22.10.2016

1

Detection and enumeration of microbial cells in drinking water using flow cytometry

A new technology for an old problem

Thomas Egli 

MICROBES‐IN‐WATER GmbH, Feldmeilen, Switzerlandthomas.egli@microbes.in.water.ch

Keime, Antibiotikaresistez und Desinfektion in WassersystemenBaselArea.swiss und FHNW HLSBasel,  25. Oktober 2016

Outline

Background on hygiene and microbiological safety of drinking waterA bit of historyAn established field: Present concepts and methods

What could be better?Alternative methodsFlow cytometry as an option?

Flow cytometry basicsPrinciple and fluorescent staining optionsTotal cell counting, cell clusters, fingerprintsLive/dead‐staining

Performance in practiceFlow cytometry versus plating

Standardization and validationSLMB: Method 333.1

Some applications in practiceBiostability during storage and distributionAssessing disinfection

The near future: Routine online flow cytometry in drinking water monitoring

Infectious diseases (1)

1800‐1900: Century of worldwide cholera pandemics

1. Pandemic 1817‐23 2.  Pandemic 1826‐373. Pandemic 1841‐62 . . . . . . . . . . First international collaboration (Vibrio suspected)4. Pandemic 1864‐755.  Pandemic 1882‐96 . . . . . . . . . . Vibrio cholerae shown to be the pathogen6. Pandemic 1899‐237. Pandemic 1936‐… . . . . . . . . . Occasional occurrence (1991 South America)

Source: COX, FEG. The Welcome Trust Illustrated History of Tropical Diseases, 1996 

Track of the2nd pandemic

Infectious diseases (2)

Discovery of microorganisms as the cause of infectious diseases

1870‐1900: Revolution in understanding infectious diseases

Louis Pasteur (1822‐1895)

Founders of modern medical microbiology

1854 Cholera (Pacini) 1874 Leprosy 1876 Anthrax 1882 Tuberculosis1884 Typhoid fever 1884 Cholera (Koch) 1884 Diphtheria 1894 Plague

Robert Koch (1843‐1910)Filippo Pacini (1812‐1883)

22.10.2016

2

~1900: Water hygiene basics

1885 Escherich: Bacillus coli (Escherichia coli) isolated from faeces

1891/2 Péré/Schardinger: Not pathogens directly but E. coli as “indicator”of faecal contamination of water (indicator concept)

1893/4 Koch/Franklands: Number of microbial cells in wateras an indication for its pollution‐‐‐‐> heterotrophic plate count, HPCKoch’s recommendation:< 100/ml CFUs in marine, ground‐ and surface water is safe,this can be reached by slow‐sand filtration

1901 Group of coliforms as an indicator

1904 Improvement: narrowed down to thermotolerant (fecal) coliforms

1977 Further improvement: Genospecies E. coli as best indicator

1

3

2

Safe drinking water

• Ensuring safety and quality of drinking water relies onmonitoring many different parameters:

• PhysicalpH, turbidity, conductivity, temperature, …

• Chemical hardness, organic carbon, pesticides, hormones, …

• Organoleptictaste, smell, …

• Microbiological routinely: total cell number (HPC) and indicator organisms (E. coli, enterococci, P. aeruginosa)when suspected: bacterial pathogens or viruses

Water quality & safety today 

… are still used and regulatory  base for routine testing of the microbiological quality and safety of (drinking) water all over the world!

In Switzerland: 1899, HPC and coliform methods fixedin the ‘Swiss Food Book’

1883Parameter for assessing the“general” water quality:

HPC(heterotrophic plate count)

# of “all” cultivable microorganisms(< 300 / mL)

1891‐93Hygiene‐relevant parameter:

Escherichia coli

indicating fecal contamination and possible presence of microbial pathogens (0 Ec / 100mL)

Robert Koch, Source Wikipedia 2016

Microbiological methods and concepts developed ~1890

WHO

Methods: Problems

Results only after 1 (Ec) ‐ 10 (HPC) daysHPC: < 1%  of microbial cells detectedCHF 40‐60.‐ / testTo date, no continuous monitoring possible; only grab sampling

Both methods are based on cultivation and depend on growth of the target organisms to a visible colony

General quality:Heterotrophic plate count, HPC

Hygiene‐relevant:E. coli, coliforms

22.10.2016

3

Good sides and limits of E. coli

Escherichia coli has generally been a good indicator for faecal contamination(there is no better, so far!)

