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Genetica dei Procarioti - 5

Dipartimento di Scienze della VitaCdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6)

Prof. Laura Marriricevimento: previo appuntamento telefonico o e-mail

A.A. 2014-15

Bacteria produce and secrete chemical signal molecules (autoinducers)

Concentration of molecules increases with increasing bacterial density

When critical threshold concentration of molecule is reached, bacteria alter gene expression

Quorum Sensing

Gram negative and Gram positive bacteria use different signaling molecules (Acyl Homoserine lactones vs peptides) GRAM-

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GRAM+

Serratia liquefacens wild type Ceppo mutante AHL

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(b) Competence and sporulating stimulating factor (CSF)autoinducer of Bacillus subtilis. (c) AI-2 autoinducer. (d) The N-butyryl-homoserine lactone of Pseudomonas aeruginosa.

AHL

Acyl Homoserine Lactone

autoinduttori

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Una coltura di E. coli in terreno complesso (LB) entra in fase di morte dopo tre giorni di incubazione. In questa fase, il 90-99% della popolazione muore

Una coltura di E. coli in terreno complesso (LB) entra in fase di morte dopo tre giorni di incubazione. In questa fase, il 90-99% della popolazione muore

ossidazione di proteine e DNA, programma simile all’apoptosi eucariotica che determina la morte delle cellule al raggiungimento di una densità elevata

ossidazione di proteine e DNA, programma simile all’apoptosi eucariotica che determina la morte delle cellule al raggiungimento di una densità elevata

EDF (extracellular death factor) attiva l’operone mazEF responsabile del modulo tossina-antitossina che determina la morte delle cellule al raggiungimento di una densità elevata

mazF encodes a stable toxin, MazF: a sequence-specific endoribonuclease that preferentially cleaves single-stranded mRNAs at ACA sequences

mazE encodes a labile antitoxin, MazE, that counteracts the action of MazF

Any stressful condition that prevents the expression of mazEF will lead to a reduction of MazE levels in the cell, permitting the MazF toxin to act

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Biosensori batterici per la rivelazione di AHLs

gene reporter

promotore della famiglia LuxIproteina della

famiglia LuxR

Chromobacterium violaceum

A mutant of C. violaceum ATCC 31532, designed strain CV026, does not produce C6-HSL but does produce violacein in response to the presence of exogenous C6-HSL(McClean et al., 1997)

the proper production of AHL molecules has been blocked by mutation of the AHL synthase but the gene encoding the production of the purple pigment violacein remains AHL-responsive.

In the presence of specific AHLs with acylchain lengths shorter than C10, this strain willtherefore produce purple pigment due to violacein production

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Proteine specifiche si trovano:

associate alla IMnello spazio periplasmaticoOMin alcuni casi secrete completamente dalla cellula

Le proteine legate alle membrane comprendono:

CitocromiF1/Fo ATP sintasiProteine di trasportoPorine

Controllo post-traduzionale

SECREZIONE PROTEINE

Nei batteri Gram-positivi le proteine secrete o sono rilasciate nell’ambienteesterno oppure sono legate covalentemente al petidoglicano da specifici enzimiassociati alla membrana e vanno a costituire le proteine di superficie

almeno 8 sistemi IM almeno 8 sistemi OMGram-

Molte proteine sono secrete attraverso entrambe le membrane cellulari (IM, OM) dei batteri GRAM-negativiAlcune usano la via Sec per attraversare la IM ed un’altra via per la OMAltre dipendono da altri sistemi per attraversare entrambe le membrane

Sec-pathway

Il trasporto è realizzato attraverso un meccanismo dipendente da una

SEQUENZA SEGNALE

Met–X – Lys/Arg – Z(10 -12x) – Gly/Ala –

Regione basica core idrofobico N-terminus proteina matura5-6 residui

X = residuo idrofilico o idrofobico

Z= residuo prevalentemente idrofobico

translocationcomplex

peptidasePERIPLASMA

20aa

2

delivering protein

1

chaperonetranslocation

competent state

CITOPLASMA

forma un canale

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La proteina matura inizia il processo di ripiegamento, se a destinazione periplasmatica, oppure può essere presa in consegna da un successivo sistema di trasporto se destinata a OM/ ambiente extracellulare

La proteina matura inizia il processo di ripiegamento, se a destinazione periplasmatica, oppure può essere presa in consegna da un successivo sistema di trasporto se destinata a OM/ ambiente extracellulare

homologues follow the phylogenies of the host organisms with few exceptions

Phylogenetic tree of sequenced homologues of the SecY protein of E. coli and Sec61 protein of Saccharomyces cerevisiae

A+Btwo-step process

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Type III – T3S

apparato che trasloca effettori in one step attraverso la parete usando una struttura ancestralmente correlata al flagello batterico

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nomenclatura di YersiniaYop: Yersinia outer protein

chaperonine specifiche

solo dopo il contatto con la

cellula eucariotica

Shigella type III secretion system

I batteri usano il sistema di secrezione di tipo IV (T4S) per due motivi fondamentali:

• scambio genico• rilascio di molecole effettrici (EFFETTORI) a cellule

eucariotiche bersaglio

ancestralemente correlato all’apparato della coniugazione che transloca DNA o substrati proteici attraverso la parete (spesso in relazione alla patogenesi)

Type IV – T4S

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(b) transmission electron microscopic image showingT-pili and flagella on A. tumefaciens.

