Големите очаквания

Диагностика на вродените заболявания на тромбоцитите

Варна 15-18.11.2018

Анна Павлова

Institute of Experimental Haematology and Transfusion Medicine, Bonn, Germany

Декларация на лекторите за потенциални интереси

Към момента на настоящата презентация д-р Анна Павлова

декларира липса на значима финансова или друг вид обвързаност със заинтересовани институции, която трябва да бъде разкрита.

Декларация на лекторите за потенциални интереси Към момента на настоящата презентация

Д-РАнна Павлова декларира следните взаимовръзки с потенциално заинтересовани институции, които

трябва да бъдат разкрити.

Като посредник на СМЕ акредитацията Българското дружество по хематология е задължено да гарантира независимост, обективност и балансирано представяне на научната информация във всички форуми, в организирането на които участва. Очаква се от всички лектори да разкрият пред аудиторията потенциални финансови или други видове взаимоотношения с (1) производители на продукти или услуги, които са предмет на обсъждане в настоящия форум, или със (2) спонсори на настоящето събитие (получаване на награди за научни изследвания, трудови договори, консултант, притежание на акции, и др.). Целта на настоящата Декларация е не да забрани на лектори със съществени финансови или други взаимоотношения да представят своите резултати и виждания на форума, а да даде възможност на аудиторията да направи своите преценки дали и доколко представената информация и заключения са повлияни от тези връзки.

Компания Вид връзки

Octapharma, Novo Nordisk, Bayer, Lectures, Honoraria

Вродени заболявания на тромбоцитите(ВЗТ)

Хетерогенна група от редки вродени хеморагични диатези с нормален или абнормен тромбоцитен брой с или без нарушена тромбоцитна функция

Кървене по тип “нарушение на първичната хемостаза“ - кървене от кожно-лигавичен тип, петехии, пурпура, ехкимози, суфузии, кървене от ГИТ, менорагии, кървене в следствие на хирургична намеса или травма в различна степен по тежест.

Съществена хетерогенност по отношение на молекулярни/генетични дефекти.

В повечето случаи – тромбоцитопения.

Причинено от дефекти на адхезивните рецепторни протеини, разтворимите рецепторни агонисти, сигналните пътища и мембранните фосфолипиди.

Историята на вродените тромбоцитопении започва през 1948 с описанието на синдрома на Bernard-Soulier (BSS).

70 години по-късно

Дефинирани – общо 25 различни форми на ВЗТ в 30 различни гена

Основен тласък – широкото разпространение на автоматичните клетъчни анализатори.

Развитието на технологиите в областта на генетиката o Sanger секвениране и linkage анализ – времеемки и

нископроизводителни. o Next-generation sequencing – секвениране с висока производителност

NGS-таргетирани платформи - позволяват едноактов анализ на предварително дефинирани групи гени.

Секвениране на всички екзони и на целия геном (whole exome sequencing (WES) и whole genome sequencing)

Възприемане на схващането, че честотата на ВЗТ е много по-голяма от очакваната, възлизайки на най-малко 2:100 000 индивида

Подобряване на дефиницията за фенотипа на някои ВЗТ

Дефиниране на каузални гени, чиято функция по-рано бе

често неизвестна. Подобряване на разбиранията ни по отношение

физиологичните механизми на мегакариоцитопоезата и тромбоцитната биогенеза

Това доведе до…

ВЗТ остават слабо разбрани и често трудни за диагностициране, защото:

Засягат хора, които не показват спонтанни симптоми на кървене Средната възраст на диагностициране е между 21 и 37 години Генетичните изследвания често са достъпни само в отделни

специализирани центрове В около 40-50% от случаите на пациенти с ВЗТ не е възможно да се

постави диагноза, тъй като те страдат от тромбоцитни нарушения, които все още не са идентифицирани

Как да разпознаем пациент с ВЗТ

При по-тежките нарушения диагнозата рядко остава неясна

Обикновено се разпознават рано в живота на индивида в следствие на явни ехкимози и суфузии или други прояви на кожно-лигавично кървене

