Reparacion ADN

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Revue gnrale

Rparation des cassures double-brin de lADN, un mcanisme peut en cacher un autre : la ligature dextrmits non homologues alternativeDouble Strand Break Repair, one mechanism can hide another: Alternative non-homologous end joiningE. Rass a,b,1 , A. Grabarz a,b,1 , P. Bertrand a,b, , B.-S. Lopez a,b,CNRS, UMR217, 18, route du Panorama, 92265 Fontenay-aux-Roses, France Direction des sciences du vivant, commissariat lnergie atomique (CEA), institut de radiobiologie cellulaire et molculaire, 18, route du Panorama, 92265 Fontenay-aux-Roses, Franceb a

i n f o

a r t i c l e

r s u m Les cassures double-brin de lADN sont des lsions ltales majeures induites par les radiations ionisantes ou par des stress cellulaires endognes ; elles peuvent tre source dinstabilit gntique. Deux mcanismes entrent en comptition pour la rparation des cassures double-brin : la recombinaison homologue et la ligature dextrmits non homologues (non-homologous end joining, NHEJ). La recombinaison homologue ncessite des squences dADN homologue et commence par une rsection dADN simple-brin ; plusieurs tudes rcentes ont identi les principaux acteurs de cette rsection. Au contraire, la ligature dextrmits non homologues ne ncessite pas de squences homologues. Rcemment, un mcanisme de rparation des cassures double-brin ne ncessitant pas de longues homologies de squence, mais indpendant de la voie canonique de la ligature dextrmits non homologues a t rvl : la ligature dextrmits non homologues alternative. La ligature dextrmits non homologues alternative est trs mutagne, associant des dltions aux jonctions de rparation et lutilisation frquente de microhomologies distantes de la cassure double-brin. Cependant, la ligature dextrmits non homologues alternative commence aussi par une rsection dADN simple-brin. Cette revue prsente les dernires donnes sur la rsection dADN simple-brin, sur la ligature dextrmits non homologues alternative et enn discute la dlit de la ligature dextrmits non homologues. En effet, la ligature dextrmits non homologues canonique napparat pas comme un mcanisme intrinsquement mutateur, mais au contraire comme un mcanisme conservatif, la structure des extrmits de lADN dictant la qualit de la rparation (la ligature dextrmits non homologues alternative pourrait tre responsable de la mutagense prcdemment attribue la ligature dextrmits non homologues canonique). Lexistence de ce nouveau mcanisme de rparation des cassures double-brin est donc prendre en compte dans les stratgies de radiosensibilisation des cellules an doptimiser lefcacit de la radiothrapie. 2011 Socit franaise de radiothrapie oncologique (SFRO). Publi par Elsevier Masson SAS. Tous droits rservs.

Historique de larticle : Recu le 22 novembre 2010 Recu sous la forme rvise 23 mai 2011 Accept le 25 mai 2011 Disponible sur Internet le xxx Mots cls : Rparation des cassures double-brin de lADN Ligature dextrmits non homologues NHEJ Recombinaison homologue Instabilit gntique Mutagense

a b s t r a c tKeywords: DNA double-strand break repair Non-homologous end joining NHEJ Homologous recombination Genetic instability Mutagenesis

DNA double strand breaks are major cytotoxic lesions encountered by the cells. They can be induced by ionizing radiation or endogenous stress and can lead to genetic instability. Two mechanisms compete for the repair of DNA double strand breaks: homologous recombination and non-homologous end joining (NHEJ). Homologous recombination requires DNA sequences homology and is initiated by single strand resection. Recently, advances have been made concerning the major steps and proteins involved in resection. NHEJ, in contrast, does not require sequence homology. The existence of a DNA double strand break repair mechanism, independent of KU and ligase IV, the key proteins of the canonical non homologous end joining pathway, has been revealed lately and named alternative non homologous end joining. The hallmarks of this highly mutagenic pathway are deletions at repair junctions and frequent use of distal microhomologies. This mechanism is also initiated by a single strand resection of the break. The aim of

Auteurs correspondants. Adresses e-mail : [email protected] (P. Bertrand), [email protected] (B.-S. Lopez). 1 Participation quivalente cette revue. 1278-3218/$ see front matter 2011 Socit franaise de radiothrapie oncologique (SFRO). Publi par Elsevier Masson SAS. Tous droits rservs. doi:10.1016/j.canrad.2011.05.004

Pour citer cet article : Rass E, et al. Rparation des cassures double-brin de lADN, un mcanisme peut en cacher un autre : la ligature dextrmits non homologues alternative. Cancer Radiother (2011), doi:10.1016/j.canrad.2011.05.004

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this review is rstly to present recent data on single strand resection, and secondly the alternative NHEJ pathway, including a discussion on the delity of NHEJ. Based on current knowledge, canonical NHEJ does not appear as an intrinsically mutagenic mechanism, but in contrast, as a conservative one. The structure of broken DNA ends actually dictates the quality repair of the alternative NHEJ and seems the actual responsible for the mutagenesis attributed beforehand to the canonical NHEJ. The existence of this novel DNA double strand breaks repair mechanism needs to be taken into account in the development of radiosensitizing strategies in order to optimise the efciency of radiotherapy. 2011 Socit franaise de radiothrapie oncologique (SFRO). Published by Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

