Post on 16-Jun-2022
DANIEL GOUPIL
SYNTHÈSE ÉNANTIOSÉLECTIVE PAR CATALYSE ENZYMATIQUE DE DERIVES DE LA WARFARINE. DE L'ACIDE
CITRIQUE ET DE TROPANES
Mémoire
présenté à la faculté des études supérieures
de l'Université Laval
pour t'obtention
du grade de maître 6s sciences (M.Sc.)
Département de chimie
FACULTÉ DES SCIENCES ET DE GÉNIE
UNIVERSITÉ LAVAL
O Daniel Goupil. 1999.
National Library 1*1 of Canada Bibliothèque nationale du Canada
Acquisitions and Acquisitions et Bibliographic Services services bibliographiques
395 Wellington Street 395, rue Wellington Ottawa ON K 1 A ON4 Ottawa ON K I A ON4 Canada Canada
The author has granted a non- exclusive licence allowing the National Library of Canada to reproduce, loan, distribute or sel1 copies of this thesis in microform, paper or electronic formats.
The author retains ownership of the copyright in this thesis. Neither the thesis nor substantial extracts fiom it may be printed or otherwise reproduced without the author's permission.
L'auteur a accordé une licence non exclusive permettant à la Bibliothèque nationale du Canada de reproduire, prêter, distribuer ou vendre des copies de cette thèse sous la forme de rnicrofiche/film, de reproduction sur papier ou sur format électronique.
L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation.
A mes parents et mon frère.
Résume
La demande croissante de composés énantioménquement p u s a nécessité la mise
au point de diverses techniques. tant chimiques que biochimiques. Au cours des dernières
ruinées. l'utilisation d'enzymes et de micro-organismes dans la synthèse de composés
organiques est devenue de plus en plus populaire.
Le premier projet porte sur la résolution enzymatique de la wdarine. La
warfarine est un anticoagulant prothrombopénique utilisée sous forme racémique. mais
dont I'énantiomère (S)-(+) est cinq fois plus actif que le (R)-(-). On recherche une
methode simple de séparer les énantiomères.
Le deuxième projet repose sur l'acide citrique. dont on retrouve la structure dans
de nombreux composés naturels et synthétiques. Une désymétnsation de dérivés citrates a
été réalisée avec succès. permettant ainsi la synthèse asymétrique d'analogues. Ce projet a
doailleurs été publié en 1998 dans la revue Tetrahedron : Asyrnetry. volume 9. à la page
4335.
Enfin. le dernier projet consiste à faire la synthèse de dérivés d'esters de deux
alcaloïdes de type tropane, la pseudopelletierine et la tropinone. puis d'en accomplir la
résolution enzymatique. Les énantiomères ainsi obtenus pourront ensuite servir à la
préparation d'autres composés ayant des propriétés physiologiques intéressantes.
Remerciements
Je remercie mon directeur de maîtrise, le professeur Robert Chênevert, pour son
support, sa disponibilité et ses conseils tout au long de ces deux années de recherche.
Je remercie également tous mes collègues de laboratoire : Manon. Dave.
Mohammed, Marie-Pascale. Ghodsi. Yannick, Gabriel. ainsi que tous les autres que je
n'ai pas eu l'occasion de bien comaitre.
Je tiens à souligner le soutien financier du Conseil de recherches en sciences
naturelles et en génie du Canada (CRSNG).
Finalement. un merci chaleureux à mes chers parents et à tous mes amis, pour leur
aide et leur encouragement.
Table des matières
... Résumé .............................................................................................................................. iii Remerciements ........................................................................................................m........ iv
. . ............................................................................................................. Table des matieres v
.4 bréviations .................................................................................................................... 1 . . ................................................................................ . 1 Abréviations des composés: 1
. ......................................................*...*........................ 2 .Abréviations des enzymes I
2.1 Les estérases ....................................................................................... 1 3 7.7 Les lipases ............................................................................................. - 3 .................................................................................................... 2.3 Autres -
Introduction .......... ... ..................................................................................................... 3
................................................................................................ Concepts de biocatalyse 3
1 . Biocatalyse .......................................................................................................... 3 ......................................................................................... . 2 Les micro-organismes 3
......................................................... 2.1. Définition d'un micro-organisme 3 ........................................................ 2.2. L'utilisation de micro-organismes 4
2.2.1 . Avantages .............................................................................. 4 ......................................................................... 2.32. Inconvénients 5
........................................................................................................ 3 . Les enzymes 5 ....................................................................... . 3.1 Définition d'une enzyme 5
............................................................................. 3 .2 . Les types d'enzymes 6 ......................................................................... . 3 .3 L'utilisation d'enzymes 7
? - .............................................................................. . . J 3. 1 Avantages 7 7 C1 ....................................................................... . 3 . 2 .2 inconvénients 10
.......................................................................................... 3.4. Les lipases 12 ................................................................................ . 4 Mécanisme des hydrolases 13
5 . Approches ......................................................................................................... 13 ............................................................................................ 5.1 Résolution 14
................................................................................... 5 -2 Désymétrisation 14
PARTIE THEORIQUE .................................m.......................................m...m.................... 16
................................................ . A Essai de résolution enzymatique de la warfarine 17
1 . La warfarine ...................................................................................................... 17 ........................................................................................... 1.1 Généralités 17
.............................................................................. 1 . 2 Activité biologique 18 ........................... ........................... 1 . 3. Approches de la littérature .... 19
........................................................... 2 . Résolution enzymatique de la warfanne 19 ..................................................................................... 3 . Estérification chimique 20
................ 3 . 1 Estérification de la warfarine à partir de l'acide de Mosher 21 ................................................... 3.7 Estérification a partir de l'anhydride 71
33 3.3 Esterification de la warfarine a partir du chlomre d'acide .................. -- 33 .......................................................................................... 4 . Hydrolyse chimique --
............................ 6 . Hydrolyse enzymatique d'esters racémiques de la warfarine 23 6.1 Hydrolyse enzymatique de l'acétate de warfarine . dans un solvant
................................................................................................... organique 24 6.2 Hydrolyse enzymatique des esters de warfarine . dans un tampon
.......................................................................................... phosphate pH 7 25 7 . Acétylation enzymatique de la warfarine avec l'acétate de vinyle . dans un
.................................................................................................. solvant organique 16 .......................................... .................................. . 8 La cholestérol estérase (CE) .. 27
....................................................................................................... . 9 Conclusions 30
................................................ B . Désymétrisition en ymatique de l'acide citrique 31
................................................................................................. . I L'acide citrique 31 ........................................................................................... 1.1 Généralités 31
1.2 Utilisations biologiques ..................................................................... 32 .......................................................................... 1 -3 Utilisations humaines 34
1.3.1 Domaine alimentaire ............................................................ 34 1.3 .2 Domaine industriel ............................................................. 34
* 9 .................................................................. 1.3.3 Domaine médical 34 ............................................................. . 2 Résolution chimique dans la littérature 35
.......................................................................... 2.1 Méthode de Bergeron 35 ............................................................................. 2.2 Méthode de Ancliff 36 ........................................................................... . 3 Désymétrisation enzymatique 37
3.1 Désymétrisation enzymatique du citrate de triéthyle dans un tampon pH 7 ........................................................................................................... 37
................................ 3 2 Désymétrisation enzymatique du citrate protégé 38 3 2 . 1 Préparation des diesters protégés a ..................................... 38
vii
....... 3 - 2 2 Hydrolyse enzymatique des diesters (tampon pH 7) 39 3.2.3. Hydrolyse enzymatique des diesters 42. dans un solvant organique saturé en tampon pH 7 ................................................ 40
3.2.4 Estérification enzymatique du diacide protégé 4J dans le DIPE ....................................................................................... 41
......................................... . 3 .3 Détermination des excès énantiornériques II 4 . Détermination des configurations absolues .................................................... 43 . ....................................................................................... 5 Activité enzymatique 44
.................................................. 5.1 Lipase de Candida anrorcfica (CAL) 44
.............................................................. 5 2 La protéase u-chymotrypsine 45 5.3 L'estérase de foie de porc (PLE) ......................................................... 46
6 . Conclusions ....................................................................................................... 48 7 . Perspectives ...................................................................................................... 49
7.1 Topostine B ......................................................................................... 49 7.1 La malyngolide ................................................................................... 50
C . Résolution et désymétrisation enzymatique de tropanes .................................... 52
.................................................................................................... I . Les aicriloides 53 ........................................................................ 1.1 Pipéndines (et dérivés) 52
.......................................................................... 1 2 Tropanes (et dérivés) 52 ............................................................................. 1 2 . 1 La cocai'ne 53
......................................................................... 1 2.1 L'épibatidine 53 - " 1.2.;. La ferruginine ...................................................................... 33
1.2.4 La tropinone e t la pseudopelletierine ................................. 58 .............................. 2 . Résolution chimique de la pseudopelletierine et tropinone 58
3 . Résolution enzymatique de la pseudopelletierine et de la tropinone ................ 59 ................................... 3.1 Synthèse de la pseudopelletierine et tropinone 59
3.2 Synthèse des dérivés méthoxycarbonylés de la pseudopelletierine et de la tropinone ................................................................................................ 60
......... 3.3 Approches de résolution enzymatique de la pseudopelletierine 62 3 -3.1 Hydrolyse enzymatique des composés 84a-b, dans un tampon
............................................................................................... pH 7 63 3 . 3 2 Hydrolyse enzymatique du composé 84b , dans le benzène
................................................................... saturé en tampon pH 7 64 3.3.3 Acçtylation enzymatique du composé 84b, dans un solvant
..................................... organique anhydre ... ................................. 65 ..................... 3.3.4 Acétylation chimique de la pseudopelleiierine 66
3.3.5 Hydrolyse enqrnatique du composé 85. dans un tampon pH 7 ...................................................................................................... 66
4 . Synthèse formelle de la femginine ............................................................... 67
....................................................................................................... 6 . Conclusions 68 7 . Perspectives ................................................................................................. 69
. . . 7.1 Synthèse de denves tropanes ............................................................. 69 7.2 Modification de la réaction de Robinson ............................................ 69 7.3 Désymétnsation enzymatique de la pseudopelletienne ...................... 70
........................................................... 7.4. Ozonolyse de dérivés tropanes 71 ...................................................... 7.5 Synthèse de dérivés d'oxatropanes 72
D-Conclusion générale ............ .. ............................................................................. 74
PARTIE EXPERIMENTALE ................... .. ...... ..... .................................................. 75
....................................................................................................... Remarques gthérales 76 .............................................................................................................. 1 . Analyse 76
2 . Réactions ........................................................................................................... 77 . . 3 . Réactifs .............................................................................................................. 77
............................................................................................................ . 4 Enzymes 78 A . Essai de résolution enzymatique de la warfarine ................................................ 79
............................................................ . 1 Estérification chimique de la warfarine 79
1.1 Estérification de la warfarinr à l'aide de l'acide de Mosher ................ 79 1.2 Estérification de la warfarine à partir des anhydrides ......................... 80 1.3 Estérification de la warfiuine à partir du chlorure d'acide .................. 82
............................................ . 2 Hydrolyse chimique de l'acétate de warfarine 1 84 3 . Résolution enzymatique ................................................................................. 84
........................ 3.1 Hydrolyse enzymatique des esters de la warfarine 84 ....................................... 3.2 Acétylation enzymatique de la warfarine 85
................................................ B . Désymétrisatioo enzymatique de l'acide citrique 86
.............. 1 . Désymétrisation enzymatique du citrate de triéthyle .................. .... 86 ............................ . 2 Préparation des diesters protégés 42a-b .. ................... 87
....................................................... 2.1 Préparation du diacide protégé a 87 .............................................. 2.2 Préparation des diesters protégés 42a-b 88
3 . Désymétrisation enzymatique des citrates protégés .......................................... 90
........................... 3.1 Hydrolyse enzymatique des diesters protégés 42a-b 90 3.7 Estérification enzymatique du diacide protégé fi .............................. 91
........................................................ 4 . Détermination des excès énantiomériques 92 4 . l .4 vec le citrate de diéthyle ........................................................... 92 4.7 Avec les esters protégés 37a-b ......................................................... 93
. . ......................................................................................... 5 . Corrélation chimique 95 . 5 l Ouverture de cycle des esters protégés 37a-b ..................................... 95
2.1 Ouverture de cycle du méthylester protégé j7a et transestérification . 96
C . Résolution et désymétrisation enzymatique de tropanes .................................... 97
. ..........................................*...... 1 Synthèse de la pseudopelletierine et tropinone 97 ............................................... . 1 Synth2se des dérivés méthoxycarbonylés 84a-L) 98
........................................................... 3 . Acétylation chimique du composé 84b 100 ....................................................... 4 . Résolution enzymatique du composé 84b 101
4.1 Hydrolyse enzymatique du composé 84b .......................................... 101 4.2 Acétylation enzymatique du composé 84b ....................................... 1 02
............................................ 4.3 Hydrolyse enzymatique du composé a 103 ............................................................................... . 5 Synthèse de la ferruginine 103
..................................................................... 5.1 S ynthese du tnflate & 103
5.2 Synthèse du composé 87a ............................................................... 104
.................................................................................................... BIBLIOGRAPHIE 106
Abréviations
Voici les listes d'abréviations utilisées dans ce mémoire. pour les composés et les
enzymes.
1. Abréviations des composés:
AczO 1 Anhydride acétique
DIPE
1
DME: 1 2.1-diméthortyéthane
diisopropy lester
DMAP: 4-diméthylaminopyridine
DMF: N.N-diméth ylformamide
DMP:
I
EDC: 1 1 -(3 -diméthy laminopropy 1)-3-éthylcarbodiimide c hlorhy drate
2.2-diméthoxypropane
DMSO:
MBA /
diméthy lsulfoxyde
(S)-(-)-a-méthy lbenzy lamine i
NEA 1 (S)-(-)-( 1 -naphty 1)éthylamine
2. Abréviations des enzymes
2.1 Les esterases
pyr.:
THF:
1 AE 1 Acéty 1 estérase (pelure d'orange)
p y ridine
tétrahydro fume
CE Cholestérol estérase
PLE I
1
Estérase de foie de porc
2.2 Les lipases
La mention "species" signifie que la lipase provient de souches indéterminées du
micro-organisme.
1 '4NL 1 Aspergillus niger 1 CAL
I
1
C'crndida anrarctica
I CCL Candida cylindracea
CSL Candida (species) 1 l
!
P C L 1 Psettdomonas cepacia
GCL
MSL
Geotriczrrn candidztrn ! iWucor (species)
I i
, PPL pancréas de porc i
I PEL l
PFL
C 1
RNL I R hizop us Nive us 1 I
Penicilium (sprcies)
Psetrdomonus flurescens
1
WGL 1 germe de blé
RSL
2.3 Autres
Rhizopus (species)
1 a-chym i a-c hy motrypsine
S-C subtilisine carlsberg
S-BPN'
1
BY 1 levure du boulanger (micro-organisme) 1
subtilisine BPN'
Pan pancreatine
Introduction
Concepts de biocatalyse
1 . Biocatalyse
Pour répondre au besoin de composés énantiomériquernent purs. la recherche en
chimie organique s'est orientée vers diverses solutions. On utilise par exemple des
catalyseurs asymétriques ou des produits naturels chiraux peu dispendieux (des acides
aminés ou des terpènes). Un autre domaine a également été mis a contribution : celui de
la biocatalyse. On utilise le terme biocatalyse (ou biotransfonnation) pour décrire toute
réaction chimique aidée par un micro-organisme ou une enzyme.
2. Les micro-organismes
2.1. Définition d'un micro-organisme
Comme son nom l'indique. un micro-organisme est un organisme microscopique,
végétal ou animal. Dans certains cas, ils peuvent être pathogènes. causant des maladies
dans les organismes envahis. Mais dans d'autres. il peut s'établir une symbiose entre
l'hôte et le parasite, dont la présence mutuelle peut être bénéfique pour les deux. comme
dans le cas de la tlore intestinale.
L'utilisation de micro-organisme par I'être humain est très ancienne, précédant la
compréhension même des phénomènes impliqués. Le rôle de la levure de boulanger dans
la fabrication du pain n'est qu'un exemple p m i tant d'autres.
Les avantages et inconvénients de la biocatalyse par micro-organisme dans la
synthèse asymétrique fera l'objet de la section suivante.
2.2. L'utilisation de micro-organismes
2.2.1. Avantages
Les micro-organismes partagent certains avantages reliés à la présence d'enzymes
(qui seront traitées à la section 3.3). Ajoutons a ceux-ci la simplicité de leur utilisation.
On peut les reproduire. à partir d'un petit échantillon. Leur isolation est plus simple que
dans le cas d'une enzyme spécifique. Ceci contribue à diminuer grandement le coût relié à
leur utilisation. Favorisant ainsi leur implication dans des procédés industriels. tel que la
synthèse de la vitamine C '(schéma I ) :
CHO C02H C02H C02H I
oxydation (fermentation) - Ho s téréosélectiw
OH Acetobacter f" OH Me2NHBH3 otf
acide L- ascorbique 6 -
acide 0- 2Sdiaceb gluconique
g
CH~OH CH20H i 8 : 9 2 ) L-& PB
acide cetoglucontque
destruction Reudomonas de i'isomére D fluorescens
Schéma 1
Cette synthèse fait appel à deux types différents de micro-organismes. Le produit
de départ est un sucre très peu dispendieux, le D-glucose (-). Celui-ci est oxyde en acide
D-2.5-diacétogluconique (2 par l'Acetobacterfragrum, qui est réduit sélectivement par le
Me2NHBH3 en composés & et &. Ensuite, on élimine (par digestion de Pseudomonas
flrrorescens) l'énantiomère D (-), puis après conversion en ester 4 et énolate on
obtient finalement l'acide L -ascorbique (6).
2 2.2. Inconvénients
Le principal inconvénient provient d'une mutation possible chez le micro-
organisme. C'est-à-dire que deux échantillons de Pseirdomonas fltrorescens d'origine
diffirente pourraient donner des résultats variables. s'iis ne proviennent pas de ia mSme
souche. En effet. une mutation poumit modifier un aspect du micro-organisme. L'effet
peut se traduire par une baisse de rendement. d'excès énantiomériques (ex.), voire même
une perte de I'eRet catalytique.
Il est plus compliqué d'extraire le composé désiré. à cause de la présence des
micro-organismes mêmes. mais aussi de produits secondaires qui peuvent être formés.
Finalement. comme le micro-organisme se nourrit du substrat, le rendement peut Stre
moins élevé.
3. Les enzymes
3.1. Définition d'une enzyme
Une enzyme est une protéine constituée d'acides aminés reliés entre eux par des
liens peptidiques. Cette structure se replie pour former un ensemble tridimensionnel. qui
renferme un site actif à l'intérieur duquel le substrat doit pénétrer. Selon la situation. la
réaction catalysée peut être chimio-. régio- ou stéréosélective.
Certaines enzymes requièrent un cofacteur (par exemple le NADH pour une
réduction) qui doit être régénéré Ni situ. D'autres contiennent un atome (fer, zinc, etc.) au
site actif, essentiel à ia catalyse.
3.2. Les types d'enzymes
En ce moment. près de 3 000 enzymes ont été reconnues par l'International Union
of ~ i o c h e m i s f ~ y , et si on se base sur la spéculation qu'il y aurait environ 25 000 enzymes
dans la nature3. il y a la un vaste potentiel. inutilisé à près de 90%. Mentionnons toutefois
que de ces 3 000 enzymes répertoriées. seulement -15% (soit a peu près 300) sont
disponibles ~omrnercialernent.~' On en a identifié six catégories, selon le type de rkaction
Les nombres entre parenthèse font référence. respectivement. au nombre d'enzymes
répertoriées dans cette catégorie, au nombre qui sont disponibles sur le marché et à leur
utilisation approximative. pour la période 1987-88.j
1.
