

abscesso apical e sintomatologia dolorosa, tivemos associações positivas

significantes (p<0,05) em 26 pares de espécies bacterianas (Tabela 8) , todos com

valores de ODDS < 0,2.

58

Tabela 8. Associações negativas significantes (p<0,05) entre espécies bacterianas presentes

em canais radiculares de dentes com necessidade de intervenção endodôntica

com necrose pulpar associado a abscesso apical e sintomatologia dolorosa.


Valor do ODDS

Campylobater rectus Streptococcus mutans 0,048 0,167

F. nucleatum sp. nucleatum Streptococcus mutans 0,048 0,167

F. nucleatum sp nucleatum F.nucleatum sp. vincentii 0,048 0,167

Eubacterium saburreum Streptococcus mutans 0,048 0,167

Parvimonas micra Porphyromonas endodontalis 0,048 0,167

Parvimonas micra Actinomyces israelii 0,048 0,167

Streptococcus oralis Porphyromonas endodontalis 0,048 0,167

Propionibacterium acnes Streptococcus mutans 0,048 0,167

Eubacterium nodatum F. nucleatum sp. vincentii 0,048 0,167

Eubacterium nodatum Streptococcus mutans 0,048 0,167

Eubacterium nodatum Prevotella intermedia 0,048 0,167

Porphyromonas gingivalis Prevotella intermedia 0,048 0,167

Propionibacterium acnes F. nucleatum sp. vincentii 0,048 0,167

Campylobater rectus F. nucleatum sp. vincentii 0,048 0,167

Veillonella parvula Capnocytophaga ochracea 0,033 0,143

Enterococcus faecalis Streptococcus oralis 0,033 0,143

Capnocytophaga ochracea Eubacterium nodatum 0,033 0,143

Capnocytophaga ochracea Campylobater rectus 0,033 0,143

Capnocytophaga ochracea F. nucleatum sp. nucleatum 0,033 0,143

Streptococcus mitis Eubacterium nodatum 0,033 0,143

Streptococcus mitis Campylobater rectus 0,033 0,143

Streptococcus mitis Veillonella parvula 0,033 0,143

Streptococcus mitis F. nucleatum sp. nucleatum 0,033 0,143

F.nucleatum sp. polymorphum Eubacterium nodatum 0,033 0,143

F.nucleatum sp. polymorphum Eubacterium saburreum 0,033 0,143

F.nucleatum sp. polymorphum Propionibacterium acnes 0,033 0,143

Também foram encontradas associações positivas (p<0,05) entre as

diferentes espécies bacterianas investigadas das coletas dos canais radiculares e dos

abscessos apicais no grupo de pacientes com necessidade de intervenção

endodôntica com necrose pulpar associado a abscesso apical e sintomatologia

dolorosa, em 26 pares de espécies bacterianas (Tabela 9), todos com valores de

ODDS > 2.

59


em abscessos apicais e canais radiculares de dentes com necessidade de

intervenção endodôntica com necrose pulpar associado a abscesso apical e

sintomatologia dolorosa.

Espécie CA Espécie CCR

Significância

(valor de p)

Valor do

ODDS

Treponema denticola Treponema denticola 0,033 7

Streptococcus gordonii Propionibacterium acnes 0,033 7

Streptococcus oralis Porphyromonas endodontalis 0,048 6

Streptococcus intermedius Actinomyces odontolyticus 0,048 6

Treponema denticola Streptococcus intermedius 0,033 5

Actinomyces odontolyticus I Streptococcus oralis 0,048 5

CA - Coleta Abscesso; CCR – Coleta canal radicular

Nenhuma associação negativa entre as diferentes espécies bacterianas

presentes em abscessos apicais e canais radiculares de dentes com necessidade de

intervenção endodôntica com necrose pulpar associado a abscesso apical e

sintomatologia foi encontrada.

Não houve diferença estatística na associação entre espécies bacterianas

investigadas e sinais e sintomas clínicos observados no grupo de dentes com


apical e sintomatologia dolorosa (p> 0,05).

60

5.3 Suscetibilidade aos agentes antimicrobianos (E-test)

Foram testadas as suscetibilidades antimicrobianas dos seguintes

microrganismos anaeróbios estritos isolados de diferentes coletas clínicas: BPN:

Prevotella nigrescens (n=5), Prevotella melaninogenica (n=4), Porphyromonas

endodontalis (n=3), Porphyromonas gingivalis (n=2). Fusobacterium nucleatum (n=4),

Prevotella buccae (n=4), Prevotella denticola (n=4), Propionibacterium propionicum

(n=1).

Os índices de suscetibilidade foram determinados de acordo com as

concentrações inibitórias mínimas reportadas por normas do Clinical and Laboratory

Standards Institute – CLSI (2015). Os resultados foram considerados em três

categorias: suscetível (S), intermediário (I) e resistente (R). Os valores de CIM50 e

CIM90 são relativos às concentrações inibitórias mínimas de cada agente

antimicrobiano para 50 e 90% das cepas isoladas, respectivamente.

Os valores da CIM50, CIM90, valores mínimo e máximo das concentrações

para cada espécie, além de sua suscetibilidade estão descritos nas Tabelas 10 a 18.

Tabela 10. Valores médios de CIM50 e CIM90 e da suscetibilidade das cepas de Prevotella

nigrescens (n=5) aos agentes antimicrobianos.