1. Introduction La coordination dun rseau complexe de voies mtaboliques permet dassurer la prennit du patrimoine gntique au cours des divisions cellulaires. En effet, lADN, support de notre information gntique, est sans cesse soumis des stress susceptibles de lendommager. Des facteurs endognes comme les erreurs ou arrts de fourche de rplication de lADN, les stress oxydatifs issus du mtabolisme cellulaire ou des facteurs exognes comme les radiations ionisantes, les rayonnements ultraviolets (UV), les agents chimiques, peuvent gnrer des mutations ou dgradations de bases, des pontages de lADN, des cassures simple- ou double-brin de lADN. Ces diffrents types de dommages sont pris en charge par

un mcanisme de rparation spcique [1]. Cependant, certaines redondances mcanistiques existent et certains acteurs molculaires agissent dans plusieurs voies de rparation. La Fig. 1 prsente schmatiquement les diffrentes voies de rparation. Seuls les mcanismes de rparation des cassures double-brin, lsions les plus toxiques des radiations ionisantes, seront dtaills dans les paragraphes suivants. La signalisation des dommages aboutit larrt transitoire du cycle cellulaire (checkpoint) pour permettre la rparation avant les phases critiques du cycle (la rplication et la mitose). Si la cellule est dborde par le nombre de dommages, celle-ci sera alors limine par la mort cellulaire programme. Ces stratgies permettent dviter la propagation de cellules porteuses de dommages. Des

Fig. 1. Diffrentes lsions et mcanismes chargs de leur rparation. Les diffrentes sources (endognes ou exognes) de dommages de lADN et les diffrents types de lsions ainsi que leurs mcanismes de rparation sont schmatiss. La recombinaison homologue est implique dans la rparation des cassures double-brin. Avec les protines de la voie Fanconi (non schmatises ici), la recombinaison homologue joue un rle crucial dans le redmarrage des fourches de rplication et la rparation des pontages de lADN. La religature dextrmits non-homologues (NHEJ) permet la rparation des cassures double-brin. Lexcision de bases (BER) permet de rparer les dommages de bases tels que les bases oxydes ou les sites abasiques et aussi les cassures simple-chane. La rparation par excision de nuclotide (NER) limine les lsions bloquantes (tels que les dimres de thymine ou les pontages intra ou inter-brin). Le systme de rparation des msappariements (MMR) est impliqu dans la rparation des bases mal apparies lors de la rplication (insertion errone de nuclotide ou glissement ( slippage ) de polymrase). La synthse trans-lsionnelle impliquant des polymrases mutagnes, connue pour tre implique dans le dveloppement tumoral, nest pas reprsente ici. Les principales protines retrouves dcientes dans les cellules cancreuses et qui sont associes la tumorignse sont entoures en rouge.



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dfauts dans la signalisation et la rparation des dommages sont associs au dveloppement dinstabilit gntique et de cancer ce qui montre limportance de lexistence dun rseau vigilant de surveillance des dommages lADN. Des mutations dans les gnes de rponse aux dommages (DDR: DNA damage response) prdisposent des cancers familiaux (par exemple : mutations dans BRCA1 et BRCA2 dans les cancers du sein et de lovaire) et causent une varit de syndromes associs une instabilit gntique et une prdisposition tumorale. De telles mutations affectent les senseurs des dommages (NBS1 : syndrome de Nijmegen), les kinases de la signalisation (ATM : ataxie tlangiectasie), les effecteurs (p. 53 : syndrome de Li-Fraumeni) ou la rparation elle-mme (mismatch repair [MMR] : cancer colorectal non-polyposique ; nucleotide excision repair [NER] : xeroderma pigmentosum ; rparation des pontages de lADN : anmie de Fanconi). Des mutations dans 11 gnes diffrents prdisposent au cancer du sein. Il est important de souligner que dix dentre eux sont directement impliqus dans la rponse aux dommages de lADN (le 11e , phosphatase and tensin homolog [PTEN]), contrle galement indirectement la rponse aux dommages de lADN). Des altrations somatiques (gntiques ou pigntiques) de la machinerie de rponse aux dommages de lADN peuvent galement favoriser la promotion tumorale et la progression de la maladie cancreuse. En outre, la relocalisation nuclaire des protines de rparation au niveau des dommages reprsente une rgulation importante du maintien de la stabilit gntique. titre dexemple, la surexpression doncogne telle que la kinase Akt ou le facteur anti-apoptotique Bcl-2 conduit une squestration cytoplasmique de la protine BRCA1, aboutissant un dfaut de la rparation des cassures double-brin [2,3]. Cependant, une dcience dans les systmes de rparation peut aussi reprsenter le talon dAchille des cellules cancreuses et donne lopportunit dintervention thrapeutique dirige spciquement contre la cellule cancreuse et limitant ainsi la toxicit du tissu normal. Notre comprhension un niveau molculaire prcis des voies de rparation, en particulier des cassures double-brin de lADN, devrait permettre doptimiser les stratgies thrapeutiques. La cassure double-brin de lADN est une lsion particulire qui se trouve au cur de nombreuses questions concernant lquilibre stabilitvariabilit du gnome. Si elle nest pas la lsion la plus frquente induite par les radiations ionisantes, la cassure double-brin est la plus toxique ; de plus, elle peut gnrer de nombreux rarrangements avec les consquences physiologiques potentielles qui en dcoulent (initiation et/ou progression tumorale, snescence, malformations congnitales, etc.). En plus des stress exognes provoquant des cassures doublebrin, des stress endognes peuvent aussi aboutir la formation de cassure double-brin. Par exemple, au cours de la duplication du matriel gntique, larrt prolong des fourches de rplication de lADN conduit la formation de cassures double-brin de lADN [4]. Les fourches de rplication de lADN peuvent tre spontanment bloques par une varit de stress endognes pouvant provenir de rgions porteuses de structures dADN difcile rpliquer, dhybrides ADN/ARN, du mtabolisme endogne des cellules gnrant des bases oxydes dont certaines bloquent la progression de la fourche de rplication [5]. On peut souligner que la prsence de cassure double-brin et lactivation de la rponse aux dommages de lADN spontans ont t observes dans des cellules un stade prcancreux ; cette activation de la rponse aux dommages de lADN est interprte comme le rsultat dun stress rplicatif spontan [6,7]. Cela montre limportance des dommages spontans endognes, et de la rponse aux dommages de lADN aux tapes initiales du dveloppement tumoral. Les cassures double-brin peuvent tre galement utilises par la cellule pour gnrer de la variabilit gntique, par exemple lors de la miose, permettant la sgrgation rductionnelle des