. . Il .
. . . 111.
iv.
v.
vi.
oxydo-rédiictase: elle catalyse les réactions d'oxydoréductions. comme
l'oxygénation de liens C-H. C-C et C=C. ainsi que I'addition ou l'élimination
d'atomes d'hydrogènes équivalents. (650 / 90 1 25%)
transfbrasr: cette classe assure le transfert de groupements tels que les aldéhydes,
cétones. acyles. sucres. phosphoryles ou rnkthyles d'une molécule vers une autre.
(720 / 90 / 4%)
hylroiuse: celle-ci est impliquée dans l'hydrolyse ou la formation d'esters. amides.
lactones. lactames. ipoxides. nitriles. anhydrides et glycosides. (636 1 125 1 65%)
[yase: elle catalyse I'addition ou l'élimination de petites molécules sur des liens
C=C. C=N ou C=O. (255 / 32 / 5%)
isomérase: elle est impliquée dans les isomérisations. telles la racémisation et
epirnénsation. (120 / 6 1 4%)
iigase: cette classe catalyse la formation ou le bris de liaisons C-O. C-S, C-N et C-
3.3. L'utilisation d'enzymes
L'utilisation d'enzymes en synthèse organique a progressé à pas de géant au cours
des 10 dernières années. Des centaines de publications (pour une proportion de 8% des
publications en chimie organique en 1991 ") de même que des livres spécialisés ont fait
leur apparition. De plus en plus de chercheurs utilisent les enzymes pour rksoudre un
large éventail de problèmes.
3.3.1. Avantages
Tels que mentionnés. les avantages sont nombre~x."~ Par exemple:
1.
. . I l .
. . . 111.
les enzymes sont d'excellents catalysews: elles accélèrent généralement la vitesse de
réaction d'un facteur de 10'- 10" et requiert une quantité de produit plus faible qu'un
catalyseur chimique pour produire le même effet.
elles peuvent opr'rer dans des conditions cfoirces: elles opèrent dans un milieu de pH
d'environ 7. à des températures de 20 à 40°C. ce qui permet de diminuer les
réactions secondaires (décomposition. racémisation. etc.). Dans le schéma ci-
dessous. on constate qu'on peut éviter la décomposition que l'on obtiendrait lors de
l'hydrolyse chimique de l'ester du çyclopentadiene (schéma 2)':
7 - Schéma 2
il existe une enzyme pour à peu près toutes Zes réactions: les exceptions comportent
les réactions de Diels-Alder et le réarrangement de Cope. Notons également qu'une
enzyme peut catalyser une réaction sur un composé très différent de son substrat
naturel. Ceci est dû à la grande flexibilité du biocatalyseur, lui permettant ainsi
d'accommoder un produit d'une taille variable. tant que certains critères sont
respectés. Malheureusement, cet aspect est encore assez méconnu.
iv. elles démontrent trois types de sélectivité:
(a) la chimiosélectivité: la capacité de catalyser un type de fonction particulier.
(b) la rigioselectivité et diastéréosdectivire': la capacité de distinguer des types de
fonctions identiques. mais situés dans des régions différentes de la même
molécule. L'hydrolyse régiosélective d'un sucre 5 par la lipase de pancréas du
porc (PPL) ' est rapportée au schéma 3:
Y 0 - Y 0 tampon
+ HO
* " - 90% OH 5.10 Oy
Y = COR, R = alkyle
Schéma 3
(c) l 'inuntirnilecriviré: la capacité de distinguer entre deux énantiomères ou entre
les groupements énantiotopiques d'un composé méso ou prochiral.
C'est ce dernier avantage qui intéresse le plus les chercheurs des domaines
agrochimiques et pharmaceutiques. En effet. les isomères des composés biologiquement
actih ont parfois des effets différents.
Dans le cas ou un énantiomère est plus actif que l'autre. le plus actif est appelé
eutomcre et le moins actif, le distomère. Le dexchlorpheniramine (9). un antagoniste
chiral du récepteur H i de l'histamine. est hautement stéréosélectif: l'isomère (S)-(+) est
environ 200 fois plus réactif que l'isomère (R)-(-).8
Les énantiomères peuvent avoir des effets complémentaires. L'indacrinone (o)
est un diurétique (augmente l'excrétion de l'eau) possédant un effet secondaire de
rétention de l'acide urique. Malheureusement, l'énantiomère (+) possède l'activité
diurétique et l'effet secondaire. Par contre. l'énantiomère (-) est un agent réduisant le
niveau d'acide urique.'
OOH
Les énantiomères peuvent avoir des effets thérapeutiques différents. Darvon $0. le
(2s. 3R)-(+)-dextropropoxyphene ((+)-II). est un analgésique et son énantiomère
Novrad (Bi. (-)-II. est un antitussif. l0 Ces deux activités n'Çtant pas complémentaires. ces
énantiomères sont vendus séparément.
I l est aussi possible que les inantiornères aient des effets opposés. comme
l'isomère (-) du picenadol (-) qui présente une activité de calmant (antagoniste). tandis
que le ( + ) - entraîne un effet convulsif (agoniste). Le mélange racémique est quant à lui.
un agoniste prtiei.' '
II y a également nombre de molécules qui démontrent des affinités pour plusieurs
ricepteurs différents. comme le labetalol (5, un antagoniste des récepteurs a- et P- adrénergiques. Dans cet exemple. les affinités varient selon i'isomere impliqué. L'isomère
(RR) bloque le récepteur P- de façon prédominante. tandis que le (SR) bloque
principalement le récepteur a-. Les deux autres isomères. (SS) et (RS). sont presque
inactifs.
Dans le cas des bloqueurs P-adrénergiques. antiépilrptiques et anticoagulants
oraux. 90% des médicaments sur le marché sur des racémiques. Cette proportion diminue
à 50% pour les antihistarnines. anticholinergiques et anesthésiques locaux. En général.
environ 25% de tous les médicaments sont vendus en racémique."
La situation est amenée à changer. à cause des pressions ~é~is ia t ives '~ . notamment
par la FDA (Food and Drugs Administration). aux États-unis.
3.3.2. Inconvénients
I l y a évidemment des inconvénients à l'utilisation des enzymes. Entre autres. elles
ne sont disponibles que sous une seule configuration (contrairement aux catalyseun
chimiques) et démontrent un mavimum d'activité dans l'eau (un solvant très dificile à
éliminer).
Notons cependant que les enzymes peuvent dans certains cas opérer tout aussi
bien (parfois mieux) dans un solvant organique peu polaire (par exemple hesane.
dichlorométhane? benzène ou éther diisopropylique. mais pas le méthanoi qui dénature
les enzymes!). Un solvant organique offre plusieurs possibilités. Saturé en eau. il permet
une hydrolyse. Strictement anhydre, on peut accomplir une acétylation.
De récents travaux ont démontré qu'un abaissement de la température sous O°C
(ex. de 99% à 40°C) peut favoriser une augmentation de l'excès Cnantiomère et du
rendement.'" Certaines enzymes (de micro-organismes dits "extrêmophiles") peuvent
igalemrnt être chauffées jusqu'à des températures de 80°C. On a également accompli des
résolutions de composés en les chauffant périodiquement. durant de courtes périodes.
dans un four micro-onde'' .
Bien qu'une enzyme ne soit effectivement disponible que sous une seule
configuration. notons que deux enzymes de types différents peuvent se compléter. II est
igalement possible que deus voies différentes permettent d'obtenir un énantiomére ou
l'autre, comme dans cette dt%ymitrisation
antarcticn (CAL) (SC héma 4) '' : de tetrahydropyranes par la lipase de Candida
R = TBS, MOM
pyridine
OR 1
Schéma 4
Ainsi qu'on peut le constater. l'utilisation des enzymes ne doit pas être considérée
ni comme une solution miracle, ni comme une intrusion indésirable de la biochimie en
synthèse organique. Les avantages qu'elles ofient doivent être envisagés comme une
alternative a des voies de synthèse plus conventio~elles. De même. on doit tenir compte
des coûts associés et des problèmes qui risquent de survenir. Quoiqufil en soit. elles ont
su se tailler une place dans plusieurs procédés industriels.
3.4. Les lipases
Les lipases constituent une sous-catégorie des hydrolases. Bien que leur rôle
naturel consiste à la formation et a l'hydrolyse des lipides (autrement dit. la
transformation des triglycérides en acides gras et glycérol et vice-versa)''. les chercheurs
ont démontré leur capacité à hydrolyser d'autres types d'esters. et même certains
thioesters l x .
Les lipases sont également stables dans de nombreux solvants organiques et
résistent à des températures élevées1'. Elles ne nécessitent ni coenzyme. ni cofacteur. ce
qui contribue à diminuer leur coüt et la facilité de leur utilisation.
Autre particularité de ce type d'enzymes. elles démontrent souvent une activité
supérieure lors de réaction à l'interface de milieux hydrophobes et hydrophiles. tel l'eau et
un alcane20. Ainsi un produit pourra parfois réagir. malgré une faible solubilité dans le
solvant utilisé. Finalement. mentionnons que l'utilisation d'un Cmulsifiant (tel que le
Triton-X) permet dans certains cas d'augmenter le rendement etlou 1'e.e.
Tout ceci permet d'expliquer l'énorme succès des lipases. La plus utilisée est
isolée de Candida anfarctico (CAL). Cette enzyme est particulièrement efficace. robuste
et catalyse une grande variété de réactions. Anderson et ses collaborateurs ont publié en
1998 un article de fond sur la CAL."'
4. Mécanisme des hydrolases
Les hydrolases dites à senne reposent sur une triade catalytique dans le site actif
de l'enzyme pour modifier un substrat. Cette triade est composée de I'acide aspartique
(ASP). de l'histidine (HIS) et de la serine (SER) (schéma 5). Les deux acides aminés
(ASP et HIS) contribuent à diminuer le pKa du proton du groupement hydroxyle de la
sérine. par le processus d'échange qui est indiqué sur le schéma 5.
ASP
\ -
dro L'oxygène de I'h!
SER
RCOOH
RCOOR"
J R"'NH2 * RC(=O)NHW1
Schéma S
xyle de la SER peut alors attaquer le substrat (et dans cet
exemple. libérer une molécule d'alcool). Dans ce complexe enzyme-substrat. I'knergie
nécessaire pour atteindre l'état de rransition est diminuée. ce qui permet a un nucléophile
d'attaquer plus rapidement et facilement le substrat. Le produit est ensuite libéré,
l'enzyme est régénérée et le cycle catalytique peut se poursuivre.
Bien que l'hydrolyse (Nu = H20), soit le cas le plus fréquent. il est également
possible d'accomplir une transestérification. de former un amide, etc.
5. Approches
Les approches utilisées en biocatalyse pour obtenir des molécules chirales peuvent
se résumer en deux principaux types : résolution et désymétrisation.
5.1 Résolution
Une résolution consiste à séparer les énantiomères d'un mélange rackmique
(schéma 6). On utilise un biocatalyseur qui permet une réaction énantiosélective. Ainsi
l'un des énantiomères est modifié. ce qui permet ensuite d'en faire la séparation selon un
procédé usuel. L'inconvénient de cette approche est que le rendement sera de 50%. dans
le meilleur des cas. Comme exemple. on retrouve la résolution d '~~ox~-es ters '~ .
racémique rendement < 50%
exemple:
R' = H, Me, Et, n-Pr
Schéma 6
5.2 Désymétrisation
Une disymétnsation consiste à retirer le plan de symétrie retrouvé dans une
molécule dite prochirale (schéma 7). comme dans un misa-diacétateZ3:
exemple:
Schéma 7
C e mémoire décrit des projets reposant sur la biocatalyse lors de l'étape-clé. Ces
projets sont la résolution de la wdarine. la désymétrisation de dérivés de l'acide citrique
et la résolution de tropanes. Les qualités recherchées sont la simplicité et l'efficacité
(rendement élevé et e.e. 2 90%).
PARTIE THÉORIQUE
A. Essai de résolution enzymatique de la warferine
1. La warfarine
1.1 Généralités
La warfarine (u) est un composé dérivé du dicournarol (i5) (famille des
coumarines) possédant des propriétés anticoagulantes. Elle est préparée par une
condensation de Michael de ia benzalacétone et du 4-hydroxycoumarin.2"
Le composé est très soluble dans l'alcool et l'eau. En solution. la warfarine est en
tiquilibre sous 2 formes (deux hémicétals cycliques et une forme ouverte). comme on peut
le constater dans le schéma 8 :
16a - 16b - Schéma 8
Dans le chloroforme. les proportions sont de 45% pour i'hémiacétal cyclique
majeur. 40% pour l'hémiacétal cyclique mineur et seulement 15% de warfarine ouverte.
Dans le DMSO, le pourcentage est de 70:30:0 pour chaque forme, re~~ectivernent.'~
1.2 Activité biologique
La warfarine est un anticoagulant prothrombopénique. Elle agit en inhibant
compétitivement la vitamine K. nécessaire à la production de prothrombine. responsable
de la coagulation naturelle du sang. Son action est lente. parce que la prothrombine
possède une demi-vie plutôt longue (soit environ 60 heures). "a
Des 1948, la warfarine fut utilisée comme raticide. Les animaux meurent
d'épuisement causé par de multiples hémorragies.26b Elle est unique du fait qu'die doit
Stre consommée à plusieurs reprises avant de causer la mort (3 à I O jours chez les rats) et
qu'il n'en faut qu'une dose infime pour être efficace (0.025% à 0.05% dans la noumture et
0.005% dans l'eau). Ceci contribue à en faire un des raticides les plus sécuritaires et les
plus utilisés.
Depuis 1952. la warfarine de sodium ou potassium est utilisée comme
médicament. Elle est prescrite (sous plusieurs noms commerciaux. tels cournadin et
warfilone) pour prévenir la formation de caillots. lors de risques d'embolie pulmonaire.
de fibrillation auriculaire. chez les porteurs de valvules artificielles et tous les cas du
Ses effets ne sr faisant pas sentir avant 2 ou 3 jours, un autre anticoagulant
d'action rapide lui est habituellement associé. comme l'héparine (l'anticoagulant naturel
du corps humain). En cas de surdoses. elle provoque des hémorragies excessives (d'où sa
première vocation. comme poison).
Grâce à son efficacité par voie oraie. elle rivalise le dicoumarol. Elle peut aussi
être administrée par voie intraveineuse. puisqu'elle est soluble dans l'eau.
Elle est utilisée sous forme racémique. pour des raisons économiques. Cependant.
l'énantiomère (S)- ( - ) est cinq fois plus actif que le (R)-(+). et il est éliminé plus
Il est donc important de les séparer avant de procéder à des études
cliniques. d'autant plus que l'interaction de certains médicaments avec chaque
énantiomère est différente. Par exemple, administrée avec la phénylbutazone,
l'élimination du (S)-(-) est ralentie, tandis que celle du (R)-(+) est accélérée."
1.3. Approches de la littérature
La méthode usuelle est estérification de la warfarine avec un composé chiral.
tel la carbobenzyloxy-L-proline ( ) (schéma 9))'. puis la séparation des
diastéréoisomères ainsi formés, par chromatographie liquide haute performance.
EDC ou pyr. CH2Q I
mouo séparation des diastéréoisorneres
Schéma 9
2. Résolution enzymatique de la warfarine
L'approche retenue dans ce mémoire est une risolitrion, selon les deux possibilités
illustrées dans le schéma 10. La première est une acétylation enzymatique dans un
solvant organique. La deuxième est une hydrolyse enzymatique d'un ester racémique de
la warfarine (obtenu par voie chimique). Rappelons que ces deux méthodes sont souvent
complémentaires (c'est-à-dire qu'elles permettent d'obtenir chacune un énantiomère
différent). comme nous l'avons mentionné dans l'introduction. Évidemment, pour réussir
la résolution, il faudra trouver une enzyme capable de faire la réaction avec un e.e. d'au
moins 90%.
acetyîation enzymatique t
OH CH2C(=O)CH3
estérification hydrolyse R(O=)CO CH2C(=O)CH3 emymatique * chimique [R = alkyie]
Schéma 10
Cet approche est retenu. à cause de sa simplicité. En effet. la warfarine est
disponible commercialement (sous forme racémique).
3. Estérification chimique
Quatre esters de la warfarine ont été préparés, dont trois pour la résolution
(acétate. octanoate et hexadecanoatej et un quatrième pour la détermination des excès
énantiomériques (ester de I'acide de Mosher).
Trois méthodes différentes ont été utilisées pour obtenir les esters désirés: la
réaction avec l'acide approprié. avec l'anhydride et enfin avec le chlorure d'acide
correspondant. La méthode retenue pour chaque ester a été dictée par la simplicité de la
réaction et la disponibilité des composés.
L'acétate a été obtenu à partir du chlorure d'acétyle et de l'anhydride acétique,
I'octanoate, à partir du chlorure d'octanoyle, I'hexadécanoate, à partir de l'anhydride
palmitique, et enfin, l'ester de Mosher, par réaction directe avec l'acide.
Bien que la warfarine ouverte ne compte que pour environ 15% des formes en
équilibre en solution, l'ester de la forme cyclique de la warZ-aine (16a-b) n'a pas été
observé. Le fort encombrement stérique de l'hydroxyle (carbone quaternaire) en est
probablement responsable. L'équilibre est déplacé afm de favoriser la formation des
esters non-cycliques.
3.1 Estérification de la warfarine à partir de l'acide de Mosher
La première méthode consiste à faire réagir un des énantiomères de l'acide de
Mosher (a avec la warfarine. en présence dEDC et DMAP (schéma 11).
EDC, DMAP
W C b )&=Fi k 0
OCH
21 -
Schéma 11
En RMN proton. on observe un dédoublement des pics associés aux 2 centres
chiraux. soient à 2.16 / 2.14 ppm (CH) et 3.74 / 3.71 ppm (OCH3). Les diastéréoisomères
2 1. prkparés à partir de la warfarine racémique. révèlent des pics d'intégration semblables --
pour les deux isomères. Cette technique pourra donc Stre utilisée afin de déterminer les
ex . des produits des essais enzymatiques.
3.2 Estérification à partir de l'anhydride
La seconde méthode est une réaction de l'anhydride acétique ou palmitique avec
la warfarine racémique, en milieu basique (schéma 12). La réaction se fait avec
l'anhydride palmitique, malgré l'encombrement stérique important. Ces esters serviront
aux essais d'hydrolyse enzymatique.
K A +
R O R
Schéma 12
3.3 Estérification de la warfarine à partir du chlorure d'acide
La dernière méthode consiste à faire réagir la warfixine racémique (-1 avec le
chlorure d'acétyle ou d'octanoyle. La réaction avec le chlorure d'acétyle servait
uniquement à confirmer la structure de l'acétate de warfxine et n'a pas été optimisée.
C'est plutôt la deuxième mithode qui a kté utilisée pour produire cet ester en grande
quantité. L'octanoate de warfarine (m) servira dans les essais d'hydrolyse enzymatique.
+ / /' 0 / \ DMAP R
OH CH, THF ) R(O=)CO CH2C(=O)CH 3
Schéma 13
4. Hydrolyse chimique
Les esters sont tous stables en milieu aqueux neutre. En milieu basique (par
exemple, avec l'hydroxyde de sodium). l'acétate est hydrolysé et on récupère la
warfarine (schéma 14). La grande solubilité de celle-ci dans l'eau explique le rendement
un peu plus faible.