However, it is known to fail to indicate absence or disinfection of ‘hardy’ microbes and virusesExample: USA, Milwaukee outbreak 1993, where chlorinated DW was contaminated with sewage, manure (or whatever) with chlorine‐resistant Cryptosporidiumoocysts (up to 0.13 oocysts/L). Estimated 403’000 people affected.

Why still HPC?

Since the 1940s it has been known that HPC allows to detect only ~0.01‐1% of all cells present in a sample (know as “the great plate count anomaly”),… and that those not growing are not ‘dead’(Staley & Konopka, 1985, Am. Rev.  Microbiol. 39, 321‐346) 

Improvements did not resolve the problem (e.g., R2A and other media). Alternative microscopic methods are too tedious for routine monitoring.

Therefore, in lack of better methods, HPC is still used, e.g., to assess treatment efficiency in water and food industry because E. coli other indicators or pathogens are either absent or present in too low concentrations

Methods: Problems and needs

General quality:Heterotrophic plate count, HPC

Hygiene‐relevant:E. coli, coliforms

Mostly a reliable indicator of faecal contamination… but too slow 

For E. coli:much faster method

For HPC: much faster method providing realistic cell # of microbial flora

Very slow and known to detect only a minor, variable fraction (~0.01‐1%) of the microbial flora

…so, let’s start here!

Available methods

Methods used for detecting and counting microbial cells* 

Cultivation, plating very slow (standard)

Flow cytometry fast, specific staining, costly

Microscopy (fluorescence) expensive, labour‐intensive

Particle counting fast, unspecific

Biochemical component‐based slow, expensive

Molecular methods (PCR etc.) slow, reliability?

Immunology‐based slow, expensive, specificity?

* Köster W., Egli T., et al. (2003). Analytical Methods for Microbiological Water Quality Testing. In: Assessing Microbial Safety of Drinking Water, pp. 237‐295. OECD, Paris, France, WHO, Geneva, Switzerland.

22.10.2016

4

The principle

filter 1

(e.g., laser diode 488nm)

flow cell

flow cell(quarz glass 

capillary, cuvette)

cells

filter 2

detector 3:fluorescence signal >520 nm

(cell sorting)

waste

fluorescent stain (DNA, surface antibody, etc.)

520nm

detector 2:side scatter 488 nm

detector 1forward scatter 488 nm

sample

light source

filter, condenserLens system

Fluorescent stains for…

DNA

esterases

proteins

red

+

CFDA

H+

‐ ‐+++‐‐

proteins

cellular activitiescellular constituents

RNAs

lipids(pathogen) cell wall 

components

fluorescent antibodies

Hoechst, DAPI, 

SYBR green

Pyronin Y

RedoxSensorTM

propidium iodide(membrane integrity)

ethidium bromide(H+ efflux pump)

CFDA(esterase activity)

DiBac4(3)(membrane potential)

glucose transport (2‐NBDG)

Nile‐Red

SYPRO

DNA‐stains: what is ‘counted’?

When triggering on green fluorescence signals:

SYBR Green I

Counts all particles that fluoresce green, i.e., contain SYBR Green I bound to ds‐DNA (or ds‐RNA),these are with very high probability  more or less ‘intact’ cells

No distinction between:‐ alive, dead, dormant, VBNC, damaged, cultivable, pathogen, good or bad, etc.