chromosomes et le brassage des allles, ou lors de la recombinaison V(D)J, ainsi que de la commutation isotypique (CSR pour class switch recombination), permettant dtablir le rpertoire immunitaire dans toute sa diversit. Dans ces cas, la production des cassures double-brin est sous le contrle de la cellule qui utilise ses propres enzymes pour gnrer des cassures double-brin contrles. Les mcanismes de rparation sont alors identiques pour rparer les cassures double-brin physiologiques et les cassures double-brin induites par les stress spontans ou induits. Une rgulation trs prcise de la rparation des cassures double-brin doit donc uvrer pour contrler lquilibre stabilit-diversit gntique, en vitant linstabilit gntique. Deux grands mcanismes entrent en comptition pour la rparation des cassures double-brin : la recombinaison homologue et la ligature dextrmits non homologues (non-homologous end joining [NHEJ]) (Fig. 2). La recombinaison homologue utilise une squence homologue intacte pour rparer la cassure double-brin et est initie par une rsection dADN simple-brin (Fig. 1A). Au contraire, la ligature dextrmits non homologues ne ncessite pas dhomologie de squence et permet la ligature des extrmits dADN (Fig. 2B). La recombinaison homologue a longtemps t considre comme un mcanisme dle de rparation (car le brin ls recopie une squence homologue) et la ligature dextrmits non homologues un mcanisme indle de rparation des cassures double-brin. Cependant, la dcouverte dun nouveau mcanisme de rparation des cassures double-brin, la ligature dextrmits non homologues alternative (alternative non-homologous end joining [ANHEJ]) remet en question ce dernier point. En effet, le A-NHEJ est un mcanisme trs mutateur de rparation des cassures double-brin et pourrait donc tre responsable ou en partie de la mutagense prcdemment attribue au mcanisme canonique de la ligature dextrmits non homologues (C-NHEJ, correspondant la voie KU/XRCC4). La ligature dextrmits non homologues alternative partage avec la ligature dextrmits non homologues canonique le fait que de longues homologies de squences ne sont pas ncessaires pour la ligature des extrmits dADN. Le A-NHEJ partage avec la recombinaison homologue le fait quil soit lui aussi initi par une rsection simple-brin de lADN. Par un curieux phnomne de concidence, la caractrisation molculaire du A-NHEJ sest faite concomitamment dans le temps, mais indpendamment, de celle de la rsection lie la recombinaison homologue. Dans un premier temps, nous prsenterons les donnes rcentes concernant la rsection dADN simple-brin et dans un deuxime temps nous prsenterons le A-NHEJ.

2. Rsection linitiation de la recombinaison homologue Des tudes rcentes chez la levure Saccharomyces cerevisiae montrent que la rsection ncessaire linitiation du processus de la recombinaison homologue se fait en deux tapes. Une premire tape de rsection limite fait intervenir le complexe protique Mre11, Rad50 et Xrs2 (MRX) et la protine Sae2. Ces protines liminent lextrmit de la cassure double-brin quelques dizaines de nuclotides. Lextrmit simple-brin forme est alors un substrat prfrentiel pour lexonuclase Exo1 ou pour le couple Sgs1 (hlicase RecQ)/ endonuclase DNA2. Celles-ci ralisent une rsection plus processive permettant ainsi la production dun ADN simple-brin 3 sortant qui envahira la molcule homologue intacte ncessaire la rparation par recombinaison homologue [8]. Chez les mammifres des tudes suggrent un modle similaire deux tapes, cependant le mcanisme de la deuxime tape de rsection reste tre prcis [9]. Lors de la recombinaison homologue chez les mammifres, le rle du complexe MRN (pour Mre11, Rad50, Nbs1, lhomologue de XRS2 de levure) linitiation de la rsection est bien tabli. La protine CtIP (homologue de Sae2 de




Fig. 2. Rparation des cassures double-brin. La recombinaison homologue (A) utilise une squence homologue intacte pour rparer la cassure double-brin et est initie par une rsection dADN simple-brin. Le modle propose aujourdhui que le complexe MRN, en association avec CtIP, initie la rsection (tape 1), ce qui permet le recrutement dautres nuclases (comme Exo1), responsables de la formation dextrmits sortantes simple-brin (tape 2). Ces rgions simple-brin sont couvertes par la protine RPA. BRCA2 dplace RPA et charge la protine Rad51. Linvasion du brin ls de la squence homologue est mdie par le lament dADN simple-brin couvert de Rad51 (tape 3). Selon le sens de rsolution des intermdiaires par les rsolvases, la conversion gnique est associe ou non un crossing-over. La ligature dextrmit non-homologue (NHEJ) (B) ne ncessite pas dhomologie de squence. Les extrmits dADN sont reconnues par lhtrodimre Ku70/Ku80 et la sous-unit catalytique ADN-PKcs. Lactivation de celle-ci permet le recrutement du complexe XRCC4/ADN ligase IV aid par Cernunnos/XL-F. Une prparation des extrmits par la protine Artmis et lintervention de polymrases peuvent tre ncessaires avant ltape de ligature.

