5/12/2018 FOSFATASA ACIDA - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/fosfatasa-acida 1/12
ESTUDIO DE LOS PRINCIPALES FACTORES CINETICOS DE LA FOSFATASA ACIDA.
Experimento 1: Efecto del tiempo.
Tubo Nº B1 1 B2 2 B3 3 B4 4
Buffer acetato 0.1 M pH 5
p-Nitrofenilfosfato 1x10-2 M.
Agua destilada
Preincubar 2 min a 37oC (min)
Enzima
Incubar a 37oC (min)
NaOH 1N
1.0
0.2
0.8
-
1
3.0
1.0
0.2
0.7
0.1
1
3.0
1.0
0.2
0.8
-
2
3.0
1.0
0.2
0.7
0.1
2
3.0
1.0
0.2
0.8
-
5
3.0
1.0
0.2
0.7
0.1
5
3.0
1.0
0.2
0.8
-
10
3.0
1.0
0.2
0.7
0.1
10
3.0
UK Tubo UK Neta Ab Tiempo(min)
Concentración(µmol)
Velocidad(µmol/min)
102
195
103
236
107
320
105
405
B1
1
B2
2
B3
3
B4
4
93
133
213
300
0.186
0.266
0.426
0.600
1
2
5
10
10.33
14.77
23.66
33.33
0.051
0.074
0.133
0.166
La medida de la rapidez de reacción implica la medida de la concentración de uno de los reactivos o productos a
lo largo del tiempo, esto es, para medir la rapidez de una reacción necesitamos medir, bien la cantidad de
reactivo que desaparece por unidad de tiempo, o bien la cantidad de producto que aparece por unidad de
tiempo.
0
0.02
0.04
0.060.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0 2 4 6 8 10 12
V l o
c i d a d
Tiempo (min)
5/12/2018 FOSFATASA ACIDA - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/fosfatasa-acida 2/12
Experimento 2: Efecto de la Concentración de enzima.
Tubo Nº B1 1 2 3 4
Buffer Acetato 0.1 M pH5
p-Nitrofenilfosfato
1X10
2
mAgua destilada
Preincubar 2 min a 37oC
Enzima
Incubar 3 mina 37OC
NaOH 1N
1.0
0.2
0.8
-
3.0
1.0
0.2
0.75
0.05
3.0
1.0
0.2
0.7
0.1
3.0
1.0
0.2
0.65
0.15
3.0
1.0
0.2
0.6
0.2
3.0
Tubo Uk UK neta Ab [E] Concentración
(µmol)
Velocidad
(µmol/min)
B1
12
3
4
65
14
5224
248
380
80159
183
315
0.1600.318
0.366
0.630
0.050.1
0.15
0.2
8.8917.67
20.33
35.00
0.014
70.0295
0.0339
0.0583
La velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de la enzima a cualquier
concentración de substrato. Por ejemplo, si la concentración de enzima es disminuida a la mitad, la velocidadinicial de la reacción (v0) es reducida también a la mitad de la original
Con respecto a la concentración de la enzima la grafica obtenida expresa que la máxima velocidad de reaccion
obtenida en la experimentación realizada se nota cuando agregamos de .4 a .5 así observamos con nuestro
fundamento que también se cumple con lo esperado donde la mayor velocidad de reaccion es cuando hay una
elevada cantidad de enzimas.
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
V e l o
c i d a d
[E]
5/12/2018 FOSFATASA ACIDA - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/fosfatasa-acida 3/12
Experimento 3: Efecto del pH
Tubo Nº B1 1 B2 2 B3 3
Buffer acetato 0.1 M pH 3
Buffer acetato 0.1 M pH 5
Buffer acetato 0.1 M pH 8p- Nitrofenilfosfato 1 x102 M
Agua destilada
Preincubar 2 min a 37 OC
Enzima
Incubar 3 min a 37 OC
NaOH 1N
1.0
-
-0.2
0.8
0.1
3.0
1.0
-
-0.2
0.7
0.1
3.0
-
1.0
-0.2
0.8
0.1
3.0
-
1.0
-0.2
0.7
0.1
3.0
-
-
1.00.2
0.8
0.1
3.0
-
-
1.00.2
0.7
0.1
3.0
Tubo Nº UK UK neta Ab pH Concentració
n
(µmol)
Velocidad
(µmol/min)
B1
1
2
3
40
160
42
30
20
141
25
12
0.040
0.282
0.50
0.024
3
5
8
10
2.22
15.69
2.78
13.33
0.004
0.026
0.065
0.022
Afecta al estado de disociación de los grupos, aunque todas las proteínas
no se ven afectadas de igual forma porque algunas no tienen grupos
disociables. La mayor parte de los enzimas tienen un pH óptimo. Si hay
pequeños cambios de pH no se desnaturaliza el enzima. El pH puede
afectar de dos maneras:
- La unión del sustrato es mejor o peor que antes.