CIM (µg/mL) Suscetibilidade

CIM 50 CIM 90 Variação S I R

n % n % n %

AC 0,016 0,032 0,016-1,5 5 100 - - - -

AZ 0,094 0,19 0,016-32 3 60 1 20 1 20

CM 0,016 0,75 0,016-1,5 5 100 - - - -

EM 0,023 0,094 0,016-32 4 80 - - 1 20

MZ 0,032 0,032 0,016-0,125 5 100 - - - -

PG 0,016 0,016 0,016–192 4 80 - - 1 20

XL 0,016 0,032 0,016-0,25 5 100 - - - -

S = suscetível; I = intermediário; R = resistente; AC = amoxicilina; AZ = azitromicina; CM = clindamicina; EM = eritromicina; MZ = metronidazol; PG = benzilpenicilina; XL = amoxicilina + ácido clavulânico.

61

Tabela 11. Valores médios de CIM50 e CIM90 e da suscetibilidade das cepas de Fusobacterium nucleatum (n=4) aos agentes antimicrobianos.



n % n % n %

AC >256 >256 0,032- >256 1 50 - - 3 75

AZ >256 >256 0,032- >256 1 25 - - 3 75

CM >256 >256 0,016- >256 2 50 - - 2 50

EM >256 >256 0,75- >256 1 25 1 25 2 50

MZ 0,25 >256 0,032- >256 3 75 - - 1 25

PG >256 >256 0,016- >256 1 25 2 50 1 25

XL 0,016 0,032 0,016–0,75 4 100 - - - -



buccae (n=4) aos agentes antimicrobianos.



n % n % n %

AC 0,19 0,064 0,016-0,064 4 100 - - - -

AZ 0,19 16 0,016-16 3 75 - - 1 25

CM 0,75 2 0,016-2 4 100 - - - -

EM 0,5 0,5 0,016- >256 3 75 - - 1 25

MZ 0,064 1 0,016-1 4 100 - - - -

PG 0,016 0,016 0,016-0,064 4 100 - - - -

XL 0,023 0,094 0,016-0,094 4 100 - - - -

S = suscetível; I = intermediário; R = resistente; AC = amoxicilina; AZ = azitromicina; CM = clindamicina; EM = eritromicina; MZ = metronidazol; PG = benzilpenicilina ; XL = amoxicilina + ácido clavulânico.

62


denticola (n=4) aos agentes antimicrobianos.



N % n % n %

AC 0,016 0,016 0,016-0,023 4 100 - - - -

AZ 0,094 4 0,094-4 3 75 - - 1 25

CM 0,016 0,032 0,016-0,25 4 100 - - - -

EM 0,023 0,5 0,016- >256 3 75 - - 1 25

MZ 0,016 0,016 0,016-0,064 4 100 - - - -

PG 0,023 0,094 0,016-0,094 4 100 - - - -

XL 0,016 0,032 0,016-0,032 4 100 - - - -

S = suscetível; I = intermediário; R = resistente; AC = amoxicilina; AZ = azitromicina; CM = clindamicina; EM = eritromicina; MZ = metronidazol; PG = benzipenicilina; XL = amoxicilina + ácido clavulânico.


melaninogenica (n=4) aos agentes antimicrobianos.



n % n % n %

AC 0,032 0,032 0,016-0,032 4 100 - - - -

AZ 1 1,5 0,032-1,5 4 100 - - - -

CM 0,016 0,016 0,016-1 4 100 - - - -

EM 0,064 0,5 0,0064-0,5 4 100 - - - -

MZ 2 12 2-12 3 75 - - 1 25

PG 0,016 0,016 0,016-0,023 4 100 - - - -

XL 0,016 1 0,016-1 4 100 - - - -


63

Tabela 15. Valores médios de CIM50 e CIM90 e da suscetibilidade das cepas de

Porphyromonas endodontalis (n=3) aos agentes antimicrobianos.



n % n % N %

AC 0,016 0,032 0,016-0,032 3 100 - - - -

AZ 0,032 4 0,032-4 2 66 - - 1 33

CM 0,016 0,016 - 3 100 - - - -

EM 0,5 1 0,5-1 3 100 - - - -

MZ 2 4 2-4 3 100 - - - -

PG 0,75 3 0,75-3 2 66 - - 1 33

XL 0,016 0,016 - 3 100 - - - -



oralis (n=2) aos agentes antimicrobianos.



n % n % N %

AC 0,016 0,016 - 2 100 - - - -

AZ 0,016 0,016 - 2 100 - - - -

CM 0,016 3 0,016-3 1 50 1 50 - -

EM 0,016 0,016 - 2 100 - - - -

MZ 5 15 5-15 1 50 1 50 - -

PG 0,016 1 0,016-1 1 50 1 50 - -

XL 0,016 0,016 - 2 100 - - - -


64


Porphyromonas gingivalis (n=2) aos agentes antimicrobianos.



n % n % N %

AC 0,064 0,064 - 2 100 - - - -

AZ 0,016 0.125 0,016-0,125 2 100 - - - -

CM 0,016 0,016 - 2 100 - - - -

EM 0,016 0,019 0,016-0,019 2 100 - - - -

MZ 4 6 4-6 2 100 - - - -

PG 0,023 0,023 - 2 100 - - - -

XL 0,016 0,016 - 2 100 - - - -



Propionibacterium propionicum (n=1) aos agentes antimicrobianos.