Липсваща агрегация и ристоцитин-индуцирана аглутинация

1. Пациент с тежко тромбоцитно заболяване (Тромбастения на Glanzmann и синдром на Bernard–Soulier)

Как да разпознаем пациент с ВЗТ 2. Пациенти с ВЗТ, асоциирано със синдроми или системни заболявания

Екзема, чести инфекции, лекостепенна хеморагична диатеза

Синдром на Wiskott–Aldrich

Синдром на Hermansky–Pudlak

Загуба на пигментация по косата и ирисите, лекостепенна хеморагична диатеза.

Тромбоцитопения с липсващ радиус

T A R Syndrome

Аплазия на радиуса, нисък ръст, сърдечни и бъбречни малформации

Амегакариоцитна тромбоцитопения с

радио-улнарна синостоза

Вродена проксимална синостоза на радиуса и улната

Как да разпознаем пациент с ВЗТ

Мнозинството пациенти Предизвикателство за поставяне на диагноза

3. Пациент с ВЗТ с лекостепенно кървене и леко-степенно намален до нормален тромбоцитен брой

Типът кървене дава основание за подозиране на леко по тежест заболяване на тромбоцитите

(диспропорционално кървене на размера на понесената травма, синини несвързана с травма, ексцесивно кървене от кожно-лигавичен тип, епистаксис, менорагия)

DD Типът на кървене е различен от този при тежки коагулационни нарушения

– Хемофилия (лека форма на Хемофилия, дефицит на фактор VII) Симптомите са подобни на тези при Болест на von Willebrand (VWD) или

нарушенията на съединителната тъкан.

Защо диагностицирането на ВЗТ е важно? Често ВЗТ биват по погрешка приемани за имунна тромбоцитопения

и пациентите биват подлагани на неоправдано лечение.

Идентификация на генетичните варианти с прогностично прилжение Осъществяване на ефективна генетична консултация Прилагане на правилна терапия, ако състоянието еволюира с проява на

допълнителни клинични манифестации.

Някои заболявания се асоциират с клинични манифестации, които могат да имат сериозно влияние върху качеството на живот и могат да бъдат фатални

o MYH9-related disease - заболявания – 30% от пациентите развиват

бъбречна увреда, водеща до терминална бъбречна недостатъчност; 60% развиват невросензорна глухота.

o ВЗТ, причинени от мутации в RUNX1, ANKRD26, ETV6 – свързват се с повишен риск от развитие на миелоидна левкемия.

o ВЗТ, причинени от мутации в WAS – изключително висок риск от инфекции, автоимунни заболявания и злокачествени заболявания.

Разпознаването на пациент с ВЗТ е от съществено значение за:

Класификация

Класификация,с диагностична и прогностична цел - Дефекти, асоциирани само с тромбоцитопения от раждането - Дефекти, асоциирани с допълнителни клинично значими вродени синдроми - Дефекти, асоциирани с тромбоцитопения и риск за развитие на други

заболявания в по-късен етап от живота на индивида

Използвана до момента - Базирана на механизма на унаследяване - На наличието на допълнителни вродени дефекти - На размера на тромбоцитите

Ръководи диагностичния процес, но не успява да опише клиничната комплексност на ВЗТ

Два основни подхода – според клиничната характеристика и според подлежащия молекулярен дефект

Според клиничната характеристика

Според подлежащия молекулярен дефект

Форми, свързани само с тромбоцитопения

Форми, асоциирани с допълнителни клинично значими вродени дефекти/синдроми

Radio‐Ulnar synostosis

Thrombozytopenia-absent radius syndrome

Abnormal maturation of megakaryocyte

deletion and/or mutations in the RBM8A gene

aplasia of radius, structural malformations, heart kidney defects

amegakaryocytic thrombocytopaenia

mutations in the HOXA11 gene

proximal fusion of the radius and ulna

Форми, асоциирани с тромбоцитопения и риск за развитие на други заболявания/предиспозиции