Properties of SYBR Green I

SYBR Green I binds to double‐stranded DNA (minor groove) and fluoresces 1000‐times more than in free state

Structure of SYBR Green I

Source: Wikipedia

FL1: 525‐545nm

FL2: >670nm

(or >715nm)

22.10.2016

5

Data representation

to ‘dot‐plot’from histograms

Data arranged from Kötzsch, Alisch & Egli, 2012, Handbuch: Durchflusszytometrische Analyse von Wasserproben, BAG, Bern 

Sample from groundwater at Hardhof, Zurich, after stainingwith SYBR Green I. Total cell concentration: 3.43 x 104 cells/ml.

Often observed: Cell clusters

background

Redflu

orescence intensitiy 

signals from

 SYBR Green

 I

Green fluorescence intensitysignals from SYBR Green I

cells

a single cell’s signal

cell clusters

“Big” and “small” cells

background

Redflu

orescence intensitiy 

signals from

 SYBR Green

 I

Green fluorescence intensitysignals from SYBR Green I

‘HNA’ cells(‘high nucleic acid’‐content)

‘LNA’ cells(‘low nucleic acid’‐content)

big, well‐stained cells

small, badly‐stained cells

TCC and LNA:HNA ratio

background

TCC

Redflu

orescence intensitiy 

signals from

 SYBR Green

 I

Green fluorescence intensitysignals from SYBR Green I

HNA

LNA

Parameters easily obtainedafter SYBR Green I‐staining:

# total cells (TCC )# small cells (LNA)# big cells (HNA)ratio LNA:HNA cells

22.10.2016

6

Present in most ‘fingerprints’

Drinking water Pond water River water 1 evian

Groundwater Wastewater E. coli River water 2

Helbling et al., SVWG Tagung Zurich, 4 May 2012

Disinfection: ‘Alive’ or ‘dead’ ?

Live and dead E. coli cells stained with LIVE‐or‐DIE™ Viability/Cytotoxicity Kit. Live bacteria exhibit green fluorescence, whereas dead bacteria exhibit red fluorescence.

Some ‘live/dead’ kits for bacteria:

LIVE‐or‐DIETM kit NucView Green/PILIVE/DEAD® BacLightTM kit Syto9/PI

Self‐made assays SYBR Green I/PI(Berney et al. 2008, SLMB 2012)

Concentrations, ratios of the two stains vary

LIVE/DEAD® BacLightTM kit Syto9/PI 0.5 µM/4.5 µMLIVE‐or‐DIETM kit NucView G/PI 3 µM/2 µM  Berney et al. (2008) Syto9/PI  5 µM/30 µM for 107 cells/mLBerney et al. (2008) Syto9/PI  0.5 µM/3 µM for 106 cells/mLSLMB (2012) Handbuch SG I/PI 1x/3 µM for 106 cells/mLNescerecka et al. (2014) SG I/PI 1x/6 µM for 106 cells/mL

Microscopic pictures from manufacturer’s brochures

Propidium iodide (PI)

Disinfection: Alive’ or ‘dead’?

Or better:‐ Membrane‐intact / membrane‐damaged cells‐ Intact / permeabilized cells

Typical ‘movement’ of cells during disinfection:

‐ HNA‐cells become first ‘greener’ then ‘red’ (1.)‐ LNA‐cells become simply ‘more red’ (2.)‐ Permeabilized cells then decay and move to background (3.)

From SLMB Handbuch (2012).

Total cell counting (TCC)

Reliable detection limit = 200 cells/mL

Hammes et al. 2008 Water Res. 42:269‐277

R2 = 0.9988

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

0 2 4 6 8 10percentage of bottled mineral water (%)

Bacterial con

centratio

n (cells/ml)

(diluted with cell‐free water)

22.10.2016

7

TCCs in different waters

From: Egli T, Kötzsch S (2015) Flow cytometry for rapid microbiological analysisof drinking water: From science to practice – An unfinished story. In: Flow Cytometryin Microbiology, pp. 175‐2016. Wilkinson M, Ed., Caister Academic Press, Norfolk, UK.