levure interagit avec le complexe MRN et stimule lactivit endonuclasique de MRE11 in vitro. La rsection constitue un risque dinstabilit gntique et de ce fait une ne rgulation de la rsection est ncessaire. Celle-ci est favorise pendant la phase S du cycle cellulaire an de permettre la recombinaison homologue, ncessaire au redmarrage des fourches de rplication bloques. En phase S du cycle cellulaire, la protine CtIP est phosphoryle par les CDK kinases, ce qui favorise son interaction avec BRCA1 et le complexe MRN [9]. Lassociation avec BRCA1 et MRE11 permet le recrutement de CtIP aux sites de dommages et une rsection efcace de lADN. Par ailleurs, des protines comme 53BP1, en se xant aux extrmits, protgeraient celles-ci de la rsection. Des donnes trs rcentes montrent le rle essentiel de BRCA1 dans la recombinaison homologue, en liminant 53BP1 des extrmits et permettant linitiation de la rsection et ainsi favoriser linitiation de la recombinaison homologue [1012]. En accord, avec le modle deux tapes, cette premire initiation de la rsection est poursuivie par laction des nuclases et hlicases. Limplication de lexonuclase Exo1 dans la recombinaison homologue a t montre par Bolderson et al. [13]. Une dpltion dExo1 dans les cellules possdant un substrat

de recombinaison homologue intgr de manire stable dans le gnome conduit une baisse de lefcacit de la recombinaison homologue. La phosphorylation de cette protine par la kinase ATM semblerait tre implique aussi dans lassemblage efcace de RPA et du lament Rad51 au niveau de lADN simple-brin. Une tude trs rcente montre aussi, que le recrutement dExo1 est dpendant des protines MRE11 et CtIP et que la protine CtIP est capable dinhiber lactivit exonuclasique de Exo1 in vitro [14]. Il existe une seule RecQ hlicase chez la levure : Sgs1. BLM (mute dans le syndrome de Bloom) est lune des cinq hlicases de type RecQ prsentes chez lhomme. Limplication de BLM est aussi suggre dans le processus de la rsection, mais ces donnes sont sujettes controverse. Lune des tudes montre que BLM et Exo1 agiraient dans des voies parallles mais indpendantes [15]. Dautres tudes montrent une interaction spcique entre ces deux protines. BLM serait alors capable de stimuler directement lactivit exonuclasique de Exo1 in vitro, ce qui suggre plutt leur coopration lors de la rsection [16]. Ce rsultat na pas t conrm par une tude biochimique ralise plus rcemment par le mme groupe [17]. Dans cette tude, BLM serait implique dans deux mcanismes indpendants de la rsection de lADN. Dune




part, BLM interagirait directement avec Exo1, cela augmenterait lafnit de cette dernire pour lADN, mais pas directement son activit nuclasique. Dautre part, un mcanisme parallle impliquant BLM et ADN2 pourrait tre mis en uvre. BLM droulerait la double hlice de lADN an de permettre la rsection par ADN2. La protine RPA permettrait ici dassurer la directionnalit correcte de la rsection dans le sens 5-3 (ADN2 possdant la fois une activit 53 et 35). Toutefois, il convient de rester prudent sur les conclusions de ces tudes in vitro ; en effet, il est important de noter que le rle actif de BLM dans linitiation de la recombinaison homologue nest pas cohrent avec le phnotype hyper-recombinogne des cellules de patients atteints de syndrome de Bloom (dcience dans BLM).

in vitro, il tait object que ces rsultats pouvaient tre lis lutilisation dextraits acellulaires, ncessitant la destruction de lorganisation cellulaire ; dautres tudes mesuraient la ligature de plasmides pisomiques, donc hors du contexte chromosomique (de plus dans la majorit des cas, aprs transfection, les plasmides sont rarrangs dans le cytoplasme avant datteindre le noyau) ; enn la mesure des cassures double-brin en lectrophorse en champs puls ncessitent des irradiations des doses produisant un nombre de cassures totalement incompatibles avec la survie de la cellule. La question de la relevance physiologique de telles observations pouvait donc tre pose. Ces ambiguts ont t leves dans la levure et dans les cellules de mammifres, par lutilisation de substrats intrachromosomiques, dans lesquels une cassure double-brin unique (donc naffectant pas la viabilit cellulaire) tait cible laide dune mganuclase [29,30]. De plus, les stratgies utilises ont permis la caractrisation du mcanisme un niveau nuclotidique prcis. Dans la levure, un mcanisme indpendant de KU permet la ligature de cassure double-brin cres par lendonuclase HO de levure [29]. Ce mcanisme a t nomm microhomology-mediated end-joining (MMEJ). Dans des lignes de hamster dcientes pour KU80, ces substrats intrachromosomiques ont permis de mettre en vidence lexistence dune voie trs efcace de rparation ne ncessitant pas dhomologie de squence et indpendante de KU (donc indpendante de la ligature dextrmits non homologues canonique) ; la dlit est en revanche svrement affecte. Lanalyse des cicatrices de rparation a en effet montr que la ligature se fait en gnrant des dltions et implique majoritairement des microhomologies en positions distales par rapport la cassure double-brin ; en revanche, la ligature dextrmits non homologues canonique peut hybrider des nuclotides prsents au site mme de la cassure double-brin [30]. En revanche, dans des cellules mutantes pour XRCC4, lefcacit globale de ligature des extrmits dADN est fortement affecte ( la fois le C-NHEJ et le A-NHEJ sont diminus), bien quune activit rsiduelle de ligature dextrmits non homologues alternative signicative persiste. Nanmoins, les cicatrices de rparation montrent des prols identiques dans les mutants xrcc4 et les mutant ku [31]. Une tude parue quelque temps aprs a reproduit les mmes rsultats dans des cellules de souris [32]. Ces donnes qui montrent que le dfaut dXRCC4 affecte plus fortement lefcacit de ligature que le dfaut de KU, peuvent donc expliquer la diffrence de phnotype entre les souris invalides pour KU ou pour XRCC4. En effet, linvalidation de XRCC4 conduit un phnotype plus svre (ltalit embryonnaire) que linvalidation de KU (viable). la vue des rsultats obtenus par ces diverses tudes, le mcanisme de la ligature dextrmits non homologues a t rednie en deux grandes voies [30,31] : le NHEJ canonique (C-NHEJ) qui dpend des complexes KUADNPKC et XRCC4/ADN ligase IV et qui est conservatif ; le NHEJ alternatif (A-NHEJ) (qui intgre le B-NHEJ) qui ne dpend pas des acteurs de la voie canonique et qui est trs indle. Le A-NHEJ pourrait rassembler plusieurs mcanismes diffrents. Cependant, les donnes obtenues la jonction de rparation permettent de proposer que le NHEJ alternatif est initi par une nuclase ou une hlicase an de gnrer des extrmits dADN simple-brin (Fig. 3). Ces activits permettent de dcouvrir des microhomologies de part et dautre de la cassure, dont lhybridation permettrait la ligature de lADN. En absence de KU, les extrmits dADN sont immdiatement accessibles ces activits ce qui explique lefcacit du A-NHEJ dans un mutant ku . En revanche,