- Que afecte a la velocidad catalítica de la reacción.
Al observar la grafica realizada en el pH nos damos cuenta que el punto
donde se nota el mejor rendimiento de la enzima con respecto al pH es
de 8
5/12/2018 FOSFATASA ACIDA - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/fosfatasa-acida 4/12
Experimento 4: Efecto de la Temperatura.
Tubo Nº B1 1 B2 2 B3 3
Buffer acetato 0.1 M pH 5
p-Nitrofenil fosfato 1x 102M
Agua destilada
Preincubar 2 min a 37 O C
Enzima
Incubar 3 min
NaOH 1N
1.0
0.2
0.8
0.1
20
3.0
1.0
0.2
0.7
0.1
20
3.0
1.0
0.2
0.8
0.1
37
3.0
1.0
0.2
0.7
0.1
37
3.0
1.0
0.2
0.8
0.1
60
3.0
1.0
0.2
0.7
0.1
60
3.0
Tubo Nº UK UK neta Ab T OC Concentración
(µmol)
Velocidad
(µmol/min)
B1
1
2
3
64
128
340
168
51
107
383
87
0.202
0.214
0.626
0.174
20
30
60
80
5.67
11.89
33.67
9.67
0.009
0.020
0.056
0.016
Las velocidades de reacción son generalmente sensibles a la temperatura. En el caso de las reacciones
biomoleculares, un aumento de 10º C incrementa su velocidad entre 1,5 y 5 veces. Para explicar este hecho se
postuló que al acrecentar la temperatura aumenta la fracción de moléculas capaces de tener una energíasuficiente para alcanzar un "estado activado" que luego se transforme en producto de la reacción por formación
o ruptura de enlaces químicos.
0
0.01
0.020.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0 2 4 6 8 10 12
V e l o c i d a d
pH
5/12/2018 FOSFATASA ACIDA - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/fosfatasa-acida 5/12
Experimento 5: Efecto de la concentración de sustrato.
Conc. Inicial de p-NO2 1 x 10-2 M 1 x 10-3 M
Conc. final de p-NO2 1x10-3 B 5x 10-4 B 2x10-4 B 1x10-4 B 5x 10-5
Buffer acetato 0.1 M pH 5
p-NO2
Agua destilada
Preincubar 2 min a 37O
C
Enzima
Incubar 3 min
NaOH 1N
1.0
0.2
0.7
0.1
3.0
1.0
0.2
0.8
-
3.0
1.0
0.1
0.8
0.1
3.0
1.0
0.1
0.9
-
3.0
1.0
0.1
0.5
0.1
3.0
1.0
0.1
0.6
-
3.0
1.0
0.2
0.7
0.1
3.0
1.0
0.2
0.8
-
3.0
1.0
0.1
0.8
0.1
3.0
1.0
0.1
0.9
-
3.0
Blanco Uk
Blanco
UK T UK
neta
Ab [S]
x10-4
1/[S]
x10-4
Concentración
(µmol)
Velocidad
(µmol/min)
1/Vel.
B1
B2
B3
B4
B5
21
13
8
5
1
163
154
126
97
65
1
2
3
4
5
142
141
118
92
64
0.284
0.282
0.296
0.184
0.128
10
5
2
1
0.5
0.1
0.2
0.5
1
2
15.78
15.67
13.11
10.22
7.11
0.026
0.026
0.022
0.017
0.012
38.02
38.31
45.45
58.82
83.33
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0 20 40 60 80 100
V e l o c
i d a d
T OC
5/12/2018 FOSFATASA ACIDA - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/fosfatasa-acida 6/12
b= 1/Vmax
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0 2 4 6 8 10 12
V e l o
c i d a d
[S]
y = 24.495x + 34.17
R² = 0.9976
0
10
20
30
40
50
60
7080
90
0 0.5 1 1.5 2 2.5
1 / V
1/[S]
5/12/2018 FOSFATASA ACIDA - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/fosfatasa-acida 7/12
Haciendo Regresión lineal:
y = 24.495x + 34.17
R² = 0.9976
Entonces Vmax = 1/31.17 = 0.029µmol/min
Km= -1/Km = 1.395 µmol
5/12/2018 FOSFATASA ACIDA - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/fosfatasa-acida 8/12
Cuestionario.
1. Describa el mecanismo de la reacción de la fosfatasa acida.
Como sustrato de la fosfatasa alcalina utilizaremos un compuesto artificial: p-Nitrofenil-fosfato que, al
poseer un resto orgánico con un grupo fosfato unido, puede ser reconocido por la enzima.