La détermination des e.e. des esters nécessite d'abord l'hydrolyse, puis une
estérification de la warfarine ainsi obtenue avec l'acide de Mosher.
19a - 14 -
Schéma 14
6. Hydrolyse enzymatique d'esters racémiques de la warfarine
Dans les essais d'hydrolyse enzymatique sur esters (principalement l'acétate).
deux méthodes ont été utilisées: hydrolyse dans un milieu aqueux (tampon phosphate) et
hydrolyse dans un solvant organique saturé en tampon phosphate.
6.1 Hydrolyse enzymatique de I'acétate de warfarine, dans un solvant
organique
Les données des premiers essais enzymatiques se retrouvent au tableau 1.
Tableau 1: Hydrolyse enzymatique de I'acétate de warfarine, à la température
de la pièce, dans un solvant organique saturé en tampon pH 7
enzyme m / \ soitant *
HICKO CH2C(=O)CH3 OH CH2C(=O)CH3
0 - 14
Solvant Enzyme Durée Composé
CHClj PPL J j décomposition
PSL. 4 j 19a
DIPE CCL 7 j 19a
CE décomposition
ANL 19a
PSL 19a
PCL 19a
GCL 19a
PEL 19a
RNL 19a
RSL 19a
MSL 19a
Dans les cas de PPL et CE, aucun composé spécifique n'a pu être identifié, étant
donné l'impossibilité de les isoler. Il semblerait que le substrat ait été décomposé. Pour
tenter d'empêcher la décomposition du substrat et d'augmenter l'activité enzymatique, le
solvant organique est remplacé par un tampon phosphate (pH 7).
6.2 Hydrolyse enzymatique des esters de warfarine, dans un tampon
phosphate pH 7.
Le tableau 2 résume les essais d'hydrolyse enzymatique dans le tampon pH 7.
Tableau 2: Hydrolyse enzymatique des esters de warfarine,
à II température de la pièce, dans un tampon pH 7
enzyme tampon
RKO CH2C(=O)CHi OH CH2C(=O)CH3
0 R=CH3 - 19a - 14
(CH211 4CH3 (CH2)6CH3
Substrat Enzyme Durée Composé
19a PPL 6 j t9a
CCL 6 j 19a
CE 24 h 19d14
PSL 6 j 19a
RNL 6.i 19a
WGL 6.i 19a
PLE 6.Î 19a
AE 61 19a
PCL 6.i 19a
PFL 6 j 19a
PEL 6 j 19a
a-c h y n 6 j 19a
Dans l'essai d'hydrolyse de l'acétate par la cholestérol estérase (CE), après une
conversion d'environ 50% du produit de départ (déterminée par chromatographie sur
couche mince). on récupère près de 50% de l'acétate. mais qu'une petite quantité de
warfarine. L'acétate lui-même (ou hydrolysé chimiquement en warfarine) démontre un
pouvoir rotatoire nul. On conclut alors que cette réaction n'est malheureusement pas
stéréosélective. Dans la littérature3'. on retrouve [ a ] " ~ = + l 5 3 et - 15.5 pour (+)-M et ( -
)-M. respectivement. dans l'acétonitrile.
Puisqu'une chaîne plus longue donne parfois une meilleure sélectivité en catalyse
enzvmatique. l'octanoate et l'hexadécanoate de warfarine ont été testés dans les mêmes
conditions. Malheureusement. aucun des deux esters n'a été hy dro 1 y si .
7. Acétylation enzymatique de la warfarine avec l'acétate de vinyle, dans un
solvant organique.
Le tableau 3 présente les acétylations enzymatiques qui ont été tentées.
Tableau 3 : Acétylrtion enzymatique de la warfarine avec l'acétate
de vinyle, à la température de la pièce, dans un solvant organique
mzym + a / / *
* solvant Y C Y O CH2C(=O)CH3 OH CH2C(=O)CH3 eOAc
h
14 u
- - 19a Solvant Enzyme Durée Résultat
CHîC12 PPL 9 j décomposition
CE 9 j décomposition
CCL 8j 14
PSL 8 j 14
THF CE 8 j décomposition
benzène CE décomposition
hexane CE 8 j décomposition
Les acétylations n'ont pas permis d'accomplir une résolution. La cholestérol
estérase n'a que décomposé le substrat. Il est possible que la réaction soit défavorisée par
la forme cyclique sous laquelle on retrouve majoritairement la warfiuine. lorsqu'elle est
en solution. En effet. sous forme cyclique. l'hydroxyle est quaternaire. ce qui rend
I'acétylation plus difficile que pour la forme ouverte.
8. La cholestérol estérase (CE)
La cholestérol estérase catalyse l'hydrolyse et la formation d'esters du cholestérol
(=a), d'acétate à stéarate.'? Certains autres stérols sont également hydrolysés. comme le
p-sitostérol (a) et l'ergostérol (23). alors que d'autres sont inactifs, tels l'épicholestérol
(24). I'estradiol (25) et le diéthylstilbestrol (a. Les nombres entre parenthèses
correspondent à la vitesse relative d'hydrolyse par la CE. la référence étant l'hydrolyse de
l'acétate de cholestérol. Un "x" indique que l'ester de ce composé n'est pas hydrolysé.
On remarquera qu'une modification de I'environnement du groupement hydroxyle
du cholestérol se traduit par une perte complète de l'activité catalytique de la CE (cas de
2 4 , z et 26). Un changement dans la chaîne latérale entraîne quant B elle une baisse de la
vitesse de réaction (a et 23).
Des molécules. telles le binaphtol (m et spirobiindanol (-), peuvent Ztre
hydrolysées sélectivement par la CE (schéma 16). '~ L'enzyme permet de faire la
résolution d'un mélange racémique du pentanoate de binaphtol et d'obtenir les deux
énantiomères (e.e. > 98%). De mèrne. l'hexanoate du spirobiindanol peut Sue Rsolu avec
des e.e. d'environ 90%.
Pour expliquer ces résultats. deux règles empiriques ont été proposées par
Kazlauskas et ses collaborateurs (schéma 15). Le premier modèle (a) indique pour un
ester d'alcool secondaire donné. quel énantiomère réagira le plus rapidement avec la CE. 34 Le deuxième modèle (,b) a 6 é adapté pour des esters d'aryles chiraux.35 La lettre "M"
représente un substituant de taille moyenne. comme un méthyle et le "Lu. un substituant
de taille plus large. tel un phényle. Dans le deuxième modèle (b). la CE favorise
I'Çnantiornère où le substituant plus large "L" est situé en bas à droite et demère le plan
de cette feuille.
O*< 9 c 90' vue de face vue de côté
schéma 15
Les résultats obtenus peuvent être expliqués à l'aide du schéma 16. Le composé
29 est d'abord donné en exemple (a). L'énantiomère ( S ) - présente son substituant Ic - plus large "L" demère le plan. tandis que dans l'autre énantiomère, (R)-29, "L" se trouve
au devant. Le ( S ) - se comporte comme le modèle présenté au schéma 15 et sera alors
hydrolysé plus rapidement que le (R)-29. C'est ce qui a permis d'accomplir la résolution
du binaphtol (27).
Dans le cas de l'acétate de warfarine &i (b), les deux énantiomères présentent un
substituant "L" dans une position à peu près similaire. La CE hydrolyse alors les deus
énantiomères avec la même vitesse. ce qui se traduit (tel qu'observe au tableau 7) par une
absence d'énantiosélectivité.
schéma 16
Ces analyses sont évidemment très sommaires et il serait souhaitable de recourir à
la modélisation moléculaire pour déterminer le rotamere le plus stable de l'acétate de
warf'arine et ensuite appliquer le modèle.
9. Conclusions
La résolution enzymatique de la warfarine racémique commerciale a été tentée.
par hydrolyse d'esters (milieux aqueux et organiques) et acétylation de la ~ ~ a r i n e . mais
sans succès.
Une seule enzyme. la cholestérol estérase. a permis I'hydrolyse de l'acétate de
warfarine (m) dans un délai raisonnable. mais sans énantiosélectivité. Les autres esters
de la wadarine (19b-c) n'ont par contre pas été hydrolysés. Il semble que la taille des
substiruants soit trop élevée pour leur permettre l'accès au site actif de l'enzyme.
La décomposition des substrats a été observée dans quelques essais. lors de
l'utilisation de CE ou PPL dans un solvant organique. II est possible que cette
dkcomposition observée soit celle de l'enzyme utilisée ou que le solvant modifie l'action
de l'enzyme sur le substrat.
Dans les essais d'acétylation. il est vraisemblable que la forme cyclique de la
warfarine nuise à l'action de l'enzyme. Étant donné que I'acétylation chimique a pu Stre
effectuée malgré cela. l'absence de réactivité enzymatique peut être attribuée a une
mauvaise interaction entre le site actif et la warfarine sous forme cyclique.
B. Désymétrisation enzymatique de l'acide citrique
1 . L'acide citrique
1 -1 Généralités
L'acide citrique (30) est un composé naturel et un métabolite commun des plantes
et des animaux. 11 est l'acide le plus versarile et le plus utilisé dans les domaines
alimentaires et pharmaceutiques.
I l a été isolé du jus de citron pour la première fois en 1784 par Scheele. En 1834.
Liebig le reconnaît comme un hydroxy-triacide et en 1893. Wehmer découvrait que
certaines moisissures produisent de I'acide citrique lorsqu'elles poussent sur du sucre.
C'est d'ailleurs cette méthode qui est toujours utilisée de nos jours. quoiqu'elle ait
été raffinée et aseptisée avec le temps. On introduit un micro-organisme, Aspergillus
niger. dans un sirop sucré (canne à sucre et sucre de betterave). La conversion en acide
citrique peut prendre jusqu'à 1 5 jours.
En 1990. on en estimait la production mondiale à plus de 550 000 tonnes (dont
4 1% pour l'Europe de l'Ouest et 28% pour l'Amérique du ~ o r d ) . - ' ~ L'utilisation de l'acide
citrique aux États-unis est présentée au tableau 4. répartie selon les secteurs, pour les
152 000 tomes produites en 1990.
Tableau 4 : Distritution de I'acide citrique
par secteur, aux Etats-Unis, en 1990
Produits YO
Breuvages 45
Nourritures 2 1
Pharmaceutiques et cosmétiques 8
Détergents et produits de nettoyage 19
Autres 7
L'acide citrique est très soluble dans l'eau (59.2 g par 100 g d'eau). A 20°C. ses
trois pK, sont de 3.14. 4.77 et 6.39. En tant qu'acide. il peut servir à abaisser le pH.
Neutralisé en partie par une base (telle que l'hydroxyde de sodium). i l peur servir de
tampon.
Ses trois fonctions acides et son groupement hydroxyle en font un excellent
ligand. Ses propriétés de chéiation seront détaillées dans la section 1.3.
1.2 Utilisations biologiques
Bien qu'on retrouve l'acide citrique principalement dans les fmits tels le citron. il
se trouve. sous forme d'acide. dans une grande variété de plantes et de fleurs. Sous forme
d'ion citrate. on le retrouve pratiquement dans toutes les plantes et animaux. Le sérum
humain en contiendrait environ 1 rng/kg du poids corporel. Le tableau 5 fournit quelques
exemples de teneur naturelle en acide citrique:"
Tableau 5 : Teneur naturelle en acide citrique de plantes et fluides humains
Plantes Acide citrique Fluides humains Acide citrique (% P/P) ( P P ~ )
citron 4.0-8.0 sang entier 15 orange 0.6- 1 .O lait maternel 500- 1250
f r m boise 1 .O-1 -3 urine 100-750 pomme 0.008 OS 7500 patate 0.3-0.5 salive 1 -2 laitue 0.0 16 Iarme 5-7
L'acide citrique est impliqué dans le cycle de Krebs. le processus qui convertit les
elucides. les graisses et les protéines en dioxyde de carbone et en eau. Ce cycle se b
retrouve dans virtuellement tous les organismes vivants. car il permet de libérer l'énergie
nécessaire à toutes les activités.
I l n'est donc pas étonnant que l'on retrouve une foule de composés naturels dérivés
de ['acide citrique. comme par exemple. rhizobactin 1021" (z), un sidérophore chiral
isolé d'un champignon. Les sidérophores sont des biomolécules qui permettent de
chilater (et donc de rendre accessible) les ions ferriques essentiels à la survie des plantes.
Les ~iridiofun~ines '~ - (32). membres d'une famille d'inhibiteurs de !a squalènr
synthétase (SS) et produits naturels antifongiques incorporent le noyau citrate. La SS est
une enzyme impliquée dans la biosynthèse du cholestéroi. On espère que ses inhibiteurs
pourront Cventuel lement conduire a un médicament efficace contre la cholestérolémie.
On a récemment utilisé uii citrate de méthyle dans des nucléosides anti-VIH,
pour remplacer le triphosphate (34). Ce dernier est trop facilement hydrolysé in vivo, ce
qui entraîne la perte d'activité des rnédi~aments."~ La modélisation moléculaire a
dimontré que ce noyau constituerait un bon substitut. tout en résistant a l'hydrolyse dans
l'organisme.
OH O O O O II II II
Me. ,P. ,P. .P 0 10 1 0 1.0-
coi G o - @
1.3 Utilisations humaines
L'acide citrique est l'acide le plus versatile et le plus utilisé dans les domaines
alimentaires et pharmaceutiques. Ces utilisations font appel à l'une (ou plusieurs) des
propriétés suivantes: goiit agréable. ajustement de pH. tampon (pour maintenir ou
contrôler le pH), chélation d'ions métalliques et agent dispersant.
1.3.1 Domaine alimentaire
11 est ajouté dans de nombreux breuvages pour son goût agréable. sa capaciti de
tamponner les solutions et pour augmenter l'efficacité des préservatifs. 11 désactive des
enzymes naturelles qui causent la détérioration du goût et de l'apparence des fruits en
conserve et des aliments surgelés. II prévient l'oxydation des graisses et huiles en
chélatant les ions métalliques traces qui catalysent cette réaction. Enfin. il est utilisé dans
la pasteurisation du fromage poiir permettre la stabilisation de l'émulsion eau-huile.
1.3.2 Domaine industriel
L'acide citrique est principalement utilisé dans les détergents. à cause de sa grande
solubilité dans l'eau a toutes les températures et dans une large étendue du pH et de sa
capacité de chélûter les ions responsables de la dureté de l'eau. Il est considéré comme un
substitut acceptable des phosphates.
1.3.3 Domaine médical
L'acide citrique et les sels du citrate sont utilisés comme tel pour tamponner
différentes solutions. pour optimiser leur stabilité et efficacité. Une solution de
citrate/phosphate peut conserver le sang pendant environ 21 jours (35 jours en ajoutant de
l'adénosine. mais le sang n'est alors plus propre a la transfusion). L'ion citrate chélate I'ion
de calcium. nécessaire au processus naturel de coagulation du sang. Une fois le sang
réintroduit dans l'organisme, les ions calcium sont libérés et le citrate est diminé.
La structure du citrate a déjà fait ses preuves dans de nombreux composés naturels
bioactifs. II est donc utilisé aussi dans la recherche de nouveaux composés synthétiques.
C'est justement sur ceci que portera la suite de cette partie.
2. Résolution chimique dans la littérature
De nombreux composés-cibles peuvent Ctre préparés à l'aide de l'acide citrique.
Dans la plupart des cas. ceci requiert cependant la synthèse de dérivCs citrates chiraux.
Ce n'est que récemment que deux méthodes permettant d'accomplir ceci ont été
publiées. Elles sont prksentées ci-dessous. Ce sont des résolutions par cristallisation
fractionnée. Elles sont longues à accomplir et le rendement est plutôt faible.
2.1 Méthode de Bergeron
Cette méthode. publike par Bergeron et ses collaborateurs en 1997.'" est présentée
au schéma 17:
CH300C OH NaOH CH300C OH CH,O&&COICH, MeOH ) CH~O~C&CO,H
1. (-)-brucine 2. crist. fract. 3. HCI
Le citrate de triméthyle (m, préparé selon une méthode connue.J2 est converti
en 1.2-diméthylcitrate (36) par une saponification contrôlée. On forme ensuite les sels de
(-)-brucine. suivi d'une cristallisation fractionnée. La configuration a été déterminée par
rayon-X. L'excès énantiomérique est de 99%. mesuré par spectroscopie RMN d'un dérivé
formé par acy lation avec le (S)-(-)-sec-phenylethy 1 alcohol.
La pureté énantiomérique est excellente. mais le rendement globai est très faible
(moins de 10%).
2.2 Méthode de Ancliff
La méthode d 'hc i i f f et ses collaborateurs. publiée en 1997.'~ est présentée au
schéma 18 :
1. (R)/(S)cr-MBA O 7 2. crist. fract.
3. HCI w 046 OU (SI-(-)-= HO& C02Me 20% H02C C02Me
(*)-rn (R) - (+ ) - rn
Schéma 18
Le dérivé rnéthylester racémique (m) est préparé à partir de l'acide citrique. Ce
mélange est dissous dans I'éthanol et traité avec la (S)-a-méthylbenzy lamine (MB A).
Après une seconde recristallisation dans l'éthanol et un lavage avec une solution aqueuse
faiblement acide. le (R)-(+)-37a est récupéré. Les eaux-mères sont traitées en milieu
acide. puis on répète le même processus avec le (R)-MBA pour obtenir le (S)-(-)-m.
Cette méthode fournit un dérivé citrate chiral avec un rendement global de I l %
en 4 étapes (la quatrième étape incluant le long processus de résolution) à partir de l'acide
citrique et avec un e.e. de 90%.
3. Désymétrisation enzymatique
Les deux méthodes de désymétrisation enzymatique suivantes ont été mises au
point comme alternative aux résolutions chimiques présentées ci-dessus. La première. à
partir du citrate de triéthyle (38) et la deuxième. à partir des esters d'acétal J2' font l'objet
de ce mémoire. Ces résultats ont d'ailleurs déja été publiés.""
3.1 Désymétrisation
PH 7
Le citrate de triéthyle
méthode est rapide. puisqu'on
enzymatique du citrate de triéthyle dans un tampon
(38) est un composé disponible commercialement. Cette
en fait directement l'hydrolyse en milieu aqueux (tampon
phosphate). Deux diesters ont ité obtenus. selon l'enzyme utilisee (tableau 6): l'un est
chiral (39) et de configuration absolue R. tandis que l'autre est symétrique (m.
Tableau 6: Désymétrisation enzymatique du citrate de triéthyle,
h la température de la pièce, dans un tampon pH 7
m e H"fico2Et evou tampon
Et20C C02Et H02C C02Et H°Ko2H
Et02C C02Et
38 - - 39 40 - Enzyme Durée Rendement Régiosélec tivité e. e.
(jours) (%) rapport 39/40 (y4
u-chym 8 85 - 40 seulement - S-C 0.5 80 t 1 -
S-BPN' 4 80 I I - CAL 3 82 - 39 seulement 90
ANL 38 85 19/ 1 90
PLE (7 h) 85 4 / 1 90
L'hydrolyse en présence d'une des trois protéases a serine (a-chymotrypsine.
subtilisine carlsberg et subtilisine BPN') est très régiosélective. donnant exclusivement le
diester symétrique a. Ceci est intéressant du fait que seulement Ir groupement acide le
plus encombré est affecté.
La lipase de Candida nntarctica (CAL) produit exclusivement le diester chiral
( R ) - o avec un excellent rendement (90%) et e.e (90%). Celle de I'.lspergiIlus niger
(ANL) produit majoritairement le diester chiral ( R ) - 2 (avec une faible proportion du
diester symétrique 40). avec un rendement et un exces énantiomérique comparables. mais
dans des délais trop longs.