3. Un nouveau mcanisme de rparation des cassures double-brin, la ligature dextrmits non homologues alternative (alternative non homologous end joining) Plusieurs tudes ont aujourdhui dmontr lexistence dun mcanisme qui peut se mettre en place en labsence des facteurs cls de la ligature dextrmits non homologues canonique. Ces observations ont t ralises dans diffrents organismes (de la bactrie aux mammifres) et par lutilisation de diffrents systmes exprimentaux. Ce mcanisme de la ligature dextrmits non homologues alternative la voie canonique a t nomm par les diffrents auteurs : backup non-homologous end joining (B-NHEJ), microhomology mediated end-joining (MMEJ) ou encore micro-single strand annealing ( -SSA du sa similarit avec le mcanisme de rparation des cassures double-brin par SSA). Par un souci de clart, nous avons nomm ce mcanisme qui ne ncessite pas la voie canonique : ligature dextrmits non homologues alternative (A-NHEJ).

3.1. Identication et caractristiques de la ligature dextrmits non homologues alternative Diffrentes tudes avaient suggr lexistence dune activit de ligature dextrmit dADN double-brin, en labsence des protines cls de la ligature dextrmits non homologues, aussi bien chez la levure que dans des cellules de hamster ou de souris, ou in vitro dans des extraits acellulaires ou dufs de xnope [1823]. Les donnes divergent cependant entre ces diffrents systmes quant lefcacit et la dlit de la ligature. Plus particulirement, une tude in vitro a suggr que la ligature dextrmits non homologues alternative la voie canonique pourrait dpendre de lutilisation de microhomologies (alignement de deux quatre nuclotides) situes de part et dautre de la cassure double-brin [19]. En utilisant llectrophorse en champs puls (PGFE), une tude suivante a mesur la rparation des cassures double-brin radioinduites. des doses comprises entre 10 et 60 Gy, la rparation des cassures double-brin est efcace mais beaucoup plus lente dans des cellules humaines dcientes pour ADN-PKCs [24]. Cette activit de ligature en labsence de ADN-PKCs a t appele B-NHEJ. Cette voie de rparation a une cintique plus lente que la ligature dextrmits non homologues canonique [24]. Par ailleurs, la prsence de KU semble favoriser la ligature dextrmits non homologues canonique au dtriment de la voie alternative [2527]. Enn, on peut noter que lexistence de cette voie alternative ne peut tre rduite la rparation dun faible nombre de cassures puisque la rparation de cassure double-brin en rponse aux radiations ionisantes est encore efcace en absence de KU ou de ADN ligase IV bien quelle soit rduite [28]. Cependant lexistence de la ligature dextrmits non homologues alternative dans des cellules vivantes restait conteste :




dans un mutant xrcc4 , le C-NHEJ ne peut aller son terme mais la prsence du KU aux extrmits dADN inhibe galement linitiation du A-NHEJ, ce qui explique la faible efcacit globale de ligature dextrmits double-brin dans un mutant xrcc4 [31]. la mme priode, deux tudes chez la levure ont permis darriver aux mmes conclusions que chez les mammifres, concernant la ligature dextrmits non homologues alternative [33,34]. Enn, il faut souligner deux caractristiques importantes de la ligature dextrmits non homologues : le C-NHEJ ainsi que le A-NHEJ sont oprationnels tout au long du cycle cellulaire, mais la rparation est moins dle au cours de la phase S [35] ; si en absence de KU le A-NHEJ est trs efcace, dans une cellule sauvage, il ne reprsente que 10 % des vnements totaux de ligature dextrmits double-brin [30,31]. Lexistence du NHEJ alternatif a t conrme dans des modles murins invalids pour la XRCC4 ou ligase IV, dans les cellules de patient dcient pour la ADN ligase IV, et dans des mcanismes physiologiques, comme la commutation isotypique ou la recombinaison V(D)J [3638]. Enn, un mcanisme de type de A-NHEJ a rcemment t dcrit dans la bactrie qui serait impliqu dans le transfert horizontal dinformation gntique [39], attestant de la conservation volutive du NHEJ alternatif. 3.2. Les acteurs de la ligature dextrmits non homologues alternative chez les mammifres partir de plasmides linariss et dextraits de cellules humaines, des tudes ont montr limplication de poly (ADP-ribose)