(a) a model for T-pilus assembly in Agrobacterium tumefaciens

VirB4–VirB8–VirB5–VirB2 interaction sequence leadto the formation of VirB2–VirB5 complexes followedby T-pilus assembly

Secretion pathway and structure of the T4S system

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secondary amine derivatives formed by condensation of an amino acid, either with a ketoacid or a sugar

Crown gall tumors

galla del colletto

Ti è un esempio di plasmide batterico naturale

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Also, virulence plasmids from Salmonella, Shigella, Yersinia, B. anthracis, E.coli, and others.

MGEs: segmenti di DNA codificanti enzimi o altre proteine checonsentono lo spostamento di questi elementi nel genoma (mobilitàintracellulare) o tra cellule batteriche (mobilità intercellulare)

nella maggior parte dei casi sono molecole di DNA circolari

(1 - 1000 kb) ma anche lineari o integrati nel cromosoma

batterico (episomi)

PLASMIDI

dal 1977

plasmide superavvoltosupercoiled

plasmide circolare rilassato

plasmide linearizzato

nick

Le forme molecolari circolari superavvolte durante le

manipolazioni sperimentali possono rilassarsi o linearizzarsi

in seguito a rotture a singolo o a doppio filamento.

PLASMIDI

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forma rilassataforma lineareforma superavvolata

forma linerizzata ( tagliata con un enzima di restrizione in un sito unico)

In un gel di agarosio e bromuro di etidio le tre forme migrano a velocità diverse e possono essere distinte

Three forms of plasmid DNA

Large-scale purification of plasmids by cesium chloride density gradient centrifugation

“old school method of purifying plasmid”since the 1950s

72-96 hrsduring this time, the CsCl forms a gradient and the molecules migrate according to their density until they float at their individual isopycnic points (the point in the gradient that equals the buoyant density of the molecule).

Plasmid replication

1. Plasmid replication requires host DNA replication machinery.

2. Most wild plasmids carry genes needed for transfer and copy number control.

3. All self replication plasmids have a oriV: origin of replication

4. Some plasmids carry and oriT: origin of transfer.

5. Plasmid segregation is maintained by a par locus-a partition locus that ensures each daughter cells gets on plasmid. Not all plasmids have such sequences.

6. There are 5 main “incompatibility” groups of plasmid replication. Not all plasmids can live with each other.

7. Agents that disrupt DNA replication destabilize or cure plasmids from cells.

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un plasmide deve contenere un’origine per la replicazione del DNAun plasmide deve contenere un’origine per la replicazione del DNA

Replicazione plasmidicaReplicazione plasmidica

REPLICONI

I plasmidi si replicano

per replicazione (uni o bi-direzionale)

per circolo rotante

richiedono proteine plasmidiche e/o dell’ospite batterico

replicazione circolo rotante

Replicazione plasmidica

REPLICONI

I plasmidi si replicano

per replicazione (uni o bi-direzionale)

per circolo rotante

richiedono proteine plasmidiche e/o dell’ospite batterico

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Replicazione plasmidica

La capacità di replicarsi autonomamente è conferita loro dalla presenza di una origine di replicazione, ori (oriV, “ori vector”)

host protein

P1

Funzioni dell’origine di replicazione

Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l’origine di replicazione oriV controlla:

Il numero di copie

La specificità d’ospite

I gruppi di incompatibilità

NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE

I plasmidi si replicano con due modalità diverse

Alcuni, generalmente quelli di grandi dimensioni, si replicano in

maniera coordinata con la replicazione del cromosoma batterico

e si dicono sottoposti a

controllo stringente

In genere sono presenti in una o poche copie per batterio.

NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE

Altri, in genere di piccole dimensioni, si replicano in maniera

indipendente dalla replicazione batterica e si dicono sottoposti a

controllo rilassato

Sono presenti in molte copie - fino a 1000 - per batterio.

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Plasmidi ori N. di copie

PUC e derivati ColE1 500-700

pACYC e derivati p15A 10-12

pSC101 e derivati Psc10 1-5

NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE HIHG

COPY

NUMBER

Sistema di ripartizioneLOW

COPY

NUMBER

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Sistema di ripartizione

parS-ParA-ParB

Bacterial plasmids encode partitioning (par) loci that ensure ordered plasmid segregation prior to cell division

Sister plasmid segregation is achieved through bidirectional insertional polymerization of the ParM filaments.