Патогенеза

2. Само при някои ВЗТ – дефект, водещ до намалена клетъчна преживяемост

Развитие на мегакариоцит - формиране на тромбоцит - тромбоцитна функция

Ниският тромбоцитен брой произтича от

1. При мнозинството от ВЗТ – дефект в 1 или повече фази от биогенезата на тромбоцита

Стволова клетка

Мегакариобласт Мегакариоцит

Стволово-клетъчна ниша Мегакариоцитна миграция

MPL THPO RBM8A - TAR HOXA11 - Амегакарицитна тр-пения с радиоулнарна синостоза ANKRD26 - ANKRD26-свързана тр-пения

GATA FLI1 Deletions in 11q23 RUNX1 ETV6 GFI1B

MYH9 FLNA ACTN1 TUBB1

Дефект в Мгк диференциация

Кръв

ен т

ок

Съдова ниша

Дефект в Мгк матурация Дефект в тромбоцитното отделяне

Вродена Амегакариоцитна Тромбоцитопения

Фамилно ТЗ с предразположение към AML iETV6- свързана Тр-пения

GATA1-свързана Тр-пения

GFI1B- свързана Тр-пения

May-Hegglin свързано заболяване

FLNA- свързана Тр-пения

WAS

ACTN1- свързана Тр-пения

TUBB1- свързана Тр-пения

Регулация на транскрипционните

фактори

Paris-Trousseau /Jacobsen синдром

Тромбопоетиновия сигналнален

път Цитоскелетни дефекти

(1.2) (1.1) (1.3)

ВЗТ, дължащи се на дефектна тромбоцитна функция(1.4)

ВЗТ, засягащи тромбоцитната адхезия (1.4.1) ВЗТ, засягащи тромбоцитната агрегация (1.4.2)

ВЗТ, засягащи тромбоцитната активация (1.4.3)

ВЗТ, засягащи прокоагулантната активност (1.4.5)

ВЗТ, засягащи тромбоцитната секреция (1.4.4)

ВЗТ, дължащи се на дефектна тромбоцитна функция (1.4.1)

1. Синдром на Bernard-Soulier – GP1BA, GP1BB, GP9 2. GPVI Дефицит – GP6 – рецептор за колаген 3. α2β1 (GPIa-IIa) – рецептор за колаген 4. Тромбоцитен тип на Болест на von Willebrand - GP1BA

Нарушения на тромбоцитната адхезия

ВЗТ, дължащи се на дефектна тромбоцитна функция(1.4.2)

Тромбастения на Glanzmann – ITGA2B, ITGB3

Вродена афибриногенемия – FGA, FGB, FGG

Нарушения на тромбоцитната агрегация

ВЗТ, дължащи се на дефектна тромбоцитна функция(1.4.3) Нарушения на клетъчната активация

(сигнална трансдукция) a. Дефекти на тромбоцитните рецептори TPα (тромбоксан A2), P2Y1 P2Y12 (ADP), α2A (епинефрин) b. Дефект в активацията на G-протеина Gαq дефицит, Gαs нарушения ,Gαi1 дефицит c. Нарушения в синтезните пътища на арахидоновата киселина и на тромбоксан A2 Нарушено освобождаване на арахидонова киселина, циклооксигеназен дефицит, дефицит на тромбоксан синтетазата.