N % n % N %

AC 0,016 0,016 - 1 100 - - - -

AZ 0,032 0,032 - 1 100 - - - -

CM 0,016 0,016 - 1 100 - - - -

EM 0,25 0,25 - 1 100 - - - -

MZ 0,25 0,25 - 1 100 - - - -

PG 0,016 0,016 - 1 100 - - - -

XL 0,094 0,094 - 1 100 - - - -


Dentre as cepas bacterianas testadas foram consideradas suscetível aos

seguintes antibióticos: amoxicilina + ácido clavulânico (29/29), metronidazol (26/29),

amoxicilina (26/29), clindamicina (26/29), eritomicina (24/29), benzilpenicilina (24/29)

e azitromicina (23/29). Foram consideradas intermédiario aos seguintes antibióticos:

benzilpenicilina (03/29), clindamicina (01/29), eritromicina (01/29) e metronidazol

(01/29). Foram consideradas resistentes aos seguintes antibióticos: azitromicina

(06/29), eritromicina (04/29), amoxicilina (03/29), clindamicina (02/29), benzilpenicilina

(02/29) e metronidazol (02/29). Como mostram os dados apresentados na Figura 8.

65

Figura 8. Porcentagem de cepas bacterianas avaliadas em suscetíveis (S), intermédiario (I) e

resistentes (R) aos agentes bacterianos testados amoxicilina (AC), azitromicina

(AZ), clindamicina (CM), eritromicina (EM), metronidazol (MZ), benzilpenicilina (PG)

e amoxicilina + acido clavulânico (XL).

66

6 DISCUSSÃO



sintomatologia

O interior dos canais radiculares em dentes com necrose pulpar constitui

um nicho ecológico complexo que propicia condições adequadas para o

desenvolvimento da infecção endodôntica (Sundqvist, 1992). As interações

microbianas (Gharbia e Shah, 1993), as pressões exercidas pelo ambiente

(Haapasalo, 1993) e o contínuo desafio proporcionado pela ação do sistema imune

humano restringem o número de espécies capazes de colonizar o sistema de canais

radiculares.

A microbiota encontrada nas infecções endodônticas primárias é constituída

predominantemente por espécies anaeróbias estritas (Gomes et al., 1994a) e sua

composição está relacionada à presença ou não do desenvolvimento de

sintomatologia dolorosa (Yoshida et al., 1987). Estudos demonstram que espécies

pertencentes aos gêneros Prevotella ssp., Porphyromonas ssp., Fusobacterium ssp.,

Peptostreptococcus ssp. e Eubacterium ssp. são freqüentemente isoladas nessas

infecções (Yoshida et al., 1987; Hashioka et al., 1992; Gomes et al., 2004). Os

microrganismos estão envolvidos direta e indiretamente nos processos inflamatórios

e na sintomatologia dolorosa de origem endodôntica, pois componentes estruturais de

sua célula são capazes de ativar o sistema imune do hospedeiro (Jacinto et al., 2005;

Wadachi e Hargreaves. 2006).

No presente estudo foi possível observar que os casos de infecções primárias

associadas a lesões periapicais e sem sintomatologia apresentaram uma microbiota

polimicrobiana em 100% dos canais radiculares, com o predomínio de bactérias

Gram-negativas, anaeróbias e em forma de bastonetes. Sendo assim, o nosso estudo

corrobora com outros estudos recentes de composição microbiana em infecções

primárias que utilizaram a mesma metodologia (Roças IN e Siqueira JF, 2012;

Martinho FC et al., 2014).

Hashioka et al. (1992), ao estudarem a relação entre os achados clínicos e a

composição da microbiota de canais radiculares infectados, observaram que o número

de colônias em casos que apresentavam sintomatologia dolorosa espontânea foi

67

superior àqueles casos onde não havia sintomatologia. Uma correlação positiva foi

estabelecida entre a presença de dor à percussão e as espécies Peptococcus ssp.,

Peptostreptococcus ssp., Eubacterium ssp., P. gingivalis, P. endodontalis e

Bacteroides ssp., tornando estes microrganismos patógenos suspeitos de causarem

alterações periapicais. O odor desagradável ao acessar o sistema de canais

radiculares foi observado principalmente em casos onde Peptococcus ssp.,

Peptostreptococcus ssp., Eubacterium ssp. e Bacteroides ssp. foram encontrados.

Em nosso estudo não foi possível observar diferença estatística na associação

entre espécies bacterianas investigadas e sinais e sintomas clínicos observados (p>

0,05) no grupo de pacientes pertencentes ao grupo com necrose pulpar e presença

de lesão periapical. Acreditamos que não foi possível verificar tais associações devido

a uma amostra pequena e padronizada.

Em 1994b, Gomes et al. sugeriram que o desenvolvimento da patologia

endodôntica é dependente de associações entre as espécies. Ao avaliarem uma

extensa série de casos através do método de cultura bacteriana, os autores relatam o

isolamento de até 11 diferentes espécies nos canais radiculares. Associações

positivas foram observadas entre Peptostreptococcus ssp./Prevotella ssp., P.

micros/Prevotella ssp., Peptostreptococcus ssp./P. melaninogenica, Prevotella

ssp./Eubacterium ssp., P. micros/P. melaninogenica, dentre outras.

Com os resultados de nosso estudo foi possível observar associações positivas

em 13 pares bacterianos. As associações mais significantes (p=,033) foram as

associações com a espécie Porphyromonas endodontalis (bastonete, Gram-negativo

e anaeróbio) associado tanto a cocos Gram-positivos e facultativos (Gemella

morbillorum, Streptococcus gordonii, Staphylococcus epidermidis) quanto a bacilos

Gram-negativos e anaeróbios estritos (Treponema denticola e Tannerella forsythia).

