¨AÑO DE LA INVERSION PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD ALIMENTARIA”

UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL DE LA AMAZONIA

UNIAFACULTAD DE INGENIERÍA Y CIENCIAS AMBIENTALES

MICROBIOLOGÍA AGROINDUSTRIAL

PRACTICA Nº 5

TEMA:

OBSERVACIÓN DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS

DOCENTE: BIÓLOGA. CASTILLO LLANOS DIANA

ALUMNO: DE LA CRUZ OCHOA WILLIAM

ESPECIALIDAD: INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

CICLO: V

YARINACOCHA – PERÚ

2013

I.- GENERALIDADES:

Las bacterias son organismos procariotas, que miden uno o varios micrómetros, las podemos diferencias en dos grandes grupos: Las bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas. En términos generales, las capas que rodean a la célula bacteriana, se conoce como envoltura celular o pared celular. La estructura y organización de ésta difieren en las bacterias Gram positivas y Gram negativas. El componente químico común en ambas es el péptidoglucano o mureína, que es el responsable de la forma y consistencia de la pared celular. La cantidad de péptidoglucano de la pared de las células bacterianas varía desde el 90% en la pared de algunas bacterias Gram-positivas hasta menos del 10% en las bacterias Gram-negativas. La pared celular de las bacterias Gram-positivas contiene pequeñas cantidades de proteínas y polisacáridos, a menudo también ácidos teicoicos (polímeros de ribitolfosfato o glicerol-fosfato unidos mediante enlaces fosfodiéster) o de ácidos teicurónicos. Estos ácidos están unidos al péptido-glucano por los fosfatos. En las proteobacterias, Gram-negativas, la capa interna de la pared celular es pobre en péptidoglucano y la capa externa rica en lipoproteínas y lipopolisacáridos, los cuales constituyen más del 80% del peso seco de la pared. El espacio entre la membrana externa y la capa de péptidoglucano, llamado periplásmico, contiene un gran número de proteínas enzimáticas (Carrillo, 2005).

A través de la coloración de Gram, podemos diferencias ambos grupos bacteriano; el fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram postivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram negativas, mientras que en las Gram postivas el colorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram negativas se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse. (Jawest, 2005).

Objetivos

Al finalizar la práctica el alumno será capaz de:

Manipular adecuadamente la tinción diferencial de Gram

Diferenciar frente al microscopio las bacterias Gram postivas y Gram negativas

II. MATERIALES

2.1 Material biológico: Cultivo purificado de Escherichia y Bacillus Yogurt natural

2.2 Material de vidrio: Láminas porta objeto Láminas cubre objeto Gotero Pasteur Mechero

2.3 Reactivos: Violeta de genciana Safranina Lugol Alcohol acetona Agua destilada Aceite de cedro

2.4 Equipos: Microscopio compuesto

2.5 Otros: Mondadientes estériles

III. PROCEDIMIENTO

3.1 Coloración diferencial de Gram

- Con un mondadientes picar una colonia de Escherichia coli y Bacillus, y colocarlo sobre una lámina porta objeto.

- Dejar secar y fijar por calor

- Colocarlo sobre un soporte y cubrirlo con una solución de violeta de genciana, esperar por 2 minutos

- Desechar el exceso del colorante y agregar lugol, esperar por 1 minuto.

- Desechar el exceso de colorante y agregar etanol-acetona para decolorar, esperar 20 segundos.

- Lavar con agua

- Añadir safranina (colorante de contraste), esperar 1 minuto

- Lavar con agua

- Esperar que seque y observar con objetivo de inmersión. Esquematizar.

3.2 Tinción de corpúsculos metacromáticos

- Tomar una muestra de un yogurt con el asa de siembra y colocar en un portaobjetos.

- Teñir con azul de metileno (descrito en coloración Gram), esperar 2 minutos

- En esta preparación se observan dos microorganismos: Lactobacillus (con los corpúsculos

metacromáticos en su interior) y Streptococcus (forman cadenas).

IV RESULTADOS

Muestra:……sarro dental

Observación: gran negativo

Colorante: safranina, violeta, lugol

Aumento: 100

Preparado: en fresco

Muestra: sarro dental

Observación: color rojizo (Gran Negativa)

Colorante: safranina, violeta, lugol

Aumento: 400

Preparado: en fresco

V DISCUSIÓN:

La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana citoplasmática y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglucano, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmática mediante moléculas de ácido.