El sustrato al ser hidrolizado origina un producto, el p-Nitrofenol, compuesto coloreado que en soluciónalcalina absorbe a una longitud deonda de 405 nm, por lo que su aparición en el transcurso de la
reacción puede seguirse colorimétricamente. Para detener la reacción se añadirá fosfato, ya que el
exceso de este producto de la reacción inhibe la actividad enzimática.
2. Cuál es el Km, Vmax y pH óptimo obtenido para la fosfatasa acida. Cuál es su significado.
V max = 0.029µmol/min
Km= 1.395 µmol
pH optimo 8
Estos datos nos indican las condiciones a las cuales la enzima tiene mejor eficiencia
3. Se ha determinado la velocidad inicial de una reacción catalizada enzimáticamente para diversas
concentraciones de sustrato. Los datos obtenidos son los siguientes:
[S] (µmol/L) V [(µmol/L)min] 1/[S] 1/V
5
10
20
50
100
200
22
39
65
102
120
135
0.2
0.1
0.05
0.02
0.01
0.005
0.045
0.026
0.015
0.009
0.008
0.007
a) Estime Vmax y Km usando las representaciones graficas de Michaellis-Menten
5/12/2018 FOSFATASA ACIDA - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/fosfatasa-acida 9/12
En esta forma de cálculo se representa 1/V frente a 1/[S], obteniéndose una recta cuya intersección con
el eje X es 1/Km y con el eje Y es 1/Vmax, siendo la pendiente Km/Vmax.
Vmax = 175.44
Km = 34.61
b) Calcule Kcat/Km
4. El efecto de la temperatura en la hidrolisis de la lactosa mediante una -galactosidasa se muestra a
continuación. Calcular la energía de activación y también Q 10.(Q 10)t = Vt+10/Vt
T OC T (K) Vmax
(µM/min/mg proteína)
(Q 10)t = Vt+10/Vt Ln V 1000/T
20
30
35
40
45
293
303
308
313
318
4.50
8.65
11.80
15.96
21.36
1.92
0.54
1.81
1.50
2.16
2.47
2.77
3.06
3.41
3.30
3.25
3.19
3.14
Pendiente: m= -Ea/RT Ea : energía de activación
-5.76 = -Ea/(1,9872 cal K-1mol-1)(298K)
-5.76 = Ea/ 592.1856
Ea = 3,411 Kcal K-1mol-1
y = 0.1973x + 0.0057
R² = 0.9988
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0.04
0.045
0.05
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
1 / V
1/[S]
5/12/2018 FOSFATASA ACIDA - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/fosfatasa-acida 10/12
5. Se estudia la cinética del estado estacionario de una enzima en ausencia y en presencia de un
inhibidor. La velocidad inicial viene dada en función de la concentración del sustrato en la siguiente
tabla.
V[mmol/L)-1
min-1
[S](mmol/L) Sin inhibidor Inhibidor A Inhibidor B 3mM Inhibidor B 5mM
1.25
1.67
2.5
5.00
10.00
1.72
2.04
2.63
3.33
4.17
0.98
1.17
1.47
1.96
2.38
1.25
1.54
2.00
2.86
3.7
1.01
1.26
1.72
2.56
3.49
1/V[mmol/L)-1 min-1
1/[S](mmol/L) Sin inhibidor Inhibidor A Inhibidor B 3mM Inhibidor B 5mM
0.80
0.60
0.40
0.20
0.10
0.58
0.49
0.38
0.30
0.24
1.02
0.85
0.68
0.51
0.42
0.8
0.65
0.50
0.35
0.27
0.99
0.79
0.58
0.39
0.29
Sin Inhibidor Inhibidor A Inhibidor B 3mM Inhibidor B 3mM
Vmax 5.12 2.97 5.08 5.33
Km 2.5 2.54 3.83 5.33
Inhibidor competitivo (Km alterada y la Vmax. es igual). Por los métodos de Michaelis-Menten y Lineaweaver-
Burk
y = -5.7608x + 21.161
R² = 0.9988
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
3.1 3.15 3.2 3.25 3.3 3.35 3.4 3.45
L n V
1000/T (1/K)
5/12/2018 FOSFATASA ACIDA - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/fosfatasa-acida 11/12
y = 0.4823x + 0.1954
R² = 0.9977
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
1 / V
1/[S]
Sin Inhibidor
y = 0.7549x + 0.197
R² = 0.9999
0
0.1
0.2
0.30.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
1 / V
1/[S]
Inhibidor B 3mM
y = 0.8549x + 0.337
R² = 0.9999
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
1 / V
1//[S]
Inhibidor A
5/12/2018 FOSFATASA ACIDA - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/fosfatasa-acida 12/12
y = 1.0006x + 0.1877
R² = 0.99980
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
1 / V
1/[S]
Inhibidor B 5mM
Top Related