ВЗТ, дължащи се на дефектна тромбоцитна функция(1.4.4)

Нарушения на тромбоцитната секреция platelet storage pool disease

Синдром на сивите тромбоцити (α-granuls) - NBEAL2 Quebec тромбоцитно нарушение (α-granuls) –PLAU Синдром на Hermansky-Pudlak - HPS1 – 7 Синдром на Chediak-Higashi -CHS1/LYST Синдром на артрогрипоза, бъбречна дисфункция, и холестаза (α-granuls) - VPS33B, VIPAS39

лекостепенно кървене Част от спектъра на синдром с

множество прояви

Обхваща нарушения с вариабилно намаление на броя и съдържанието на плътните δ-гранули и α-гранули, както и комбинирани дефекти

ВЗТ, дължащи се на дефектна тромбоцитна функция(1.4.5)

Синдром на Scott - ABCA1

ПРОКОАГУЛАНТНА ТРОМБОЦИТНА АКТИВНОСТ

Тромбоцитите играят важна роля във вторичната хемостаза или плазмената система на коагулацията – комбинация от протромбинов комплекс, тромбинова генерация и формация на фибрин.

Интактна първична хемостатична функция на тромбоцитите – нормални реакции на адхезия, агрегация и секреция

Тромбоцитите не подпомагат образуването на протромбинов комплекс и генерацията на тромбин.

ВЗТ, дължащи се на дефектна тромбоцитна преживяемост (2)

Тромбоцитен тип Болест на von Willebrand

Генът GP1BA кодира GPIba Нарушението е по тип „ gain-of function“ – мутации, които повишават афинитета на GPIba към фактора на von Willebrand

Синдром Wiskott-Aldrich X-свързана тромбоцитопения

Мутация, причинена от повишен клирънс на тромбоцити от ретикулоендотелната система и прематурно, ектопично отделяне на тромбоцити в костния мозък.

Диагноза на ВЗТ

Диагностиката на ВЗТ схематично преминава през два етапа

Разпознаване на пациентите, които имат вродена форма сред индивидите с тромбоцитопения

Диференциална диагноза на ВЗТ с цел диагноза на правилното

заболяване

Диагностичният процес трябва да се основава на съчетаване на старателна

клинична оценка и панел от лабораторни тестове.

Диагностичният подход трябва да следва поетапен алгоритъм

Препоръки на SSC на ISTH

Gresele et al.2015

ИДЕНТИФИЦИРАНЕ НА ПАЦИЕНТИ СЪС СУСПЕКТНИ ВЗТ Анамнезата – първо съмнение за ВЗТ

Оценка на вида, продължителността и тежестта на кръвоизливните симптоми.

(спонтанни или провокирани кръвоизливи, единични или множествени локализации на кървене, синини в неоткрити области, честота, продължителност на кървене и склонност за рецидив на кървенето, диспропорционалност на кървенето спрямо травмата, необходимост от трансфузии или наличие на желязодефицитна анемия, необясними екстензивни синини, епистаксис, менорагия, кървене по време на раждане, след инвазивни процедури и дентални екстракции) - Кървенето не обхваща стави и мускули (рядко изключение при ВЗТ с дефект в прокоагулантната активност (VWB))

Препоръчително използване на ”bleeding assessment tool“ (BAT)

Информация за прием на лекарства, вкл. билкови средства, антибиотици, НСПВС или необичайни храни (които са най-чести причини за тромбоцитна дисфункция).

Оценка на фамилните случаи на екзема, рекурентни инфекции, Миелодисплазия, Остра миелоидна левкемия.

Диагнозата не зависи от възрастта на пациента при дебюта (много пациенти с ВЗТ биват откривани след периода на детството)

ИДЕНТИФИЦИРАНЕ НА ПАЦИЕНТИ СЪС СУСПЕКТНИ ВЗТ

Физикален преглед

Оценява кръвоизливните манифестации, типични за ВЗТ. Оценява потенциални синдромални стигми – глухота, сърдечни, лицеви, костни

дисморфизми, очно засягане, умствено изоставане, липсваща кожна пигментация.

- Някои аномалии са явни, други по-трудно откриваеми и изискват целенасоченонасочено търсене.

