Genética Molecular em Análises Clinicas

TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos

– PCR

– Real Time PCR

– NASBA/TMA

PCR

OPTIMIZAÇÃO DO PCR

• [MgCl2]

• Th• [dNTP]• [primers]• [DNA]• [inibidores]

Variações

• RT-PCR• Multiplex PCR• Nested PCR

Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos

– PCR

– Real Time PCR

– NASBA/TMA

Principio de funcionamento do Real-Time PCR

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http://biochem.roche.com/lightcycler/_vti_bin/shtml.dll/hardds01.htm/map

Detecção dos produtos de PCR

Montar uma reacção

Químicas Utilizáveis

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Detcção com SybGreen

Sybr-Green Detection

• Intercalates to dsDNA• Inhibits DNA

amplification so concentration is critical

• Detects specific and non-specific targets

• Low starting background with large increase in signal

• Can run a melt curve to look at product specificity

Detecção com sondas

Quimicas utilizáveis:sondas taqman

Quimicas utilizáveis:molecular beacons

Quimicas utilizáveis:sondas FRET

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Hyb-ProbesTM

Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: Quencher

Excitation Emission

Transfer

Quimicas utilizáveis:mgb-probes

F

Q

F F

MGB

Q

F

MGB

Q Q

F

Aplicações

Quantificação

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End Point versus

Real-Time

Quantificação

Aplicações

Detecção de Mutações / SNP

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Detecção de mutações

Aplicações

Multiplex Detection

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Detecção simultânea de vários produtos

Os equipamentos

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Light Cycler

Smartcycler

Rotorgene

• The samples spin continually during a run at 500 rpm

• The samples are heated and cooled in a low mass air oven

• Tubes are illuminated as they pass the detector

• On data acquisition energy is averaged over 20 revolutions to give the fluorescence of each sample

• Four Channels• Ch1: ex 470nm, det 510nm• Ch2: ex 530nm, det 550nm• Ch3: ex 585nm, det 610nm• Ch4: ex 625nm, det 660nm

Near-patient-testing

Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos

– PCR

– Real Time PCR

– NASBA/TMA

NASBA/NUCLISENS

Amplification: schematic diagram

Primer 1

Reverse Transcriptase

RNase HPrimer 2

Reverse Transcriptase

T7 RNA polymerasePrimer 2

Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase

RNase HPrimer 1

• sense RNA• antisense RNA• sense DNA• antisense DNA

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