Associações bacterianas podem ser importantes, agindo sinergicamente e

aumentando sua virulência, o que agrava os danos causados no hospedeiro.

68

6.2 Caracterização da microbiota presente em canais radiculares e abscessos

apicais de dentes com necessidade de intervenção endodôntica com necrose

pulpar associado a abscesso apical e sintomatologia dolorosa

As infecções endodônticas primárias são constituídas por interações

entre espécies de microrganismos. Estudos sugerem que a presença ou ausência

de sintomatologia está associada às características específicas da composição

microbiana, tanto qualitativa quanto quantitativamente (Sundqvist, 1976; Yoshida

et al., 1987; Hashioka et al., 1992).

No presente estudo foi possível observar que os casos de infecções primárias

associadas a abscesso apical agudo e sintomatologia dolorosa apresentaram uma

microbiota polimicrobiana em 100% dos canais radiculares e dos abscessos apicais,

com o predomínio de bactérias Gram-negativas, anaeróbias e em forma de

bastonetes. Sendo assim, o nosso estudo corrobora com outros estudos recentes de

composição microbiana em infecções primárias que utilizaram outras metodologias

(Montagner et al., 2010; Nobrega et al., 2016 a,b).

Para Gomes et al. (1994a), a presença de dor espontânea esteve associada

com as espécies Prevotella ssp., Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica e

Peptostreptococcus ssp. As espécies Prevotella ssp., Fusobacterium necrophorum,

Peptostreptococcus ssp. e Peptostreptococcus micros estiveram associadas à edema.

Correlações positivas foram observadas também entre presença de fístula e

Eubacterium lentum. Quando havia exsudato purulento no canal radicular, isolaram-

se os microrganismos Fusobacterium ssp., Fusobacterium necrophorum, Prevotella

buccae e Prevotella loescheii.

O emprego de testes estatísticos de correlação tais como o Chiquadrado de

Pearson ou o Exato de Fisher tem estabelecido associações positivas e negativas

entre a presença de sinais e sintomas de origem endodôntica e determinadas

espécies microbianas (Yoshida et al.,1987; Hashioka et al., 1992; Gomes et al., 1994

a,b; Jacinto et al., 2003; Gomes et al., 2004). Esta estratificação tem sido

extensivamente estudada em periodontia, onde a distribuição da microbiota em

complexos permite um melhor entendimento das sucessões ecológicas que

determinam o estabelecimento da patologia periodontal em suas diversas

modalidades (Socransky e Haffajee, 2005).

69

No presente estudo foram encontradas diversas associações positivas e

negativas entre as bactérias investigadas em cada um dos sítios coletados (canais

radiculares e abscessos apicais) e associações positivas entre bactérias investigadas

nos abscessos apicais e nos canais radiculares. Essas associações podem ser

importantes, agindo sinergicamente e aumentando sua virulência, o que agrava os

danos causados no hospedeiro.

Interações entre espécies bacterianas podem ser negativas ou

positivas, e dependendo do seu coeficiente estatístico indicam uma dependência

mais ou menos significante entre elas (Gomes et al., 1994b). No presente estudo,

associações positivas específicas foram constatadas entre os bacilos anaeróbios

estritos Gram-negativos Porphyromonas gingivalis e Bacteroides ureolyticus,

Fusobacterium nucleatum e Clostridium ssp., Prevotella disiens e Porphyromonas

gingivalis. Interações entre os bacilos anaeróbios estritos Gram-negativos

Clostridium butyricum e cocos anaeróbios Gram-positivos Peptostreptococcus

micros também foram observadas. Menos freqüentes foram as associações entre

os anaeróbios estritos Prevotella ssp. e Bifidobacterium bifidum e apenas uma

correlação positiva estatisticamente significante foi constatada entre os facultativos

Staphylococcus aureus e Staphylococcus xylosus.

Em nosso estudo não foi possível observar diferença estatística na associação

entre espécies bacterianas investigadas e sinais e sintomas clínicos observados (p>

0,05) no grupo de pacientes pertencentes ao grupo com necrose pulpar associada a

abscesso apical agudo e sintomatologia dolorosa em nenhum dos sítios coletados

(canais radiculares e abscessos apicais). Acreditamos que não foi possível verificar

tais associações por ser uma amostra padronizada.

6.3 Suscetibilidade aos agentes antimicrobianos (E-test)

Com o objetivo de determinar padrões de suscetibilidade antimicrobiana de

cepas isoladas no presente estudo foi utilizado o E-test. Este é um teste comercial,

baseado nos princípios de difusão de gradiente antimicrobiano em ágar, como forma

de determinação da concentração inibitória mínima. O E-test, por se tratar de um

método qualitativo e quantitativo, apresenta vantagens, por determinar a ação

70

antimicrobiana do antibiótico testado, além de determinar a concentração inibitória

mínima capaz de impedir o crescimento microbiano; uma vez que a fita utilizada

apresenta diferentes concentrações do antibiótico. Este método foi utilizado

anteriormente em diversos estudos (Citron et al., 1991; Nachnani et al., 1992;

Kuriyama et al., 2000; Jacinto et al., 2003; Sousa et al., 2003; Martinho 2007; Gomes

et al., 2011; Montagner et al., 2014).

