Metal Binding Reversible method of immobilized enzim

Ani novitasari

Mita maharani bahriah

Nida awalia hanifah

Tiara rismayanti

Vina oktapiani

Gambar 1. Representasi metode Imobilisasi enzim metode reversible  yang berbeda d) adsorpsi e) ionik mengikat

ion logam f) afinitas mengikat dan g) Imobilisasi

Metal Binding /Chelation

Transisi

logam garam atau hidroksida diendapkan pada permukaan 

organik dan terikat dengan kelompok-

kelompok nukleofilik pada matriks. Terutama garam

Titanium dan Zirkonium digunakan dengan metode yang di

kenal sebagai"logam link Imobilisasi"(Cabral, J.M.S. and

Kennedy, J. F, dkk (1991)). 

Garam logam atau hidroksida diendapkan (misalnya,

selulosa, kitin, asam alginat, dan operator berbasis silika)

dengan cara pemanasan atau netralisasi. Faktor sterik

menyebabkan matriks tidak bisa menempati semua posisi

koordinasi logam, oleh karena itu beberapa posisi bebas

untuk berkoordinasi dengan kelompok-kelompok lain dari

enzim.

Logam

ion kemudian terikat oleh koordinasi dan kompleks stabil

terbentuk dapat digunakan

untuk retensi protein. Elusi protein terikat dapat dengan

mudah dicapai

oleh persaingan dengan ligan larut atau dengan

menurunkan pH.

kemudian

diregenerasi dengan mencuci dengan chelator yang kuat

seperti etilena diamina

Asam tetraacetic (EDTA) bila diinginkan. Logam chelated

dukungan tersebut diberi nama

Adsorben IMA Imobilisasi Logam-Ion Affinity (IMA) dan

telah digunakan

ekstensif dalam kromatografi protein (Porath, J. ,dkk.

(1992)).

Pemilihan Bahan Pendukung • Karakteristik dari matriks sangat penting dalam menentukan

kinerja sistem imobilisasi enzim. Sifat bahan pendukung yang ideal, meliputi ketahanan fisik untuk kompresi, hidrofilisitas, inert terhadap enzim yang mudah terderivatisasi, biokompatibilitas, ketahanan terhadap serangan mikroba, dan biaya yang rendah (Gale EF, Epps MR, Biochem J dkk: 1944).

Klasifikasi bahan pendukung

Bahan pendukung dapat diklasifikasikan sebagai bahan organik dan anorganik menurut komposisi kimianya. Yang terdapat pada tabel berikut :

• Karakteristik fisik dari matriks meliputi diameter partikel, sifat, kekuatan mekanik, dan sifat kompresi.

• Ukuran partikel menentukan total luas permukaan dengan demikian sangat mempengaruhi kapasitas pengikatan enzim.

• Karakteristik dari matriks sangat penting dalam menentukan kinerja sistem imobilisasi enzim. Sifat bahan pendukung yang ideal, meliputi ketahanan fisik untuk kompresi, hidrofilisitas, inert terhadap enzim yang mudah terderivatisasi, biokompatibilitas, ketahanan terhadap serangan mikroba, dan biaya yang rendah (Gale EF, Epps MR, Biochem J dkk: 1944).

Imobilisasi Dan Stabilisasi Dari Papain Melalui Keratin Separosa : Cariier Kelat Metal Regenable

Immobilization and stabilization of papain on chelating sepharose: a metal chelate regenerable carrier

Keywords: papain, immobilized metal ion (IMI) carrier, immobilization, thermal stability, regeneration of matrix.

Prinsip dan latar belakang

pasangan kovalen dari enzim dapat memproduksi penurunan aktivitas yang terjadi karena pengaruh dari kondisi pasangan dan perubahan kompormasi dari struktur enzim.ikatan irreversibel dari enzim dengan carrier selama pemasangan kovalen tidak dapat mengalami perbaikan carrier dari kompleks carrier - enzim metode yang dibutuhkan adalah carrier harus lebih mudah diregenerasi dan digunakan tanpa menurunkan hasil imobilisasi.percobaan yang telah dilakukan secara langsung dan sebuah carrier kelat metal regenable telah digunakan dalam imobilisasi papain. imobilisasi ini berdasarkan kemampuan sisi aktif protein dari sistein, histidin dan triptopan untuk mensubtitusi ikatan ligan yang lemah dalam kompleks metal.

BAHAN YANG DIGUNAKAN

papain serbuk telah diperoleh dari sigma chemical company USA , pengkelat separosa yang diproduksi oleh pharmasia biotech, uppsala, swedia. kasein, sistein dan bahan kimia lainnya didapatkan dari lab penelitian mumbai india.