flow cytometrydetection limit

Application: FCM‐TCC vs HPC

distribution system

samples collected

raw water(Lake Zurich)

pre‐ozonation

rapid sandfilter

ozonation granular activated

carbon filter)

slow sandfilter

drinkingwater

reservoir

Drinking water production train and distribution in the town of Zurich

HPC vs. FCM‐TCC vs. ATP

0RW RSF ACF SSF PA N18 N19 N20

HPCs (R2A‐Agar)

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

Total cell cou

nt FCM

 (cells/mL)

Total cell count FCMTotal ATP

0

20

40

60

80

100

120

ATP (pM)   and

  HPC

s (colonies/m

L)

Egli, T, Hammes F (2010). Neue Methoden für die Wasseranalytik. gwa Gas, Wasser & Abwasser 4, 315‐324.

HPC ≠ FCM‐TCC

0–200 

vs

10‘000–1‘000‘000

Unpublished data from the Waterworks of Zurich and Eawag from the treatment and distribution system

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0.0E+00 2.0E+05 4.0E+05 6.0E+05 8.0E+05 1.0E+06 1.2E+06 1.4E+06

FCM total cell count (cells/mL)Heterotroph

ic plate cou

nt (colon

ies/mL)

Public fountains 

Ends of atown quarter

22.10.2016

8

No correlation

Flow cytometry total cell countno legally established valuebut ~20’000‐200’000/mLin safe drinking water

Heterotrophic plate count (HPC)< 2‐300/mL for drinking water

(legally established in some countries) 

HPC and FCM‐TCC measure ‘two different things’

FCM‐TCC becoming ‘official’

Method development atEawag since ~2004

Testing the methodat WVZ ~2005

FCM available atWVZ since ~2007 anduse of methods in practice

Water works Basel andAmsterdam, CantonalLab ZH follow ~2009/2011EU project: Successful demonstrationsin DE, NL, PT, NO, DK, LV, NA

2011‐12: Standardisation andValidation of TCC method together with SVGW, BAG, Cantonal Labs,WVZ and Basel, private firms;Goal: acceptance of method

Results from validation

Total cell count (14 persons)

LNA/HNA (14 persons)

groundwater spring water lake water treated HI after flushing

BIG (HNA)cells

Small (LNA) cells

R‐STDV = 8.08 %

R‐STDV = 6.92 % 

R‐STDV = 7.97 %

R‐STDV = 4.56 %

R‐STDV = 6.75 %

# of data sets

groundwater

beads

spring water

lake water treated

house installationafter flushing

Standardization, validationDecember 19, 2012:Fed. Office of Public Health (BAG) has included  the method in the Swiss Food Regulations(Schweizerisches Lebensmittelbuch) including a guideline for interpretation of results.

22.10.2016

9

How to use FCM‐TCC data?

Comments on interpretation of HPC data from the WHO‘[HPC] has little value as an index of pathogen presence but can be useful in operational monitoring as a treatment and disinfectant indicator, where the objective is to keep numbers as low as possible.’

‘…the current EU Directive [and WHO] do not set numerical standards of guideline values for colony counts, which are defined as indicator parameters, but state that there should be no abnormal change.’

Exactly the same applies for FCM‐TCC, just that the numerical values are in the range of ten‐ or hundred thousand cells, instead of a few hundred colonies.[Comment: Some countries still cling totheir tolerance levels, e.g., Switzerland]

World Health Organization (WHO) (2011). Guidelines fordrinking‐water quality – 4th ed. WHO, Geneva, Switzerland.

Bartram, J. et al., eds. (2003). Heterotrophic plate counts and drinking‐water safety. The significance of HPCs for water quality and human health. IWA Publishing, London UK.

Biostability during distribution

Drinking water produced fromlake water at SeewasserwerkLengg, Zurich

Residence time: 6‐50 hSampling Nov.‐March 2008/2009

Lautenschlager et al. (2013) Water Res. 47, 3015‐3025

distribution system

1 Reservoir Lengg

2

4

5

Reservoir Witikon

Reservoir Sonnenberg

ReservoirLooren

ReservoirOrelli

3

Stoicheiometry of growth

1 µg 

of assimilable organic carbon (AOC)supports growth of

≈107 microbial cells !