Провеждане не първични лабораторни изследвания – ПКК, PT, aPTT и VWF скринингови тестова (VWF антиген, ristocetin cofactor активност), фактор VIII активност

Алгоритъм за провеждане на фенотипни и генетични изследвания при ВЗТ

Gresele et al.2016

Диагностичен процес: изследвания от първи етап

Изследването на натривка от периферна кръв е задължително

Големи Thr

Нормални Thr

Гигантски Thr

Малки Thr

‘Бледи’ Thr

Döhle-like включвания

Размер на тромбоцита

Малки WAS Големи BSS, GPS, GT-variant4 PT-VWD, PTS, VCF, ARC, GATA, Филаминопатия White platelet syndrome MYH9-RD

Нормални Всички останали ВЗТ

Тромбоцитна морфология

‘Сиви’ или ‘бледи’ тромбоцити GPS, ARC

Друга клетъчна морфология

Телца на Howell-Jolly Синдром Stormorken в еритроцитите Гигантски гранули в CHS eoзинофили, базофили и моноцити Дисеритропоеза GATA, GPS

Левкоцитни инклузионни телца MYH9-RD

Агрегатометрия/Light transmission aggregometry(LTA) (скрининг)

Нормална агрегация Синдром на Scott Всички агонисти

Епинефрин Нарушена агрегация

QPD, α 2 адренергични рецептори, GT, WAS, FPD/AML/MDS, LADIII, δ –SPD,PSD,cPLA2, ARC ,Синдром на белите тромбоцити.

ADP P2Y12 дефект, GPS, GT, WAS FPD/AML/MDS, LADIII, δ -SPD PSD, cPLA2, ARC

α 2β1,GPVI, δ –SPD, P2Y12 дефект, GT, Синдром на Stormorken, GPS, WAS, LADIII, PSD, cPLA2, ARC, GATA, FPD/AML/MDS, Синдром на белите тромбоцити. , Филаминопатия,

Колаген

COX-1,TP дефект, GT, P2Y12 defect, δ –SPD, FPD/AML/MDS, ARC, Синдром на белите тромбоцити.

Арахидонова к-на

PT-VWD, BSS, GATA1 Ристоцетин

Нарушена агрегация

Нарушена агрегация

Нарушена агрегация

Нарушена агрегация

Грануларно освобождаване Флоуцитометрия

Грануларно освобождаване (луминометрия, ELISA)

GPS, QPD, WAS, ARC Синдром на Stormorken

α- гранули Дефектно освобождаване

δ- SPD, HPS, CHS, WAS FPD/AML/MDS Филаминопатия

δ- гранули

α- δ гранули PSD, α- δ SPD

ФЦМ (скрининг)

GPIb/IX Дефект в експресията

GPIIb/IIIa Дефект в експресията GT

GPIIIa Дефект в експресията GT

BSS, VCF GPIb Дефект в експресията BSS

GT, синдром на Stormorken PKC дефекти

GPIIb/IIIa активация Дефект в активацията (PAC-1)

Дефектно освобождаване

Дефектно освобождаване

Next-generation секвениране

NGS позволява: Едновременнен анализ на големи групи от кандидат

гени

Бърза идентификация на известни генетични мутации Нов метод на избор за идентифициране на подлежащи

генетични варианти

Next-generation секвениране

Резултатите са трудни за интерпретация, използването им в посока подобряване на клиничната практика е предизвикателно

Изисква голям опит в областта на тромбоцитните болести, молекулярната биология, биоинформатиката за предсказване на клиничната значимост на новооткритите мисенс варианти

За потвърждаването на каузалността на новооткрит ген за ВЗТ е

необходимо експресирането на мутантния протеин в клетъчен модел.

Ограничения

Въпреки че NGS-базираните методи биха могли да революционизират диагностиката на ВЗТ, предварителното клинично и лабораторно

фенотипизиране остава от съществено значение.

Кои пациенти трябва да подлежат на генетични изследвания? При някои ВЗТ констелацията от клинични и лабораторни критерии е

достатъчна за окончателната диагноза (Тромбастения на Glanzmann, синдром на Bernard–Soulier).

За други генотипизирането е незадължително, но уместно (доказана корелация генотип/фенотип).

