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5/17/2018 Manual de Practicas de Bioquimica

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Manual dePracticas deBioqufmica


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INSTRUCCIONES GENERALESPARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO

Para el desarrollo de las practicas es conveniente tener en cuentaalgunas normas elementales que deben ser observadas con toda escrupulosidad.1. Antes de realizar una practica, debe leerse detenidamente paraadquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y tecnlca. Los resultados debenser siempre anotados cuidadosamente apenas se conozcan.2. EI orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias delaboratorio. En consecuencia, al terminar cada practica se procedera a limpiarcuidadosamente el material que se ha utilizado.3. Cada grupo de practicas se responsabillzara de su zona de trabajo yde su material.4. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta paraasegurarse de que es el que se necesita y de los posibles riesgos de sumanipulaci6n.5. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de losproductos utilizados sin consultar con el profesor.6. No tocar con las manos y menos con la boca los productos qufmicos.7. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas ymicroscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes 0 el forzar sus

mecanismos.8. Los productos inflamables (gases, alcohol, eter, etc.) debenmantenerse alejados de las llamas de los mecheros. Si hay que calentar tubos deensayo con estos productos, se hara al bane Marfa, nunca directamente a la llama.Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las lIavesde paso al apagar la llama.9. Cuando se manejan productos corrosivos (acidos, alcalis, etc.) deberahacerse con cuidado para evitar que salpiquen el cuerpo 0 los vestidos. Nunca severteran bruscamente en los tubos de ensayo, sino que se dejaran resbalarsuavemente por su pared.10. Cuando se quiera diluir un acido, nunca se debe echar agua sobreellos; siempre al contrario: acido sobre agua.11. Cuando se vierta un producto Ifquido, el frasco que 1 0 contiene seinclinara de forma que la etiqueta quede en la parte superior para evitar que siescurre Ifquido se deteriore dicha etiqueta y no se pueda identificar el contenido delfrasco.


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12. No pipetear con la boca. Se debe utilizar la bomba manual, unajeringuilla 0 artilugio que se disponga en el laboratorio.

13. Las pipetas se coqeran de forma que sea el dedo fndice el que tapesu extremo superior para regular la cafda de Ifquido.

14. AI enrasar un Ifquido con una determinada divisi6n de escalagraduada debe evitarse el error de paralaje levantando el recipiente graduado a laaltura de los ojos para que la visual al enrase sea horizontal.

15. Cuando se calientan a la llama tubos de ensayo que contienenIfquidos debe evitarse la ebullici6n violenta por el peligro que existe de producirsalpicaduras. EI tubo de ensayo se acercara a la llama inclinado y procurando queesta actue sobre la mitad superior del contenido y, cuando se observe que se iniciala ebullicion rapida, se rstirara, acercandolo nuevamente a los pocos segundos yretirandolo otra vez al producirse una nueva ebulliclon, realizando asf uncalentamiento intermitente. En cualquier caso, se evitara dirigir la boca del tubohacia la cara 0 hacia otra persona.

16. Cualquier material de vidrio no debe enfriarse bruscamente justodespues de haberlos calentado con el fin de evitar roturas.

17. Los cubreobjetos y portaobjetos deben manejarse por los bordes paraevitar que se engrasen.

ACCIONES QUE SE DEBEN DETOMAR EN CASO DE ACCIDENTES

1. En caso de que exista contacto de acidos 0 bases con la piel, ojos 0 boca serecomienda enjuagar el area con abundante agua con el proposito dedisminuir su accion por dilucion, para ello en el laboratorio existen tarjas yregaderas especiales.

2. En caso de ingestion de corrosivos NUNCA provocar vomito. Si existeningestion de acid os hacer beber inmediatamente una solucion de bicarbonatode sodio (2 cucharadas soperas en 2 vasos de agua); en caso de ingestion desoluciones causticas (hldroxido de sodio 0 de potasio) ingerir una cucharadade vinagre 0 25 ml de juga de limon en agua.

3. AI ingerir otras sustancias qufmicas hacer vomitar a la persona accidentada.Vigilar que exista una ventitacion adecuada y mantener las vfas aereaspermeables.

4. Si existe derramamiento de acido, neutralizar agregando bicarbonato de sodioy en caso de bases agregar acido acetico (vinagre). NUNCA tratar deadicionar agua. Emplear bata, guantes y gafas durante la limpieza.

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AGUA, pHPractica No.1Soluciones, pH y Amortiguadores

Introducci6nEI catabolismo de hidratos de carbono, lipidos y amlnoacldos da a lugar a la producci6n de una grancantidad de acldos relativamente fuertes en relaci6n al pH fisiol6gico. Por ejemplo, la combusti6ncompleta de hidratos de carbono y IIpidos genera bi6xido de carbono y agua los cuales se combinanpara producir acldo carb6nico a nivel tisular. EI pH fisiol6gico debe conservarse por arriba de 6.8 yaque las enzimas y en general las proteinas, tales como la insulina y la hemoglobina, son sensibles alos cambios bruscos de pH. EI intervalo de pH fisiol6gico aceptado como normal es de 7.35 a 7.45 conun promedio de 7.40. Para lograr mantener practlcarnente sin cambios el pH fisiol6gico se necesitanno s610de sustancias capaces de amortiguar los cambios bruscos de pH que ocurririan en ausenciade estas, sino que ademas se requiere de un mecanisme de regulaci6n en donde interviene el sistemanervioso, el aparato respiratorio y el aparato genitourinario.EI objetivo del presente experimento consiste en poner de manifiesto, la existencia deamortiguadores en ciertos Ifquidos biol6gicos y compararlos con el agua, la cual no contienesustancias amortiguadoras de pH. Los amortiguadores de pH se encuentran formados por un acidodebil y su sal. Los principales amortiguadores de pH en la sangre los constituyen el parbicarbonato/acido carb6nico, el fosfato monobasico/fosfato dibaslco y la hemoglobina/hemoglobinaprotonada. La manera en que los amortiguadores evitan cambios bruscos de pH ante la presencia delos acldos producidos durante el catabolismo, consiste en que la base del acido debil, por ejemplo elbicarbonato, acepta los protones liberados por un acldo relativamente fuerte. Una soluci6namortiguadora que mantenga el pH fisiol6gico en 7.4 se logra, de acuerdo con la ecuaci6n deHenderson-Hasselbalch, cuando la relaci6n bicarbonato/acido carb6nico es 20:1, que es precisamentela relaci6n que se encuentra en la sangre.Material y ReactivosUguidos biol6gicos:Saliva, Orina.Soluciones y suspensiones:Agua destilada, Melox (1:5) y Peptobismol (1:5).Reactivos:NaOH 0.01 NHel 0.01 NTiras reactivas para pH (6 papel tornasol).Tubos de ensaye 13 x 100 (con tap6n).Matraces Erlenmeyer de 50 ml.Pipetas de 1, 5 Y 10 ml.Probetas de 50 ml.Gradilla.