Finalement. l'estkrrise de foie de porc produir aussi majoritairement le diester
chirai (R)-39: mais dans une proportion plus faible qu'avec ANL (4:l). Le temps de
réaction est par contre relativement court.
Dans tous les cas. les diesters chiraux obtenus étaient dextrogyres (+).
3.2 Désymétrisation enzymatique du citrate protégé
3.2.1 Préparation des diesters protégés a
La deuxième désymétrisation utilise le diacide protégé de la méthode de
Ancliff. L'acide citrique (30) est protégé par fusion dans le paraformaldéhyde. Le diacide
;11 est ensuite estérifié par retlux dans le méthanol ou l'éthanol. en milieu acide. Ces deux
diesters et $2J ont été utilisés dans les essais enzymatiques.
HofiCo 2" (CH ROH, H*, (CH3)2C(OW 2.
DMSO, A reflux, 85% R02C C02R
H02C C02H 6710 H02C C02H
R=Me, 42a Et,
Schéma 19
3.2.2 Hydrolyse enzymatique des diesters 42, dans un tampon pH=7.
La majorité des essais, présentés au tableau 7. ont été effectués dans un tampon
phosphate. d'abord avec 10?6 d'acétonitrile. puis sans ce CO-solvant (avec de meilleurs
résultats).
Tableau 7 : Hydrolyse enzymatique des diesters 42,
à la température de la pièce, dans un tampon pH 7
R = Me, 4 2 R = W , 37a - 36 Et, 42b Et, gJ
Enzyme Substrat Solvant Durée Résultat emem (CO-solvant) (rendement) (%)
CAL J2a tampon i l j 42a - PPL 42a ( 1 O?/, MeCN) 1 1 j 42a - ANL 43a
CCL 42a
Ps sp 4% i l j 4% - PLE J3a 2 h 37a (60 %) 85
PLE 42 b 2 h 37b (50 %) 8 1
PLE 42a tampon 2 h 37a (75 %) 90
PLE "' 42b 3 h 37b (82 %) 90 -
PLE '!' 42a 2 h 37n (85 %) 92
a-chym. 42a 24 j 42a (2%). 36 (7%) -
3 : PLE d'une source differente (Aldrich)
L'ajout d'acétonitrile. même s'il facilite la solubilisation du substrat et accélère
légèrement la vitesse de réaction. diminue le rendement et la stéréosélectivité de
l'hydrolyse. Ces résultats seront discutés plus en détail a la section 5.
3.2.3. Hydrolyse enzymatique des diesten 42, dans un solvant
organique saturé en tampon pH 7.
L'hydrolyse a été tentée sur les diesters d'éthyle J2b et de méthyle m. en milieus
organique, mais avec la seule enzyme ayant démontré de l'activité en milieux aqueux.
PLE. Les résultats se retrouvent au tableau 8.
Tableau 8 : Hydrolyse enzymatique des diesters 42, à la
température de la pièce, dans un solvant organique saturé en tampon pH 7
R=Me, 42a R = M e , 37a Et, 42b Et, 37b
Enzyme Substrat Solvant Durée Résultat
PLE 42b DIPE 1 5 j 42b
42a 15 j 42a
4Sa benzène 7 j 42a
42a CHICI? 7.i 4Sa
II semble que l'utilisation d'un solvant organique nuise a l'activité catalytique de
l'enzyme. peut-être parce qu'il la dénature ou qu'il modifie l'arrangement spatial de son
site actif.
3.2.4 Estérification enzymatique du diacide protégé fi dans le DIPE.
Pour compléter ce projet, deuv estérifications enzymatiques ont été tentées sur le
diacide protégé à l'aide de la PLE. avec le méthanol ou l'éthanol dans le
diisopropyléther. mais sans succès. comme le démontre le tableau 9.
Tableau 9 : Estérification en y matique du diacide &i
dans le DIPE anhydre, à In température de la pièce
enzyme ROH
R = & , 37a Et, 37b
Enzyme Alcool Durée Résultat
PLE MeOH 7 j 4 I
E ~ O H 7 j 4 1
3.3. Détermination des excès énantiomériques
Tous les excès ont été dkterminés en faisant réagir les produits obtenus avec EDC.
DMAP et la (S-)-(-)-(1-naphty1)éthylamine (NEA). Une réaction avec un mélange
racimique a démontré une intégration similaire pour les deux diastéréoisorneres.
La réaction avec le diester 3<) (obtenu de la première désymétrisation. tableau 6)
s'est déroulée normalement, avec la formation d'un lien amide sur le groupement acide
libre (schéma 20) pour donner le composé a. On observe une séparation des pics des
diastéréoisomères en RMN 'H, ce qui permet de déterminer les e.e. Les doublets dus au
proton de l'azote sont dédoublés en 6.39 et 6.48 ppm (NH).
'OzH EDC, DMAP
Schéma 20
Dans le cas de la réaction avec les diesters 37a-b de la deuxième dtisymetrisation
(tableau 7). il y a d'abord formation d'un lien amide avec le groupe acide libre résultant au
composé Ma-b. puis une seconde attaque sur le groupement acide protégé par un ester
d'acital. pour former une imide cyclique I - b (schéma ? 1 ).
L'ester d'acétal est relativement stable en milieu Faiblement acide (estérification au
schéma 19). mais non en milieu basique (présence d'amines). On peut croire que ce
carbonyle est activé et donc vulnérable à une attaque de l'azote. ce qui permet la
cyclisation observée. La structure a été confirmée par analyse RMN. C r phinomène a
déjà ité obsrnC entre le composé j7a et un dérivé de base et un dérivé de base azotie."'
Les imides cycliques sont Ctudiés comme des tranquilisants et neuroleptiques.'" mais
aussi comme agent anti-cancer et a n t i - ~ ~ ~ . ' ' ~
On peut déterminer les ex. grâce à la séparation des pics des diastéréoisomères en
RMN 'H. Dans le cas de l'imide a. on peut utiliser le doublet de 3.57 ppm (CH2) ou le
singulet de 3.49 ppm (COICH3). Par contre. pour l'imide Jjb. on ne peut recourir qu'au
doublet de 2.55 ppm (CH?).
R = M e . 37a Et, 37b
EDC. DMAP
R=Me, Et, 44J
R - M e , !l5iJ Et, @
Schéma 21
4. Détermination des configurations absolues
Cetie détemination des configurations absolues s'est faite par corrélation avec des
composés de configuration déjà connue. Bergeron a déterminé que son diméthylester
possédait une configuration R et était dextrogyre (+).'"
I l faut donc que les produits des hydrolyses enzymatiques soient convertis en ce
compos~. selon le schéma 22. S'ils sont toujours dextrogyres. on pourra conclure qu'ils
sont Çgalernent de contiguration absolue R.
OMe OEt
EtOH, EtjN, reflux. 60% t
Schéma 23
Le méthylester protégé z. transformé en diméthylester par retlux dans le
méthanol (et triéthylamine). est dextrogyre et donc de configuration R. Converti en
diéthylester j9 par transestérification dans I'éthoxyde de sodium. il demeure R-(+).
Le diéthylester 39' obtenu par hydrolyse enzymatique du citrate de triéthyle (38)
ou par ouverture de I'éthylester protégé 37b. reste dextrogyre. Ce composé est donc
kgalement de configuration R.
5. Activité enzymatique
Toutes ces hypothèses pourraient être éventuellement étudiées plus profondément
dans un projet de modélisation moléculaire.
5.1 Lipase de Candida antarctica (CAL) *'
La CAL. contrairement h la majorité des lipases. ne nécessite pas une interface
eau-huile pour être activée. On la considère souvent comme un intermédiairs entre les
lipases et les estérases.
L'enzyme est robuste. Elle est stable dans un milieu aqueux de pH 3.5 a 9.5. On
peut la chauffer jusqu'à 50-60°C sans la dénaturer. Elle réagit bien avec plusieurs
solvants organiques et endure la plupart des agents acylants (même ceux libérant de
l'acétaldéhyde. comme les esters vinyliques).
Le site actif de la CAL est plus petit que celui de la majorité des autres lipases. ce
qui est un des facteurs expliquant sa sélectivité. L'intérieur du site est couvert d'acides
aminés hydrophobes. à l'exception de trois résidus hydrophiles (serine. acide aspartique et
histidine: revoir le schéma 5 pour les hydrolases à serine). Ce site est composé de deux
"canaux". un pour le groupement acyle et I'autre pour l'hydroxyle du substrat. le premier
étant plus spacieux que le deuxième. Le schéma 4 présentait un exemple de
désymétrisation de tétrahydropyranes par la CAL.
Cette lipase convertit le citrate de triéthyle (18) en citrate de diéthyle chiral
(R)-(+)- avec un excellent recdement (82%) et c.e. (90%). Par contre, dans le cas des
diesters protégés 423-b, elle n'est pas efficace. La différence entre les composés est
l'absence d'un hydroxyle libre dans les molécules 42a-b. Ce groupement OH, devant
occuper le "canal hydroxyle" du site actif. semble donc nécessaire pour que le substrat
soit reconnu et transformé par la CAL.
5.2 La protéase a-chymotrypsine
De la famille des chymotrypsines. la a-chymotrypsine est la mieux connue. Elle
consiste en 241 acides aminés. répartis en 3 polypeptides séparés mais reliés par 5 ponts
disulfures. ln vivo. c'est une "protéine endopeptidase" et elle catalyse l'hydrolyse
spécifique des liens peptidiques adjacents à une phénylalanine. tyrosine ou iryptophane.
La u-ciiyrno~psint: est moins robuste que la CAL. Dans un pH de 6 ii 9. i l a
Cventuellement un phénomène d'auto-destruction autolytique. Le pH optimum est de 7.8.
.i pH faible. l'enzyme peut Ztre conservé pendant 1-2 jours. Plusieurs solvants organiques
agissent comme inhibiteurs forts de l'enzyme (comme le diCthyl Çther) même d faible
concentration.
Le schéma 23 présente le modèle de ohe en'" du site actif de l'enzyme. En (a) on
retrouve un substrat connu de l'enzyme. le méthylester de la IV-acétyl-L-phénylalanine et
en (b). le citrate de triméthyle (38).
I I y a quatre sites. Le premier. fi. est l'endroit ou un ester ou une amide subit une
attaque par un nucliophile (par exemple. l'eau). Le site - est hydrophobe et
suffisamment large pour accommoder un groupement aromatique. Le site est l'endroit
où l'amide se lie avec l'enzyme. Finalement. le site h ne peut quand à lui contenir qu'un
petit groupement. comme H. OH ou Cl (mais pas CH3).
- Schéma 23
L'action de cette protéase convertit le citrate de triéthyle (-1 en diéthyle
symétrique a. L'hydroxyle va nécessairement dans le site h. Les deux chaînes. plus
longues. L seront plus facilement accommodées dans les sites - et m. Finalement. l'ester
le plus court (tel dans le schéma 23-a) pénétrera dans la section a. ou il sera hydrolysé.
Étant donné que le composé n'a pas été observé. il semblerait que l'enzyme ait une
préférence dans la répartition des groupements dans le site actif.
Par contre. dans le cas du citrate protégé m, après presque un mois. on obtient
une faible quantité de citrate de diméthyle (ouverture du cycle) et de produit de dépan.
La partie cyclique du composé J2a semble rendre l'accès au site actif plus ardu. La
réaction n'a pas kté énantiosélective. ce qui signifie probablement qu'il pourrait y avoir
ru une transestérification entre deux molécules du composé pour donner le composé
36. -
5.3 L'estérase de foie d e porc (PLE)
Seulement quelques vraies estérases. comme I'estérase de foie de porc (PLE) et de
cheval (HLE). ont été utilisées en synthèse organique (et sont disponibles sur le marché).
L'ac~tylcholine estérase (ACE). isolée de l'anguille Clectrique. a démontré une sélectivité
exceptionnelle dans plusieurs cas. mais de par son origine. son utilisation s'avère plutôt
coûteuse.
Le rôle biologique de la PLE est l'hydrolyse des différents esters retrouvés
dans la diète du porc. ce qui pourrait expliquer son exceptionnelle versatilité. Cette
enzyme est très complexe. consistant en au moins 5 iso-enzymes. associées en trimères
de trois protéines individuelles.'l%r contre. du point de vue d'un chimiste organicien. ce
mélange peut être considéré comme une seule enzyme. Ctmt donné que les iso-enzymes
possèdent habituellement la même stéréosélectivité. On a cependant rapporté récemment
quelques exceptions."9 Par conséquent. la sélectivité de PLE peut varier selon la source et
le pr6-traitement qu'elle a subi. Ce phénomène a été observé au tableau 7. dans
l'hydrolyse des diesters 42a-b.
Une adaptation d'un des plus récents modèles du site actif de la PLE, publié en
1993 par Provencher et ses collaborate~rs,~~ est présentée au schéma 24. Il y a quatre
"poches" dans ce site. Dew sont hydrophobes (HL étant plus grande que Hs). tandis que
les deux autres sont plus polaires (PF étant celle de devant et PB, celle à l'arrière).
En (a) on retrouve le citrate de triéthyle (38) avec les deuv esters plus
hydrophobes dans les poches latérales (HL et Hs), l'hydroxyle dans la poche polaire du
devant et le troisième ester lié à la serine (et donc celui qui sera hydrolysé). Cette
disposition des substituants donnera le diester symétrique a. En (b). l'ester le moins
hydrophobe est placé dans la poche Hs. tandis qu'un des deux autres esters entre en
présence de la serine. Cette configuration donnera le diester (R)-(+)-B.
Étant d o ~ e son volume plus petit, la poche Hs accommodera plus facilement
l'ester le plus court (b). Ceci est en accord avec les résultats du tableau 6, qui mentionnait
un rapport de 4 : 1 pour les composés j 9 l a.
Schéma 24
Au schéma 25. le même modèle est appliqué aux diestcrs 42a-b. Dans ces cas. il
semble qu'un des esters se loge dans la poche HL, tandis que l'autre se lie à la serine.
L'ester d'acétal occuperait vraisemblablement une partie des poches Hs, PF et PB. Les
composés (R)-(+)-37a-b pourrait alors être obtenu.
schéma 25
6. Conclusions
Deux techniques de désymétrisation permettant d'obtenir des dérivés de l'acide
citrique. avec d'excellents rendements et excès énantiomériques, ont été exposées dans
cette partie. Le tableau 10 permet de comparer celles-ci avec les deux résolutions
chimiques présentées dans la section 2.
Tableau 10 : méthodes de préparation de citrates chiraux
Méthode # étapes Rendement e.e. configuration (%) ("/.)
Bergeron 3* < 10 99 (Rb(+)
section 3.1 1 82-85 90 (RI-(+)
section 3.2 3 48 00 (RH+)
* : en incluant dans une seule étape la formation des sels, les recristallisations et l'hydrolyse
Les méthodes des sections 3.1 et 3.2, respectivement à partir du citrate de aiéthyle
(38) et du diacide a sont plus simples et plus rapides que les approches précédentes,
tout en étant plus efficaces. Par contre, contrairement a celle d'hcliff, elles ne permettent
pas d'obtenir directement les deux énantiomères des dérivés citrates.
7. Perspectives
Cette section propose quelques composés qui pourraient être synthétisés à partir
des dérivés citrates exposés dans ce mémoire. dans des projets futurs.
7.1 Topostine 6
Les ADN topoisomCrases sont des enzymes catalysant le bris et le rattachement
concerté de l'ADN. permettant ainsi l'accès au code génétique qui serait autrement
inaccessible. On étudie plusieurs inhibiteurs de ces enzymes, dans l'espoir de mettre au
point un agent anti-cancer efficace.
Une famille de tels inhibiteurs est nommée topostine B (46). Elle a été isolée de
Flexibacter iopostinus en 1990 par Andoh et ses collaborate~rs.~~ En fait, c'est un
mélange qui a été analysé. On a découvert deux types de topostine B très semblables l'un
de l'autre. que l'on a appelé simplement B-1 (-1 et B-2 (46b). La structure exacte de la
topostine n'a pas encore Cté déterminée, tout comme la stéréochimie de la liaison double
et la configuration du centre chiral. II semblerait que les topostines possédant des chaînes
dont les indices m+n sont de 25 ou 26 se révèlent meilleurs inhibiteurs. On peut
également la retrouver sous forme cyclique (lactone).
R2-(cH'm 4 (cH?),-R'
HO
Topostine 8-1 : R' = CONU, R~ = Me ,
Topostine 6-2: R' = Me, R~ = CONH2. 46q
m + n = 25,26 (E) ou (Z), (S) ou (R)
Une approche de synthèse de ces composés a éti réalisée. mais elle ne contrôlait
pas le centre chiral." En utilisant les dérivés chiraux de ce mémoire. il serait possible
d'accomplir la synthèse Cnantiosélectivement. tel que le présente le schéma 76.
Schéma 26
L'acide citrique (a). transformé en dérivé chiral. est convertit en di01 fl dont un
des groupements est protégé. Le groupement alcool libre est oxydé en aldéhyde fi puis
transfomi en composé fi par une réaction de Wittig. suivie d'une hydrogénation.
L'alcool est ensuite déprotégé puis oxpdi en aldéhyde 3. Une deuxième réaction de
Whig donne le composé protégé a. que l'on hydrolyse en topostine 46a-b.
7.2 La malyngolide
La (-)-malyngolide (52) est un antibiotique isolé de l'algue marine bleu-vert,
Lyngbya rnajicscda et dont la structure est présentée ci-dessous. Quelques synthèses ont
été proposées. dont une à partir de l'acide (-)-quinique (53).j3
La synthèse proposée au schéma 27 est très semblable à celle des topostines
(schéma 16) . À partir de l'acide citrique 3l, convertit en dérive chiral g. on réalise a
deus reprises une série de déprotection. oxydation de l'alcool. réaction de Wittig et
hydrogénation pour obtenir le composé 2, qui après hydrolyse basique (KOH) et acide
(HCl). donnera la (-)-malyngolide (2).
31 - 47 54 C02Et -
Schéma 27
C. Résolution et désymétrisatjon enzymatique de tropanes
1. Les alcaloïdes
Les alcaloïdes sont des composes azotés naturels que l'on isole particulièrement
des plantes. Plusieurs de ces composés ont des propriétés pharmacologiques très
marquées. '"
1 .1 Pipéridines (et dérivés)
La stmcture de base d'un alcaloïde de type pipéridine est un cycle à 6 atomes.
dont un d'azote. ce qui lui confere la propriété d'une base faib1e.15 Parmi les composés
connus. il y a l'alcaloïde l J l D (55). un des composants majeurs du poison de la
grenouille Dencirobates speciosid6. 1'histrionicoto.uine (56). d'origine similaire et
l'épimyrtine (57). On s'intéresse à ces produits dans l'espoir de développer des analogues
ayant des propriétés pharmaceutiques.
1.2 Tropanes (et dérivés)
Les propriétés chimiques et pharmaceutiques des tropanes leur procurent une
place parmi les plus importants alcaloïdes. Le squelette de base des tropanes est le
nortropane. soit l'azabicyclo[3.2.1]octane.57 On présente la cocaïne (-), l'épibatidine
(3) et la femginine (60) en exemple.
1.2.1 la cocaïne
La cocaïne. un alcaloïde extrait des feuilles de 1'Eryrhro.xyZan coca. est une des
drogues créant le plus la dépendance chez les consommateurs. Elle constitue un grave
fléau au niveau de la santé publique.58 II faut mentionner que l'énantiomère naturel. le
(R)-(-)-cocaïne. est environ 200 fois plus puissant que l'autre. la (S)-(+)-cocaïne.
