CONGELACION DE CONGELACION DE EMBRIONESEMBRIONES

Ventajas de la Congelacion de Embriones

• No es necesario transferir los embriones inmediatamente después de colectados.

• No es necesario tener muchas receptoras sincronizadas.

• Permite el transporte de genética a bajo costo.

• Facilita la introducción de una nueva raza y la adaptación de los futuros terneros al nuevo medio ambiente.

•Disminuye el riesgo de introducir enfermedades exóticas.

•Los embriones pueden ser almacenados mientras se testean los padres por enfermedades o por producción.

•Almacenamiento de genética de razas o especies raras o en extinción.

•Permite mantener la diversidad genética a través de un banco de embriones.

- 5 to - 7 °C - 30 to - 35 °C

Constitution of Freezing MediumConstitution of Freezing Medium

1. PBS + antibiotic-antimycotic1. PBS + antibiotic-antimycotic2. Biological proteins – 0.4-20%2. Biological proteins – 0.4-20%3. Cryoprotectants - ~10%3. Cryoprotectants - ~10%

*Glycerol*Glycerol*Ethylene Glycol*Ethylene Glycol

CryoprotectantsCryoprotectants

Permeating e.g. Glycerol or Permeating e.g. Glycerol or ethylene glycolethylene glycol

Nonpermeating e.g. SucroseNonpermeating e.g. Sucrose

Protocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de Congelación

ColectarColectar

Lavar (10 veces)Lavar (10 veces)

Clasificar los embriones.Clasificar los embriones.

Protocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de Congelación

Lavado de embriones• 5 lavados con PBS (1/100 volumen de los

embriones y no mas de 10 embriones)

• 2 lavados con tripsina al 0,2% por 30-60 segundos

• 5 lavados con PBS

• Los Embriones deben Tener la ZP intacta, sin material adherido y ser observados a 50X de magnificación

Lavado de embriones

Enfermedades que no se Transmiten a través de la Transferencia de Embriones

Categoría 1• Leucosis Enzootica Bovina• Fiebre Aftosa (Bovino)• Lengua Azul (Bovino)• Brucela Abortus (Bovino)• Encefalitis Espongiforme Bovina (BSE)• Scrapie (Ovino)• IBR (Bovino) (con tripsina)• Pseudorrabia (Porcino) (con tripsina)

IETS, 2004

Categoría 2• Peste Porcina Clasica• Lengua Azul (ovino)

Categoria 3• DVB• Peste Bovina• Haemophilus Sommus• Virus de la Inmunodeficiencia

Bovina• Campilobacter Fetus (ovino)• Fiebre Aftosa (porcino, ovino y

caprino)• Enfermedad Vesicular Porcina• Adenomatosis Pulmonar (ovinos)

Categoría 4• Micobacterium Bovis• Micobacterium Paratuberculosis• Neospora Caninum• Anaplasmosis Bovina• Herpesvirus Bovino-4• Ureaplasma Micoplasma• Clamidia Psitaci• Virus Parainfluenza 3• Estomatitis vesicular (bovino)• Enfermedad de Akabane (bovino)• E. Coli 09:k99 (bovino)• Lepto Borgpeterseni s, hardjobovis• Enterovirus (bovino)• Maedi-visna (ovino)• Scrapie (Caprino)• Lengua Azul (caprino)• Artritis-encefalitis Caprina• Parvovirus porcino• Leptospirosis (porcino)• Brucela Ovis • Peste Porcina Africana• Circovirus Porcino• Sindrome Reproductivo y Respiratorio porcino

Cycle day: 6 Cycle day: 6.5 Cycle day: 6.5 Cycle day: 6.5 Cycle day: 6.5Stage Code: 3 Stage Code: 3 Stage Code: 3 Stage Code: 3 Stage Code: 4Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:2 Quality Code:2 Quality Code:1

Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:1

Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4Quality Code:2 Quality Code:2 Quality Code:2 Quality Code:2 Quality Code:2