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ProcedimientoI. Medici6n del pH en diferentes soluciones (medici6n semicuantitativa). Una forma rapldade medir el pH consiste en utilizar tiras reactivas diseliadas para ese fin. Estas reaccionan porcontener diferentes compuestos que cambian de color de acuerdo al pH. Estas mediciones seconsideran semicuantitativas debido a que no indican el valor exacto de pH. Uguidos problema:Saliva, orlna, agua destilada, Melox (1:5) y Peptobismol (1:5).1. Sumergir la tira reactiva en elliquido problema y mantenerla por 10 segundos.2. Retirar la tira y quitar el exceso de liquido.3. Comparar los cambios de color obtenidos con la gama de colores existentes en el frasco.4. Registrar los valores de pH obtenidos de las diferentes soluciones.5. Investigue que compuesto(s) explican el pH de cada una de las soluciones estudiadas (*).6. Reporte sus resultados en una tabla con el siguiente orden: Soluci6n - pH - Compuesto*.II. Capacidad amortiguadora de liquidos biol6gicos y annacldos.1. Preparar una serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

Tubo Muestra (2.5 ml) pH NaOH Hel pHinicial 0.01N 0.01 N final1 Orina 0.5ml -2 Orina - 0.5 ml3 Saliva 0.5 ml -4 Saliva - 0.5 ml5 Melox (1:5) 0.5ml -6 Melox (1:5) - 0.5 ml7 Pep_tobismol(1:5) 0.5 ml -8 Peptobismol (1:5) - 0.5 ml9 Agua destilada 0.5 ml -10 Agua destilada - 0.5 ml

2. Agitar vigorosamente las mezclas preparadas.3. Medir el pH de cada soluci6n empleando tiras reactivas.4. Explique la capacidad amortiguadora de cada una de las soluciones.

Preguntas1. Explique en que consiste el equilibrio acido-base.2. Describa mediante las ecuaciones de Henderson-Hasselbalch como se obtiene el equilibrioacido-base de la sangre.3. Investigue los compuestos que contienen las tiras reactivas para medir el pH.

REPORTE:Introducci6n.Objetivos.Metodologia.Resultados.Observaciones.Conclusiones.Referencias Bibliograficas.

Dr. Jose Gerardo Gaona LozanoDepartamento de Biotecnologia de EnzimasFacultad de Ciencias Quimicas, UA de CE-mail: [email protected]
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CARBOHIDRATOS

Practica No.2 Prueba de FehlingEnsayo basado en el poder reductor de los azucares

Introducci6nLos azucares se comportan como acidos deblles que tienen caracteristicas de aldehidos 0 aldehidospotenciales. Por ello los efectos de los alcalls en los azucares, a los que enolizan, son semejantes alos que ejercen en los aldehidos. En ausencia de alcall existe posiblemente un equilibrio entre lasformas enol y ceto, si bien generalmente el equilibrio esta en favor de la forma ceto. AI adicionaralcall, la forma aclda enol origina una sal y desplaza la reacci6n a la derecha por efecto de la acci6nde las masas (sustracci6n del producto en el estado de equilibrio). En presencia de alcali puedeinvertirse el equilibrio adicionando acido que descompone la sal originando la forma enol yreestableciendo el equilibrio taut6mero. La tautomerizaci6n es propia de los azucares que contienenun grupo aldehido 0 cetona libre. Dado que los azucares sencillos en soluci6n se presentan en sumayor parte en forma clclica (piranosa) mas estable, parece que el efecto de los iones alcalinosconsiste en disminuir la formaci6n ciclica, adernas de originar tautomerizaci6n.La enolizaci6n de los azucares en condiciones alcalinas es un factor muy importante para evaluar laspruebas de reducci6n, sobre todo cuando son cuantitativas. Muchos reactivos oxidan el grupoaldehldo (reductor) de los azucares, En esto se basa la reacci6n 0prueba de Fehling para distinguirlos azucares reductores . EI tartrato, al unirse al cobre formando un complejo soluble, impide laformaci6n de hidr6xido cuprico insoluble que tend ria lugar si existiese cobre libre en la soluci6nalcalina. Como criterio de positivi dad de la reacci6n se utilize la formaci6n de 6xido cuproso rojoinsoluble. La prueba de Fehling no es especifica. Otras substancias que dan reacci6n positiva son :fenoles, aminofenoles, benzoina, acido urico, catecol, acido f6rmico, hidrazobenceno, fenilhidracina,pirogalol y resorcinol.

Material y reactivosSoluci6n 0 reactivo de Fehling:Soluci6n 1: Pesar 8.663 9 de sulfato de cobre en polvo (CuS04.5H20) y disolver en 125 ml de aguadestilada. Soluci6n 2: Pesar 43.25 9 de tartrato sodico-potasico (C4H40sNaK.2H20) y 12.5 9 dehidr6xido s6dico (NaOH) y disolverlos en 125 ml de agua destilada. Preparar el reactivo de Fehlingmezclando cantidades igua/es de las soluciones 1y 2,justo antes de iniciar laprectice.Azucares: Glucosa (dextrosa), fructosa (Ievulosa), sacarosa, maltosa, lactosa. Preparar soluciones decada reacnvo disolviendo 2 9 en 50 ml de agua destilada.