polymerase 1 (PARP1), de XRCC1/ADN ligase III et PNK dans le A-NHEJ [23,40]. Par ailleurs, les auteurs ont galement propos lexistence dune comptition pour la liaison des extrmits entre KU et PARP1 [28]. Enn, il semble que la voie de NHEJ alternatif dpendante de PARP1 puisse dpendre de la composition en nuclotides des extrmits [41]. Plus rcemment une tude de la commutation isotypique chez la souris a suggr que PARP1 favorise lutilisation de microhomologies ce qui est cohrent avec limplication de PARP1 dans le NHEJ alternatif [42]. Dans des cellules de hamster dcientes pour ERCC1, XRCC3, XRCC2, XRRC8 ou XRCC1, il ny a pas de diffrence de lutilisation de microhomologies pour la ligature en comparaison aux cellules sauvages [43]. Selon cette tude, ces protines ne seraient donc pas impliques dans le NHEJ alternatif. Enn, avec des substrats intrachromosomiques dans des cellules de mammifres, il a t montr que CtIP stimule la ligature dextrmits non homologues alternative alors que ni RAD52, ni ERCC1, ni RAD51 ne seraient ncessaire la ligature dpendante de microhomologies [26]. Le modle de ligature dextrmits non homologues alternative prdit une initiation par une rsection dADN simple-brin (Fig. 3). Le complexe MRX est propos pour intervenir lors de la rsection de la cassure double-brin au cours du NHEJ alternatif chez la levure. De plus lactivit de MRE11 a t montr comme tant ncessaire pour initier la rsection dans les tapes prcoces de la recombinaison homologue [44]. Limpact de MRE11 et du complexe MRN (MRE11/RAD50/NBS1) sur le NHEJ a t abord simultanment par plusieurs laboratoires. Les donnes des diffrents laboratoires, utilisant diffrents systmes, saccordent pour attribuer un rle MRE11 la fois dans le C-NHEJ et dans le A-NHEJ, en association avec CtIP ; cependant, lactivit nuclase de MRE11 favorise le A-NHEJ [4548]. Enn le traitement des cellules avec la MIRIN, un inhibiteur de MRE11, sensibilise aux radiations ionisantes, non seulement les cellules sauvages mais galement les cellules dfectives en KU80, montrant ainsi limpact du A-NHEJ dans la rponse des cellules aux radiations ionisantes [45]. Ces donnes ont permis de proposer un modle pour lorganisation squentielle des diffrents mcanismes de rparation des cassures double-brin (Fig. 4) [45].

4. Fidlit de la ligature dextrmits non homologues canonique et de la ligature dextrmits non homologues alternative Dans de nombreuses publications, la ligature dextrmits non homologues est gnralement qualie de mcanisme indle de rparation. Les travaux rcents mentionns plus haut ont montr que cette assertion est une surinterprtation car ils concluent que le C-NHEJ est un mcanisme conservatif alors que le A-NHEJ est un mcanisme mutagne de rparation. En effet, linitiation du ANHEJ par une rsection conduit invitablement une dltion la jonction de rparation (avec une utilisation frquente des micohomologies). En r-analysant les nombreuses donnes sur le NHEJ, la lumire de lexistence du A-NHEJ, il apparat quune part trs importante de la mutagense attribue au NHEJ provenait en ralit du A-NHEJ. Si C-NHEJ est conservative, il est nanmoins adaptable et peut ligaturer des extrmits dADN imparfaitement complmentaires, aboutissant une cicatrice de rparation en apparence mutagne. On peut remarquer cependant quen fonction des extrmits proposes, le C-NHEJ utilise les solutions permettant de limiter linstabilit gntique [30]. Lensemble des donnes permet donc de conclure que ce nest pas le mcanisme de C-NHEJ qui est

Fig. 3. Ligature dextrmits non homologues alternative. Dans la voie de la ligature dextrmits non homologues alternative KU ou XRCC4, des dltions sont observes au niveau des jonctions de rparation, associes lutilisation de microhomologies distantes des extrmits. Cela suppose que la voie alternative de la ligature dextrmits non homologues commence par une rsection simple-brin de la cassure double-brin. MRN/CtIP est ncessaire linitiation de cette rsection, ce qui favoriserait la rsection proprement dite par des nuclases associes ou non des hlicases. Cette rsection dcouvre des zones dADN complmentaires, qui peuvent shybrider Cette hybridation ne ncessite pas de longues homologies de squence (2 4 nuclotides sufsent), ce sont les microhomologies. La rsolution de lintermdiaire puis la ligation des extrmits conduisent des dltions la jonction.




Fig. 4. Modle pour limplication de Mre11 dans la rparation des cassures double-brin. Au niveau de la cassure double-brin, le complexe MRN permet la signalisation du dommage par activation dATM. CtIP est galement implique dans la rsolution des structures secondaires et dans llimination de protines lies aux extrmits. PuisquATM est active en prsence de cassure double-brin, MRN peut donc en partie intervenir de manire dpendante dATM et signaler le dommage pour la mise en place de la ligature dextrmits non homologues canonique an de permettre une rparation dle. Cependant, lactivit nuclasique de Mre11, en coopration avec CtIP, permet la rsection des extrmits dADN (de facon indpendante dATM). En fonction de la longueur de la rsection, de la prsence ou non de squences homologues et de la phase du cycle cellulaire, il y a alors mise en place de la recombinaison homologue ou de la ligature dextrmits non homologues alternative, lequel conduit une rparation indle de la cassure.