BOVINE EMBRYOS: EXAMPLES OF DEVELOPMENTAL STAGE AND QUALITYPage 1

BOVINE EMBRYOS: EXAMPLES OF DEVELOPMENTAL STAGE AND QUALITYPage 2

Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4Quality Code:2 Quality Code:3 Quality Code:3 Quality Code:3 Quality Code:3

Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 5 Stage Code: 5 Stage Code: 5Quality Code:3 Quality Code:3 Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:1

Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7Stage Code: 5 Stage Code: 5 Stage Code: 5 Stage Code: 5 Stage Code: 5Quality Code:1 Quality Code:2 Quality Code:2 Quality Code:2 Quality Code:3

BOVINE EMBRYOS: EXAMPLES OF DEVELOPMENTAL STAGE AND QUALITYPage 3

Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7.5 Cycle day: 7.5 Cycle day: 7.5Stage Code: 5 Stage Code: 6 Stage Code: 6 Stage Code: 6 Stage Code: 6Quality Code:3 Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:2

Cycle day: 7.5 Cycle day: 7.5 Cycle day: 7.5 Cycle day: 7.5 Cycle day: 7.5Stage Code: 7 Stage Code: 7 Stage Code: 7 Stage Code: 7 Stage Code: 7Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:2

Cycle day: 8.0 Cycle day: 8.0 Cycle day: 7.0 Cycle day: 7.0 Cycle day: 7.0Stage Code: 8 Stage Code: 8 Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:2 Quality Code:1 Quality Code:1

Calidad y Estadío de los Embriones Respuesta Posible a la Congelación

Calidad y Estadío de los Embriones Respuesta Posible a la Congelación

Estadío Descripción Grado Respuesta posible3 Mórula temprana 1

2 y 3variablemala

4 Mórula compacta 123

muy buenabuena - regularvariable - mala

5 Blastocisto temprano 123

muy buenabuena - regularvariable - mala

6 Blastocisto 123

muy buenabuena - regularmala

7 BlastocistoExpandido

12

muy buena pero variablebuena pero variable

Stroud y Leibo, 1995

Estado embrión P/total Valor P %Mórula 259/468ab

0,004

55,40

Blastocisto temprano

275/463a 59,39

Blastocisto 179/344bc 52,03

Blastocisto expandido

23/58c 39,66

Total 1333

Calidad Embrión

P/total Valor P %

1 693/1235a

0,01

56,11

2 32/65ab 49,23

3 11/33b 33,33

Total 1333

Cryoprotector

EmbryoCotton plug Plug/label

E511 SM010769 SRN 5G DT 1

Cryoprotector

EmbryoCotton plug Plug/label

E511 SM010769 SRN 5G DT 1

Protocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de Congelación

1. Clasificar los embriones (Grado 1).1. Clasificar los embriones (Grado 1).

2. Colocarlos en Crioprotector 1.5 M y 2. Colocarlos en Crioprotector 1.5 M y cargar la pajuela. cargar la pajuela.

Tiempo Total: 10 minutos.Tiempo Total: 10 minutos.

3. Colocar las pajuelas en la congeladora 3. Colocar las pajuelas en la congeladora

(-6,5 ºC) y dejar 1 a 2 minutos.(-6,5 ºC) y dejar 1 a 2 minutos.

4. Realizar el “seeding”. Dejar 10 minutos4. Realizar el “seeding”. Dejar 10 minutos

SeedingSeeding

Induction of ice crystals in the sample (break Induction of ice crystals in the sample (break the metastable state of solution)*the metastable state of solution)*

Begins cell dehydration processBegins cell dehydration process

*Critical step*Critical step

Crioprotector

Embryo

E511 SM010769 SRN 5G DT 1

Protocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de Congelación

1. Clasificar los embriones (Grado 1).1. Clasificar los embriones (Grado 1).

2. Colocarlos en Crioprotector 1.5 M y cargar la 2. Colocarlos en Crioprotector 1.5 M y cargar la pajuela. pajuela.

Tiempo Total: 10 minutos.Tiempo Total: 10 minutos.

3. Colocar las pajuelas en la congeladora 3. Colocar las pajuelas en la congeladora

(-6,5 ºC) y dejar 1 a 2 minutos.(-6,5 ºC) y dejar 1 a 2 minutos.