Material:Bario de agua.Perlas de vidrio.Balanza analitica.
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ProcedimientoReacci6n de Fehling. A un tubo de ensaye agregar 2.5 ml de un azucar a ensayar. Posteriormenteanadirle 2.5 ml del reactivo de Fehling. Mezclar ambas solueiones vigorosamente. Someter la mezelaa ebullici6n en balio de agua durante 5 a 10 minutos. Registre sus observaciones. Reporte losresultados obtenidos.

Preguntas1. "C6mo se explica el eomportamiento de la saearosa en la prueba de Fehling?2. "Una prueba gravimetrica debidamente ejecutada constituiria una buena reacci6n cuantitativapara los azucares reductores?


Dr. Jose Gerardo Gaona LozanoDepartamento de Biotecnologia de EnzimasFacultad de Ciencias Qulmicas, UA de CE-mail: [email protected]
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CARBOHIDRATOSPractica No.3 Prueba de BarfoedPruebas basadas en el poder reductor de los azucares

Introducci6nLa prueba 0 reacci6n de Barfoed se emplea para diferenciar entre mono y disacaridos. La base deesta prueba la constituye la diferente velocidad de la reacci6n con el acetato cuprico, La velocidadde reacci6n se determina por la velocidad de formaci6n de CU20. Concentraciones equimolaresde monosacarldos y dlsacaridos que tienen un grupo reductor por molecule reaccionan con elreactivo de Barfoed a velocidades distintas. Una clara diferencia entre mono y dlsacarldos es sutamario molecular, 1 0 que parece constituir un factor limitante en la velocidad de la reacci6n.Tarnbien pueden estar implicados otros factores tales como una interreacci6n mas compleja conlos dos anillos monosacandos. Esto parece suficiente para suponer que las moleculas maspequerias tienen una mayor reactividad.

Material y reactivosReactivo de Barfoed: Disolver en 500 ml de agua destilada 33.25 g de acetato de cobre en polvo(CH3COOhCu; filtrar la soluci6n por papel Whatman nO1 y ariadir 12.5 ml de acldo acetico al 38%(9 ml de acldo acetico glacial aforados a 25 ml con agua destilada).Azucares: glucosa, fructosa, lactosa, maltosa y sacarosa. (0.05 M, 50 ml de c/u).Bario de agua, perlas de vidrio y cronometro.

ProcedimientoReacci6n de Barfoed. A 2.5 ml de cada una de las soluciones de los azucares ariadir 2.5 ml delreactivo de Barfoed. Colocar los tubos en un bario de agua hirviendo. Anotar el tiempoaproximado en que aparece el precipitado rojizo en cada tubo. Preparar un graffco de lasvelocidades de reacci6n de cada ezucet (abscisas = nombre del ezucer; ordenadas = rec/procodel tiempo en min") para formar CU20.Preguntas1 l.Cuales son los tiempos medios de forrnaclon de Cu20 en los mono y disacarldos empleadosen este experimento?2. l.Es importante el tiempo de la reacci6n? l.Varia de un carbohidrato a otro? l.Tiene estoimportancia?REPORTE: Introducci6n, Objetivos, Metodologia, Resultados, Observaciones,Conclusiones y Referencias Bibliograficas.

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LlPIDOSPractlca No.4

Propiedades Fisicoquimicas de los lipidos

lntrcnucclenDentro de los principales grupos de biomoleculas que conforman a todo ser vivo se encuentran los lipidos. Demanera muy general, estes se definen como un conjunto heteroqeneo de compuestos que se caracterizanprincipal mente por su poca 0 nula solubilidad en agua (de caracter polar) y por el contrario, solubles ensolventes orqanicos (de caracter no polar). Esa gran heterogeneidad estructural conlleva a una variedad defunciones biol6gicas, por citar s610 algunas: fuente de energia (triacilgliceroles), reguladores metab61icos yfisiol6gicos (hormonas esteroideas y prostaglandinas), vitaminas liposolubles (A, D, E y K), emulsificantes (salesbiliares) y estructura de las membranas celulares (fosfolipidos y colesterol). EI modo y grado de interacci6n deestas blomoleculas con el agua tarnblen determina aspectos importantes en los procesos biol6gicos. Porejemplo, el caracter antipatlcc de los fosfolipidos favorece la eficiente formaci6n de micelas y bicapas; mientrasque, el caracter apolar de los acidos grasos y los triacilgliceroles los hace requerir mecanismos especificos detransporte a traves de la sangre mediante la albumina y las lipoproteinas. EI objetivo de este experimento escomprobar la relaci6n de la estructura quimica con las propiedades fisicas de algunos compuestos de caracterlipidico presentes en los seres vivos.

Material y ReactivosTubos de ensayo 13 x 150 (con tap6n). Bario de agua. Mechero, tripie y tela de asbesto. Pipetas de 5 ml.Gradilla. Soluciones: Glicerina, acido acetico, acido oleico, acldo estearico y aceite vegetal.

ProcedimientoI. Determinar la solubilidad de lipidos con base en su grado de saturaci6n y longitud de cadena hidrocarbonada.

1. Disponer de 3 tubos de ensayo. En los tres primeros depositar 2 ml de cada una de las siguientessustancias: glicerina, acldo acetico y acido oleico. En el tubo restante 0.5 9 de acido estearlco. Observary anotar las caracteristicas de las sustancias que se estan utilizando.2. Agregar 3 ml de agua destilada a cada uno de los 4 tubos, taparlos (con tap6n de platico 0 parafilm) ymezclar vigorosamente. Realice sus observaciones.3. Disponer de otros 4 tubos con las mismas sustancias como en la serie anterior. Agregar 3 ml de aceitevegetal y mezclar. Realice sus observaciones.4. Colocar los tubos (excepto el que contiene la mezcla de acido acetico y aceite vegetal) en un barto deagua hirviendo, observar 10que sucede durante 5 minutos.5. Transcurrido ese tiempo sacar los tubos del bano de agua y dejar enfriar. Observar y anotar 10ocurrido.