Metode imobilisasi dari papain melalui

pengkelatan metal separosa yang diaktivasi oleh ion Cu2+.

regenerasi matriks dari papain terimobilisasi

reimobilisasi dari papain teregenerasi separosa yang diaktivasi oleh ion Cu2+

pengujian logam enzim

Pembuatan buffer fosfat

Natrium dihydrogen fosfat (NaH2PO4) 0,2 M dibuat dengan melarutkan 27,8 gram natrium dihidrogen fosfat dalam aquades sampai volume larutan 1 L , dalam labu takar.Dinatrium hidrogen fosfat (Na2HPO4) 0,2 M dibuat dengan melarutkan 53,65 gram Na2HPO4 dalam aquades sampai volume larutan 1 L, dalam labu takar.

imobilisasi dari papain melalui pengkelatan metal separosa yang diaktivasi oleh ion Cu2+.

0,5 ml pengkelat separosa + 1 ml

aquades

sentrifigus selam 30 detik + diulang sebanyak 4 kali

cuci seluruh matrik yang telah diisi

dengan ion metal (Cu2+)

stirer pada suhu ruang selama 30 menit yang disentrifugasi sesaat

untuk membuang supernatan.

cuci matriks dengan 1 ml aquades sebanyak 4 kali dengan 1 ml buffer sodium fosfat

pH 8,2 10 mM

matriks ini dicampur dengan 1,5 ml larutan papain (8,9 mg/ml),

stirer pada subu ruangan selama 3 jam

sentrifugasi selama 30 detik dan ambil

supernatan

dicuci kembali dengan 1 ml buffer fosfat pH 8,2, 10mM sampai

tidak terdeteksi aktivitas setelah

pencucian.

regenerasi matriks dari papain terimobilisasi

0,5 ml matriks enzim dalam 2 ml

elusi (0,05 M EDTA dan 0,5M NaCl) selama 1

jam

Cuci dengan 10 mM buffer fosfat

pH 8,2

diresuspensi dalam 0,5 ml

buffer pencuci

Dihasilkan elusi dan matriks tanpa

warna

diulang hingga total empat kali

siklus.

reimobilisasi dari papain teregenerasi separosa yang diaktivasi oleh ion Cu2+

0,2 ml dari regenerasi matriks

(tanpa warna) dicuci dengan 1 ml akuades (sebanyak

tiga kali).

buang supernatan dan campur matriks

dengan 0,4M CoCl2 pada volume yang sama (0,2 ml).

larutan distirer dalam suhu ruang selama 30 menit,

disentrifugasi, dan buang supernatan.

matrik dicuci dua kali dengan 1 ml akuades dan 10

mM buffer fosfat pH 8,2.

keseluruhan matrik disuspensi dalam

1,0 ml larutan papain (8,9 mg/ml).

Pengujian Logam Enzim• aktivitas larutan papain ditentukan dengan

menggunakan kasein sebagai substrat pada suhu 37C dan ph 8,2.• aktivitas enzim papain terimobilisasi secara

berkelanjutan selama bereaksi dalam stirer. • satu unit dari aktivitas enzim adalah jumlah dari

enzim yang menghasilkan larutan TCA Peptida atau asam amino yang memberikan warna biru yang setara dengan 0,5 µg pirosin permenit pada 30C.

Imobilisasi Dan Reimobilisasi Papain Dalam Pengkelat Separosa Yang Diaktivasi Oleh Ion Cu2+

Hasil yang ditampilkan ini adalah hasil penghitungan mean dan standar deviasi dari tiga penyiapan imobilisasi yang berbeda. hasil dari aktivitas dan imobilisasi dihitung dari nilai mean.

Hasil reimmobilisasi dari papain pada pengkelat separosa yang diaktivasi oleh Co2+ yang telah diregenerasi.

inaktivasi termal pada larutan papin dan papain terimobilisasi

Stabilitas termal dari larutan dan papain terimobilisasi yang ditentukan setelah inkubasi pada suhu 65◦C, pada durasi yang berbeda. aktivitas papain ditentukan setelah inkubasi berakhir dibawah kondisi standar. (o) larutan papain, (●) papain terimobilisasi.

Hasil dan Diskusi dalam tabel 1. diterangkan dalam tabel aktivitas dan hasil imobilisasi adalah 78% dan 98%, yang secara signifikan lebih tinggi ketika dibandingkan dengan ikatan kovalen papain (Zhuang and Butterfield, 1992). aktivitas dan hasil imobilisasi dari papain berikatan kovalen hanya 6% dari 10,5% dalam penelitian yang dilakukan oleh Zhuang and Butterfield, 1992.enzim papain terimobilisasi menunjukkan sebuah tanda peningkatan aktivitas setelah 1 jam inkubasi pada suhu 65C ketika pasangan larutan hampir 75% hilang dari aktivitas sebenarnya. Stabilitas yang lebih tinggi pada papain IMI yang berikatan dapat mengurangi autolisis dari enzim yang tetap dalam pendukung. penjelasan kemungkinan yang kedua yang berhubungan dengan kekakuan dari konformasi molekul enzim yang dihasilkan dari matriks yang berikatan.