1.2.2 L'épibatidine
L'épibatidine a Cté isole de la grenouille vénéneuse Epipedobares rricolor en
1997.j9 Ceci a nécessité l'extraction cutanée de 750 spécimens pour accumuler
suffisamment de produit (500 pç) pour Clucider sa structure. I l semble en effet que la
grenouille puise dans son alimentation les éléments essentiels a la biosynthèse de
I'épibatidine.
On a démontré que I'épibatidine posside un effet analgésique 200 fois supérieur à
celui de la morphine. et par la suite les recherches ont indiqué un effet sédatif de longue
durée (3-4 heures) et la mort pour des doses trop élevées. Par contre, il ne semble pas y
rivoir de dépendance au composé. C'est pourquoi il a servi de modkle à de nombreux
analogues, toujours dans l'espoir de mimer ses propriétés analgésiques. mais de réduire sa
toxicité.
II a fait l'objet de nombreuses synthèses. la plupart étant racémique. Une des
stratégies adoptées, présentée au schéma 28, est la formation du squelette bicyclique a par cycloaddition d'un pyrrole N-protégé fl avec un sulfone déthynyle On
additionne le dérivé méthoxy-pyndine 64, puis on réalise une désulfonation avec un
amalgame, pour obtenir le composé a. Une réaction sous les conditions de Vilsmeier.
puis une hydrolyse en milieu acide permettent d'obtenir l'épibatidine (2).
1) POCS ( 2) 2M HCI, L\
Schéma 28
Une autre approche est d'utiliser la tropinone et de contracter le cycle à l'aide
d'un réarrangement de Favorskii (schéma 29)". La tropinone &3 est transformée. par du
chloroformate d'éthyle. puis bromure de cuivre. en dérivé a. Le méthoxyde de sodium
permet d'accomplir le réarrangement en composé a. Une a-sélénation. suivi de
l'élimination de sélénoxyde, introduisent une double liaison et donnent le composé B. On lui couple le dérivé de pyridine (70) par catalyse au palladium, pour obtenir le
composé 71. L'hydrolyse. suivie d'une décarboxylation radicalaire de Barton fournit le
composé 2. Une déprotection a l'aide du MeiSiI donne enfin I'épibatidine (m.
COzEt CQ2Et \
Jk I).."",""OL
&y3; 2) CuBr2 C02Me
66 - 67 - 1) LDA
2 ) PhSeBr
3) H202
OS ONa 1
Schéma 29
1 -2.3. La ferruginine
La (+)-ferruginine (60). une puissante neurotoxine. a été isolée des plantes
Duriingianrr ferrzrgineah7 et LI. darlingionah3. Elle a fait 1'0 bjet de plusieurs synthèses
Le schéma 30 donne un exemple. La réaction du vinylcarbenoïde a avec des N-
(alkoxycarbony I) pyrroles 74,@ catalysée par de l'octanoate de Rhodium (II), suivie d'une
hydrogénation avec le cataiyseur de Wilkinson donne la structure 75. Une déprotection
avec le fluorure de tétrabutylammonium (TBAF), suivie d'une méthylation réductive avec
formaldéhyde aqueux et cyanoborohydrure de sodium foumit enfin la femginine (60)
racémique.
COMe
PR + :> 2 ) 1 ) Rh2(00C-çH15)4, (PPh3)3RhCI,
- - "2 aCoMe
Schéma 30
Rapoport et ses collaborateurs ont mis au point une mithode permettant d'obtenir
I'un ou l'autre des énantiomères. par cyclisation intramoléculaire d'un ion iminium dérivé
de l'acide pyroglutamique.h5 mais elle est longue et le rendement en est faible.
La méthode de l'équipe du Dr ~ o ~ e r . ' ~ permettant de synthétiser I'énantiomère
(+)-a en 7 Ctapes (une huitième. pour la préparation du composé de départ. l'oxazolo-
pyrrolidine "1. est présentée au schéma 3 1.
La pyrrolidine est alkylée en dérivé 77: puis le groupement cyano est éliminé
dans un mélange de lithium et d'ammoniaque pour donner le composé B. Après
déprotection en milieu acide. il est converti en dérivé 3 à l'aide d'un phosphonate. Celui-
ci subit un réarrangement. lors de conditions acides, en composé bicyclique 80, qui est
converti en dérivé N-méthyle fi. L'élimination de méthanol par catalyse acide résulte
enfin en (+)-ferruginine (a).
Ph,, Ph., Ph,, A LDA
___C)
n N C ~ ' R-Br
78 - 1) HCI
Ph,, n
Schéma 31
La (-)-ferruginine. non-naturelle. est un bon agoniste du récepteur acétylcholine et
peut étre obtenue rapidement à partir de la (-)-cocaïne 3 (schéma 32)". À partir de (-)-
58. après une hydrolyse acide. puis basique. on obtient le sel de lithium u. qui est - converti en (-)-ferruginine (60) par réaction avec du MeLi.
Schéma 32
1.2.4 La tropinone et la pseudopelletierine
Ces deux dérivés des tropanes interfèrent en plusieurs points du système nerveux
central (SNC). Leurs analogues sont considérés, entre autres. comme agents potentiels
neuroleptiques et anti-parkinsoniens. d'oh l'intérêt pour des dérivés chiraux de ia
tropinone (m) et de la pseudopelletierine (8jb). Les approches conventionnelles sont
des résolutions chimiques. -N
\ N
2. Résolution chimique de la pseudopelletierine et tropinone
Carroll et ses collaborateurs ont mis au point une méthode permettant d'accomplir
la résolution chimique de la pseudopelletierine et de la tropinone (schirna 33)." A partir
d'un dérivé méthoxycarbonylé 8- (dont la synthèse sera présentée à la section 3.1). on
forme des bitartrates avec l'acide L-(+)-tartrique. puis l'acide D-(-)-tartrique. pour obtenir
après cristallisation Fractionnée. le R-(+)-8J énantiomérique a Cté évalué à plus de 90%.
acide tartrique (30%) (
1 : 2-(methoxycarbonyl) tropinone, 84a
et le S-(-)-fl respectivement. L'excès
2 : 2-(methoxycarbonyl)pseudopeIletierine, 84b
Schéma 33
La faiblesse de cette méthode, comme dans le cas des autres résolutions
chimiques, est un faible rendement (30%) et de longues manipulations. La partie suivante
porte sur les essais de résolution enzymatique de ces deux dérivés tropanes.
3. Résolution enzymatique de la pseudopelletierine et de la tropinone
Les efforts de résolution se sont portés uniquement sur la pseudopelletierine. Étant
donné la similitude entre les deux structures. il est raisonnable de croire qu'une enzyme
permettant la résolution de la pseudopelletierine donnera des résultats comparables avec
la tropinone. bien qu'il puisse évidemment y avoir des différences dans le rendement et
l'excès énantiomérique.
Lorsqu'une enzyme aura démontrée une certaine activité avec la
pseudopelletierine. elle sera ainsi testée également sur la tropinone. Ceci évitera la
multiplication inutile des essais enzymatiques.
3.1 Synthèse de la pseudopelletierine et tropinone
On peut obtenir la pseudopelletierine et la tropinone gràce à une réaction
"one-pot". dite de Robinson (schéma 34). bien que la tropinone soit disponible
commercialement.
Schéma 34
On mélange un dialdéhyde avec de la méthylamine et de l'acide acétonedicar-
boxylique dans un tampon phosphate. Après 24h. on ajoute de l'acide chlorhydrique afin
de permettre la décarboxylation et d'obtenir ainsi le composé désiré.
Cette réaction est en fait une double réaction de Mannich. Son mécanisme est
présenté au schéma 35.
Schéma 35
I l y a d'abord une première condensation de la rnéthylamine sur l'aldéhyde. suivi
de la formation d'un lien avec l'acide acétonedicarboxylique (qui est en Cquilibre avec sa
forme énolique). II y a ensuite une deuxième condensation de l'amine sur le groupement
aldéhyde libre. puis formation d'un nouveau lien. Après environ ?4h. on obtiendra le
dicarboxylate. qui est décarboxylé par reflux en milieu acide.
3.2 Synthèse des dérivés méthoxycarbonylés de la pseudopelletierine et
de la tropinone
tropinone (m) sont préparés à partir des composés 8jb et 8)a. respectivement. par la
même méthode (schéma 36). Une base permet d'arracher un proton en position a de la
cétone. Il y a ensuite addition du méthoxycarbonyle. Les produits 84a.b obtenus sont
racémiques. -N
NaH, (CH 30)2C=0,
( lHF,3,80% * (
n = 1 :tp, && 2 : pp, 83b
Schéma 36
Les composés carbony lés 84a. b présentent certaines particularités. Le 84b se
retrouve presque exclusivement sous forme énolique (schéma 37). La forme cétonique
n'est pas observée en RMN 'H. Ce composé présente une certaine instabilité (par
exemple. en milieu aqueux).
cétonique enolique
Schéma 37
En solution. le composé se retrouve quant à lui. en équilibre de trois formes:
deux cétoniques (endo et exo) et une énolique (schéma 38). Ces trois formes. observables
en RMN 'H. compliquent l'analyse spectrale. Ce dérivé est encore plus instable que le
composé 84b (et se décompose éventuellement. même s'il est conservé sous 0°C).
exo-cét~n iq ue enolique endo-cétonique
Schéma 38
À cause de l'équilibre des formes cétonique et énolique des composés 84ab, on ne
saunit déterminer I'approche de l'introduction du groupement COOMe (exo ou endo).
3.3 Approches de résolution enzymatique de la pseudopelletierine
Comme il est mentionné ci-dessus. les essais enzymatiques ont été effectués sur la
pseudopelletierine. Le schéma 39 présente les différentes approches tentées et qui seront
abordées plus en détail dans les sections suivantes.
(*)-W
agent acy lant
enzyme Hz0 - OAc
Schéma 39
L'approche la plus simple consiste à faire des essais d'hydrolyse enzymatique sur
le composé 8Jb (sections 3.3.1 et 3.32). Dans un cas idéal. un seul des deux
énantiomères serait hydrolysé (et se décarboxylerait spontanément pour redonner la
pseudopelletierine).
Les deux autres approches sont normalement complémentaires (c'est-à-dire qu'une
même enzyme pourrait donner les deux énantiomères, selon la voie utilisée). La première
consiste en une acétylation enzymatique de 8Jb (qui est presque exclusivement sous
forme énolique), idéalement sur un seul énantiomère (section 3.3.3). La seconde requiert
d'abord l'acétylation chimique du composé 8Jb. Cet acétate racémique 85 sera ensuite
soumis à des hydrolyses enzymatiques (section 3.3 5).
3.3.1 Hydrolyse enzymatique des composés 84a-b, dans un
tampon pH 7
Les premiers essais d'hydrolyse enzymatique sont présentés au tableau 1 1.
Tableau 11 : Hydrolyse enzymatique des composés 8Ja-b,
à la température de la pièce, dans un tampon pH 7
( tampon 84a-b
n = 1 : 84a I-COÎ 2: && 83a-b
Substrat Enzyme Durée Résultat
(*)-84b PLE 3 j 83b t t PPL 10 j (+-)-84b
CAL
ANL t I CCL t l I l
I l Pen sp II II
CRL
Can sp
GCL 11
I l PCL t l II
9 1 WGL II l t
(+84a PLE 3 j 83a
Dans les essais avec la PLE des composés 8Ja-b. l'hydrolyse est complète. après
environ 3 jours. Elle ne semble pas stéréosélective. Dans un essai avec la même enzyme
et le con~posé 8Jb, mais en additionnant quelques gouttes d'un émulsifiant (triton-X). la
réaction semble s'arrêter d'elle-même après l'hydrolyse d'environ 50% du substrat
(déterminée par c m ) . Par contre jusqu'h maintenant. seule la pseudopelletierine (8jb) a
pu être isolde. ce qui ne permet pas de déterminer 1'r.e.
Étant donné la similarité entre les composés 84a-b, il n'a pas été jugé nécessaire
de hire tous les essais en double.
On a observé d'infime trace d'hydrolyse dans tous les essais. mais elles sont
attribuées à une hydrolyse chimique. due à une certaine instabilité des composés Ma-b
dans un milieu aqueux. Un blanc (c'est-à-dire un essai sans enzyme) a permis de
confirmer ceci.
3.3.2 Hydrolyse enzymatique du composé 84b, dans le benzène saturé en
tampon pH 7
Seulement quelques enzymes ont été choisies pour ces tests. en se basant sur les
hydrolyses en milieu aqueux. Les résultats se retrouvent au tableau 12.
Tableau 12: Hydrolyse enzymatique du composé 84b,
à la température de la pièce, dans le benzène
kzMe OH benzène - 84b
(i)-84b
pseudopelletierine
Enzyme Durée Résultat
PLE 10 j (&)-84b
CAL Pt (cl-84b
PPL 91 (*)-84b
On note que la PLE a perdu toute son activité en milieu organique. tandis que les
autres se révèlent toujours aussi inefficaces.
3.3.3 Acétylation enzymatique du composé 84b, dans un solvant
organique anhydre
Les acétylations enzymatiques sur le composé && ont été réalisées dans divers
solvants et m e c deux agents acylants différents. l'acétate de vinyle (AV) et
dlisopropényle (-41). Les résultats sont présentés au tableau 13. Aucune acétylation n'a Bté
observée.
Tableau 13: Acétylrtion enzymatique du composé m, à In température de la pièce, dans un solvant organique anhydre
\ \
erIym=, + &zMe AV ou Al OAc
C02Me
Enzyme solvant agent Durée Résultat acy lant
PLE benzène AV 10 j (2)-84b
CAL I I
PPL II
PLE CHIC12 AI 17 j I i
CAL I I
PPL Il
CAL cyclohexane AV 15 j t l
3.3.4 Acétylation chimique de la pseudopelletierine
L'acétylation du dérivé &J est accomplie avec le chlorure d'acétyle en milieu
basique. tel que présenté au schéma 40. Ce composé. l'acétate a, doit servir de référence
lors des acétylations enzymatiques du composé 8Jb. Il sera également utilisé dans des
essais d'hydrolyse enzymatique (section suivante).
Schéma 40
3.3.5 Hydrolyse enzymatique du composé û5, dans un tampon pH 7
Faute de temps. un seul essai a éti tenté avec l'acétyle estérase (AE), mais i l s'est
révéiti un échec (tableau 14).
Tableau 14 : Hydrolyse enzymatique du composé û5,
h la température de la pièce, dans un tampon pH 7
\ \
enzyme #
eau OH OAc OAc +- C02Me + a.M=
(*)-85 (+) ou (-)-M (-) ou (+)*
Enzyme Durée Résultat
AE 12j (+85
4. Synthèse formelle de la ferruginine
Le schéma JI présente la synthèse formelle de la femginine (a) qui a été
accomplie au cours de ces travaux
'OzMe (CF 3S02)20. pyr. C02Me
CH2C12, 0°C - ~ .P .w& On -
Schéma 41
Le composé & est transformé en triflate de vinyle &, puis converti en alcéne
87a." Ce composé est ensuite hydrolysé en sel lithien de l'anhydroecgonidine 8& puis - l'action du MeLi donnera la ferruginine & (comme présenté au schéma 32Lbn
Les composés 84a. 85a et ont été isolés et caractérisés. Les deux dernières
étapes ont déjà été réalisées par Campbell et ses collaborateurs (1977).
Lorsqu'une méthode de résolution enzymatique aura été mise au point, il sera
alors possible de synthétiser l'un ou l'autre des énantiomères de la ferruginine.
5. Activité enzymatique
Une seule enzyme. la PLE. a démontré une activité catalytique. lors de l'hydrolyse
des dérivés 84a-b (revoir tableau I I ) . Par contre. elle n'était pas stéréosélective. Cette
enzyme a déjà été discutée à la section 5.3 de la partie B. lors de la désyrnétrisation des
citrates js et 42a-b (revoir les schémas 24 et 25).
.4u schéma 43. le modèle du site actif est présenté avec les composés 84a-b.
L'ester se lie avec la serine pour ensuite subir l'hydrolyse et ['hydroxyle ira peut-être dans
une des deus poches polaires (PF OU PB). Le reste de la molécule pourrait se loger dans
une des poches hydrophobes (probablement la plus large. HL). Mais quoiqu'il en soit.
étant donné l'absence de sélectivité. les substituants de la molécule ne doivent pas se lier
fortement et spécifiquement dans les différentes poches du site actif.
Schéma 42
6. Conclusions
Une résolution enzymatique a été tentée sur deux dérivés tropanes, la 2-
(rnéthoxycarbonyl)-tropinone (m) et la 2-(méthoxycarbony1)-pseudopelletierine (84b),
mais sans succès. L'estérase de foie de porc (PLE) a réalisée une hydrolyse complète,
mais non-stéréosélective de ces deux composés (donnant respectivement les composés
83a et m). -
Il a été démontré que la tropinone (83a) permet d'accomplir la synthèse formelle
de la ferruginine (a, en 6 étapes.
7. Perspectives
Cette section propose quelques projets Futurs pouvant ètre réalisés à partir des
dérivés tropanes synthétisés dans ce mémoire.
7.1 Synthèse de dérivés tropanes
Le triflate de vinyle 86a ou 86b permet le couplage par catalyse au palladium
avec de nombreux groupements aryles et alkyles (schéma 43). Les composés 8%-b ainsi
obtenus pourraient ensuite Stre convertis en de nombreux analogues utilisés dans des
Ctudes sur les effets de dépendance de la cocaïne.
. - - - - - * ( ------* analogues
n OTf n R'
2, 89b
Schéma 43
7.2 Modification de la réaction de Robinson
En exécutant d'abord une mono-estérification sur l'acide acétonedicarboxylique,
on pourrait obtenir directement les composés 84a-b par la réaction de Robinson. comme
on le présente au schéma 44.
Selon Chen et Meltzer (1997),11 on doit d'abord convertir l'acide
acétonedicarboxylique en anhydride 90, puis en mono-ester a. Ce composé est mélangé
avec le diaidéhyde approprié et de la méthylamine, pour obtenir directement les
composés ou m.
Schéma 44
Cependant. les travaux préliminaires n'ont pas permis d'obtenir le mono-ester o. sans doute à cause d'une dkarboxylation de l'acide acétonedicarboxylique. dès la
première Ctape. La présence de traces d'acide dans I'anhydride acétique en est
probablement responsable.
7.3 Désymétrisation enzymatique de la pseudopelletierine
Comme il a déjà été mentionné précédemment. une désymétrisation est plus
avantageuse qu'une résolution. entres autres au point de vue du rendement.
La synthèse de ces composés (93a-b) peut se faire encore une fois en modifiant la
réaction de Robinson. On utiliserait le dimethy lester de l'acide acétonedicarbo~y lique
(92). disponible sur le marché et on remplacerait le tampon phosphate par du méthanol.
Ceci est illustré au schéma 45.
Dans la littérature des années 1950.
(diméthoxycarbony1)-tropinone (93a) par une
on retrouve déjà Ia préparation de la 2.4-
méthode semblable."
92 - n = l , 93a 2, 93b
Schéma 45
Les composés 93a-b pourraient ensuite être testés dans des hydrolyses
enzymatiques. selon le schéma 46.
enzyme) ( (
C02Me
Schéma 46
7.4. Ozonolyse de dérivés tropanes
Au schéma 47. on présente une ozonolyse qui a été tentée sur la 2-
(méthoxycarbony1)-tropinone (m ( n = 1 et R = OH). mais sans succès. Le produit a été
décomposé. Une explication p!ausible est que ce composé. n'étant présent sous forme
Cnolique qu'en faible proportion (revoir le schéma 38), est moins susceptible à une
oxydation d'une liaison double.