Martinho (2007), investigando canais radiculares com infecção primária,

assintomáticos, avaliou a suscetibilidade aos agentes antimicrobianos em isolados

bacterianos e verificou que 100% das cepas de Prevotella buccae, Prevotella oralis e

Porphyromonas gingivalis foi suscetível à amoxicilina. Os resultados do presente

estudo estão de acordo com os apresentados por ele. No entanto em nosso trabalho

foi possível observar 75% de resistência ao antibiótico amoxicilina nas cepas de

Fusobacterium nucleatum, diferentente do apresentado por Martinho (25%) o que

também pode ser um resultado preocupante.

Os nossos resultados discordam parcialmente de um estudo realizado por

Montagner et al. (2014) que estudaram a resistência de Prevotella oralis e

Porphyromonas gingivalis aos seguintes agentes antimicrobianos: benzilpenicilina,

amoxicilina e amoxicilina+acido clavulânico utilizando a metodologia do E-test . Todas

as cepas do estudo foram suscetíveis aos agentes antimicrobianos testados. Foi

possível observar em nosso estudo que 50% das cepas de Prevotella oralis (n=2) foi

classificada em um nível intermediário ao ser testada com benzilpenicilina, o que pode

representar um resultado preocupante. No entanto com relação às cepas de

Porphyromonas gingivalis, o nosso estudo corrobora com o realizado por Montagner

e colaboradores. Não foi possível observar nenhum grau de resistência aos

antibióticos testados.

No Brasil, a amoxicilina tem sido rotineiramente prescrita como coadjuvante

para o tratamento de infecções orofaciais em pacientes que não apresentam reações

alérgicas a esse medicamento. Seu uso clínico está relacionado às suas

características de biodisponibilidade, tais como rápida absorção pelo organismo e

manutenção prolongada de níveis séricos, permitindo intervalos de administração

mais longos (Montgomery, 2000).

71

A associação da amoxicilina ao ácido clavulânico foi 100% eficaz contra

todas as cepas testadas, concordando com os achados de Jacinto et al. (2003),

Sousa et al. (2003), Matinho (2007), Montagner et al. (2014). Tal associação foi eficaz

mesmo contra cepas resistentes a amoxicilina, revelando ser um potente agente

antimicrobiano no tratamento de infecções dentoalveolares.

Eritromicina e a clindamicina têm sido prescritas para pacientes alérgicos à

penicilina (Gill e Scully et al., 1990; Sandor et al., 1998). A clindamicina, medicamento

de primeira escolha atualmente na odontologia para pacientes alérgicos as penicilinas,

apresenta efeito bacteriostático, exceto em altas doses, quando se torna bactericida,

apresentando excelente ação contra anaeróbios, inclusive os produtores de beta-

lactamases (Gill e Scully et al., 1990; Sandor et al., 1998). Devido à propensão dos

pacientes em desenvolverem colite associada ao uso da clindamicina, esse

medicamento por sua vez, não tem sido amplamente utilizada nas infecções com

intensidades baixas a moderadas. O uso limitado da clindamicina provavelmente se

dá em função da sua efetividade contra uma gama diversa de microrganismos (Sousa

et al., 2003; Jacinto et al., 2003).

Em nosso estudo foi possível observar resistência a clindamicina em 50%

das cepas de F. nucleatum. No ano de 2003, Sousa e Jacinto et al. verificaram 100%

de suscetibilidade da espécie F. nucleatum a clindamicina. Entretanto Vianna (2006)

relatou percentual de suscetibilidade de 56%, resultado semelhante ao encontrado em

nosso estudo.

A eritromicina apresenta um espectro similar ao das penicilinas G e V,

porém não atinge altas concentrações plasmáticas, além de ser menos efetiva contra

espécies anaeróbias (Moenning et al., 1989). Kuriyama et al. (2000) e Chan e Chan

(2003) relataram um aumento na incidência de resistência à eritromicina. Em nosso

estudo foi possível observar algum grau de resistência a eritromicina nas seguintes

espécies: Prevotella nigrescens, Fusobacterium nucleatum, Prevotella buccae e

prevotella denticola.

Modificações na estrutura química da eritromicina permitiram a síntese da

azitromicina, que apresenta um espectro de ação e meia-vida plasmática ampliados

(Kapusnik-Uner et al., 1996), sendo empregada como alternativa aos lactâmicos na

profilaxia para endocardite bacteriana em pacientes suscetíveis (Montgomery, 2000).

72

O perfil de suscetibilidade dos isolados de canais radiculares e abscessos periapicais

à eritromicina e azitromicina são variáveis. Porphyromonas endodontalis, Prevotella

denticola, Prevotella buccae, Fusobacterium nucleatum e Prevotella nigrescens foram

as espécies que se mostraram resistentes a azitromicina.

A efetiva ação do metronidazol frente a microrganismos anaeróbios tem

sido freqüentemente relatada (Kuriyama et al., 2000; Sousa et al., 2003; Jacinto et

al., 2007; Montagner et al., 2010; Gomes et al., 2011). Em nossas amostras Prevotella

oralis, Prevotella melaninogênica, Fusobacterium nucleatum foi possível observar

resistência ao metronidazol. Como as infecções endodônticas são mistas e abrigam

também microrganismos 162 facultativos, clinicamente o emprego isolado do

metronidazol não se mostra efetivo, necessitando associação com antibióticos β-

lactâmicos (Baumgartner e Xia, 2002; Jacinto et al., 2008).

