7/26/2019 PCR (Polymerase Chain Reaction ).pptx
1/15
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Suatu tehnik sintesis dan amplifkasi DNA
secara invitro.Tehnik ini ditemukan oleh ary
!. "ullis dan #. #aloona pada tahun $%&'. PCRdidasarkan pada amplifkasi enimatik
ra*men DNA den*an men**unakan dua
oli*onukleotida primer yan* komplementerden*an u+un* ', dari kedua untaian sekuensi
tar*et.
Apa itu PCR?
7/26/2019 PCR (Polymerase Chain Reaction ).pptx
2/15
Pada proses PCR men**unakanmen**unakan alat termosiklus.Se-uah mesin yan* memiliki
kemampuan untuk memanaskansekali*us mendin*inkan ta-un* reaksidan men*atur temperatur untuk tiap
tahapan reaksi.
Alat PCR
7/26/2019 PCR (Polymerase Chain Reaction ).pptx
3/15
7/26/2019 PCR (Polymerase Chain Reaction ).pptx
4/15
7/26/2019 PCR (Polymerase Chain Reaction ).pptx
5/15
Amplifkasi DNA pada PCR dapat tercapai -ila
men**unakan primer oli*onukleotida yan* -iasa
dise-ut amplimers. DNA primer merupakan rantai
tun**al DNA yan* pendek yan* nantinya akan
dilen*kapi sesuai den*an urutan dari DNA
template. /mumnya primer yan* di*unakan pada
PCR terdiri dari 01231 nukleotida. Tidak ditemukan
adanya penin*katan pada spesiftas den*anpan+an* primer yan* mele-ihi 31 nukleotida.
Amplikasi DNA
7/26/2019 PCR (Polymerase Chain Reaction ).pptx
6/15
a.DNA cetakan yaitu ra*men DNA yan* akan dilipat*andakan.
DNA cetakan yan* di*unakan se-aiknya -erkisar antara $1' 4
$15 molekul. Dua hal pentin* tentan* cetakan adalah kemurnian
dan kuantitas.
-.6li*onukleotida primer yaitu suatu sekuen oli*onukleotida
pendek ($& 4 0& -asa nukleotida) yan* di*unakan untuk
men*a7ali sintesis rantai DNA yan* mempunyai kandun*an 8 9
C se-esar '1 4 51: untuk kesta-ilan penempelan primer.
c.Deoksiri-onukelotida triosat (dNTP) terdiri dari dATP dCTP
d8TP dTTP. dNTP men*ikat ion "*09 sehin**a dapat men*u-ahkonsentrasi eekti ion. omponen ini yan* diperlukan untuk
reaksi polimerasi.
Komponen utama padaPCR
7/26/2019 PCR (Polymerase Chain Reaction ).pptx
7/15
d.;nim DNA Polimerase yaitu enim yan* melakukan katalisis
reaksi sintesis rantai DNA. ;nim ini diperoleh dari ;u-acterium
yan* dise-ut Thermus aer. ?arutan
-u>er PCR umumnya men*andun* $1 4 '1m" Tris2@Cl p@ &32
&& (suhu 01oC) '1 m" Cl 1$: *elatin atau !SA (!ovine
Serum Al-umin) T7een 01 se-anyak 11$: atau dapat di*anti
den*an Triton B2$11 se-anyak 1$: disampin* itu perlu
ditam-ahkan $' m" "*Cl0.
Lanjutan
7/26/2019 PCR (Polymerase Chain Reaction ).pptx
8/15
Ti*a tahapan pentin* dalam Proses PCR)
a.Denaturasi
Di dalam proses PCR denaturasi a7al dilakukan se-elum
enim ta< polimerase ditam-ahkan ke dalam ta-un* reaksi.
Denaturasi DNA merupakan proses pem-ukaan DNA untai *andamen+adi DNA untai tun**al. ni -iasanya -erlan*sun* sekitar 3
menit untuk meyakinkan -ah7a molekul DNA terdenaturasi
men+adi DNA untai tun**al. Denaturasi yan* tidak len*kap
men*aki-atkan DNA men*alami renaturasi (mem-entuk DNA
untai *anda la*i) secara cepat dan ini men*aki-atkan *a*alnyaproses PCR. Adapun 7aktu denaturasi yan* terlalu lama dapat
men*uran*i aktiftas enim Ta< polymerase. Aktiftas enim
terse-ut mempunyai 7aktu paruh le-ih dari 0 +am 1 menit '
menit masin*2masin* pada suhu %0' %' dan %E'oC.
