ANALISIS DEL POLIMORFISMO GENETICO
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ANALISIS DEL POLIMORFISMO GENETICO
Proyecto Genoma Humano
El proyecto Genoma Humano (HGP) se inició en 1990 y fue completado en 2003, fue coordinado por
• U.S. Department of Energy• National Institutes of Health• Wellcome Trust (U.K.) en los primeros años• Otras contribuciones desde Japon, Francia, Alemania,
China, y otros.
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml
Beneficios del Proyecto Genoma Humano en Medicina
• Mejor diagnóstico (dx temprano, específico) de enfermedades genética e infecciosas
• Detección temprana de mayor susceptibilidad a enfermedades
• Mejor diseño de drogas
• Terapia génica y desarrollo de sistemas de control de drogas
• Farmacogenómica
Análisis del Polimorfismo
• RFLP - restriction fragment length polymorphism (Polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción).
• AFLP - amplified fragment length polymorphism• RAPD - random amplification of polymorphic DNA• VNTR - variable number tandem repeat• SSR - simple sequence repeat
RFLP
• RFLP - restriction fragment length polymorphism (Polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción).
• Tecnologia mas antigua• Diferencia entre secuencias de DNA en la que un
DNA presente una secuencia de restricción que el otro DNA no presenta.
• Los sitios de restricción son polimorficos
RFLP
Procedimiento:• Corte con enzimas de restriccion• Separacion por electroforesis• Transferencia de DNA a filtro (Southern)• Hibridación sobre filtro: La sonda utilizada debe
reconocer la secuencia donde se encuentra el sitio de restricción
LA ANEMIA FALCIFORME ES CAUSADA POR UNA MUTACION PUNTUAL
DNA CCT-GAG-GAG GEN NORMAL (Hb A)
Proteína Pro - Glu - Glu
DNA CCT GTG GAG GEN MUTANTE
Proteína Pro - Val - Glu Anemia Falciforme (Hb S)
Enzima de Restricción utilizada : Mst I
RFLP Analysis
RFLP Analysis
PCR – RFLP
1. PCR – se obtiene la secuencia target (OJO: aún cuando se obtenga un producto de tamaño definido, no necesariamente la secuencia de los productos es la misma)
2. Digestión con enzimas de restricción
3. Electroforesis en gel
4. Transferencia e hibridación con sondas específicas si es necesario
RAPD
• Random amplification of Polymorphic DNA
(amplificación al random de DNA polimórfico)• Primers de 10 bases• 1 primer por reacción
RAPD
Template DNA
Los primers se unen a varios sitios en el DNA templado
Sólo cuando los primers se hayan unido en sitios cercanos y estén orientados en direcciones opuestas, ocurrirá la amplificación
RAPD
Template DNA
Primers apuntan hacia afuera, entonces no ocurrirá la amplificación
RAPD
Template DNA
Primers apuntan a la misma dirección, entonces la amplificación no ocurrirá.
RAPD
Template DNA
Primers están muy alejados, entonces la amplificación no ocurrirá.
> 2,000 bases
Template DNA
Los Primers están a una distancia apropiada, ocurrirá la amplificación
100 - 1,500 bases
RAPD
VNTR
• VNTR ( Variable Number of Tandem Repeats): Repeticiones en tandem de número variable.
• Secuencias cortas (10 - 100 bp) repetidas dentro de los sitios de restricción (si el análisis se hace por RFLP), o los sitios donde se anclan los primers (si el análisis es por PCR).
VNTR Analysis
Sitio de restricción
Sitio de restricción
Repeticiones en tandem (Tandem Repeats)
4 repeticiones
9 repeticiones
17 pb
VNTR Analysis
SNPs
SNPs : Single nucleotide polymorphism (polimorfismo dado por la diferencia en un solo nucleótido)
Detección por PCR : primers diseñados con la misma secuencia pero con la ultima base (extremo 3’) cambiada según el polimorfismo que se quiera detectar.
DNA Templado 3´ 5´
5´ 3´ primer
La DNA polimerasa no puede iniciar aquí la extensión de la nueva cadena
SECUENCIAMIENTO DE DNA : Metodo de Sanger (uso de dideoxynucleótidos: ddNTPs)
Figure 7-29a
Se realizan 4 reacciones por separado, los productos de cada tubo se visualizan en gel.
Uso de dideoxynucleótidos en el secuenciamiento marcados con agentes fluorescentes
APLICACIONES
- Análisis evolutivo de especies relacionadas
- Determinación de relaciones de filiación
- Determinación de marcadores asociados con virulencia o alguna caracteristica fenotípica (pero no significa causalidad)
- Determinación de polimorfismos que causan una enfermedad (dependiendo de dónde ocurre el cambio)
+1upstream downstream
GEN
Inicio de Transcripción
pppAAGUCACGUAAAGGGUAUCGACAAUGAAAGCAAU...
Inicio de Traducción
Met-Lys-Ala- -
Región transcrita pero no traducida
5´ UTR (untranslated region)
Región en el DNA no transcrita
Región promotora 5´UTR
Secuencias repetitivas simples
1. DNA satélite: 5-500 pb en tándem (extensiones en el orden de las megabases, ~ 106 pb) Centrómero
2. DNA minisatélite: 5-100 pb en tándem (~ 103-105 pb) Conservado: telómeros
Hipervariable (longitud): cerca de telómeros → identificación de individuos (“fingerprint”)
3. DNA microsatélite: 1-5 pb en tándem (10-40 pb) Distribuidos de manera uniforme Longitud variable → relaciones filogenéticas
Uso de minisatélites hipervariables en laidentificación de individuos
1. Digestión de DNA con enzimas de restricción2. Separación de fragmentos por electroforesis3. Transferencia de DNA a membrana4. Hibridación con sonda con secuencia de minisatélite marcada radioactivamente
Análisis de polimorfismo de tamaño de cromosomas en Leishmania
• Comparación por PFGE del tamaño de cromosomas en cepas y aislamientos de pacientes de diferentes regiones del Perú
• Variación de tamaño por amplificación /eliminación de genes ribosomales repetidos en tándem:
Polimorfismo en cromosoma que contiene los genes ribosomales en Leishmanias del complejo Viannia.
EJERCICIO
Usted desea determinar por PCR si un paciente es portador del gen de la anemia falciforme.
Indique:
a) dónde ubicaría los primers a usarb) cuál sería el procedimiento a seguirc) cómo espera usted que sean los resultados