A benzilpencilina (penicilina G), uma das penicilinas naturais mais

utilizadas, foi eficaz contra 82,75% das cepas analisadas; entretanto, ao considerar

sua via de administração parenteral, esta por sua vez, limita o uso. Desta forma, a

opção pelo medicamento no tratamento de infecções dentoalveolares está indicada

quando uma rápida concentração da mesma é necessária.

Segundo van Winkelhoff et al. (2005) e Hawkey (2008), variações entre os

resultados descritos em diferentes estudos podem estar relacionadas à metodologia

empregada, época de sua realização, localização geográfica ou o número de

amostras estudadas. Apesar do limitado número de cepas analisadas nessa pesquisa,

os resultados demonstram uma diferença nas características de suscetibilidade dos

isolados em amostras de canais radiculares e abscessos periapicais de um mesmo

paciente.

O uso indiscriminado de antibióticos para complementar tratamento

odontológico deve ser evitado por poder levar a sérias consequências, incluindo

reações alérgicas aos medicamentos usados, desenvolvimento de superinfecções

com espécies bacterianas resistentes e exposição desnecessária de pacientes a

certas toxicidades e efeitos colaterais dos medicamentos.

Em resumo, para melhor caracterização da microbiota presente nos canais

radiculares de dentes infectados sintomáticos e dos abscessos correspondentes,

73

assim como da microbiota dos canais radiculares de dentes assintomáticos, faz-se

necessário um maior número de casos. Além disso, seria interessante a utilização do

Next Generation Sequencing para detecção de espécies de difícil detecção, de

espécies não identificadas e de filotipos. Outro fato importante é a necessidade de um

monitoramento contínuo da suscetibilidade destes microrganismos aos antibióticos

mais utilizados na prática odontológica.

74

7 CONCLUSÃO

Baseado nos diversos métodos utilizados neste estudo e nos resultados obtidos

pode-se concluir que:

1. A microbiota dos canais radiculares de infecções primárias sintomáticas e

assintomáticas são polimicrobianas

2. A microbiota presente nos casos sintomáticos é mais complexa que a dos

casos assintomáticos com periododontite apical, com um maior numero de

associações positivas e negativas entre os microrganismos.

3. Os agentes antimicrobianos amoxicilina+acido clavulânico, metronidazol,

amoxicilina e clindamicina foram os que se mostraram mais efetivos, ou seja

apresentaram um maior numero de cepas suscetíveis, para as cepas

bacterianas testadas. A azitromicina foi o antibiótico testado menos efetivo.

75

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84

APÊNDICES

Apêndice 1 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

87

Apêndice 2 – Tabelas das Bacterias pelo Checkerboard em casos sintomáticos e assintomáticos asociados a abscessos

apicais

Quadro 1. Bactérias identificadas pelo Checkerboard em canais radiculares de dentes com necessidade de intervenção endodôntica, com lesão

periapical e sem sintomatologia

Casos Bacterias – Canais radiculares Total de

especies

1 Actinomyces odontolyticus, Actinomyces oris, Capnocytophaga gingivalis, Dialister pneumosintes, Enterococcus faecium,

Fusobacterium periodonticum, Prevotella nigrescens, Streptococcus oralis, Veillonella parvula 9

2

Actinomyces israelii, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces oris, Campylobacter showae, Capnocytophaga gingivalis,

Capnocytophaga sputigena, Dialister pneumosintes, Eikenella corrodens, Enterococcus faecium, Enterococcus hirae,

Eubacterium saburreum, Fusobacterium nucleatum sp nucleatum , Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Filifactor alocis,

Fusobacterium periodonticum, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella

nigrescens, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Treponema socranskii, Veillonella parvula

24

3

Actinomyces israelii, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces oris, Campylobacter showae, Campylobater rectus,

Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Dialister pneumosintes, Eikenella

corrodens, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus hirae, Eubacterium saburreum, Fusobacterium

nucleatum sp nucleatum , Fusobacterium nucleatum sp polymorphum , Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Filifactor

alocis, Fusobacterium periodonticum, Gemella morbillorum, Parvimonas micra, Porphyromonas endodontalis, Prevotella

intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella nigrescens, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus gordonii,

Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Tannerella forsythia,

Treponema denticola, Veillonella parvula

34

4 Actinomyces israelii, Actinomyces oris, Campylobacter showae, Dialister pneumosintes, Enterococcus faecium,

Enterococcus hirae, Filifactor alocis, Prevotella nigrescens 8

88

5

A actinomycetencomytans, Actinomyces israelii, Actinomyces oris, Campylobacter showae, Capnocytophaga sputigena,

Enterococcus faecium, Enterococcus hirae, Eubacterium nodatum, Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Filifactor alocis,

Fusobacterium periodonticum, Gemella morbillorum, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella

intermedia, Prevotella nigrescens, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Treponema socranskii, Veillonella parvula

20

6

A actinomycetencomytans, Actinomyces israelii, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces oris, Campylobacter showae,

Campylobater rectus, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Dialister

pneumosintes, Eikenella corrodens, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus hirae, Eubacterium

nodatum, Eubacterium saburreum, Fusobacterium nucleatum sp nucleatum , Fusobacterium nucleatum sp polymorphum ,

Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Filifactor alocis, Fusobacterium periodonticum, Gemella morbillorum, Parvimonas

micra, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella

nigrescens, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mutans,

Streptococcus oralis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Treponema socranskii, Veillonella parvula