ParM binds to DNA-binding proteins, called ParR (orange proteins) around which segments of genomic DNA are coiled

Actina-omologo

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Controllo del numero di copie

I plasmidi possono controllare il numero di copie regolando l’inizio della replicazione plasmidica

inibizione mediante RNA + proteina dell’inizio della replicazione

La maggior parte dei vettori di clonaggio derivano dal plasmide ColE1

Controllo del numero di copie

ori

RNA IIRnasi H

la replicazione è innescata da un primer (RNA II), trascritto da un promotore situato 550 bp a monte di ori.

Gli ibridi DNA:RNA formati dal filamento di DNA e dall’RNA II nascente, costituiscono un substrato per la Rnasi H che taglia l’ibrido e fornisce l’OH al 3’ per la replicazione del DNA.

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oriRNA I rop

La maturazione di RNA II è controllata da RNA I, trascritto sul filamento opposto della stessa regione di DNA e, quindi, complementare a RNA II .

RNA I-RNA II compete con l’appaiamento tra RNA II e il filamento stampo, riducendo la frequenza di inizio della replicazione.

Il prodotto del gene rop stabilizza il complesso RNA I-RNA II , riducendo ulteriormente la frequenza di inizio.

RNA II

origin

P-II

P-I

Replicazione del plasmide ColE1

RNA I

RNA II

RNA I (108 b)

RNA II is required for priming DNA synthesis at the origin. Positive regulation.

P-I & P-II: promotori

-555 -20

RNA polimerasi

RNA I è complementare alla regione terminale 5’ di RNA II

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Funzioni dell’origine di replicazione

Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l’origine di replicazione oriV controlla:

Il numero di copie

Lo spettro d’ospite

I gruppi di incompatibilità

Alcuni plasmidi sono in grado di replicare in un numero limitato di

specie batteriche e si dicono a specificità d'ospite limitata : narrow

host range

Altri sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie

batteriche e si dicono a largo spettro d'ospite: broad host range, BHR

I plasmidi BHR derivano questa loro proprietà dal possesso di

funzioni per il riconoscimento dell' origine di replicazione, dipendono

meno, quindi, dall'apparato replicativo dell'ospite batterico

SPETTRO D’OSPITE

Funzioni dell’origine di replicazione

Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l’origine di replicazione oriV controlla:

Il numero di copie

La specificità d’ospite

I gruppi di incompatibilità

Plasmidi con la stessa origine di replicazione sono incompatibili tra

loro.

Se in uno stesso batterio entrano due plasmidi con la stessa origine

di replicazione, questa compete per componenti proteici comuni.

Come risultato nel giro di poche generazioni uno dei due plasmidi

verrà perso.

Possono invece coesistere plasmidi con origine di replicazione

diverse che appartengono a diversi gruppi di incompatibilità

GRUPPI DI INCOMPATIBILITA’

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INCOMPATIBILITA’ PLASMIDICA

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MARCATORI SELEZIONABILI

I plasmidi naturali a volte veicolano uno o più geni non

essenziali capaci di conferire loro un vantaggio selettivo in

alcune situazioni.

Per es. possono codificare per tossine o resistenza agli

antibiotici

Plasmidi coniugativi e non coniugativi

capacità di trasferire materiale genetico tra batteri

mediante coniugazione

Per essere coniugativo un plasmide deve possedere:

Una specifica regione di riconoscimento chiamata Ori T (origine di trasferimento)

I prodotti genici, agenti in trans, specificati dal locus tra (trasferimento)

una delle funzioni tra: sintesi del pilo coniugativo

Plasmidi coniugativi e non coniugativi

plasmidi privi di queste funzioni geniche non sono trasmissibili

Tuttavia . . .

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Plasmidi coniugativi e non coniugativi

se un plasmide possiede un Ori T può essere trasferito per coniugazione utilizzando funzioni helper che forniscono, in trans, i prodotti genici mancanti

Distribution of conjugative, mobilizable, and nonconjugative plasmids according to plasmid size

Smillie C et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010;74:434-452

Schematic view of the genetic constitution of transmissible plasmids.

Smillie C et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010;74:434-452

MPF: mating pair formation T4CP: Type IV coupling proteins

Escherichia coli S17-1 λpir è in grado di mobilizzare plasmidi non coniugativi inbatteri Gram-negativi grazie all’integrazione stabile nel proprio cromosoma dei genicodificanti per le funzioni di trasferimento derivate dal plasmide RP4 che agisconosulla sequenza oriT presente sui plasmidi mobilizzabili

geni tra

Ricevente

plasmide

coniugazione

oriT