Hammes & Egli (2005) Environ Sci Technol 39, 3289‐3294 

Cell concentration is stable

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

RW RSF ACF SSF PA N18 N19 N20

0

20

40

60

80

100

120

ATP (pM) and

 HPC

s (colon

ies/mL)

Total cell count FCM

Total cell cou

nt FCM

 (cells/mL)

Biostable water !!!

Lautenschlager et al. (2013) Water Res. 47, 3015‐3025

22.10.2016

10

…and stable flora composition

Each line corresponds to one “species”

Pearson correlation [0.0%-100.0%]DGGE

100

500-50

DGGE

4 network March

2 network March

3 network March

5 network March

3 network Nov.

4 network Nov.

5 network Nov.

5 network Dec.

3 network Dec.

2 network Dec.

4 network Dec.

1 network Jan

1 network Dec.

2 network Nov.

1 network Nov.

4 network Feb

2 network Feb

1 network Feb

1 network March

3 network Feb

4 network Jan

2 network Jan

5 network Jan

7 network Jan

7 network Dec.

5 network Feb

3 network Jan

6 network March

6 network Feb

7 network Feb

1 Reservoir Lengg

2,3,4,5 Net

Not only the cell number but also the composition of the microbial flora is stable during distribution !!! 

“Finger print” of the microbial flora in drinking water using DGGE(DGGE = Denaturing gradient gel electrophoresis of amplified pieces of rRNA genes)

Each line corresponds  to one “species”

Regrowth during distribution

Full scale drinking water system at Riga (Latvia)

Water is chlorinated before distribution,but massive regrowth takes place in distribution system(indicated by FCM‐TCC but not HPC),and even occurrence ofE. coli during summer.

FCM‐TCC

HPC

 (CFU

/mL)

FCM TCC

 (cells/mL)

HPC

Nescerecka et al. (2014) Biological instability in a chlorinated drinking water distribution network. PLOS ONE 9(5), e96354.

Regrowth during distribution

…and the corresponding ‘live/dead’dot‐plots for increasing residence times

Nescerecka et al. (2014) Biological instability in a chlorinated drinking water distribution network. PLOS ONE 9(5), e96354.

(In)Stability of groundwaters

(Egli & Kötzsch (2015). Flow Cytometry for Rapid Microbiological Analysis ofDrinking‐Water. From Science to Practice – An Unfinished Story. In: FlowCytometry in Microbiology, Wilkinson ed., Caister Academic Press, Norfolk UK.

0

20

40

60

80

100 TCC

ICC

PCC

LNA HNA

TOC

DOC

0

20

40

60

80

100 TCC

ICC

PCC

LNA HNA

TOC

DOC MÄR 2010

MAI 2010

JUN 2010

JUL 2010

SEP 2010

Month 1

Month 2

Month 3

Month 4Month 5

Groundwater A in [%] Groundwater B in [%]

TCC: Total cell countICC: Intact cell countPCC: Permeabilized cell countLNA: Low nucleic acid content cellsHNA: High nucleic acid content cellsTOC: Total organic carbonDOC: Dissolved organic carbon

22.10.2016

11

Disinfection: DW flora

From: Ramseier et al. (2011) Water Res. 45: 1490‐1500

Flow cytometric assessment of total cell count and of membrane‐intact/damaged cells in drinking water as a function of exposure to ClO2. Initial concentrations of ClO2 were: 0.75 mg/L (a,b,c,e,f,g) and 2.5 mg/L (d,h).

SGI only SGI only SGI onlySGI only

SGI+PI

SGI+PI

SGI+PI

SGI+PI

ClO2

Increasing cxt

12

3

‘Live/dead’ and free chlorine

From: Gillespie et al. (2014) Water Res. 65: 224‐234

Effect of free chlorine concentration on the proportion of intact cells in a water treatment and its supplied distribution system. 