37

7


Campylobater rectus, Capnocytophaga gingivalis, Dialister pneumosintes, Eikenella corrodens, Enterococcus faecalis,

Enterococcus faecium, Enterococcus hirae, Eubacterium nodatum, Eubacterium saburreum, Fusobacterium nucleatum sp

polymorphum , Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Fusobacterium periodonticum, Gemella morbillorum, Neisseria

mucosa, Parvimonas micra, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella nigrescens, Staphylococcus

epidermidis, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus oralis, Tannerella forsythia, Treponema

denticola, Treponema socranskii, Veillonella parvula, Capnocytophaga sputigena, Filifactor alocis, Streptococcus mutans,

Prevotella intermedia

35

8


Campylobater rectus, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga sputigena, Dialister pneumosintes, Eikenella corrodens,

Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Eubacterium saburreum, Fusobacterium nucleatum sp polymorphum ,

Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Filifactor alocis, Fusobacterium periodonticum, Gemella morbillorum, Parvimonas

micra, Porphyromonas endodontalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Staphylococcus epidermidis,

Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Tannerella forsythia,

Treponema denticola, Treponema socranskii, Veillonella parvula

31

89

9


Campylobater rectus, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Dialister

pneumosintes, Eikenella corrodens, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Eubacterium nodatum, Eubacterium

saburreum, Fusobacterium nucleatum sp nucleatum , Fusobacterium nucleatum sp Polymorphum , Fusobacterium

nucleatum sp vincentii , Filifactor alocis, Fusobacterium periodonticum, Gemella morbillorum, Neisseria mucosa, Parvimonas

micra, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella

nigrescens, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis,

Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Tannerella forsythia, Treponema denticola,Treponema socranskii, Veillonella

parvula

38

10

A actinomycetencomytans, Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Treponema socranskii, Actinomyces oris, Enterococcus

faecalis, Dialister pneumosintes, Porphyromonas endodontalis, Streptococcus oralis, Capnocytophaga ochracea,

Actinomyces israelii, Treponema denticola, Prevotella nigrescens, Actinomyces odontolyticus, Campylobacter showae,

Fusobacterium periodonticum, Fusobacterium nucleatum sp nucleatum , Capnocytophaga gingivalis, Streptococcus

gordonii, Tannerella forsythia, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus mitis, Capnocytophaga sputigena, Filifactor alocis,

Streptococcus mutans, Prevotella intermedia, Veillonella parvula

26

90

Quadro 2. Bactérias identificadas pelo Checkerboard em canais radiculares e abscessos apicais de dentes com necessidade de intervenção

endodôntica com necrose pulpar associado a abscesso apical e sintomatologia dolorosa

