ADN recombinante

Dr. Luis A. Mora B.Cátedra de BioquímicaUCIMED

IMPORTANCIA BIOMÉDICA

Diagnóstico Medicina forense Terapia génica Producción de medicamentos

insulina

factores de la coagulación

activador del plasminógeno

hormona de crecimiento

Producción de vacunas

Antihepatitis B

IMPORTANCIA BIOMÉDICA

·Diagnóstico de enfermedades genéticas con cambios en la secuencia de ADN

(base molecular de la enfermedad)

• Hipercolesterolemia familiar

• Drepanocitosis

• Talasemias

• Fibrosis Quística

• Distrofia Muscular

ESTRUCTURA MOLECULAR DEL ADN

Forma (doble hélice de nucleótidos)

Componentes (bases nitrogenadas, azúcares, enlaces

fosfodiéster)

Apareamiento de las bases (A:T, G:C)

Pares de bases en genoma haploide humano (3x109)

Longitud de genes (3x103)

Empacamiento del ADN (histonas)

ESTRUCTURA MOLECULAR DEL ADN

EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN

Replicación

Transcripción (Exones e intrones)

Traducción

Síntesis de proteínas

EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Aislamiento del ADN

Desnaturalización

Manipulación

Endonucleasas

Polimerasas

Formación de moléculas quiméricas

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:

endonucleasas

Endonucleasas:

enzimas que cortan enlaces fosfodiéster del material genético a partir de

una secuencia de nucleótidos que reconocen (diana de restricción ) ;

estos tienen entre 4 y 12 pb.

Cortan ADN de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas

(se leen igual en ambas direcciones). Esto produce dos extremos: romos

y cohesivos o escalonados, unidos por ligasas.

No pueden cortar ADN metilado.

Proceden de organismos procarióticos (bacterias) con capacidad de

metilar su ADN, lo cual sirve para distinguir entre el ADN extraño y el

ADN propio.

Isoesquizómeros:

de diferentes especies

idéntica diana

dejan el mismo extremo cohesivo pero no cortan en el mismo

sitio.

Arber, Nathans y Smith, 1978, Nobel de Medicina. E. coli. Insulina

humana.

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE:

endonucleasas

Las enzimas de restricción al cortar el ADN pueden producir 2 tipos de cortes: 1. Cohesivos o pegajosos:   GAATTC GGATCC AAGCTT CTTAAG CCTAGG AACGAA EcoRI BamHI HindIII

2.  Abruptos:   AATATT CCCGGG TTATAA GGGCCC  SspI SmaI

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Tipo 1: Restricción (cortan) y modificación (metilan). o cortan al azar en sitios distinto (corriente arriba o abajo) o dejan extremos cohesivoso Necesitan ATP o Necesitan de S adenosil metionina (SAM) y Mg+2 como cofactores.

Tipo 2: Sólo restricción. o otras enzimas metilan. o cortan de manera consistente y predecible en el sitio que reconocen o muy

cerca de él. o son muy utilizadas en clonación (recuperan secuencias conocidas)o sólo requieren Mg+2 como cofactor.  o no necesitan ATP.

Tipo 3: Enzima oligomérica (realizan todas las actividades)o cortan de 25 a 27 pb lejos del sitio restrictivo, dejando extremos cohesivos. o requieren dos secuencias de reconocimiento de orientación opuesta en la

misma cadena de ADN. o Necesitan ATP, Mg y SAM.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:

endonucleasas

Nomenclatura

El nombre se asigna según el origen bacteriano. Consiste en:

1)Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo: Escherichia coli (Eco)

2) La cepa o estirpe si la hubiere. ( EcoR, aislada de la cepa RY13 de E. coli )

3) En números romanos para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de una misma especie. No confundir con el tipo o clase de enzima.

4) Todas deberían llevar delante una R de restricción o M de metilasa según la función pero usualmente se omite.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

DefiniciónVectores

PlásmidosbacterianosADN circular de doble bandaInserción de 6-10 Kb

FagosviralesADN lineal de doble bandainserción de 10-20 Kb

CósmidosSon plásmidos con características de fagosADN circular de doble bandainserción de 35-60 Kb

YACSon cromosomas artificiales de levaduras

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE:

vectores

Propiedades de los vectores

Replicaciones independientes del ADN de la célula hospedera

Secuencias de ADN conocidas

Copias únicas

Cromosoma más pequeño que el del hospedero

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Definición:

1. m. Biol. Conjunto de células u organismos genéticamente idénticos,

originado por reproducción asexual a partir de una única célula u

organismo o por división artificial de estados embrionarios iniciales.

2. m. Biol. Conjunto de fragmentos idénticos de ácido desoxirribonucleico

obtenidos a partir de una misma secuencia original.

CLONACIÓN

CLONACIÓN

Gracias