За всички останали случаи се препоръчва генотипизиране.

Биалелен синдром на Bernard–Soulier, Тромбастения на Glanzmann, Синдром на Wiskott–Aldrich, leukocyte adhesion дефицит III, тромбоцитен тип VWD, Синдром на сивите тромбоцити, GPIV и GPVI дефицит представляват нарушения, които могат да бъдат явно диагностицирани без необходимост от генетични изследвания.

ВЗТ, при които генотипизирането не е задължително

Генетичният анализ може да: Потвърди диагнозата. Позволи идентифицирането на нова мутация в известен ген. Разшири наличната генетична база с данни, позволявайки изследвания

върху корелацията генотип/фенотип.

Кои пациенти трябва да подлежат на генетични изследвания?

Тъй като е описана взаимовръзка генотип/фенотип, генотипизирането е уместно за по-точна прогностична оценка при: MYH9-RD, Синдром на артрогрипоза, бъбречна дисфункция и холестаза, Синдром на Chediak–Higashi, Hermansky–Pudlak, и Синдром на сивите тромбоцити. Синдромите на Stormorken и Scott, P2Y12 и ТР рецепторни дефекти са ВЗТ, при които фенотипът на тромбоцитите не може безспорно да се припише на това специфично разстройство, поради което се препоръчва генетично изследване

ВЗТ, при които генотипизирането е незадължително, но уместно

Редките моноалелни, доминантни варианти на Синдром на Bernard–Soulier и Тромбастения на Glanzmann (клиничната и лабораторната характеристика може да е объркваща; унаследяването им е различно от това (рецесивно) при класическите форми; GPIIb/IIIa или GPIb/IX/V са намалени, а не липсващи; тромбоцитната дисфункция е от вариабилна тежест)

Макротромбоцитопения при Филаминопатия, GATA1-свързани заболявания,

Gsα тромбоцитни дефекти, Синдром на Paris–Trousseau, cPLA2 дефицит, Quebec тромбоцитно нарушение, Tx синтетазен дефицит (изследванията на функцията на тромбоцитите може да са неубедителни поради хетерогенност на функционалните промени; съкращаване на сигналните пътища; несигурно охарактеризиране на само няколко описани случая)

Фамилно ЗТ, свързано с предиспозиция към Остра миелоидна левкемия. RUNX1 е ген често включен в патогенезата на спорадичната левкемия и миелодиспластичните синдроми, като еволюцията до левкемия зависи от вида мутация

ВЗТ, при които генотипизирането е препоръчително

Кои пациенти трябва да подлежат на генетични изследвания?

Молекулярната диагноза

Може да избегне допълнително/неправилно лечение

Набавя информация по отношение на необходимото проследяване и мониторинг

Може да даде информация за риска в семейството Доведе до значим напредък в разбирането ни за

тромбоцитите/ВЗТ през последните 10 години.

Take home points

NGS е възможна алтернатива на обширното тестуване на функцията на тромбоцитите при изследването на предполагаеми ВЗТ Идентифицирането на специфична ДНК вариация като каузална за ВЗТ при отсъствие на фенотипна информация е много предизвикателна.

ВЗТ представляват голяма и хетерогенна група от хеморагични диатези, вариращи по отношение на тежестта си – от леки до тежки, които могат да се асоциират с дефекти в костно-мозъчната мегакариопоеза и соматични дефекти

Поетапното тромбоцитното фенотипизиране остава есенциален елемент в диагнозата на ВЗТ и при идентифицирането на все още неразпознати форми на заболяване.

Накрая, широкото въвеждане през последните няколко години на NGS анализ доведе до откриването на нови гени, причиняващи ВЗТ и които могат да революционизират диагностичния подход към тези заболявания

Клинична оценка, Фамилна анамнеза, Физикален преглед,

Синдроми

Интерпретация на данни

лекари, генетици, биоинформатици,

учени

Обширни лабораторни изследвания

NGS генотипизиране

Благодаря Ви за вниманието!