intrinsquement indle, mais cest la structure des extrmits double-brin de lADN qui dicte la qualit de la rparation . Ce concept revt une importance particulire pour la dlit de rparation des cassures double-brin induites par les radiations ionisantes. En effet, les extrmits dADN gnres par les radiations ionisantes sont souvent dites sales , porteuses de dommages sur les bases et/ou les sucres, les rendant impropres laction directe de la ligase. Il convient donc de nettoyer ces extrmits an de les rendre compatibles la ligase du NHEJ. Ce processus, qui utilise des nuclases, gnre ainsi des altrations de squence nuclotidique la jonction, en amont du NHEJ. La mutagense devrait donc tre principalement due la phase de prparation des extrmits dADN plutt qu ltape de ligature des extrmits elles-mmes. Un exemple du faible pouvoir mutateur intrinsque du C-NHEJ est apport par la recombinaison V(D)J, qui se produit par NHEJ aprs induction de cassure double-brin cibles par RAG1-RAG2. En effet, lenjeu est ici de gnrer de la diversit gntique dans la formation du rpertoire immunitaire. Cette diversit est gnre deux niveaux : 1- le rarrangement des segments dADN V, D et J et 2- la variabilit au niveau de la jonction. On peut remarquer, que cette deuxime tape, ncessite la Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) qui ajoute des nuclotides aux extrmits dADN. Cela implique que le C-NHEJ ntait pas capable de gnrer cette diversit et donc quil nest pas sufsamment indle. La capacit ligaturer des extrmits distales dADN doublebrin fait du NHEJ un candidat pour la gnration de translocations induites par les cassures double-brin. Si le C-NHEH ou le A-NHEJ sont capables de transloquer un fragment dADN dans une cassure double-brin situe dans un locus diffrent [30], le C-NHEJ protge

contre les translocations chromosomiques et labsence de KU ou de XRCC4 conduit une augmentation signicative de la frquence de translocation, qui se produisent par A-NHEJ [36,4951]. Dans ce cadre, il est important de souligner que lanalyse des points de jonctions de translocations dans diffrentes tumeurs fait apparatre une utilisation de microhomologies [52], suggrant que ces translocations ont t gnres par A-NHEJ. En rprimant le A-NHEJ qui gnre de linstabilit gntique, la ligature dextrmits non homologues canonique renforce lefcacit de maintien de la stabilit du gnome, tant au nivau chromosomique quau niveau de la squence nuclotidique la cicatrice de rparation. Dores et dj, les protines de rparation constituent des cibles thrapeutiques importantes [53,54] ; cependant, le ciblage conjoint des protines du C-NHEJ et du A-NHEJ pourrait reprsenter une stratgie davenir de radiosensibilisation an daugmenter lefcacit de la radiothrapie.

5. Vers une utilisation en thrapie ? Les agents gnotoxiques sont trs frquemment utiliss pour le traitement des cancers. Les systmes de rparation contrecarrent ces effets gnotoxiques. Lactivation de ces mcanismes de rparation peut tre lorigine des rsistances tumorales la radioou chimiothrapie. Cela a justi le dveloppement de nombreux inhibiteurs chimiques dirigs contre diffrents acteurs de la signalisation ou de la rparation de lADN. Ceux-ci pourraient tre utiliss en association avec la radiothrapie (ou chimiothrapie), ce qui pourrait permettre de diminuer les doses utilises et les effets




secondaires engendrer par ces traitements anticancreux. Certains inhibiteurs sont dores et dj tests en clinique [55,56]. La dcouverte de nouveaux acteurs et des mcanismes de rgulation du NHEJ (en particulier celle du A-NHEJ qui reste tre dtaill molculairement) permet aussi de proposer de nouvelles cibles pharmacologiques. Les cellules dcientes pour KU70/80 ou pour la sous-unit catalytique ADN-PK sont sensibles aux cassures double-brin induites par les radiations ionisantes ou les agents utiliss en chimiothrapie. Inversement, une augmentation de lactivit ADN-PK a t retrouve augmente dans certains cancers, augmentant ainsi leur rsistance aux agents gnotoxiques [57]. Ces donnes justient le dveloppement dun certain nombre dagents ciblant la ADNPK. Certains dentre eux sont lheure actuelle en essais cliniques [55,56]. Le rcepteur au facteur de croissance pidermal (EGFR) est retrouv surexprim dans environ 50 % des glioblastomes multiformes, tumeurs extrmement radiorsistantes. Dans la moiti des cas, une forme mutante constitutivement active (EGFRIII) est exprime. Des tudes ont montr que cette forme dEGFR est associe lhyperactivation de ADN-PK. Cependant, leffet de lEGFR sur lactivit ADN-PK semble tre dpendante du type tumoral. Linhibition du NHEJ en ciblant lEGFR est une stratgie thrapeutique ltude aujourdhui [58]. Dautres tudes montrent que la protine BMl1 est implique dans la radiorsistance des glioblastomes multiformes. Dans ces glioblastomes, une population de cellules souches neurales (CD133 positive) est extrmement radiorsistante. La protine BML1 est enrichie dans cette sous-population de cellules. Cette protine colocalise et co-purie avec ATM et -H2AX. Elle est co-purie galement avec ADN-PK, PARP-1, hnRNPU, et lhistone H1. Sa surexpression augmente le recrutement dATM aux cassures double-brin [59]. Il peut donc tre propos que linhibition pharmacologique de BMl1 ou du NHEJ en association la radiothrapie serait un moyen efcace pour cibler les cellules souches de glioblastome multiforme. Cependant, une stratgie dinhibition spcique du NHEJ canonique, se heurte deux difcults : le NHEJ intervient galement dans des mcanismes physiologiques fondamentaux tel que la diversit du rpertoire immunologique, son inhibition prolonge pourrait entraner des effets secondaires importants ; linhibition du NHEJ risque de laisser le champ libre au A-NHEJ qui est mutagne, cela pourrait engendrer une instabilit accrue dans les cellules tumorales rsiduelles. Cibler le NHEJ alternatif ou simultanment les deux voies du NHEJ devrait permettre daugmenter lefcacit du traitement tout en protgeant de linstabilit gntique associ au NHEJ alternatif. La protine PARP et ses partenaires XRCC1/ligase 3 ont t proposs pour participer au A-NHEJ [23,40]. Des inhibiteurs dirigs contre la protine PARP sont actuellement utiliss en clinique pour traiter des cancers du sein dans lesquels la voie de recombinaison homologue est affecte [6063]. Ce principe de ltalit synthtique pourrait tre appliqu avec des molcules ciblant la ligature dextrmits non homologues. La combinaison dinhibiteurs de PARP avec des inhibiteurs de ADN-PK, par exemple, pourraient permettre dinhiber plus efcacement le NHEJ et donc devrait potentialiser la radiothrapie. Il a t montr que le traitement combin dun inhibiteur de PARP (AG14361) et dun inhibiteur de ADN-PK (NU7026) augmente la sensibilit de cellules murines ou de hamster [64]. Des cellules dcientes pour la ligase IV (ligature dextrmits non homologues canonique) sont radiosensibilises par linhibiteur de PARP, olaparib (AZD2281) [65].