4. Realizar el “seeding”. Dejar 10 minutos4. Realizar el “seeding”. Dejar 10 minutos

5. Congelar a 0,6 ºC por minuto hasta - 35 ºC.5. Congelar a 0,6 ºC por minuto hasta - 35 ºC.

6. Sumergirlas en N6. Sumergirlas en N22..

DESCONGELACIONDESCONGELACION

10 segundos en arie10 segundos en arie30 segundos en agua a 25-30 30 segundos en agua a 25-30 ooCC

Vaciar la Pajuela en una placa de PetriVaciar la Pajuela en una placa de Petri

Remover el GlicerolRemover el Glicerol

Embryo Thawing & Broken Zonae

• Mouse Bovine• n % n %

• 22oC Water 223 (10.3%) 207 (21.7%)

• 22oC Air 220 (0.01%) 202 (0.02%)

•

• Palasz et al. (1989)

Transferencia Directa Transferencia Directa de Embriones de Embriones

BovinosBovinos

Cell Volume Changes with Addition and Cell Volume Changes with Addition and Removal of Removal of GlycerolGlycerol vs vs Ethylene GlycolEthylene Glycol

Diluent Diluent AddedAdded

InfluxInfluxEffluxEfflux

11

Rel

ativ

e C

ell

Rel

ativ

e C

ell

Vo

lum

eV

olu

me

Time in Permeating AdditiveTime in Permeating Additive

00

1997 Census of Cattle Embryos Frozen and Transferred in Canada and the

USA

Glycerol Ethylene Glycol

Country

No. Frozen

% Pregnant

No. Frozen

% Pregnant % of Total

Canada 1,609 58.0 11,376 59.2 87.6

USA 12,411 56.9 15,433 58.5 55.4

(Leibo and Mapletoft, 1998)

100

90

80

70

60

50

40

Pre

gnancy

(%

)

Seeding Temperatures of Direct Seeding Temperatures of Direct Transfer EmbryosTransfer Embryos

Seeding Temperature (oC)

-5-4 -6 -7 -8

100

90

80

70

60

50

40

Pre

gnancy

(%

)

Cooling Rate of Direct Transfer Cooling Rate of Direct Transfer EmbryosEmbryos

Cooling Rate (oC/min) from -7oC to -33oC

0.4 0.5 0.6

Protocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de Congelación

Protocolo de CongelaciónProtocolo de Congelación

• 1. Clasificar los embriones (Grado 1).• 2. Colocarlos en EG 1.5 M y cargar la pajuela. • Tiempo Total: 5 minutos.• 3. Colocar las pajuelas en la congeladora (-6,5 ºC) y

dejar 1 a 2 minutos.• 4. Realizar el “seeding”. Dejar 10 minutos• 5. Congelar a 0,5 ºC por minuto hasta - 35 ºC.

• 6. Sumergirlas en N2.

Direct Transfer StrawDirect Transfer Straw

Ethylene glycol

EmbryoCotton plug Plug/label

E511 SM010769 SRN 5G DT 1

Pajuela de Transferencia Directa

Pajuela de Transferencia Directa

Etilenglicol 1,5 MEtilenglicol 1,5 M

Protocolo de CongelaciónProtocolo de Congelación

• 1. Clasificar los embriones (Grado 1).• 2. Colocarlos en EG 1.5 M y cargar la pajuela. • Tiempo Total: 5 minutos.• 3. Colocar las pajuelas en la congeladora (-6,5 ºC) y

dejar 1 a 2 minutos.• 4. Realizar el “seeding”.• 5. Congelar a 0,5 ºC por minuto hasta - 35 ºC.

• 6. Sumergirlas en N2.

Effect of Time Between Flushing and Freezing on Pregnancy Rate (Embryos frozen at Em Tran & thawed at Holland

Genetics)Time (min) No. Transfers % Pregnant

0 - 30 85 54.1

31 - 60 418 56.0

61 - 90 722 56.0

91 -120 507 56.2

121 - 150 264 53.0

151 - 180 106 55.7

(Hasler, 2001)

Protocolo de DescongelaciónProtocolo de Descongelación

• 1. Sacar la pajuela.