Preguntas1. Escriba las estructuras quimicas desarrolladas de los siguientes compuestos: glicerina, acido acetlco,

acido oleico, acido estearlco y lecitina. Indique si es un compuesto con tendencia polar 0 no polar.2. Investigue la composici6n del aceite vegetal, manteca, mantequilla, margarina y aceite de oliva.

Reporte: lntroducclon, objetivos, metodologia, resultados, observaciones, conclusiones y referenciasbibliograficas.



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LlPIDOS

Practica No.5Complejos de la urea con los acidos grasos

lntroducclenLos complejos de urea con los acldos grasos constituyen unos derivados relativamente nuevos y (Jtilespara la identificaci6n, preparaci6n y aislamiento de los acldos grasos de mezclas sencillas 0complejas. La urea forma tarnbien complejos con los esteres, alcoholes, hidrocarburos saturados y nosaturados, cetonas y haluros alquilicos. No puede expresarse con una ecuaci6n la reacci6n que tienelugar a causa de sus proporciones macromoleculares, si bien pueden formularse las relaciones entreel nurnero de molecules de acido graso y de urea. Los complejos de urea cumplen casi todas lascondiciones de los derivados ideales. Las temperaturas de disociaci6n de los complejos que contienenacidos grasos intimamente relacionados, son 1 0 suficientemente caracteristicos como para permitir suestimaci6n. La reacci6n se verifica igual a nivel semimicro 0micro y el acldo graso que forma parte delcomplejo es facitmente recuperable. Los cristales son grandes y facllrnente manejables y loscomplejos brutos normal mente son puros y no necesitan recristalizaci6n ulterior alguna.Las molecules que poseen menos de 3 6 4 atornos de carbona no forman complejos con la urea ycada atorno de carbona del acido graso 0 del derivado alquilico necesita 0.7 moles de urea, hecho quesltua a los complejos de urea al margen de los compuestos quimicos ordinarios. Para iniciar lacompleja reacci6n de la urea con los acldos grasos se necesitan 2 rnoleculas de urea. EI complejo deurea deriva su caracter en el tamalio, mas que en la forma de sus molecules. Cuanto mas larga es lacadena hidrocarbonada mayor es la cantidad de urea necesaria para la formaci6n del complejo.Cuando se forma el complejo, la estructura de la urea cambia y sus cristales tetragonales normalespasan a hexagonales, dlsponlendose en forma helicoidal.

Material y reactivos

Capilares de vidrio, portaobjetos y cubreobjetos.Parril la de calentamiento electrica.Microscopio 6ptico.Acido estearico.Acido oleico (cis).Metanol absoluto.Alcohol isopropilico.Urea.Hielo.
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Procedimiento

1. Disolver 3 9 de urea en 20 ml de metanol absoluto (un matraz per cada acido graso a ensayar).2. Atiadir 1 9 de acido estearlco y 1 ml de acido oleico, en sus respectivos matraces. Prepararblancos que contengan s610metanol y el acido graso a ensayar (sin urea).3. Calentar en la parrilla electrica a una temperatura moderada, hasta que la soluci6n se observetransparente, (si la sustancia no se disuelve completamente adicionar alcohol isopropilico gotaa gota a la soluci6n caliente hasta alcanzar homogeneidad completa).4. Enfriar al chorro de agua 0 introducir los matraces en hielo para aumentar la producci6n decristales, sobre todo si no se obtiene precipitado a temperatura ambiente.5. Observar los cristales al microscopio. Dibuje perfectamente 0 fotografie los cristales obtenidos.

Preguntas1.l,Seria este un buen metodo para investigar los componentes de las grasas?2. Escriba las estructuras quimicas desarrolladas de la urea, acido oleico y acido estearico.3. Describa y esquematice la estructura quimica del complejo urea - acido graso.


Dr. Jose Gerardo Gaona LozanoDepartamento de Biotecnologla de EnzimasFacultad de Ciencias Quimicas, UA de CE-mail: [email protected]
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PROTEINASPractlca No.6

Pruebas para la identificaci6n de aminoacidos

Introducci6nLas protefnas son rnacrornoteculas de elevado peso molecular, ya que su estructura constade cadenas de arninoacldos unidos por enlaces peptfdicos entre el grupo alfa-carboxflico deun arnlnoacido y el grupo alfa amino del otre. Aunque en la naturaleza existen mas de 300amlnoacldos, en las protefnas s610 se encuentran 20 que difieren en su tamano, forma, carga,capacidad de formar puentes de hidr6geno 0 disulfuro y reactividad qufmica. Las multiplesprobabilidades de combinaci6n de los veinte aminoacidos en las cadenas peptrdicas,permiten la gran diversidad de las funciones protelnicas. La presencia de grupos qufmicosionizados en los arnlnoacidos permite a las proteinas presentar caracterlsticas fisicoqulmicasespeclficas en el microambiente biol6gico. De ahl la importancia de su estudio. EI objetivo deesta practtca es realizar las pruebas de laboratorio que permitan el estudio de las propiedadesfisicoqufmicas de amlnoacldos y protefnas, asl como su identificaci6n.

Material y reactivosParrilla de calentamiento electricaMatraces erlenmeyer de 125 mlTubos de ensaye 13 x 100Pipetas de 10, 5 Y 1 mlBano MarfaGradillaSoluci6n de Ninhidrina al 0.2%Reactivo de BiuretSoluci6n de glicina al 1%.Soluci6n de fenilalanina al 1%Soluci6n de tript6fano 0 tirosina al 1%Soluci6n de alburnina de suero bovino (0.5 mg/ml)Hidr6xido de sodio al 40%Hidr6xido de sodio al 10%Acido nltrico concentradoAcido sulturlco concentradoTartrato de sodio y potasio tetrahidratadoSulfato de cobre pentahidratadoYoduro de potasioEtanol al 95%
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Preparar los reactivos como se indica:Soluci6n de Ninhidrina al 0.2%: Disolver 0.2 9 de ninhidrina en 10 ml de etanol al 95% ycompletar a 100 ml con agua destilada.Reactivo de Biuret: Disolver en 25 ml de agua destilada 0.75 9 de sulfato de cobre, 3 9 detartrato de sodio y potasio tetrahidratado y 0.5 9 de yoduro de potasio (KI). Anadir conagitaci6n constante 150 ml de hidr6xido de sodio al 10%. Diluir hasta 500 ml con aguadestilada y mezclar.