La envoltura celular de las bacterias Gram-negativas está compuesta por una membrana citoplasmática (membrana interna), una pared celular delgada de peptidoglicano, que rodea a la anterior, y una membrana externa que recubre la pared celular de estas bacterias.

VI CONCLUSIÓN:

En la presente práctica se logró manipular adecuadamente la tinción diferencial del Gram mediante el microscopio logrando diferenciar sus características físicas entre la positiva y la negativa, dando como resultado un Gram negativa como se vee en los resultados.

VII REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

- Carrillo L. 2005. Manula de microbiología Agrícola. Universidad Nacional de Jujuy.176p.- Brooks G. 2005. Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. 896p.

CUESTIONARIO

1. A QUE SE LLAMA COLORACIÓN GRAM Y QUIEN PROPUSO ESTA COLORACIÓN?

Al procedimiento que consiste en teñir las paredes con un colorante básico reforzado por un mordiente  y que permite diferenciar los dos grandes grupos bacterianos.Y quien propuso esta coloración fue el médico danés Christian Gram en 1884.

2. DIFERENCIA DE GRAM POSITIVO Y GRAM NEGATIVO (4)DIFERESNCIAS

GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS Pared celular con grueso

peptidoglicano que retiene un colorante específico. No tienen membrana externa.

pared celular compleja, con membrana externa y un espacio entre membrana interna y externa

 aparecen en color púrpura presentan color rojo  presentan sólo una membrana

lipídica y la pared de peptiglicano es mucho más gruesa

 El peptidoglicano es fino, por lo que no retienen el colorante.

 se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de aquí el nombre de "Gram-positivas" o también "grampositivas".

causan enfermedades. Los cocos Gram-negativos causan la gonorrea (Neisseria gonorrhoeae), meningitis (Neisseria meningitidis) y síntomas respiratorios (Moraxella catarrhalis), entre otros.

Práctica Nro. 6

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

I.- GENERALIDADES:

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne, peptona y/o triptona a la que se añadirán otros ingredientes. El Agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos.(Madigan, 2004)

Los medios de cultivo preparados pueden ser clasificados por su aspecto en: Líquidos, Semisólidos, Sólidos. Y por su uso en: Medios de cultivos básicos y Medios de cultivos especiales como: mejorados, selectivos, diferenciales, de transporte.(Madigan, 2004)

Objetivos:

Elaborar medios de cultivo sólido y líquido para el crecimiento de microorganismos

II. MATERIALES

2.1 Insumos: Papa amarilla Sacarosa

2.2 Material de vidrio: Matráz de 250 mL Probeta de 100 mL Vaso de precipitación de 250 mL Placas petri

2.3 Reactivos: Triptona

Extracto de levadura NaCl Agar Agar Mac Conkey Agar Plate Count Agua destilada NaOH 10N HCl 0.1N.

2.4 Equipos: Agitador magnético Barra magnética Balanza analítica Cocina eléctrica Autoclave Campana de flujo laminar Potenciómetro

2.5 Otros: Papel aluminio Espátula Tela de nailon Papel craff parafilm

III. PROCEDIMIENTO

3.1 Medio medio Luria Bertani (LB) (sólido)

- Con un mondadientes picar una colonia

- Medir 50 mL de agua destilada en probeta graduada y vaciarlo al matraz.

- Adherir al matraz los reactivos del medio LB (previamente pesados), excepto el agar

- Disolver los reactivos mediante agitación en el agitador magnético

- Ya homogénea la solución vaciarlo a la probeta y aforar hasta 98 mL

- Medir y corregir el pH hasta 7.0 con NaOH 10N, o HCl 0.1N.

Reactivos para medio Luria Bertani ( LB)

Triptona 1g.Extracto de levadura 0.5g.NaCl 1g.Agar 1.5 gAgua destilada 100 mLpH 7.0

- Ya corregido el pH, aforar nuevamente en la probeta hasta 100 mL

- Vaciar el medio al matraz, incluyendo el agar.

- Tapar el matraz y autoclavear a 15 lb/plg2, 120°C durante 15 min.

- Vaciar en medio en placas petri dentro de la Cámara de flujo Laminar.