Schéma 47
L'ozonolyse de la 2-(rnéthoxycarbony1)-pseudopelletierine (m) (n = 2 et R =
OHj. composé qui se retrouve presque exclusivement sous forme énolique. n'a pas été
tentée. Elle permettrait d'obtenir un pipéridine cis-2.6-disubstitué (m). que l'on pourrait
convertir en d'autres analogues potentiellement bioactifs. Ceci constituerait une nouvelle
voie de synthèse pour de tels composés.
Le succès de I'ozonolyse des alcènes 873-b (R = H) fait peu de doute. Ceci
pourrait également être tenté. comme voie alternative.
7.5 Synthèse d e dérivés d'oxatropanes
On a récemment découvert que les oxatropanes (tropanes contenant un oxygène à
la place de l'azote) constituaient des inhibiteurs de la DAT (un neurotransmetteur.
responsable du transport de la dopamine). un systkme particulièrement touché par la
cocaïne. Cette dicouverte fournit de nouveaux outils permettant d'étudier et d'espérer
mieux comprendre la DAT."
La préparation d'oxatropanes. mise au point par Chan et Brownbridge, est
présentée au schéma 48 : 74
OMe Me3Si0 OMe TiCb- & 2 ~ e
( n ( OH
n OMe 97a-b
* I
96 n = l , I
- 2, kV0
résolution analogues
Schéma 48
Le composé réagit avec le I -3-bis(trirnéthylsi10~y)- 1 -méthoxybuta- 1 Sdiène
96 en présence de tétrachlorure de titane pour domer l'oxatropane o. Les rendements - sont de 79% (m) et 74% (m).
Étant donné la flexibilité des biocatalyseurs. on peut raisonnablement penser
qu'une enzyme. permettant la résolution ou la désymétrisation d'un dérivé de ia tropinone
et de la pseudopelletierine. sera tout aussi active avec les oxatropanes correspondants.
Les travaux de Chënevert et ses collaborateurs sur les tétrahydropyranesi6 et les
pipéridineç75 démontre une telle possibilité.
À partir du composé 97, on pourra synthétiser différents dérivés. tel le tritlate de
vinyle (suivi d'un couplage au palladium).
D-Conclusion générale
La résolution enzymatique de la warfkine a été tentée. mais elle n'a pas donné de
bons résultats. La cholestérol estérase (CE) a toutefois permis I'hydrolyse non-
stéréosélective de l'acétate de wdarine.
La lipase de Cundida antarcricu (CAL)permet de réaliser la désymétrisation du
citrate de triéthyle (38). On obtient alors le composé (R)- (+)-o (e.e. 90%). Les diesters
Qa-b peuvent être hydrolysés énantiosélectivement par I'estérase de foie de porc. pour
donner dans ce cas les esters (R)-(+)-37a-b (e.e. 90%).
La résolution de deux tropmes n'a pas été réussie. La PLE a tout de même permis
l'hydrolyse complète (mais non-stéréosélective) des dérivés esters 8Ja-b. Une synthèse
t'ormelle de la ferruginine en 6 étapes. à partir de la tropinone. a également été accomplie.
Remarques générales
1. Analyse
Les spectres de résonance magnétique nucléaire de proton (RMN 'H) et du
carbone (FWN '-'c) ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker modèle AC-300.
Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm. Les constantes de couplage
( J j sont exprimées en Hertz (Hz). Les solvants deutérés sont utilisés comme référence
interne pour la RMN ' H et 13c.
Les abréviations suivantes sont utilisées dans les pages suivantes. pour la
description des spectres RMN : s (singulet). d (doublet). dd (doublet de doublet). t
(triplet). q (quadruplet). qt (quintupler). rn (multiplet).
Les spectres infrarouges (IR) ont été enregistrés sur un spectromètre Bechan
modèle IR-4-50. Les fréquences sont rxprimies en cm-'. Pour les composés solides. une
faible quantité de solide (soit environ 2 mg) est mélangée a du bromure de potassium
( KBr) (environ 75 mg). puis mis sous pression. afin de former une pastille. Les liquides et
les huiles sont deposés comme un film. en faible quantité. entre deux pastilles de NaCl,
puis analysés.
L'activité optique a été mesurée grâce à un polarimetre digital Jasco modèle DIP-
360. La valeur de la raie D du sodium (589 nm) est la longueur d'onde utilisée. Les
solvants utilisés sont de haute pureté (spectroscopique). La concentration (c) est donnée
en gramme de composé par 100 mL de solvant.
Les points de fusion des composés solides ont été déterminés à l'aide d'un appareil
électrotherrnal Thomas Hoover, modèle 642744 1 O.
2. Réactions
L'avancement des réactions enzymatiques en milieux aqueux est suivi par des
mesures régulières à l'aide d'un pH-mètre Fisher, de modèle 8 15. avec une électrode
Fisher modèle 1 3-620-97.
La purification des produits par chromatographie-éclair est effectuée avec du gel
de silice (40-60 prn). Le degr6 d'avancement d'une réaction est suivi par chromatographie
sur couche mince (ccm) a l'aide de plaques (Mrrck) en gel de silice (250 prn d'épaisseur)
sur du verre. Le révélateur utilisé pour les ccrn. CAM (cérium ammonium molybdate).
est priparé de la façon suivante:
NH-tMoO4 (21 g) et H4Ce(S04) 4 ( 1 g) dans H2S04 10% (v/v) (500 mL).
3. Réactifs
Les solvants et réactifs courants sont séchés et purifiés de la manière suivante:
Éthanol et méthanol: distillés sur Mg + I2
Benzène: distillé sur Na + benzophénone
Dichlorométhane: distillé sur CaHr
Hexane et cyclohrxane: distillés sur CaHz
Pyidine et triéthylamine: distillées et conservées sur KOH
THF: distillé sur Na + benzophénone
DMSO et DMF: séchés sur Na2S04. distillés sous vide, puis conservés sur tamis
moléculaire 4 A.
4. Enzymes
Les protéases sont obtenues de Sigma. Les lipases sont achetées d'Aman0
Intemationai Enzyme Co.. à l'exception de la PPL (Sigma) et de la lipase de
Pse~~domonusj7uorescens (Fluka). L'estérase de foie de porc (PLE) provient de Sigma ou
d'hm.no. La lipase de Candida a~rrarc~ico ( n o v o q n 435) est achetée chez Novo
Nordisk.
A. Essai de résolution enzymatique de la warfarine
1. Estérification chimique de la warfarine
Trois méthodes ont été utilisées pour obtenir les esters désirés: la réaction avec
l'acide. avec l'anhydride et enfin avec le chlorure d'acide correspondant.
1.1 Estérification de la warfarine à l'aide de l'acide de Mosher
w ; O 2 H OCH
;\ la warfarine 3 (55.7 mg. I éq..
EDC, DMAP
(70% ) " cH2c12 *$CF3
0CH3 O
0.181 mrnol), dissous dans 3 mL de
dichlorométhane anhydre. on ajoute l'acide de Mosher (50.8 mg. 1 .I éq., 0.2 17 mmol),
de I'EDC (45.0 mg. 1.3 éq.. 0.235 mmol) et du DMAP ( I O mg). On laisse agiter pendant
environ 24 heures.
On dilue dans 50 mL d'AcOEt et lave avec une solution de HCl i M ( 2 x 10 mL),
une solution aqueuse saturée en NaHC03 (2 x 10mL) et de la saumure (2 x 10 mL). On
sèche (Na$30r), filtre et évapore sous vide.
On chromatographie sur gel de silice (éiuant: 30% AcOEt. 70% hexane). pour
obtenir l'ester de Mosher 3 en une huile jaunâtre (70% de rendement).
Nom formel:
Formule brute:
Masse molaire:
Aspect:
IR (NaCl):
RMN I3c (CDC13):
21 - J-(2-méthoxy-2-phény1-2-trifluorométhy 1acétoxy)-3-(3 -oxo- 1 - phény lbuty1)-2H- 1 -benzopyran-?-one
C19Hu FjOb
524.50 @mol
huile
3080-3030 (CH). 7980-2900 (CH). 2253, 1779 et 1722 (C=O).
1630. 1460. 1 170.9 1 O, 730.650.
2.14 et 2.16* (S. 3H. CH3C=O). 3.5 (m. 2H. CH2). 3.77 et 3.74* (S.
3H.0CH3). J.6(t. IH.CH). 7.2 (m. 8H.Ar). 7.5 (m. 4H.Ar). 7.8
(m. 7H. Ar).
205.9 (CH3C=O). 153.2 (CO2), 1139.5. 139.3. 132.0. 130.3. 128.9,
128.8. 128.3. 127.8. 127.6. 126.8. 124.3, 132.7. 131.8. 121.1.
116.5. 115.2 (Ar)]. 55.8. 55.7 (OCH3). 44.9 (CH?). 44.5 (CHz),
36.6 (CH). 36.5 (CH). 30.0 (CH3C=O).
Les pics en 2 .142 16 et 3.72l3.74 peuvent ètre utilisés pour evalurr l'ex. d'un
échantillon.
1.2 Estérification de la warfarine à partir des anhydrides
On place la warfarine (lOOrng, 0.324 m o l ) dans un ballon. On ajoute l'anhydride
acétique (2 mL) ou palmitique (481 mg, 0.973 m o l ) . 3 rnL de pyridine et 10 mg de
DMAP. On laisse agiter jusqu'au lendemain.
Puis on ajoute 100 mL de EtO2 et on lave avec une solution aqueuse de HCl 1 M.
afin de neutraliser la pyridine. On lave ensuite avec de l'eau distillée (2 x 70 mL), une
solution aqueuse saturée en NaHC03 (2 x 75 mi,) et de la saumure (2 x 25 mL). On sèche
la phase organique avec du MgSOj. la filtre et évapore sous vide.
On chromatographie ensuite sur gel de silice (éluant: AcOEthexane 30/70). On
obtient un solide blanc (98 mg. 86%) dans le cas de l'acétate et une huile dans le cas
de I'hexadécanoate ( 115 mg, 7 1 %).
Nom formel:
Formule brute:
Masse molaire:
Aspect:
pF:
IR (NaCi):
O 19a - 4-acétoxy-3-(3-0x0- 1 -phény 1butyl)-2 H- 1 -benzopyran-Zone
C ~ I H I R 05
350.39 grno1
solide (blanc)
156-8 O C
3080-3020 (CH). 2980-2900 (CH). 1760 et 1720 (C=O), 1630,
1380, 1 100,930,760,700.
1.95 (S. 3H. CH3C=O). 2.05 (m, 3H. CH3C02). 2.2 (m. 1 H. CH?),
3.1 (m. 1 H, CHt). 4.0 (m. 1 H. CH), 7.2 (m. 7H. Ar). 7.5 (m. 1 H.
Ar), 7.9 (m. 1H. Ar).
168.5 (CH3C=O), 160.7 (CH3C&), 157.9 ( G O ) , 152.9 (=C-O),
142.2 (=C-O). 1132.0, 128.6, 128.2, 126.8, 123.8, 122.8, 116.4,
115.1, 104.7, 102.7 (Ar)l, 11.3 (CH2), 35.1 (CH), 24.2 (CH3C=O),
Nom formel:
Formule brute:
Masse molaire:
Aspect:
IR (NaCl):
huile
7920 (CH). 2840 (CH). 1710 (C=O). 1630. 1370. 1070. 900. 710.
640.
0.88 (m. 3H. CHiCH2). 1.24 (m. 76H. CH2CH2CH2). 1.56 (m. 2H.
CH2CH2COr), 1.99 (S. 3H. CH3C=O). 2.04 (m. 1 H. CH2C=OCH3).
2.79 (t. 5=7. ZH. CH2CH2C02), 3.00 (m. 1H. CHzC=OCHj). 3.97
(m. 1H. CH). 7.23 (m. 7H. Ar). 7.53 (m. IH. Ar). 7.90 (m. IH.
Ar).
RMN "C (CDCli): 17 1.4 (CHiC=O). 160.6 (CH2COI), 157.9 (C=O). 152.9 (=C-O).
147.2 (=C-O). 1131.8, 128.6. 126.9. 113.8. 122.8. 116.4. 115.1.
104.7. 102.6 (Ar)). 41.3 (CH2C=OCH3), 35.1 (CH). 134.9. 31.8.
~9.6.29.5.29.4.39.3.29.1.29.1. - 28.8.27.6. 24.9. 24.7.22.6. 19.0
(CH2CH2CH2)I. 19.5 (CH3C=O). 14.0 (CHJCH~).
1.3 Estérification de la warfarine a partir du chlorure d'acide
+ 0 0 \ R
CH3 THF ) R(O=)CO CHZC(=O)CH
À la warfitrine (100 mg, 0.324 mrnol). on ajoute du chlorure d'acétyle (18 PL. 1.1
éq.. 0.389 mmol) ou d'octanoyle (66 PL. 1.2 éq.. 0.398 mmol), du triéthylamine (60 PL.
1.3 éq.. 0.472 mrnol) et du DMAP (IO mg) dans 3.0 mL de THF.
On laisse agiter sous azote jusqu'au lendemain. On exécute les extractions et la
chromatographie. telle que décrits ci-dessus.
Dans le cas de l'acétate m, le rendement est faible (30%). La cause semblerait
etre une hydrolyse partielle du chlorure. particulièrement sensible à l'humidité. Le
composé Stant en tout point semblable à celui préparé par l'autre méthode. l'optimisation
de la réaction n'a pas été tentée.
Dans le cas de I'octanoate m, on obtient une huile claire (86 mg. 6 1%').
O O 19c -
Nom formel: 4-octanoxy-3-(3-0x0- 1 -phénylbutyI)-IH- 1 -benzopyran-2-one
Formule brute: C17HjoOc
Masse molaire: 434.57 &/mol
Aspect: huile
IR (NaCi): 3070-3050 (CH). 1930 (CH). 2860 (CH). 1770 (C=O). 1720
(C=O). 1630. 1575. 1490. 1360. 1000.910.755,700.
RMN 'H (CDCI;): 0.90 (m. 3 H. CHICH?). 1.2-1.4 (m. 8H. CH2CH2CH2). 1-83 (qt,
2H. CH2CH2C02). 2.17 (s, 3H. CHE=O), 2.77 (t, 1=7, 2H.
CH2CHF02), 3.47 (2 x dd, k 7 , 2H. CH2C=OCH3), 4.79 (t, 5 ~ 7 .
IH, CH), 7.1-7.5 (m. 9H. Ar).
Rh3N I3c (CDClj): 169.9 (CH3C=O), 16 1.0 (CH2C02), 155.4 (C=O), 152.3 (=C-O),
140.2 (=C-0): 1131.8. 128.6, 127.7, 126.8, 124.1, 123.0. 121.2,
1 16.5. 1 16.0 (Ar)], 45.0 (CHtC=OCH3), 36.4 (CH), [35.2, 34.9,
33.9, O . 29.0. 28.9. 28.8, 24.6, 22.5 (CH2CH2CH2)J, 31.5
2. Hydrolyse chimique de l'acétate de warfarine 19a
A de l'acétate de warfanne (38 mg. 1 éq.. 0.108 mrnol), on ajoute 1 mL dune
solution aqueuse de NaOH 0.1 M. 1 mL de MeOH et 4 mL de THF. On fait agiter pendant
environ 1 heure dans un bain de glace (OaC).
On neutralise le NaOH avec 1 mL de solution HCI O. IN. puis on ajoute 50 mL de
Et20. On lave la phase organique avec de l'eau ( 2 x 30 mL) et de la saumure ( 2 x 20 mL).
On sèche (MgS04). tiltre et évapore. On chromatographie sur gel de silice (éluant:
AcOEtIhexane 30/70). On récupère la warfarine sous la forme d'un solide blanc (23 mg.
70% de rendement).
Cette warfarine est comparable a celle disponible commercialement.
3. Résolution enzymatique
3.1 Hydrolyse enzymatique des esters d e la warfarine a
Dans un essai typique, l'ester de warfarine (30 mg) et l'enzyme (30-40 mg) dans le
solvant (3 mL), a la température de la pièce. L'avancement de la réaction enzymatique est
indiqué par une baisse du pH, qui est maintenue à sa valeur initiale par addition d'une
solution de NaOH (0.1 M). Ceci est suivi par la consommation de base et elle est
terminée lorsqu'un équivalent d'ester a été hydrolysé.
Alors, on filtre pour retirer l'enzyme, puis on extrait avec de I'AcOEt (3 x 50 mL).
On lave la phase organique avec de la saumure (2 x 70 mL), puis on sèche (MgSQ) et
kvapore la solution. Le résidu est chromatographié sur gel de silice (iluant AcOEthexane
20/80) au besoin.
Les composés sont décrits dans les sections précédentes.
3.2 Acétylation enzymatique de la warfarine
La procédure est la même que celle décrite à la section 3.1. sauf que les solvants
sont anhydres et qu'on ajoute également de ['acétate de vinyle (28 PL. 0.291 mrnol).
B. Désymétrisation enzymatique de l'acide citrique
1. Désymétrisation enzymatique du citrate de triéthyle
HofiCo enzymet HofiCofit euou HOfiCo2H tampon
Et20C C02Et H02C C02Et Et02C C02Et
38 - 39 40
Dans un essai typique. une suspension de citrate de triéthyle 3 ( 1 50 mg. 1.84
mmol) est hydrolysie avec PLE (50 mg) dans un tampon phosphate (pH 7) B la
température de la pièce. La réaction e e m a t i q u e est indiquée par une baisse du pH. qui
est maintenue à sa valeur initiale par addition d'une solution de NaOH (0.1 M).
L'avancement de la réaction est suivi par la consommation de base. La réaction est
considérie comme terminée lorsqu'un ciquivalent d'ester a été hydrolysé. La solution
aqueuse est alors extraite avec de l'éther (pour retirer tout reste du produit de départ). puis
acidifiée (HCl 3 N) jusqu'à pH 2. Les produits de l'hydrolyse sont extraits avec de
l'acétate d'éthyle. Les d e u isomères (3 et 40) sont séparés par chromatographie sur gel
de silice. en employant comme éluant une solution d'hexane/AcOEt (4.5 / 5.5).
Nom formel: Acide 3 -éthoxycarbony 1-3 -hydroxy-4-éthoxycarbonylbutyrique
Formule brute: C 1oHi60:
Masse molaire: 248.23 dm01
Aspect: huile
[alo'': +3.8 (c 1.84. MeOH)
IR (NaCI): 3600-3040 (OH), 7980-2860 (OH), 1750 (C=O). 1370.1 120, 1020,830.
RMN1~(CDC13) : 1.25(t. J=9.1,6H,CH3),2.86(m,4H,CHtC02),4.12(q, J=9.1,
2H, CH2CH3), 4.28 (q, J=9,2H, CH2CH3).
RMN ''(2 (CDC13): 174.76 (C=O). 174.03 ( G O ) , 169.64 (CZ0). 73.12 (C-OH). 62.39
(CH2CH3). 60.86 (CH2CH3). 42.88 (CH2C02). 13.89 (CH3).
Nom formel: Acide 2-hydroxy-2-(éthoxycarbonyl)méthyl-3 -~thoxycarbonylpropanoïque
Formule brute: C l o H 1 6 0 7
masse molaire: 248.33 iJrno1
Aspect : huile
IR (NaCl): 3600-3040 (OH). 1980-2860 (OH). 1750 (C=O). 1370. 1 190. 1020.
850, 780.
RMN 'H (CDCI,): 1 .Zj (t. 5=7.1. 6H. CHs). 1.91 (m. W. CH2C02). 4.15 (q. J=7.1.
4H. CH2CH3).