Procedimiento

Prueba de la Ninhidrina

Fundamento: La ninhidrina reacciona especificamente con el grupo alfa-amino de losarnlnoacldos ya sean libres 0 bien unidos mediante enlace peptidico. La ninhidrina a un pHentre 4 y 8 es un oxidante muy fuerte y siempre reacciona con los grupos alfa-amino para darun compuesto coloreado que varia del azul violeta al purpura. Esta reacci6n tarnbien seconoce como condensaci6n de la ninhidrina.Metodo:

1. Enumerar tres tubos de ensayo.2. En el tubo 1 colocar 1 ml de agua destilada (bianco).3. En el tubo 2 colocar 1 ml de la soluci6n de glicina a11% (0 cualquier otro aminoacido).4. En el tubo 3 colocar 1 ml de la soluci6n de albumlna de huevo al 1%.5. Agregar a cada tubo 10 gotas de soluci6n de ninhidrina al 0.2%.6. Mezclar y colcar en bano maria durante 5 minutos.7. Observar y registrar sus resultados.

Prueba de Biuret

Fundamento: La prueba lIamada Biuret nos sirve para investigar la presencia de enlacespeptidicos, uni6n especifica entre los amlnoacldos de las proteinas. Se basa en la formaci6nde sales complejas de color violaceo al anadtr sulfato cuprico en soluci6n alcalina. EIcomplejo esta formado por enlaces de coordinaci6n, donde los pares electr6nicos procedende los grupos amino de los arninoacidos de la cadena polipeptidica.Metodo:

1. Enumerar tres tubos de ensayo.2. En el tubo 1 colocar 2 ml de agua destilada (bianco).3. En el tubo 2 colocar 2 ml de la soluci6n de fenilalanina al 1% (u otro arninoacido).4. En el tubo 3 colocar 2 ml de la soluci6n de alburnina de huevo al 1%.5. Agregar a cada tubo 2 ml del reactlvo de Biuret.6. Mezclar, observar y registrar sus resultados.
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Reaccion xantoproteica para /a identificacion de aminoacidos eromstlco.Fundamento. Los aminoacidos que contienen anillos arornaticos (fenilalanina, tirosina ytript6fano) se someten a nitraci6n, los compuestos nitroderivados son de color amarillo. Lacoloraci6n amarilla se vuelve anaranjada con un tratamiento alcalino.Metodo:

1. Enumerar tres tubos de ensayo.2. En el tubo 1 colocar 1 ml de agua destilada (bianco).3. En el tubo 2 colocar 1 ml de la soluci6n de tript6fano 0 tirosina al 1%.4. En el tubo 3 colocar 1 ml de la soluci6n de albumina de huevo al 1%.5. Ariadir sucesivamente a los tres tubos: 0.5 ml de acido nitrico concentrado y

posteriormente una gota de acido sulfurico.6. Colocar en baric marfa durante 5 minutos.7. Dejar enfriar y agregar posteriormente 1 ml de hidr6xido de sodio al 40%.8. Observar y registrar sus resultados.

Preguntas1. Describa el mecanisme de reacci6n de cada una de las pruebas ensayadas.2. Investigue los rnetodos que se emplean para la secuenciaci6n de proteinas.


Dr. Jose Gerardo Gaona LozanoDepartamento de Biotecnologfa de EnzimasFacultad de Ciencias Quimicas, UA de C

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PROTEINASPractica No. 7Determinaci6n de la concentraci6n de proteinapor el metodo de Peterson (Lowry modificado)

Introducci6nEn muchas ocasiones, cuando deben analizarse multiples muestras, se prefiere el empleo de unprocedimiento analitico sencillo y rapldo para determinar el nitroqeno proteico 0 "equivalentes" de laproteina. A menudo la concentracion de nitr6geno proteico se determina por la rnlcrotecnica deKjeldahl 0 por el micrornetodo de Dumas. Estos rnetodos, sin embargo, exigen demasiado tiempo parala obtenci6n de valores empiricos no 10suficientemente exactos. Una forma de resolver este problemaconsiste en la determinaci6n de los grupos reactivos de las proteinas intactas. De estos grupos losmas importantes son los acid os y basicos (-COOH y -NH2) que no permiten el empleo deprocedimientos rapidos, EI grupo imidazol de la histidina puede determinarse facllrnente en la cadenapeptfdica, 10 mismo que el grupo hidroxilo fenollco de la tirosina, el sulfhidrilo de la cisteina y elguanidino de la arginina.Dado que la tirosina se presenta en muchas proteinas a intervalos regulares, el rnetodo de Lowry(Folin-Ciocalteu) para la determinaci6n de los grupos hidroxilfen61icos, constituye una tecnica paraestimar la protelna total. La reacci6n de una proteina en soluci6n con el reactivo de Folin se lIeva acabo en dos etapas que lIevan a la aparlclon final de color: (i) reacci6n con cobre alcalino y (ii)reducci6n del reactivo de Folin (fosfomollbdico-fosfotOngstico) por la proteina tratada con el cobre. Laprimera fase de la reacci6n de Folin asemeja a la del biuret 0 tiene una confiquraclon semejante. Encuanto a la reduccion del reactivo de Folin, el maximo color se obtiene cuando la reacci6n se lIeva acabo a un pH de 10, a este pH el reactivo solamente es activo durante poco tiempo.EI metodo de Lowry para la determinacion de la concentraci6n de proteina es de 10 a 20 veces massensible que la estimaci6n por absorci6n ultravioleta a 280 nm, varias veces massensible que la reacci6n de la ninhidrina y mas facil de realizar a microescala. EI reactivo de Folin damas color con las proteinas que con los aminoacidos y es 100 veces mas sensible que la reacci6n debiuret. Peterson G.L., modific6 el metodo de Lowry 5610 aliadiendo a la tecnica el reactivo SDS(dodecil sulfato de sodio) que permite una raplda determinacion de la concentraci6n de proteinas de lamembrana y de proteoifpidos de las celulas de microorganismos en soluciones diluidas.