• 2. Colocarla en Baño María a 30 ºC por 30

segundos.

• 3. Transferir dentro de los 15 minutos de

descongelado.

100

90

80

70

60

50

40

Pre

gnancy

(%

)

Warming in Air of Direct Transfer EmbryosWarming in Air of Direct Transfer Embryos

Warming Time (sec) in Air

42 6 8 10

Rutina de Transferencia Directa de Embriones

Rutina de Transferencia Directa de Embriones

• Trabajar al lado de la manga• 1. Anotar número de receptora y embrión.• 2. Examinar ovarios (palpación o US) y

vaciar el recto. • 3. Anestesia epidural, limpiar zona perineal.• 4. Descongelar el embrión y cargarlo en la

vaina de transferencia.• 5. Transferir en el cuerno ipsilateral al CL lo

más rápido posible.• 6. Chequear planilla y largar.

Tiempo TETF P/total Valor P %≤180 segundos 251/385

0,42

55,84

>180≤360 segundos

372/655 56,79

>360 segundos 42/82 51,22

Total 1122

Peres Coelho et al., 2007

Embriones Brahman vs Bos Taurus (Looney et al., 2004)

Biotipo Glicerol Etilenglicol Total

N Pre. % N Pre. % %

Británicas 80 49 61 375 240 64 63.5

Continentales

105 61 58 131 80 61 59.7

Sintéticas con Brahman

103 67 65 231 124 54 57.2

Brahman 67 20 30 203 98 48 43.7

Totales 355 197 55.5 940 542 57.7

Porcentajes de preñez con embriones congelados o refrigerados por 24-30 h y transferidos en receptoras

cruzas Bos Indicus.

  Grado 1 Grado 2 Total

Congelados

27/49 (55,1) 7/20 (35,0)a 34/69 (49,3)

Refrigerados 21/36 (58,3) 7/13 (53,8)b 28/49 (57,1)

Tribulo et al., 2001

54.2057.50

52.70 52.40

0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.0090.00

100.00

Preñadas

Por

cent

aje

30 days60 days

Refrigerated

n=131

%

Frozen-Thawed DT

n=252

VitrificationVitrificationVitrumVitrum = Latin for glass= Latin for glassFormation of glassy solid without Formation of glassy solid without

ice crystalsice crystalsVery rapid freezingVery rapid freezingHigh molar level (5 to 7M) of High molar level (5 to 7M) of cryoprotectantscryoprotectantsRequires no freezer (Dewar of Requires no freezer (Dewar of

nitrogen)nitrogen)Can be used with in-straw dilutionCan be used with in-straw dilution

Advantages of Advantages of Vitrification to the Vitrification to the

PractitionerPractitionerNo freezer requiredNo freezer required

Faster with small no. of embryosFaster with small no. of embryos - -

Shortens day with small no. of embryos or at the Shortens day with small no. of embryos or at the

end of the day with “left over” embryosend of the day with “left over” embryos

Higher survival of IVF-derived embryos Higher survival of IVF-derived embryos

Increased survival of lower quality Increased survival of lower quality

embryosembryos

Procedures Basal embryo holding

medium

Sucrose or galactose

Need four media• Embryo holding medium• “Low” concentration EG• High concentration EG• Dilution medium

Addition of Addition of CryoprotectantCryoprotectant

3 minutes in 1st EG solution3 minutes in 1st EG solution

45 seconds in 245 seconds in 2ndnd EG solution EG solution• Draw embryo into straw, seal and Draw embryo into straw, seal and

freezefreeze

• Embryos can be loaded and frozen Embryos can be loaded and frozen approximately 1 per minuteapproximately 1 per minute

Straw ConfigurationStraw Configuration

DHCDM V2HCDM

Cotton plugPlunged end

ThawingThawing

In air 10 s

Water bath 37°C 20 s

Shake the straw

Back in bath

Dry

Embryo transfer