RMN "C (CDCl,): 1 77.13 (C=O). 1 70.09 (C=O), 73.1 6(C-OH). 6 1.36 (CH2CHs),
2. Préparation des diesters protégés 42a-b
2.1 Préparation du diacide protégé a
R=Me, 42a Et, 42b
De I'acide citrique 3 (8.0 g, 4 1.7 mmol), de la parafonnaldéhyde (3.76 g, 125.23
mmol) et du DMSO (2.1 mL) sont chauffés dans un ballon, a 156OC pendant environ 6
heures.
On laisse revenir à la température de la pièce. puis on filtre sur buchner. Le résidu
est recristallisé dans l'eau. pour donner un solide blanc. le diacide a (4.78 g, 56%: 67%
dans la littérature).
41 Nom formel: Acide 7-[4-(carboxyméthy 1)-5-0x0- 1.3-dioxolan-4-y llacétique
Formule brute: C:HsO7
Masse molaire: 204.13 @mol
Aspect: solide blanc
Point de fusion: 213-5 O C
[R (KBr): 2940 (COOH). 1800 (C=O). 1730 (C=O), 1440. 1260. 1200. 1 170.
RiMN ' H (CD30D): 5.52 (S. 2H. O-CH2-O). 7.88 (S. 4H. CH2C02).
RblN "C (CD30D): 175.57 (C=O). 172.22 (C=O). 96.30 (O-CH2-O), 77.29 (C).
42.05 (CH2CO7).
2.2 Préparation des diesters protégés 42a-b
Le diacide fl ( 1 .O g, 4.90 mmol) est dissous dans l'alcool (méthanol ou éthanol.
?O mL), puis l'acétal correspondant (diméthoxypropane ou diéthoxypropane, 4 mL) et
une résine acide d'échange ionique (Dowex 5OWX4. 0.5 g) sont ajoutés. Le mélange est
chauffé à reflux pendant 24 h.
Le mélange réactionnel est refroidi. filtré pour retirer la résine et évaporé. Le
produit brut est dissous dans ltAcOEt (100 mL) et lave avec Na2C03 aq. (2 x 20 mL) et
de la saumure (2 x 20 mL). La phase organique est séchée (MgS04), puis évaporée. Le
produit est ensuite chrornatographié (gel de silice; éluant AcOEt 1 Hexane 3 / 10) pour
fournir le diester correspondant (rendements: 86% et 42b. 85%).
Nom formel: 5-5-di[(méthoxycarbonyl)méthyl]- 1.3-dioxolan--!-one
Fornule brute: C9Hi207
Masse molaire: 231.19 grno1
Aspect : solide blanc
Point de fusion: 60-63 "C
IR (KBr): 3000 (CH). 2960 (CH). 1800 (C=O). 1740 ( G O ) . 1-1-10. 1370.
1240. 1 180. 1060,990.
RMPJ ' H (acetone-d,): 2.97 (S. 4H. CH2C02), 3.66 ( S . 6H. CH3). 5-50 (S. 2H. O-CH2-O).
RMN I3c (acerone-d6): 174.9 (GO) . 17 1 .O (C=0). 96.3(0-CHrO). 77.1 (C). 51.3 (CH3),
41.8 (CH2C02) .
Nom formel: 5.5-di[(éthoxycarbonyl)mCthyl]- 1.3 -dioxolan-4-one
Formule brute: CI lH1607
Masse molaire: 160.74 g/mol
Aspect: huile
IR (NaCl): 1980 (CH), 2930 (CH). 1800 (C=O), 1740 (GO) . 1375, 1 180,
1060, 1020.
RMN ' H (acetone-d6): 1.21 (t, J=7.0, 6H. CH3), 2.94 (s, 4H. CH1C02), 4.1 1 (q, J=7.0,4H,
CH2CH3), 5.5 1 (S. 2H, O-CH2-O).
RMN 13c (ûcetone-d,): 173.3 (C=O), 169.4 (C=O), 95.4 (O-C&-O), 76.3 (C), 61.4
(CHiCH3). 4 1.6 (CH2C02), 14.2 (CH3).
3. Désymétrisation enzymatique des citrates protégés
3.1 Hydrolyse enzymatique des diesters protégés 42a-b
R=Me, 42a R = M e , 3ta Et, 42b Et* 37b
La procédure est semblûble à celle décrite pour le citrate de triéthyle (38). à la
section 1 ci-dessus. On mélange le diester protégé J1 (50 mg. 2 (0.43 mmol). b (0.38
rnmol)) et 50 mg d'enzyme dans le solvant approprié.
Nom formel: 5-carboxyméthy 1-5-(rnéthoxycarbony 1)méthyl- 1.3-dioxolan-4one
Formule brute: CsH1007
Masse molaire: 218.16 glmol
.4spec t: huile
-4.4 (c 2.46. MeOH): [litt. +0.28. c 10. MeOH] '' IR (NaCl): 3500-2500 (COOI-I). 1790 (C=O). 1720 (C=O), 1 180. 1 145. 1000.
RMN ' H ( C D C I ~ ) : 2.90 et 2.95 (2s. JH. C H F 0 2 ) , 3.71 (S. 3H. CH3). 5.55 (S. 2H. 0-
CHI-O). 7.97. (S. 1 H. OH).
RMN I3c (CDC13): 173.4 ( G O ) . 172.8 (C=O), 168.9 (C=O). 95.0 (O-CH2-O). 75.3
(C), 52.2 (CH3), 40.8 (CH2C02).
Russell et Ancliff ont admis leur erreur dans la mesure de l'activité optique de ce
composé. Après vérification, ils ont trouvé une valeur semblable à celle de ces travaux.
Nom formel: 5-carboxyméthyl-5-(éthoxycarbonyl)méthyl- 1.3-dioxolan-4-one
Formule brute: CsH1i07
Masse molaire: 232.19 @mol
Aspect : huile
IR (NaCl): 3500-2500 (COOH). 1790 (C=O). 1720 (C=O). 1 180, 1 145. 1000.
RbfN 'H (CDCI,): 1.20 (t. .J=7.0. 3H. CH3). 2.83 et 2.89 (2s. 4H. CH2C02). 4.10 (q.
J=7.0. 2H. CH2CH3). 5.49 (S. 2H. O-CH2-O). 8.97, (S . 1 H. OH).
RMN "C (CDC13): 173.6 (C=O), 171.8 ( G O ) . 168.4 ( G O ) , 75.3 (C). 61.3
(CH2CH3). 4 1 . 1 (CHzC02). 40.8 (CH2C02). 13.9 (CHs).
3.2 Estérification enzymatique du diacide protégé a
enzyme ROH
R = M e , 37a Et, 37J
La procédure est sernblabie à celle décrite à la section 3.1. sauf qu'on ajoute
également 5 éq. d'alcool (g-méthanol. 300 PL; b-éthanol, 285 PL). On mesure
l'avancement de la réaction par ccm. Aucun essai n'a permis d'obtenir les composés 37a-
4. Détermination des excès énantiomériques
Dans les deux cas. les excès ont ét i déterminés en faisant réagir le citrate (1 éq.)
avec EDC (1.2 éq.). DMAP (cat.) et le (S-)-(-)-(1-naphty1)éthylarnine (NEA. 1.2 éq.).
dans du dichlorométhane anhydre à O O C . On laisse agiter toute la nuit. La température
revient progressivement à environ 20°C.
On dissout le mélange dans 150-100 mL de AcOEt et on lave succrssivement
avec WC1 IN (2 x 20 mL). eau ( 2 x 10 mL). NaHC03 aq. (3 x 20 mL) et saumure (2 x 30
mL). On seche la phase organique (MgSOd). puis on évapore le solvant. Au besoin. on
purifie par chromatographie (gel de silice: éluant AcOEthexane 25/75).
4.1 Avec le citrate de diéthyle 39
Selon la procédure décrite ci-dessus. on mélange le composé 3 (86 mg. 0.36
mmol), NEA (67 PL. 0.42 mmol). EDC (80 mg. 0.42 mmol) et DMAP (cat.) dans 5 mL
de CHZC12.
Formule brute: C73H27N06
Masse molaire: 40 1.45 g/mol
Aspect: huile
IR ('NaCl):
RMN 'H (CDC13):
RMN "C (CDC13):
3300 (NH), 2980-2860 (CH), 1730 (C=O). 1635 et 1550 (NH).
1450, 1370, 1250, 1 160, I W O , 780.
1.23 (t. 5=8, 6H. CH2CH3). 1.67 et 1-62 (2d, J=8. 3H, NCH-CH3).
2.80 (m. 4H, CH5C02), 4.10 et 4.2 1 (q. J=8. 4H. CH2CH3), 5.90
(qt. J=8. 1H. NCH). 6.39 et 6.48 (2d. 1=8. 1H. NH).
173.3 (C=O). 169.9 (GO), 167.9 ( G O ) , [138.1. 13 .8 . 130.7.
128.6. 128.1. 178.0. 126.3. 125.6. 123.1. Ar]. 73.5 (C). 62.1 1 et
62.05 (CH2CH3), 44.5 (MX), 42.62 et 42.59 (CH2C02). 30.8
(NCH-CH3). 13-81 et 13.77 (CH2CH3) .
Pour la détermination des e.e.. on utilise les doublets dus à I'azote (6.39 et 6.48 ppm).
4.2 Avec les esters protégés 37a-b
R=Me, 37a Et, 31b
R = Me, 45a Et, $J
Selon la procédure décrite ci-dessus. on mélange le compose a (118 mg. 0.59
rnmol). NEA ( 1 14 PL. 0.70 mmol). EDC ( 135 mg, 0.70 rnmol) et DMAP (cat.) dans 5
mL de CH2Cl2.
o$tB OH
C02CH3 45a -
Formule brute: CI!JHI~NOS
Masse molaire: 341 -36 g/mol
Aspect: huile
IR (KBr): 3420 (OH). 1780 (C=O), 1700 (C=O). 1380. 1330, 1200. 1 170.8 10
(Ar), 780 (Ar).
RMN 'H (acetone-d6): 1.89 (d, J=7, 3H. NCH-CHi), 2.57* (d, 5 4 8 . 1 H. CHr), 3.10 (m.
3H. CH2). 3.49* (s.3H. Co2CHJ), 6.10 (q, J=7. 1H. NCH). 7.48
(m. 3H. Ar). 7.88 (m. 3H. Ar). 8.10 (m. 1H. Ar).
RMN "C (acetone-d6): 178.7 (C=O). 175.0 (C=O), 170.9 (C=O). [ 5 . 5 134.6. 132.1.
179.5. 129.0, 127.1. 126.8. 126.2. 125.8. 113.8. Ar]. 72.5 (C). 51.9
(C02CH3). 47.1 (NCH). 42.4 (CH?). 4 1.2 (CHt). 1 7.2 (NCH-CH3)
Les spectres sont donnés pour un seul diastéréoisomère. Les pics de 2.57 et 3-49
sont utilisés pour évaluer 1'e.e. d'un échantillon.
Formule brute: CloHllN05
ii4asse molaire: 355.38 glmol
Aspect: huile
IR (NaCl): 3500-3200 (OH). 3020 (CH). 2940 (CH), 1680(C=0). 1600
(NC=O). 1560. 1360. 1240.760 (Ar).
RMN 'H (acetone-d,): 1.1 1 (t. 5=7. 3H. CH2CHi), 1.90 (d. J=7. 3 H. NCH-CHa). 2 . S 4 (d,
J=18. 1 H. CH?), 2.93 (m. W. CH2). 3.97 (q, J=7. 2H. CH2CH3),
6.12 (q, J=7. 1H. NCH), 7.50 (m. 3H. Ar). 7.87 (m. 3H. Ar), 8.13
(m. 1 H. Ar).
RMN ')c (xetone-d,): 178.8 (C=O). 175.0 (C=O). 170.4 (C=O), (135.5, 134.6. 132.1,
119.6, 129.0. 127.1. 126.8. 126.2. 125.7, 123.8, Ar1 72.4 (C), 61.1
(CH2CH3). 46.8 (NCH), 42.4 (CH2), 41.4 (CH2), 17.1 (NCH-
CH3), 14.2 (CH2CH3).
Les spectres sont donnés pour un seul diastéréoisomère. Le pic de 2.55 est utilisé
pour évaluer 1'e.e. d'un échantillon.
5. Corrélation chimique
5.1 Ouverture de cycle des esters protégés 37a-b
R = Me, (RI-(+)-= R = Me, (R)-(+)-36 Et, (R)-(+)-3fb Et, (R) - (+) -a
Le compose a (0.85 rnrnol) est dissous dans l'éthanol ou le méthanol anhydre (20
mL). On ajoute de la triéthylamine (236 PL. 1.70 mmol) et chauffe la solution à reflux
pendant 24 h. On laisse ensuite revenir à la température de la pièce. puis on évapore à
sec. L'excès d'amine est neutralisé avec du HCI IN (20 mL) La solution aqueuse est
estraite avec de ItAcOEt (4 x 15 mL). puis on lave la phase organique avec de la saumure
(2 s 20 mL). On la sèche (MgS04) et l'évapore pour obtenir ou o.
Le composé obtenu par cette méthode est identique en tout point à celui obtenu
précidemment.
OMe
Nom formcl: Acide (R)-(+)-3-méthoxycarbonyl-3-hydroxy-4-méthoxyc~que
Formule brute: CsH1207
Masse molaire: 220.18 g/mol
Aspect: huile
[a] 13.9 ( c 1, MeOH); [litt. +4.0, c 1.00, MeOHJ "
ER (NaCl): 3400 (COOH), 3020 (OH), 1740 (C=O).
RMN 'H (acetone-&): 2.86 (m, 4H. CH2C02). 3.61 (S. 3H. CHi), 3.71. (S. 3H. CH3).
RMN ''c (acetone-4): 174.3 (GO). 1 71.5 (C=O). 170.7 ( G O ) . 74.0 (Cl. 57.8 (CHJ).
5 1.8 (CH3). 43.7 (CH2C02). 43.3 (CH2C02).
5.2 Ouverture de cycle du méthylester protégé 37a et transestérification
Du sodium (47 mg. 7.06 rnrnol) est introduit dans un ballon d'éthanol anhydre
refroidi à O O C . Une solution de j7a ( 1 80 mg. 0.835 mmol) dans de l'éthanol anhydre est
ajouté et le mélange revient à la température de la pièce pendant une nuit. La solution est
Cvaporée à sec et le résidu est dissous dans de I'AcOEt. La phase organique est
neutralisée avec du HCl 1N et lavé avec de la saumure ( 2 x 20 mL). Puis elle est séchée
(MgS04) et évaporé pour récupérer le composé 2 (50 %).
Le composé 3 obtenu par cette méthode est identique en tout point 3 celui obtenu
précédemment.
C. Résolution et désymetrisation enzymatique de tropanes
1. Synthèse de la pseudopelletierine et tropinone
COzH > 1) Na2HP04, NaOH, eau + CH3NH2 + O 2)HCI.A
COzH 80%
La tropinone utilisée provient de chez Aldrich. La pseudopelletierine est préparée
par la réaction de Robinson.
Dans un ballon on introduit le glutaraldéhyde (19 rnL de solution 25% p/p dans
l'eau. 50 mrnol. 1 éq.). de la méthylamine hydrochlorée (5.0 g. 70 mrnol. 1.5 éq.) dissous
dans 50 mL d'eau. de l'acide acétonedicarboxylique (8.3 g. 60 mmol. 1.2 éq.) dissous
dans 83 mL d'eau. ainsi qu'une solution de Na2HP04'H20 (8.8 g. 25 mmol) et NaOH
(0.73 g. 18 mmol).
On laisse agiter à la tempirature de la pièce. sous azote. pendant 24 h. Ensuite. on
ajoute 3.3 mL de HC1 concentre et on Fait chauffer la solution sur bain-marie pendant une
heure. pour permettre la décarboxylation.
Lorsque la solution est refroidie. on ajoute 7.5 g de NaOH dissous dans 10 mL
d'eau. puis le mélange est extrait avec du dichlorométhane (8 x 25 mL). On séche la
phase organique (MgS04), puis on évapore le solvant.
La purification du produit par chromatographie-éclair s'est révélée peu efficace. 11
est plus efficace de sublimer le produit (40aC. 0.3 mm Hg). On obtient un solide blanc-
jaunâtre. Les rendements de cette réaction ont varie de 50060% (lin 80% 69).
Nom formel:
Formule brute:
Masse molaire:
Aspect:
pF:
IR (NaCl):
CqH 1 sNO
1 3 - 2 2 g'moi
solide
5 1-54 O C (lin. 48-52 O C ) 69
2890 (CH). 2810 (N), 1700 (C=O),
9 1 0. 730.
1.27-1.49 (m. 4H. 7 6 er 8 endo). 1.80-1.91 (m. 2H. 6 et 8 exo).
2.17 (S. 1H. 3'4 a..). 7.17 ( S . IH. Y 4 a.). 2.52 (S . 3H. 9). 1.67 (dd.
J=17 et 7. ZI-1.2 er 4 Pq.). 3.21 (s large. 2H. 1 ef j).
210.4 (3). 55.5 ( 1 er 5). 41.7 (2 et 4. 41.0 (9). 29.4 (6 et 8). 15.8
2. Synthèse des dérivés méthoxycarbonylés 84a-b
NaH, (CH 30)2C=0.
( M F , A. 80% (
n = l : t p . 83a 2 : pp, g3J
Une solution de tropinone 83a ( 1 .O0 g. 7.1 8 m o l . 1 éq.) dans 5 mL de THF
anhydre est ajoutée goutte-à-goutte dans un mélange de NaH (0.3638, 14.37 mrnol, 2 éq.)
et carbonate de diméthyle (1.33 mL, 15.80 mrnol. 2.2 éq.) dans 5 mL de THF anhydre
chauffé à reflux doux.
Une solution de pseudopelletierine 83b (0.963g. 6.29 mmol, 1 éq.) dans 5 mL de
THF anhydre est ajoutée goutte-à-goutte dans un mélange de NaH (0.3 18g, 12.58 mmol.
2 éq.) et carbonate de diméthyle (1.2 mL. 13.84 mmol. 2.3 eq.) dans 5 mL de Tm
anhydre chauffée à reflux doux.
Le reste des manipulations est semblable dans les deux cas. Après une heure. on
ajoute 30 uL de MeOH et laisse encore agiter pendant une heure de plus. Puis on laisse
revenir à la température de la pièce. On ajoute 25-30 mL d'eau distillée. que l'on extrait
avec du CH2C12 (8 x 25 mL). On sèche la phase organique (MgS04). filtre et ivapore
sous pression réduite. On place au congélateur jusqu'au lendemain. Après subiimation. on
obtient un solide blanc (parfois Iégérement jaunâtre) (0.800 g. 61-6900. lin. 80% 75) .
L'analyse du composé 8Ja s'avère compliquée. à cause de l'équilibre de trois
formes (revoir le schéma 38 de la partie théorique). Ci-dessous. on retrouve les données
pour la forme dominante (énolique).
Nom formel:
Formule brute:
Masse molaire:
Aspect:
pF:
IR (KBr):
RMN 'H (CDC13):
5 4 3
84a -
2-(méthoxycarbony 1)-8-méthy 1-8-azabicyclo[3.3.1]-oct-2-én-3-ol
Ci0Hl5N03
197.13 grno1
solide
40 "C
3500-3300 (OH), 2940 (CH). 2780 (N). 1650 (C=O). 1520. 1260,
1220,800 (=CH), 770 (=CH).
1.48-2.23 (m. jH, 6, 7 et 4 a), 2.34 (s, 3H. a), 2.74 (dd, J=19 et 5,
IH, 4 kq.). 3.32 (m. IH, j), 3.75 (s, 3H, 10), 3.79 (s, IH, l), 11.75
(s, 1 H, OH: pas toujours visible).