3.2 Medio medio Luria Bertani (LB) (líquido)

- Medir 50 mL de agua destilada en probeta graduada y vaciarlo al matraz.

- Adherir al matraz los reactivos del medio LB (previamente pesados), excepto el agar

- Disolver los reactivos mediante agitación en el agitador magnético

- Ya homogénea la solución vaciarlo a la probeta y aforar hasta 98 mL

- Medir y corregir el pH hasta 7.0 con NaOH 10N, o HCl 0.1N.

- Ya corregido el pH, aforar nuevamente en la probeta hasta 100 mL

- Vaciar el medio al matraz, no incluir el agar.

- Cubrir el matraz y autoclavear a 15 lb, 120°C durante 15 min.

3.3 Medio Agar Papa

- Se cocinan las papas (peladas, pesadas previamente y cortadas en pedacitos) en 25 mL de agua destilada hasta que se muestren cocidas.

Reactivos para medio Luria Bertani ( LB)

Triptona 1g.Extracto de levadura 0.5g.NaCl 1g.Agua destilada 100 mLpH 7.0

Reactivos para medio Agar Papa

Papa 150g.Sacarosa 20g.Agar 7.5g.Agua destilada 50 mLpH 6.8

- Colar el extracto de papa a través de varias capas de tela

- El filtrado mezclar con los demás ingredientes(sacarosa) ya disueltos en los 25 mL de agua destilada restantes (excepto el agar)

- Corregir el pH hasta 6.8 con NaOH 10N, o HCl 0.1N.

- Disolver en caliente el agar

- Vaciar a viales de vidrio y cubrirlos con papel aluminio

- Envolver los viales en paquetes de 6 con papel craff.

- Esterilizar en autoclave a 15 lb, 120°C durante 15 min.

3.4 Medio Agar Plate Count

Para la preparación de medio Agar Plate Count, se procede de la misma forma que se preparó medio LB, sin embargo por ser un medio de cultivo comercial, ya lo podemos obtener todos los reactivos mezclados a manera de polvo, dentro de un frasco con las indicaciones como prepararlo descritos.

Para ese caso se procederá de la siguiente manera (siguiendo las instrucciones de la etiqueta del frasco):

- Pesar 23.5 g. de agar Plate count

- Diluirlo en 1 L de agua destilada dentro del matraz

- Corregir pH a con NaOH 10N, o HCl 0.1N.

- Aforar hasta volumen definitivo

- Cubrir el matraz con tapón de algodón y autoclavear a 15 lb, 120°C durante 15 min.

- Vaciar en placas petri dentro de campana de flujo laminar

Reactivos para medio Agar Plate Count

Triptona 5 gr Extracto de levadura 2.5grDextrina 1 gragar 15 gragua destilada. 1000 mLpH 7.0

3.5 Medio Agar Mac Conkey

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-

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-

Al igual que el medio Agar Plate Count, es usual que el medio Agar Mac Conkey, ya se adquiera comercialmente todos los reactivos mezclados, entonces se deberá seguir las indicaciones descritas en la etiqueta del frasco:

- Pesar 51.5 g. de agar Mac Conkey

- Diluirlo en 1 L de agua destilada dentro del matraz

- Corregir pH a con NaOH 10N, o HCl 0.1N.

- Aforar hasta volumen definitivo

- Cubrir el matraz con tapón de algodón y autoclavear a 15 lb, 120°C durante 15 min.

- Vaciar en placas petri dentro de campana de flujo laminar

3.6 Solución Salina Peptonada (SSP)

IV. RESULTADOS

Reactivos para medio Agar Mac Conkey

Cristal Violeta 0.002 mgExtracto de levadura en polvo 3 gRojo neutro 30 mgSales biliares 1.5 gLactosa 10 gNaCl 5 gPeptona 7 gGlucosa 10 gAgar 13 gAgua destilada 1000 mLpH 7.1

Reactivos para SSP

Peptona 1 gr NaCl 8.5gragua destilada. 1000 mLpH 7.0

A. A continuación, el estudiante deberá esquematizar, graficando y coloreando, el medio de cultivo que le correspondió preparar, indicando ordenadamente paso a paso como lo obtuvo.

B. Así mismo detallará las principales aplicaciones de todos los medios de cultivo preparados en clase, haciendo énfasis si es un medio de cultivo básico o selectivo de acuerdo a sus propiedades químicas.