Material y reactivosReactivo A (cobre alcalino):Pesar 0.6 9 de SDS y disolverlos en 12 ml de agua destilada. Posteriormente aliadir 6 ml de hidr6xidode sodio (NaOH) 0.8 N. Aliadir a la mezcla anterior 6 ml de la soluci6n de cobre alcalino preparadacomo sigue: a 5 ml de carbonato de sodio (Na2C03) al 20% agregar 1 ml de sulfato de cobre(CuS04.5H20) al 1%; 1 ml de tartrato de sodio y potasio al 2% y 3 ml de agua destilada. Mezclar deforma moderada para evitar la formaclon excesiva de espuma.Reactivo B (Folin-Ciocalteu, diluido 1:5).AlbUmina de suero bovino (soln. estandar de 0.1 mg/ml = 100 ~g/ml). Preparar 100 rnl,Espectrofot6metro.
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ProcedimientoConstrucci6n d e la curva d e calib ra ci6n .A partir de la soluci6n estandar de alburnina de suero bovino (100 ~g/ml) tomar 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6,0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 ml y completar a 1 ml con agua destilada para cada tubo (9). Como control(blanco) afiadir 1 ml de agua destilada a un tubo por separado.Meto do de P eterson (L ow ry m odificad o).A 1 ml de la muestra problema, al blanco y a las soluciones estandar para la curva de calibraci6n,afiadir 1 ml de Reactivo A, mezclar y dejar reposar por 10 minutos. Posteriormente agregar 0.5 ml delReactivo B, mezclar y dejar reposar por 30 minutos. AI cabo de este tiempo leer la absorbancia decada soluci6n a una longitud de onda de 750 nm en el espectrofot6metro. AI inicio, antes de leer lasmuestras problema y estandar en el espectrofotornetro, ajustar a cero de absorbancia con el blanco.D eterm inaci6n de la concentraci6n de proteina en la m uestra problem a.Construir la curva de calibraci6n graficando en papel milirnetrico la absorbancia (abscisas) vs laconcentracion estandar de cada soluci6n de alburnina de suero bovino (ordenadas). Trazar un linearecta que incluya la mayoria de los puntos determinados y posteriormente extrapolar la lectura deabsorbancia de la muestra problema para determinar la concentraci6n de proteina.

REPORTE:Introducci6n.Objetivos.Resultados.Observaciones.Conclusiones.Referencias Bibliograficas.

Dr. Jose Gerardo Gaona Lozano.Departamento de Biotecnologia de Enzimas.Facultad de Ciencias Quimicas, UA de C.E-mail: [email protected]
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ENZIMASPractlca No.8Determinacion de la actividad enzlrnatlcaamilasa y catalasa

lntroducclenLas enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica. Todas las reacciones quimicas del metabolismocelular se realizan gracias a la acci6n de catalizadores 0 enzimas. La sustancia sobre la que aetna una enzimase denomina sustrato. Pasteur descubri6 que la fermentaci6n del azucar mediante levaduras, con su conversi6nen alcohol etilico y anhidrido carb6nico es catalizada por enzimas. En 1897 Buchner logr6 extraer de las celulasde levadura las enzimas que catalizan la fermentaci6n alcoh6lica. Sumner en 1926, aisl6 en forma cristalina laenzima ureasa a partir de extractos obtenidos de Cannavalia enzyformis. En 1930, Northrop aisl6 en formacrlstalina las enzimas digestivas: pepsina, tripsina y quimotripsina. En la actualidad se conocen mas de 2000enzimas que han sido aisladas en forma crlstalina. Antiguamente las enzimas fueron nombradas atendiendo alsubstrato sobre el que actuaban, ariadlendole el sufijo -asa 0 haciendo referencia a la reacci6n catalizada. Asitenemos que la ureasa, catallza la hidr61isisde la urea; la amilasa, la hidr61isisdel almid6n; la lipasa, la hldrollslsde lipidos; la ADNasa, la hidr6lisis del ADN; la ATPasa, la hldrollsls del ATP, etc. Debido al gran nurnero deenzimas conocidas en la actualidad, se ha adoptado una clasificaci6n y nomenclatura mas sistematica, en la quecada enzima tiene un nurnero de clasificaci6n que la identifica:I. Oxidorreductasas. Reacciones de transferencia de electrones.2. Transferasas. Transferencia de grupos funcionales. Ej. UDP-glucotransferasa.3. Hidrolasas. Reacciones de hidr6lisis. Ej. lipasa, proteasa, celulasa.4. Liasas. Adici6n a dobles enlaces. Ej. carboxilasa, fenilalanina amonioliasa.S. Isomerasas. Reacciones de isomerizaci6n. Ej. fosfoglucosa isomerasa.6. Ligasas. (sintetasas). Participan en la formaci6n de enlaces con hidr6lisis de ATP.