RMN I3c (CDCI,): 171.2 (9). 169.5 (3). 102.0 (2). 60.5 (9, 57.0 (Z), 47.3 (10). 38.1
(4). 34.2 (6), 29.1 (3.27.7 (8).
Nom Formel: 7-(méthoxycarbony 1)-9-méthy 1-9-awbicyclo[. 1 1-non-2-en-3-01
Formule brute: C I I H ! ~ ~ ~
Masse molaire: 2 1 1 2 6 g h o l
Aspect: solide
pF: 97- 10 1 'C (lin. 126-7OC) "
IR (KBr): 3500-5200 (OH). 3080 (CH). 2940 (CH). 2880 (N). 27/10, 1660
(C=O). 15 IO, 1250. 1720. lO5j.830 (=CH). 775 (=CH).
RMN 'H (CDCi3): 1.36-1.90 (m. 7H. 6. 7, Y rr 4 m). 2.29 (S. 3H. 9). 2.64 (dd. J=19 et
7. IH. 4L;rl.). 5.05 (s large. 1H.J), 3.59(s large. iH. 1). 3.71. (S.
3H. 11). 12.1 (S. 1 H. OH: pas toujours visible).
RMN1'~(CDC13): 171.7(!0, 3).96,8(2).53.0(j),52~4(1).51.1 (11).41.6(4).32.4
(9). 19.0 (6). 27.8 (8). 14.7 (7 .
3. Acétylation chimique du composé 84b
\ \ a:."' &-CI, DMAP,
CH2C12 83 %
a';: (I)-84b (*)dB
On mélange le composé 84J avec du chlorure d'acétyle (38 PL, 0.538 mmol, 1.2
éq.) et du DMAP (71 mg, 0.582 mmol, 1.3 éq.) dans du dichiorométhane anhydre (2 mL).
On laisse agiter sous azote pendant 24 h.
On ajoute un peu d'eau (20 rnL) et on extrait avec du dichiorométhane (4 x 50
mL). On sèche la phase organique (MgSO4) et évapore le solvant. Au besoin. on
chromatographie sur gel de silice (éluant AcOEthexane 20/80). On obtient un solide
blanc. le composé (95 mg, 83%).
Nom formel:
Formule brute:
Masse molaire:
Aspect:
pF:
IR (KBr): ???
85 - 2-(méthoxycarbony 1)-3-acétoxy-9-méthy1-9-biccl[ 3.1 ]-non-
2-en-3 -01
Ci3Hi9NO.t
253.29 g/mol
solide
54-6°C
3080 (CH). 7940 (CH). 2880 (N). 2740, 1660 (C=O). 1510. 1230.
1230. 1055.830 (=CH). 775 (=CH).
RMN'H(CDCI~): 1.36-1.90(m.7H.6, ~ ,8et . (m.) ,2 .20(s .3H.13) .2 .35(~,3H.9) ,
2.59 (dd. J=19 et 7. 1H. 4 Iq.). 3.69 (s large. 1H. 1), 3.77 (s, 3H.
II).
RMN I3c (CDC13): 175.7 (17). 170.2 (10). 96.1 (1), 52.9 (3, 52.3 ( I ) , 5 1.4 (1 i), 40.7
(9). 31.5 (4). 28.3 (6), 28.2 (8). 22.2 (13), 14.2 (7).
4. Résolution enzymatique du composé 84b
4.1 Hydrolyse enzymatique du composé 84b
Dans un essai typique, on mélange le composé &J (70 mg. 0.33 rnmol) et
l'enzyme (70 mg) dans le solvant indiqué (3 mL). L'avancement de Ia réaction est suivie
par ccm. On utilise comme éluant de I'AcOEt avec 510% de triéthplamine. La
pseudopelletierine semble plus polaire que le composé && (Rf de 0.2 par rapport à 0.33).
Lorsque la réaction semble terminée, on ajoute du NaCl pour saturer la phase
aqueuse. puis on extrait avec du dichlorométhane (4 x 75 mL). On sèche la phase
organique (MgS04) et évapore le solvant. Les composés obtenus sont identiques à ceux
obtenus ci-dessus.
4.2 Acétylation enzymatique du composé 84b
La procidure est la même que celle décrite à la section 4.1. sauf qu'on ajoute de
l'acétate de vinyle (1 O? PL. 1.66 rnmol. 5 éq.) ou d'isopropényle (1 82 PL. 1.66 rnmol. 5
éq.) et qu'on utilise des solvants organiques anhydres.
4.3 Hydrolyse enzymatique du composé @
\
enzyme eau
+ &fzMe OAc
C02Me
Même procédure qu'à la section 4.1
5. Synthèse de la ferruginine
5.1 Synthèse du triflate 86a
Co2Me (CF3S02)20, pyr.
A une solution de & ( 1 93 mg. .979 mmol. 1 éq.) et pyridine (1 19 PL. 1-47
mmol. 1.5 éq.) dans du dichlorornéthane anhydre (2 mL) à 0°C. on ajoute de I'anhydride
trifluorométhanesulfonique (206 PL. 1.72 mmol. 1.25 éq.). On laisse la solution revenir a
la température de la pièce.
Après 12 h. on Cvapore le solvant. puis chromatographie directement le résidu sur
gel de silice (çluant: AcOEt/Hexane/Et3N 49/49/3). On obtient une huile jaunâtre (347
mg. 75%: lin. 80% 'O).
Nom formel:
Formule brute:
Masse molaire:
Aspect:
IR (NaCl):
RMN 'H (CDC13):
86a - 7-(méthoxycarbony l)-8-méthy1-8-azabicyclo[ 2.11-oct-%ne
3-triméthylsulfonate
C i i H i4NOjS
329.29 g h o l
huile
3054 (CH). 2985 (CH). 1720 (C=O), 1590. 1420,1340,740 (=CH).
1.45-2.12 (m. jH, 6, 7 et 4 ar.), 2.32 (s, 3H, a), 2.77 (dd, 5=18 et 4.
lH, 4 éq.), 3.36 (m, lH, Li), 3.74 (s, 3H, IO), 3.85 (m, lH, 1).
5.2 Synthèse du composé 87a
Et3N, P ~ ( O A C ) ~ . HC02H, DMF, W C , lh,
45%
On agite sous azote une solution de Ka (350 mg, 0.759 mmol. 1 éq.).
triithylamine (3 17 PL. 1.28 mmol. 3 éq.). acétate de palladium (3.4 mg. 0.0 15 m o l .
0.07 Cq.) et triphénylphosphine (8 mg, 0.030 rnrnol. 0.04 éq.) dans du DMF (4 mL). On
ajoute lentement de l'acide formique (57 PL. 1.52 mrnol. 2 éq.). puis on chauffe le
mélange à 60°C pendant 1 h.
On laisse refroidir. puis ajoute de l'eau (20 mL). On extrait avec du
dichlorométhane ( 5 x JO mL) et on sèche la phase organique (MgS04). On
chromatographie sur gel de silice (éluant: éther de pétrole/EtzOIEt3N 495015) pour
obtenir une huile claire (65 mg, 45%; lin. 80% 'O: la réaction n'a pas été optimisée).
Nom formel: méthanoate d'anhydroecgonidine
Formule brute: C IOHISNO~
Masse molaire: 18 1.37 glmol
Aspect: huile
IR (NaCl): 3000 (CH). 1600 (C=O). 1420, 1 120,700.
RiMN 'H (CDC13): 1.38-2.10 (m. jH. 6. 7 e t 4 ar.). 2.29 (S. 3H, 8). 2-57 (m. 1H. 4 e'y.).
3.19(m. lH, j ) .3 .69(~ .3H. 10),3.72 (m. IH. 2).6.76(m. 1H.3).
I3c (CDCh): 166.3 (9). 135.6 (31, 133.9 (2) , 58.3 (9, 56.7 (1). 51 -4 (10). 36.1
(fi). 34.2 (8). 31.5 (4. 29.9 (7).
BIBLIOGRAPHIE
1) Sheldon. R.A.. Chirotechnology: industriol synthesjs of opticolly active compounds.
Marcel Dekker. USA. 1993.
7) International Union of Biochemistry. Enzyme !Vomencluture. Academic Press. USA.
1992.
3 ) Kindel. S.. Technoiogy. 198 1.1,61.
4) Faber. K.. Biotrnnsforrnafiuns in Orgunic Chernistry- A texrbook. 2' Ed.. Springer
Verlag Berlin Heidelberg. Allemagne. 1995: (a) p. 18. (b) p. 19. (c) p. 3 4 1. (d) p. 3.
5) Crout. D.H.G. Christen. M.. "Biotransfomations in Organic synthesis" dans Modern
$vnrhrtic Methods. 1989.2, 1.
6) Burger. U.. Erne-Zrllweger. D.. Mayerl. C.M.. Helv. Chem. Acta. 1987. a, 587.
7) Shaw. J.F.. Klibanov. AM.. Biorechnol. Biueng.. 1987.29- 66.1.
8) Roth. F.E.. Govier. W.M.. J. Pharmacol. Exp. Ther.. 1958.174, 347.
9) Tobert. J.. Cirillo. V.. Hitzenberger. G.. James. 1.. Pryor, J., Cook, T.. Buntinu. A..
Holmes. t.. Lutterbeck. P.. Clin. Pharrnucol. Ther. (Sr. Louis). 1981.29, 344.
10) Sullivan. H.R.. Beck. J.R.. Pohland, A.. J. Org. Chem.. 1963.3.2381.
1 1 ) Zimmerman. D.. Gesellchen. P.. Annu Rep.. Med. Chem.. 1982. u. 3 1.
12) Sirnonyi. M.. Med. Res. Rev., 1984.3: 359.
1 3) Millership. J.S.. Fitzpatrick. .4.. Chircrlify, 1993.2. 573.
14) Sakai. T.. Kawabata. 1.. Kishimoto. T.. Ema. T.. Utaka. M.. J.Org. Chern.. 1997. a, 4906.
15) Lin. G.. Lin. W.Y.. Trrrahedron Lets.. 1998.3,4333.
16) Chenevert. R.. Goupil. D.. Rose, YS.. Bédard, E.. Tetrahedron: Asym., 1998, 9, 4285.
17) (a) Desnuelle. P.. "The Lipases" dans The Enqmes, Academic Press. USA. 1972.
(b) Wooley, P.. Petersen, S .B ., Lipases, their structure, biochemistry and applications,
Cambridge University Press, Angleterre, 1994.
18) (a) Bianchi, D. Cesti, P.. J. Org. Chem.. 1 9 9 0 , s 5657.
(b) Iriuchijima. S.. Kojima. N., J. Chem. Soc.. 1981. 185.
19) Santaniello, E.. Ferraboschi. P.. Grisenti. P.. Manzocchi. A.. Chem. Rev.. 1992. z. 1071.
20) Janssen. A.J.M, Klunder, A.J.H. Zwanenburg. B.. Tetrahedron, 1991.47,55 13.
2 1 ) Anderson. E.M.. Larsson, K.M.. Krk. O., Biocatalysis and Biotransforniation. 1998.
16, 181. - 22) Gao. Y.. Hanson. R.M.. Klunder. J.M. Ko. S.Y.. Masamune. H., Sharplrss. K.B.. J
.dm. Chern. Soc., 1987,109,5765.
23) (a) Kasel. W.. Hultin. P.G.. Jones. J.B.. J. Chrm. Soc.. 1985, 1563.
(b) Laumen. K.. Schneider, M.. Tetruhedron Leu., 1985.2073.
24) Ikawa. M. Stahrnann. MA.. Link C.P..J. Am. Chem. Soc.. 194466,902
'5) Valente. E.J.. Poner. W.R.. Trager. W.F.. J. Med C'hem.. 1978. a. 23 1. - 16) Remington's Ph~rrmacezrrical Sciences. 17' éd.. Mack Co. USA. 1985; (a) p. 826: (b)
p. 1256.
27) ?iouveaz< Giridc pratique des rncidicaments. Dorling Kindersley Limited. Angleterre.
1996. p.5 14.
28) Hewick. D.. McEwen. J.. J. Phrirrn. Pharmacol.. 1974. B. 474.
29) Lewis. R.J.. Trayer. W.F.. Chan. K.K.. Breckenridge, A.. Orme. M.. Rowland. M..
Schary . W.L.. .I. Qin. Inwst.. 1974.2 . 1607
30) Banfield. C.. Rowland. M.. J. Pharm. Sc. 1983.2.921.
3 1) West. B.D.. Preis. S., Schroeder. C.H.. Link. K.P.. J. dm. Chem. Soc. 1961. B. 2676.
32) Barman. T.E.. Enqme Handbook. vol. II. Springer-Verlag, USA, 1969. p.5 13.
33) Kazlauskas. R.J.. J. Am. Chem. Soc.. 1989. u? 1953.
34) Kazlauskas. R.J.. Wcissfloch. N.E.. Rappaport, AT.. Cuccia. L.A.. J. Org. Chrm..
1991.56,2656.
35 ) Serrequi, A.N.. Kazlauskas, R.J.. Can. J Chern., 1995.73, 1357.
36) Citric Acid. Chernicd Economic Handbook, Stanford Research Institute. Menlo Park,
USA, 1989.
-
3 7) Scient@ Literarure Review on GRAS Food Ingreciients-Citrates. National Technical
Information Service. Springfield. Va.: (a) PB-223 850. Apr. 1973: (b) PB-741 967.
Oct. 1974.
38) Persmark. M.. Pittman, P.. Buyer. J.S.. S c h ~ y n , B., Giel, P.R.. Nietlands. J.B.. J. .-lm.
C'hem. SOC.. 1993.m: 3950.
39) Harris. G.H., Turnes Jones. E.T.. Meinz. M.S.. Nallin-Omstead. M.. Helms, G.L.,
Bills. G.F.. Zink. D.. Wilson. K.E.. Tetruhedron Leit.. 1993.3, j?3j.
40) Weaver. R.. Gilbert. I.H.. Tetrrihedron. 1997. j3. 5537.
41 ) Bergeron. R.J.. Xin. M.. Smith. R.E. Wollenber. M.. McManis. J.S.. Ludin. C..
Abboud. K.A. Terrahrdron, 1997.53,427.
42) Hirota. K.. Kitagawa. H.. Shimamura. M.. Ohmon. S.. Chernisir-v L m . 1980, 191-
194.
43) Ancliff. RA. Russell. A.T. Sanderson. A.J.. Tetruhedron: Asym.. 1997.8, 3379.
44) Chênevert. R.. Ngatcha. B.T.. Rose. Y.S. Goupil. D.. Terraheriron: .-l.ym.. 1998. 9. 4325.
45) Saji. K.. Antoku. F.. Muto. M.. Ishizumi. K.. (Sumitorno Pharmaceutical Co.. Ltd.
Japon). Jpn. Kokai Tokbo koho JP 07735865 A2. 18 sep 1990. Heisei. 5 pp.
46) Flaih. N.. Pham-Huy. C.. Galons. H.. Tctrahedron Lett.. 1999.40, 3697.
47) Cohen. S.G.. Tram Y. Y. ;Icod Sci.. 1969.2 . 705.
48) Heymann. E.. Junge. W.. Grr. J. Biochem.. 1979.95, 509.
49) ohmer. N.. Manson. A.. Norin. T.. Hult. K.. Biocaralysis. 1990. J. 81.
50) Provencher. L.. Wynn. FI.. Jones. J.B.. Krawczyk. A.R.. Terrahedron: Asyrn.. 1993.4.
2025.
51) Ikegami. Y.. Takauchi, N.. Hanada. M.. Hasegawa. Y., Ishii, K.. Andoh. T., J
Antibiot.. 1990.43, 158.
52) (a) Fujiwara. H.. Aoyama. T.. Shioiri. T.. Terrahedron, 1998 ,3 , 55 1.
(b) Fujiwan, H.. Egawa S.. Terao. Y.. Aoyarna. T.. Shioiri, T., Tefrahedron, 1998.
565.
53) Matsuo. K.. blatsumoto. T.. Nishiwaki. K.. Heterocycles, 1998.48, 121 3.
54) Vollhardt, K.C.P.. Traité de chimie orgonique, Boeck-Wesmael. Belgique. 1990,
1020.
55) Hill. R.K.. "Pyrrolidine. piperidine, pyridine and imidazole alkaloids" dans Chemistv
of the alkaloids. Reinhold Book Corporation. USA. 1970. 395.
56) Daly. J.W.. Garraffo. H.M.. Spande. R.F.. "Amphibian Alkaloids" dans The
AIkuloids. Academic Press, USA. 1970 .9 , 185.
57) Fodor. G.. "Tropane Alkaloids" dans Chemisrv of the illkaloids. Reinhold Book
Corporation. USA. 1970.295.
58) (a) Ritz. M.C.. Lamb. R.J.. Goldberg. S.R.. Kuhar. M.J.. Science. 1987.137. 1 1 1 9.
(b) Madras. B.K.. Spealman. R.D.. Fahey, MA.. Neumeyer. J.L.. Saha. J.K.. Milius.
R.A.. Mol. Pharmacol.. 1989.36, 51 8.
59) Spande. T.F.. Garaffo. KM.. Edwards. M.W.. Yeh. H.J.C. Pannel. L.. Daly, J.W.. J.
dm. Chem. Soc . 1992. ml-), 3475.
60) Giblin. G.M.P.. Jones. C.D.. Simpkins. N.S., J. Chem. Soc.. Perkin Trans. 1 . 1998.
3689.
6 1 ) Bai. Donglu. Xu. R.. Chu. G.. Zhu. X. . LUrg Chem.. 1996.6l, 4600.
63) Bick. I.R.C. Gillard. LW.. Leow. H.M.. dicsi. J. Chem.. 1979,z. 2537.
63) Bick. I.R.C.. Gillard. J.W.. Leow. H.M.. h s t . J.Chrrn.. 1979.32, 2523.
64) Davies. H.M.L.. Saikali. E.. Young, WB.. J. Org. Chem.. 1991,56? 5696.
65) Hemandez. A S . . Thaler. A.. Castells. J.. Rapoport. H., J. Org. Chcm.. 1996. a, 3 14.
66) Gauthier. 1.. Royer. J. Husson. H.P.. J. Org. Chem.. 1997.62,6704.
67) Royer, J . . Husson. H.P.. Trtrahedron Leu.. 1987.2 ,6175.
68) Campbell. H.F. . Edwards. O.E.. KoIt. R.. Cm. J. Chem.. 1977 .3 . 1376.
69) Carroll. F.L.. Lewin. A.H., Abraham. P., Parham, K., Boja. LW.. Kuhar, M.J., J.
.bled. C'hem.. 1991.3 ,883.
70) Stille. J.K.. Echavarren. A.M.. Williams. R.M., Hendrix. LA.. J. Org. Synth., 1993,
71.97. -+
71) Chen. 2.. Meltzer. P., Terrahedron Lrtt.. 1997, Z, 1 12 1.
72) Findlay, S.P.. J. Org. Chem., 1957.22, 138%
73) Meltzer. P.C., Liang A.Y.. Blundell. P.. Gonzalez, M.D.. Chen. Z.. Georges. C..
Madras. B.K.. J. Med. Chem., 1997.40,266 1.
74) Brombndge. P. , Chan. T.H., Tetrahedron Letr.. 1979,46,4437.
7 5 ) Chênevert. R., Mohammadi Ziarani. G. Morin, M.P.. Dasser. M.. Tewahenl-an:
-kyn., 1999.l0, 3 117.
76) Chen. 2.. Izenwasser, S., Katz. J.L.. Zhu, N., Klein. CL. , Trudell. ML., J. .bled
C'hem.. 1996.39,4744.