100

xrs6 + DMSO xrs6 + MIRIN xrs6 + KU80 + DMSO

10

xrs6 + KU80 + MIRIN

Survie (%)

1

0,1

0

2

4

Dose (Gy)Fig. 5. Radiosensibilisation par un inhibiteur spcique de mre11, la mirin. La ligne xrs6 (ligne de hamster KU dciente) a t traite par 10 M de mirin pendant 24 h et la survie une irradiation de 2 ou 4 Gy a t mesure [45]. La mirin radiosensibilise la ligne xrs6 (montrant limplication de Mre11 dans la voie alternative de la ligature dextrmits non homologues). La mirin sensibilise galement la ligne complmente par KU.

Des tudes rcentes montrent que le complexe MRN agit sur les deux voies du NHEJ, dune part en favorisant la signalisation gnrale de la cassure, dautre part en favorisant linitiation de la voie alternative par son activit nuclasique [4548]. Le complexe MRN est requis pour lactivation des contrles du cycle cellulaire. Une dcience de Mre11 ou de NBS1 entrane des syndromes qui associent une instabilit gntique une radiosensibilit. Ce complexe reprsente donc une cible attractive pour les traitements anticancreux. Des peptides visant inhiber linteraction entre ATM et NBS1 ont t dvelopps, ces peptides empchent la signalisation du dommage et radiosensibilisent les cellules [66]. Par ailleurs, un inhibiteur dirig contre Mre11 a t identi, la mirin [67]. Nous avons montr que des cellules de hamster procientes ou dcientes pour la voie du NHEJ canonique, sont radiosensibilises par la mirin [45]. La mirin est en effet capable daugmenter la radiosensibilit de cellules mutantes pour KU et donc dinhiber le A-NHEJ (Fig. 5). Lanalyse du statut canonique ou alternatif de la ligature dextrmits non homologues dans les tumeurs est un enjeu important, en effet il prsenterait un intrt clinique pour personnaliser au mieux les traitements. titre dexemple, dans les leucmies mylodes aigues impliquant une mutation activante du gne de la FMS-like tyrosine kinase-3 (FLT3), il a t montr une diminution de la protine KU accompagne dune augmentation du niveau de ligase III ce qui aboutit une augmentation du A-NHEJ et une instabilit gntique [68]. Une thrapie cible visant inhiber spciquement le A-NHEJ (inhibiteurs dirigs contre le complexe MRN ou la ligase III) devrait tre envisage. Lanalyse systmatique de lactivit relative des diffrentes voies de la ligature dextrmits non homologues (ligature dextrmits non homologues canonique contre ligature dextrmits non homologues alternative) dans les tumeurs parat donc une voie prometteuse et pourrait permettre terme de personnaliser le traitement en employant des stratgies de lthalit synthtique, ce qui permettrait de cibler les cellules tumorales en rduisant la toxicit des tissus sains. Dclaration dintrts Les auteurs dclarent ne pas avoir de conits dintrts en relation avec cet article.



ARTICLE IN PRESSE. Rass et al. / Cancer/Radiothrapie xxx (2011) xxxxxx 9 [31] Guirouilh-Barbat J, Rass E, Plo I, Bertrand P, Lopez BS, Defects in XRCC4, et al. Defects in XRCC4 and KU80 differentially affect the joining of distal nonhomologous ends. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104:209027. [32] Schulte-Uentrop L, El-Awady RA, Schliecker L, Willers H, Dahm-Daphi J. Distinct roles of XRCC4 and Ku80 in non-homologous end-joining of endonucleaseand ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks. Nucleic Acids Res 2008;36:25619. [33] Decottignies A. Microhomology-mediated end joining in ssion yeast is repressed by pku70 and relies on genes involved in homologous recombination. Genetics 2007;176:140315. [34] Lee K, Lee SE. Saccharomyces cerevisiae Sae2- and Tel1-dependent singlestrand DNA formation at DNA break promotes microhomology-mediated end joining. Genetics 2007;176:200314. [35] Guirouilh-Barbat J, Huck S, Lopez BS. 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