Casos Abscesso apical Total de

especies Canal Radicular

Total de

especies

1

A actinomycetencomytans, Actinomyces israelii,

Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga

sputigena, Dialister pneumosintes, Enterococcus

faecalis, Enterococcus hirae, Fusobacterium

nucleatum sp vincentii , Fusobacterium periodonticum,

Leptotrichia buccalis, Neisseria mucosa, Prevotella

intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella

nigrescens, Staphylococcus epidermidis,

Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis,

Streptococcus mutans, Treponema denticola,

Veillonella parvula

20

Actinomyces odontolyticus, Actinomyces oris,

Campylobacter showae, Campylobater rectus,

Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga

ochracea, Capnocytophaga sputigena, Dialister

pneumosintes, Enterococcus faecium, Enterococcus

hirae, Eubacterium nodatum, Eubacterium

saburreum, Fusobacterium nucleatum sp

polymorphum , Fusobacterium nucleatum sp

vincentii , Fusobacterium nucleatum sp nucleatum ,

Neisseria mucosa, Porphyromonas gingivalis,

Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens,

Propionibacterium acnes, Staphylococcus

epidermidis, Streptococcus gordonii, Streptococcus

intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus

mutans, Treponema denticola, Treponema

socranskii, Veillonella parvula

28

91

2


Actinomyces oris, Campylobacter showae,

Campylobater rectus, Capnocytophaga gingivalis,


sputigena, Dialister pneumosintes, Eikenella

corrodens, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae,

Eubacterium saburreum, Fusobacterium nucleatum sp


Fusobacterium periodonticum, Gemella morbillorum,

Leptotrichia buccalis, Neisseria mucosa, Parvimonas

micra, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas

gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella

melaninogenica, Prevotella nigrescens,

Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis,

Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius,

Streptococcus mitis, Streptococcus mutans,

Streptococcus oralis, Tannerella forsythia, Treponema

denticola, Treponema socranskii, Veillonella parvula

36


Actinomyces oris, Campylobater rectus,



pneumosintes, Eikenella corrodens, Enterococcus

hirae, Eubacterium nodatum, Eubacterium

saburreum, Fusobacterium nucleatum sp

polymorphum , Fusobacterium nucleatum sp


Fusobacterium periodonticum, Leptotrichia buccalis,

Neisseria mucosa, Parvimonas micra,

Porphyromonas endodontalis, Prevotella intermedia,

Prevotella nigrescens, Propionibacterium acnes,

Staphylococcus epidermidis, Streptococcus gordonii,

Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis,

Streptococcus mutans, Tannerella forsythia,

Treponema denticola, Treponema socranskii,

Veillonella parvula

32

3

Enterococcus hirae, Prevotella nigrescens, Veillonella

parvula

3

Actinomyces oris, Campylobater rectus,

Enterococcus hirae, Eubacterium saburreum,

Fusobacterium nucleatum sp vincentii ,

Fusobacterium nucleatum sp nucleatum , Neisseria

mucosa, Prevotella nigrescens, Propionibacterium

acnes, Streptococcus gordonii, Streptococcus

intermedius, Streptococcus mutans

12

92

4

Actinomyces odontolyticus, Capnocytophaga

gingivalis, Enterococcus faecalis, Enterococcus

faecium, Enterococcus hirae, Eubacterium nodatum,

Fusobacterium nucleatum sp polymorphum ,

Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Neisseria

mucosa, Prevotella intermedia, Prevotella

melaninogenica, Prevotella nigrescens, Streptococcus

intermedius, Streptococcus mutans, Treponema


17

Actinomyces israelii, Actinomyces odontolyticus,


Capnocytophaga gingivalis, Enterococcus faecium,

Enterococcus hirae, Eubacterium nodatum,

Eubacterium saburreum, Fusobacterium nucleatum

sp polymorphum , Fusobacterium nucleatum sp

vincentii , Leptotrichia buccalis, Neisseria mucosa,

Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia,

Prevotella nigrescens, Propionibacterium acnes,


Streptococcus mutans, Treponema denticola,

Treponema socranskii

22

5

Campylobater rectus, Dialister pneumosintes,

Enterococcus faecium, Enterococcus hirae,

Eubacterium nodatum, Eubacterium saburreum,

Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Leptotrichia

buccalis, Parvimonas micra, Porphyromonas

endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella


nigrescens, Streptococcus gordonii, Streptococcus

mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis,

Treponema denticola, Treponema socranskii,

Veillonella parvula

21 Prevotella melaninogenica, Veillonella parvula

2

93

6

Actinomyces israelii, Actinomyces oris, Campylobater

rectus, Capnocytophaga gingivalis, Dialister

pneumosintes, Enterococcus faecalis, Eubacterium

saburreum, Fusobacterium nucleatum sp nucleatum ,

Neisseria mucosa, Parvimonas micra, Porphyromonas

endodontalis, Prevotella intermedia, Prevotella

melaninogenica, Staphylococcus epidermidis,

Streptococcus gordonii, Streptococcus mutans,

Treponema socranskii, Veillonella parvula

18 Enterococcus faecium, Staphylococcus epidermidis

2

7

A actinomycetencomytans, Actinomyces odontolyticus,


sputigena, Dialister pneumosintes, Eikenella

corrodens, Enterococcus faecalis, Enterococcus

faecium, Eubacterium nodatum, Fusobacterium

nucleatum sp vincentii , Leptotrichia buccalis,

Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas


melaninogenica, Staphylococcus epidermidis,

Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis,

Streptococcus mutans, Streptococcus oralis,Tannerella

forsythia

21

Capnocytophaga gingivalis, Dialister pneumosintes,

Enterococcus hirae, Porphyromonas endodontalis,


Prevotella melaninogenica, Staphylococcus

epidermidis, Streptococcus oralis

9

94

8





sputigena, Dialister pneumosintes, Enterococcus

faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus hirae,

Eubacterium nodatum, Fusobacterium nucleatum sp

vincentii , Fusobacterium periodonticum, Leptotrichia

buccalis, Porphyromonas endodontalis,


Prevotella melaninogenica, Prevotella nigrescens,

Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis,





32


Actinomyces oris, Capnocytophaga gingivalis,

Dialister pneumosintes, Enterococcus faecalis,

Enterococcus faecium, Enterococcus hirae,

Parvimonas micra, Porphyromonas endodontalis,



Streptococcus intermedius, Streptococcus oralis,

Treponema denticola, Treponema socranskii

18

95

9



Campylobacter showae, Campylobater rectus,



pneumosintes, Enterococcus faecalis, Enterococcus

faecium, Enterococcus hirae, Eubacterium saburreum,

Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Fusobacterium

nucleatum sp nucleatum , Fusobacterium

periodonticum, Leptotrichia buccalis, Parvimonas

micra, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas


melaninogenica, Prevotella nigrescens, Streptococcus

gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus

mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis,

Tannerella forsythia, Treponema denticola, Treponema

socranskii, Veillonella parvula

33


Actinomyces oris, Capnocytophaga gingivalis,

Dialister pneumosintes, Enterococcus faecalis,

Fusobacterium periodonticum, Neisseria mucosa,


Streptococcus gordonii, Streptococcus

oralis,Treponema denticola,Treponema socranskii

14

96

10




Capnocytophaga sputigena, Dialister pneumosintes,

Eikenella corrodens, Enterococcus faecalis,

Enterococcus faecium, Eubacterium nodatum,

Eubacterium saburreum, Fusobacterium nucleatum sp


Fusobacterium periodonticum, Neisseria mucosa,





Streptococcus intermedius, Streptococcus mutans,



32




Capnocytophaga ochracea, Dialister pneumosintes,

Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium,

Enterococcus hirae, Eubacterium nodatum,

Fusobacterium nucleatum sp vincentii ,

Fusobacterium nucleatum sp nucleatum , Neisseria

mucosa, Parvimonas micra, Porphyromonas

endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella


nigrescens, Staphylococcus epidermidis,



Streptococcus oralis,Tannerella forsythia, Treponema


30

97

ANEXOS

Anexo 1 - Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa da FOP-UNICAMP

ANÁLISE DO CONTEÚDO BACTERIANO DE INFECÇÕES...

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