The dotted line indicates a critical free chlorine concentration threshold for this system.

most cells dead

most cells alive

Online flow cytometry

First steps inonline flow cytometry

TCC in practice

All manual work, with all commercially available cytometers

Sample

Mix,5 sec Incubate for 13 min 

(or longer) at 37±2 °C in the dark

1000 µL

10 µL

Use directly

…or store at 4 °C in the dark for later use

SYBR Green Idiluted in DMSO

Analyze data with an FCM software‐‐> result, decision

Discrete sampling, transport to the lab, staining and FCM‐analysis

Sampling &transport

Sampling, fixation, transport & storage

Treattoxic waste

Prepare sheath fluid, cleaning liquid, stain, 

standard beads

22.10.2016

12

Online flow cytometry

Hammes et al. (2012) Cytometry Part A, 81A:506‐512.

Online flow cytometry

Background:non‐chlorinatedtap water

Hammes et al. (2012) Cytometry Part A, 81A:506‐512.

Detecting changes in cell concentration

Online flow cytometry

Hammes et al. (2012) Cytometry Part A, 81A:506‐512.

Total bacterial cell concentration in AC‐biofilter effluent as a function of the flow rate measured  with on‐line FCM during 24 hours (SYBR Green I staining).

In practice: TCC in AC‐biofilter effluent at different flow rates

Online flow cytometry

Hammes et al. (2012) Cytometry Part A, 81A:506‐512.

22.10.2016

13

On‐line FCM ‘BactoSense’

Market launch end 2016100% validated and protected by 3 patents

TCC and LNA/HNA in 15 minFully automated for online usageFor the first time: microbiological analysisof drinking water before distributionOption to set threshold alarmOnline or manual loading optionCHF < 3.‐/test (cartridge for 1000 tests)For industrial/field use

… and TCC with BactoSense

Sample

Mix,5 sec Incubate for 13 min 

(or longer) at 37±2 °C in the dark

1000 µL

10 µL

Use directly

…or store at 4 °C in the dark for later use

SYBR Green Idiluted in DMSO

Analyze data with an FCM software‐‐> result, decision

Sampling &transport

Sampling, fixation, transport & storage

Treattoxic waste

Sends the data to your lab or phone

… or can initiate action when in alarm mode  

BactoSense does all this automatically on‐site, e.g. every 20 min

Prepare sheath fluid, cleaning liquid, stain, 

standard beads

Discrete sampling, transport to the lab, staining and FCM‐analysis

Take‐home messagesThe two established methods for microbiological drinking water analysis  are based on cultivation on nutrient agar plates; these methods are slow: E. coli counting requires at least 1, HPC up to 10 days to obtain the result.

E. coli test gives realistic results but the HPC‐results have been known for a long time to be much too low.

Flow cytometry‐based cell counting allows to easily, quickly (< 15 minutes) and quantitatively detect microbial cells after staining with a DNA‐binding fluorescent dye.

FCM total cell counting has been developed in Switzerland over the last 15 years and tested in practice in several Swiss water works. It has proven useful for quickly monitoring general microbiological quality in drinking water production processes and distribution networks.

FCM total cell counting was standardized and validated and is officially accepted by the Federal Office of Public Health (Swiss Food Book, method 333.1).

FCM allows to determine many other properties of individual cells quickly  (e.g., live/dead‐staining, enzymatic cellular activities)

Shortly, small cytometers for online total cell counting will be commercially available.

Thanks

…for your attention

22.10.2016

14

Thanks 

Labor SpiezABC-Schutz

Bundesamt für Gesundheit BAG

Bundesamt für Umwelt BAFU

to all my students, collaboratorsand financial supporters….

...and

Selected papersBerney M, Hammes F, Bosshard F, Weilenmann HU, Egli T (2007). 

Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3283‐3290.

Berney M, Vital M, Hülshoff I, Weilenmann HU, Egli T, Hammes F (2008). Rapid, cultivation‐independent assessment of microbial viability in drinking water. Water Res. 42, 2010‐4018.