Material y reactivosMechero, tripie y tela de asbestoTubos de ensaye 13x100Bai'lo de agua a 37CPipetas de 5 y 10 mlTerm6metroGradillaMuestras biol6gicas:Saliva, levadura deshidratada (para preparar pan), hfgado (de res 0pouo) y papa (cambray).Per6xido de hidr6geno (H202) al 3%Soluci6n fisiol6gica (NaCI 0.85%)Almid6n soluble al 1%Isodine (soluci6n IIKI) diluido 1:2Hielo

ProcedimientoEnsayo enzimatico: AmilasaLa a-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradaci6n delalmid6n, que es un pollsacarldo de reserva vegetal. EI almid6n esta formado por dos tipos de rnoleculas: laarnilosa y la amilopectina, ambos pollsacaridos de glucosa. Para medir la actividad enzlrnatlca de la a-amilasa,se utlllzara una prueba colorlmetrlca que detecta el almid6n. Para ello se contara con una soluci6n deyodo/yoduro de potasio, ya que el almid6n en presencia de esta soluci6n adquiere una coloracion azuladacaracteristica. Por 10tanto, en este ensayo mediremos la desaparici6n de sustrato para determinar la actividadde la enzima.
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1. Recolectar 2.5 ml de saliva (concentrada) en un tubo de ensaye (A) y colocarlo en hielo. En otro tubo (B)diluir 1/50 (0.1 ml con 4.9 ml de soluci6n fisiol6gica) la muestra de saliva y dejar en hielo. En otro tubo(C) colocar 1 ml de la muestra de saliva concentrada y calentar hasta ebullici6n por 1 minuto, luego dejeel tubo en la gradi lia.2. Enumerar 3 tubos de ensayo. Agregar a los tres tubos 1 ml de la soluci6n de almid6n soluble al 1%.Posteriormente, agregar a cada tubo de 1 gota de la soluci6n yodo/yoduro de potasio (Isodine 1:2).Mezclar vigorosamente.3. En el tubo 1 anadir 1 ml de la muestra de saliva concentrada (A). En el tubo 2 anadlr 1 ml de la muestrade saliva dilufda 1/50 (B). En el tubo 3 anadlr 1 ml de la muestra de saliva concentrada previamentecalentada hasta ebullici6n (C) -control-. Tapar los tubos y mezclar por inversi6n lentamente.4. Colocar inmediatamente los tres tubos en un bano de agua a 37C.5. Registre sus observaciones y resultados.

Ensayo enzimatico: CatalasaEI per6xido de hidr6geno (agua oxigenada, H202) es un residuo del metabolismo celular de muchos organismosvivos, pero dada su toxicidad debe transformarse rapldarnente en compuestos menos peligrosos. Para ellointerviene con frecuencia la enzima catalasa (abundante en el higado de muchos animales y presente en lamayorfa de las celulas vegetales y microorganismos), que cataliza la descomposici6n del per6xido de hidrogenoen agua y oxfgeno.La enzima catalasa que se ensayara provendra de 3 fuentes diferentes:a) microbiana: levadura deshidratada (para preparar pan).b) animal: hlgado (de res 0 polio).c) vegetal: papa.1. Corte en trozos pequerios el hfgado y la papa.2. Enumere 2 series (A y B) de 3 tubos (6 tubos en total).3. En los tubos 1A Y 1B agregue 0.5 9 de levadura deshidratada.4. En los tubos 2A Y2B agregue 0.5 9 de higado en trozos.5. En los tubos 3A Y3B agregue 0.5 9 de papa en trozos.6. S610para los tubos de la serie A (controles), anadlr 3 ml de agua destilada y caliente hasta ebullici6n por1 minuto. Luego deseche el agua, y deje reposar un momento.7. A continuaci6n anada a las 2 series de tubos, 3 ml de per6xido de hidr6geno.8. Registre sus observaciones y resultados.

Preguntas1. Describa el concepto de catalisis enzimatica.2. Describa el mecanisme de la reacci6n enzirnatlca de la amilasa y catalasa de acuerdo al sustrato sobreel que actuan.3. l,Que efecto tienen el pH y la temperatura sobre las enzimas?


Dr. Jose Gerardo Gaona LozanoDepartamento de Biotecnologfa de EnzimasFacultad de Ciencias Qulmicas, UA de CE-mail: [email protected]
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ACIDOS NUCLEICOS

Practlca No.9Aislamiento de ADN (acido desoxirribonucleico)

Introducci6nLos acid os nucleicos son polimeros de nucle6tidos unidos por enlaces fosfodiester. Por sucomposici6n quimica, los acid os nucleicos se han clasificado en dos tipos: el acidodesoxirribonucleico (DNA) y el acido ribonucleico (RNA). Los nucle6ticos que forman elDNA esta constituido por el azucar 2' -desoxirribosa unido mediante un enlace glucosidicoa una base nitrogenada (adenina, guanina, timina y citosina), las cuales a su vez formandos cadenas de polfmeros generando una molecule de doble hellce. Los nucle6tidos delRNA se encuentran formados por azucar ribosa que se une con glucosidico a una basenitrogen ada (adenina, guanina, uracilo y citosina) formando rnoleculas de una solacadena.EI genom a se encuentra organizado en forma diferente en las celulas procari6ticas yeucari6ticas, presentandose en estas ultirnas un mayor grado de complejidad. EI genom ade las celulas procari6ticas esta comprendido dentro de una sola molecule de DNAcircular, dispuesta de modo compacto en una zona nuclear denominada nucleoide. EItamario del genom a bacteriano se puede ejemplificar con el de Escherichia coli cuyotamario es de 1 360 nm y se encuentra constituido por 4700 pares de bases (kpb).Segun el tipo de celula en estudio, el aislamiento de los acid os nucleicos requiere romperla membrana y la pared celular mediante el empleo de metodos fisicos, quimicos 0enzirnaticos con el fin de Iiberar las rnoleculas de DNA al medio extracelular.Posteriormente, se realiza la purlflcacion de los acidos nucleicos extrayendo las proteinasy los lipid os con solventes orqanicos, para finalmente recuperarlos mediante laprecipitaci6n con alcohol (isopropanol 0 etanol).

Material Gradilla con 2 tubos de ensayo. Pipetas de 1 y 5 ml. NaOH 0.2 N - SDS (Iauril sulfato de sodio) a 1%. Etanol absoluto frlo. Bacterias en cultivo (E. coli.)