Adakah tahapan-tahapan prosesnya?
7/26/2019 PCR (Polymerase Chain Reaction ).pptx
9/15
-. Annealin* (penempelan primer)
riteria yan* umum di*unakan untuk merancan* primer yan* -aik
adalah -ah7a primer se-aiknya -erukuran $& 4 0' -asa men*andun*
'1 4 51 : 89C dan untuk kedua primer terse-ut se-aiknya sama.
Sekuens DNA dalam masin*2masin* primer itu sendiri +u*a se-aiknya
tidak salin* -erkomplemen karena hal ini akan men*aki-atkan
ter-entuknya struktur sekunder pada primer terse-ut dan men*uran*i
efsiensi PCR.
Faktu annealin* yan* -iasa di*unakan dalam PCR adalah 31 4 '
detik. Semakin pan+an* ukuran primer semakin tin**i temperaturnya.
isaran temperatur penempelan yan* di*unakan adalah antara 35oC
sampai den*an E0oC namun suhu yan* -iasa dilakukan itu adalah
antara '1 4 51o C.
Lanjutan
7/26/2019 PCR (Polymerase Chain Reaction ).pptx
10/15
c. Peman+an*an Primer (;Gtention)
Selama tahap ini Ta< polymerase memulai aktivitasnya
memperpan+an* DNA primer dari u+un* 3,. ecepatan
penyusunan nukleotida oleh enim terse-ut pada suhu
E0oC diperkirakan 3' 4 $11 nukleotidaHdetik -er*antun*pada -u>er p@ konsentrasi *aram dan molekul DNA
tar*et. Den*an demikian untuk produk PCR den*an pan+an*
0111 pasan* -asa 7aktu $ menit sudah le-ih dari cukup
untuk tahap perpan+an*an primer ini. !iasanya di akhirsiklus PCR 7aktu yan* di*unakan untuk tahap ini
diperpan+an* sampai ' menit sehin**a seluruh produk PCR
diharapkan ter-entuk DNA untai *anda.
Lanjutan
7/26/2019 PCR (Polymerase Chain Reaction ).pptx
11/15
Apa-ila keti*a tahap dalam proses PCRtelah dilakukan maka setiap satu se*men DNApita *anda diamplifkasikan men+adi duase*men DNA pita *anda yan* identiksehin**a +umlahnya men+adi dua kali le-ih-anyak dari +umlah semula. Siklus diulan*kem-ali mulai la*i den*an denaturasipenempelan dan eGtensi primer.
Apa yang terjadi setelah ketiga tahapdilakukan ?
7/26/2019 PCR (Polymerase Chain Reaction ).pptx
12/15
Dalam proses PCR ini memiliki siklus dansiklus yan* ter+adi kisaran siklus optimumdalam proses PCR adalah 31 4 3' siklus-er*antun* pada enim polimerase +umlah
template dan se-a*ainya.
Lanjutan
7/26/2019 PCR (Polymerase Chain Reaction ).pptx
13/15
!e-erapa komponen yan* diperlukan untukproses PCR adalah alat PCR (DNA ThermalCycler) dan -ahan seperti DNA sampel yan*
diamplifkasi dNTP yaitu -ahan -akunukleotida saat polimerasi (terdiri atas dATPd8TP dCTP dan dTTP) oli*onukleotida primeryaitu nukleotida pendek untuk men*a7ali
reaksi polimerasi enim DNA polimerase untukmen*katalisis reaksi peman+an*an primer dandd@06 serta -u>er PCR se-a*ai -ahan pelarut-ahan terse-ut.
Adapun komponen-komponenprosesnya
7/26/2019 PCR (Polymerase Chain Reaction ).pptx
14/15
ele-ihan PCR dikatakan memilikin tin*kat keun**ulan yan*
san*at tin**i Spesiftas (sensiti)
Spesiftas PCR terletak pada kemampuannyamen*amplifkasi sehin**a men*hasilkan produkmelalui se+umlah siklus
;fsiensi
Akurateakuratan yan* tin**i karena DNA polymerasemampu men*hindari kesalahan pada amplifkasiproduk.
Kelebihan dan KekuranganPCR
7/26/2019 PCR (Polymerase Chain Reaction ).pptx
15/15
ekuran*an "asalah yan* -erkenaan den*an PCR yaitu
-iaya PCR yan* masih ter*olon* tin**i.
Lanjutan
Top Related