Besmer MD, Weissbrodt DG, Kratochvil BE, Sigrist JA, Weyland MS, Hammes F (2014). The feasibility of automated online flow cytometry for in‐situ monitoring of microbial dynamics in aquatic ecosystems. Front. Microbiol. 5, article 265.

Egli T (2012). Mikrobiologische Trinkwasseranalyse. Entwicklung, Stand, Ausblick. Aqua & Gas 5, 14‐22.

Egli T, Bucheli M (2014). Wie viele Zellen sind im Trinkwasser? Durchflusszytometrie in der mikrobiologische Trinkwasseranalyse: wie weiter? Aqua & Gas 11, 90‐98.

Egli, T, Hammes F (2010). Neue Methoden für die Wasseranalytik. gwaGas, Wasser & Abwasser 4, 315‐324.

Egli T, Kötzsch S (2015). Flow cytometry for rapid microbiological analysis of drinking water: From science to practice – An unfinished story. In: Flow Cytometry in Microbiology, pp. 175‐2016. Wilkinson M, Ed., Caister Academic Press, Norfolk, UK.

Gillespie S, Lipphaus P, Green J, Parsons S, Weir P, Juskowiak K, Jefferson B, Jarvis P, Nocker A (2014). Assessing microbiological water quality in drinking water distribution systems with disinfectant residual using flow cytometry. Water Res. 65, 224‐234.

Hammes F, Berney M, Wang Y, Vital M, Köster O, Egli T (2008). Flow‐cytometric total bacterial cell counts as a descriptive microbiological parameter for drinking water treatment processes. Water Res. 42, 269‐277.

Hammes F, Broger T, Weilenman HU, Vital M, Helbing J, Bosshart U, Huber P, Odermatt RP, Sonnleitner B (2012). Development and laboratory‐scale testing of a fully automated online flow cytometer for drinking water analysis. Cytometry Part A 81A, 508‐516.

Keserue HA, Baumgartner A., Felleisen R, Egli T (2012). Rapid detection of total and viable Legionella pneumophila in tap water by immunomagnetic separation, double fluorescent staining and flow cytometry. Microb. Biotechnol. 5, 753‐763.

Lautenschlager K, Boon N, Wang Y, Egli T, Hammes F (2010). Overnight stagnation of drinking water in household taps induces microbial growth and changes in community composition. Water Res. 44, 4868‐4877.

Nescerecka A, Rublis J, Vital M, Juhna T, Hammes F (2014). Biological instability in a chlorinated drinking water distribution network. PLOSone 9, e96354.

Prest EI, Hammes F, Kötzsch S, van Loosdrecht MCM, Vrouwenvelder JS (2013). Monitoring microbiological changes in drinking water systems using a fast and reproducible flow cytometric method. Water Res. 47, 7131‐7142.

Ramseier MK, von Gunten U, Freihofer P, Hammes F (2011). Kinetics of membrane damage to high (HNA) and low (LNA) nucleic acid bacterial clusters in drinking water by ozone, chlorine, chlorine dioxide, monochloramine, ferrate(VI), and permanganate. Water Res. 45, 1490‐1500.

SLMB (2012). Methode 333.1. Bestimmung der Totalzahl und des quantitativen Verhältnisses der Zellen niedrigen bzw. hohen Nukleinsäuregehalts in Süsswasser mittels Durchflusszytometrie. Schweizerisches Lebensmittelbuch. Schweizerisches Bundesamt für Gesundheit (BAG), Bern.

SLMB (2012). Method 333.1. Determining the total cell count and ratios of high and low nucleic acid content cells in freshwater using flow cytometry. Federal Office of Public Health, Bern, Switzerland.

SLMB (2012). Durchflusszytometrische Analyse von Wasserproben. Handbuch zur Methode 333.1, zusammengestellt von S. Kötzsch, S. Alisch und T. Egli. Schweizerisches Bundesamt für Gesundheit (BAG).