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Procedimiento1. Tomar 5 ml de un cultivo de bacterias y centrifugar durante 5 minutos a 1,500 rpm.Descartar el sobresendante.2. Resuspender perfectamente (de preferencia con la ayuda de un v6rtex) elsedimento bacteriano en 0.8 ml de H20.3. Adicionar 1.6 ml de una soluci6n de NaOH 0.2 N - 1% de SDS.4. Invertir el tubo suavemente tres veces.5. Agregar 2.4 ml de etanol frio.6. Invertir nuevamente el tubo tres veces y observar c6mo se precipitan los filamentosdel DNA.7. Colectar el DNA filtrando la soluci6n y con una varilla de vidrio (girandolasuavemente) lIevar el DNA a un tubo pequeno que contenga 0.2 ml de agua.8. EI DNA aislado se guarda en el refrigerador a -20C, resuspendido en agua paraser utilizado en la practice de electroforesis de acidos nucleicos.9. En caso de no poder recoger el DNA con la varilla, como se indica, proceder acentrifugar 5 minutos a 3,000 rpm. Descartar el sobrenadante y al sedimentoagregarle 0.2 ml de agua.

Preguntas1.- l,D6nde se encuentra el DNA en una bacteria y cuantas barreras hay queromper para liberarlo?2.- l,C6mo actua un detergente para la extracci6n de ADN?

REPORTE:Introducci6n.Objetivos.Metodologia.Resultados.Observaciones.Referencias Bibliogrfdicas.

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ACIDOS NUCLEICOS

Practlca No.1 0Electroforesis de acldos nucleicos

Introducci6nUnos de los campos mas importantes en la biologia molecular 1 0 constituye la ingenieriagenetica (tecnologla del DNA recombinante) que hace posible aislar un en gen en suentorno, reproducirlo en grandes cantidades, determinar su secuencia, modificarlo yreinsertarlo en el organismo, ya sea para observar el alcance de la alteraci6n 0 paraproducir grandes cantidades de su producto. EI potencial de esta tecnologia es enorme yextremadamente poderoso con un sinfin de aplicaciones a problemas biol6gicos,geneticos, medicos, agrlcolas e industriales.No es exagerado afirmar que uno de los elementos basicos del desarrollo de la ingenierlagenetica ha side la posibilidad de separar fragmentos del DNA mediante electroforesis engeles de agarosa. Este rnetodo permite: a) el ana lis is ra pld o y preciso de mezclas devarios fragmentos del DNA en funci6n de su tarnano (para ajustar los fragmentos de unrompecabezas, primer lugar hay que conocer sus dimensiones); b) la recuperaci6n de lasbandas (fragmentos del DNA del mismo tarnano) de determinado tamano para suposterior utilizaci6n. En la electroforesis, los fragmentos de DNA son depositados en unextremo del gel de agarosa y se someten a un campo electrlco: los fragmentos migranhacia el anode debido a su carga negativa.Para hacerlo tienen que pasar a traves de los poros formados por la estructura reticuladadel gel, 1 0 cual los frena mas cuanto mas grandes son. De esta manera se obtiene unaseparaci6n en la que los fragmentos pequenos migran mas lejos que los grandes. Laposici6n de los fragmentos despues de la migraci6n se pone en evidencia mediante uncolorante fluorescente muy sensible y especffico: bromuro de etidio. EI DNA que serautilizado en la electroforesis ha side aislado previamente en las practicas: Aislamiento deDNA.

MATERIAL Camara de electroforesis. tampara de UV y mascara protectora. Guantes desechables. Soluci6n amortiguadora de Tris-Boratos-EDTA (TBE). Gel de agarosa a 1% en TBE con bromuro de etidio 5 jJg/ml. Amortiguador de muestra (azul de bromofenol 0.1%. glicerol 20% y ETDA 50mmol/l). Muestras control de DNA: Marcador de peso molecular (rnolecula cuyo tarnano y

migraci6n electroforetica se conoce). Muestras de ADN yARN aislados previamente.

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ProcedimientoPrecauci6n: el bromuro de etidio es toxtco, por 10 que el manejo del gel que 10contiene debe hacerse con guantes.Preparaei6n del gel de agarosa: un gramo de agarosa se disuelve en amortiguador deTBE en ebullici6n; una vez disuelta la agarosa, esperar que la temperatura deseienda a40-50 C aproximadamente y adicionar bromuro de etidio a una concentraci6n final de 0.5IJg/ml. Vaciar la mezcla sobre el molde portagel de la camara. Colocar el peine para quese formen los pozos y esperar su gelificaci6n. Una vez solidificado el gel, quitar el peine.

1. Seleccionar la mejores muestras de DNA, previamente aislado. De cada una deestas muestras tomar 0.05 ml. (50 ul).2. Vaciar estos 0.05 ml a un tubo pequeno y agregarle 0.05 ml de amortiguador demuestra. Mezclar con cuidado, sin hacer burbujas.3. Poner el portagel en la camara de electroforesis y agregar el amortiguador TBEhasta cubrir completamente el gel.Nota: Colo car los pozos del gel orientados hacia el polo negativo (terminal negra).4. En los pozos 1 Y 6 del gel aplicar 10 IJIde las muestras control del DNA con laayuda de una pipeta automatlca 0 de un tubo capilar; cuidar de no dejar burbujasde aire. En los pozos restantes aplicar 20 IJIde las muestras del DNA ya mezcladascon el amortiguador de muestra (pasos 1 y 2) Ytapar la camara,5. Colocar los cables de los electrodos (cable rojo al polo positive y negro al neqativo)a la fuente de poder y encenderla. A partir de este momenta por ningun motivo

debe toearse la cemer de electroforesis mientras este funeionando.6. Realizar la electroforesis a 50 miliamperes (0 100 volts) durante 30 minutosaproximadamente. EI frente (coloreado de azul) no debe salir del gel.7. Terminada la electroforesis apagar la fuente de poder, desconectar los cables delos electrodos y retirar el portagel de la carnara.8. Determinar la posicion de las bandas observando los geles en una lampara de luzultravioleta (observar solo con los protectores).

REPORTE:Resultados.Observaciones.Referencias Bibliograficas.

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