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POPULATION D ADN COMPLEXE
- ADN gnomique
ou- copie d ARNm = CDNA
Amplification spcifique
Clonage dans
des vecteurs
Amplification in vitro
PCR
Dtection spcifique
Hybridation molculaire
- vecteur
- lier le fragment
d ADN au vecteur
- transfert dans
lhte
- polymrase
thermostable
-information sur la
squence permettant
de gnrer des amorces
damplification
- Sonde ADN ou ARNmarque
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LE CLONAGE
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I - Proprits des vecteurs de clonage
capables de rplication autonome dans une cellule hte donne
(origine de rplication de type procaryotique et/ ou eucaryotique)
possdent un polylinker ou site multiple de clonage
Possdent des proprits permettant la slection de la cellule hte (rsistance ATB)
supportent linsertion dun fragment dADN plus ou moins grand
Molecular Cell Biology
Molecular Cell Biology
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II Principes gnraux dutilisation dun vecteur
- Prparation du vecteur
- Prparation de lADN insrer
- Ralisation dun recombinant
- Incorporation lhte
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Obtention de lADN recombinant
An Introduction to Genetic Analysis
+ traitementPAL
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La ligation (ligature...)
Une enzyme, la ligase,
est capable
de lier de faon
covalente
deux molcules dADN
en une.
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Diffrents vecteurs de clonage
Taille maximum approximative du fragment dADN qui peut
tre clon dans chaque vecteur
Type de vecteur ADN clon en kb
Plasmide
Phage lambda
Cosmide
Phage P1
BAC(bacterial artificial chromosome)
YAC (yeast artificial chromosome)
10
25
45
100
3001000
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Les plasmides comme vecteurs de clonage (1)Molcule dADN de taille rduite, d'origine bactrienne
Molcule dADN circulaire taille 2kb 5kb
Peut accepter jusqu 10kb dADN exogne
Peut tre considre comme un minichromosome capable derplication autonome
Confre la rsistance un ou plusieurs antibiotiques=
slection
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Les plasmides comme vecteur de clonage (2)
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Dfinition
Le squenage de lADN, est la dtermination de la
succession des nuclotides le composant.
Cest aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Cette technique utilise les connaissances qui ont tacquises depuis une trentaine d'annes sur les
mcanismes de la rplication de l'ADN.
II Principes gnraux dutilisation dun vecteur
- Prparation du vecteur
- Prparation de lADN insrer
- Ralisation dun recombinant
- Incorporation lhte
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De type procaryotique(bactries):
Cas dun vecteur plasmidique:lADN est introduit dans lesbactries traites spcialementle plus souvent par chocthermique ou par choclectrique.
Introduction de lADN recombinant dans les cellules htes
lectroporateur
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Identification des clones intressants
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Dans ce cas les bactries transformes avec le vecteur nepossdant pas ou possdant linsert sont slectionnes --> uncriblage est ncessaire
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AmpRTetR
AmpRTetSClone intressant
Criblage desclonesintressants (3)
pBR322
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Dfinition
Le squenage de lADN, est la dtermination de la
succession des nuclotides le composant.
Cest aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Cette technique utilise les connaissances qui ont tacquises depuis une trentaine d'annes sur les
mcanismes de la rplication de l'ADN.
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Criblage -screening- des clones intressants (2)
An Introduction to Genetic Analysis
Test blanc-bleu (E
complmentation)
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III - Diffrents vecteurs de
clonageTaille maximum approximative du fragment dADN qui peut
tre clon dans chaque vecteur
Type de vecteur ADN clon en kb
Plasmide
Phage lambda
Cosmide
Phage P1BAC(bacterial artificial chromosome)
YAC (yeast artificial chromosome)
10
25
45
100300
1000
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Les phages comme vecteurs de clonage
Molecular Cell Biology
Phage = virus de bactries
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Dfinition
Le squenage de lADN, est la dtermination de la
succession des nuclotides le composant.
Cest aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Cette technique utilise les connaissances qui ont tacquises depuis une trentaine d'annes sur les
mcanismes de la rplication de l'ADN.
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Introduction de lADN recombinant dans les cellules htes
De type procaryotique:
Cas dun vecteur phagique
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Les cosmides comme vecteurs de clonage
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Les YACs comme vecteurs de clonage
YAC : Yeast Artificialchromosome
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Criblage dune banque phagique
An Introduction to Genetic Analysis
Hybridationavec uns sonde
spcifique...Prochain cours!
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IV - APPLICATIONS DES VECTEURS
- Clonage et amplification dune squence dADN
- Cration des banques dADN gnomiques et dADNc- Introduction dun gne dans des cellules, des plantes oudes organismes(animaux transgniques)
- Production dARN- Production de protines codes par les gnes insrs
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Banques dADN
-Banques dADN gnomique
- Banques de cDNA
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Banque (librairie)dADN gnomique
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Comment dfinir si une banque estsuffisamment grande pour esprer trouver un
fragment dintrt?Calcul afin de dfinir la probabilit de trouver une squence donne
dans une banque.
N=ln(1-P)/ln(1-f)
N: nombre de recombinants
P: probabilit dsire
f: proportion de gnome dans un seul recombinant
Ex: 99% de probabilit davoir une squence reprsente dans unebanque de fragments de 17kb dun gnome eucaryote (3.109pb)
N= ln(1-0.99)/ln(1-(1,7.104/ 3.109))=8,1.105 colonies
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Banque dADNc
Le problme ici estlobtention de clone dit
full length .
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ObtentiondelADN delorganismedonneur
A partirdelARN:
Principe de la "reverse
transcription":
An Introduction to Genetic Analysis
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Dfinition
Le squenage de lADN, est la dtermination de la
succession des nuclotides le composant.
Cest aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Cette technique utilise les connaissances qui ont tacquises depuis une trentaine d'annes sur les
mcanismes de la rplication de l'ADN.
APPLICATIONS DES VECTEURS
- Clonage et amplification dune squence dADN
- Cration des banques dADN gnomiques et dADNc- Production de protines codes par les gnes insrs
-Introduction dun gne dans des cellules, des plantes ou
des organismes(animaux transgniques)
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Production de protinesUtilisation de vecteur dexpression
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Production de protines humaines but thrapeutique
- Facteur VIII de la coagulation dans lhmophilie A
- Hormone de croissance
- Insuline
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Exemple delinsuline
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Dfinition
Le squenage de lADN, est la dtermination de la
succession des nuclotides le composant.
Cest aujourd'hui une technique de routine pour les
laboratoires de biologie.
Cette technique utilise les connaissances qui ont tacquises depuis une trentaine d'annes sur les
mcanismes de la rplication de l'ADN.
CELLULES HTES
-B
actries : E. Colipremier hte utilisnombreux vecteurs plasmidiques connus et utilisablesculture en masse dans les fermenteurstaux dexpression levs (plusieurs g de protine/litre)
MAIS secrtent mal les protines : clatement des bactriespas de modifications post-traductionnelles
-Levure saccharomyces cerevisiaemodifications post traductionnelles
MAIS pas de secrtion, moins bon rendement
-Cellules CHO (chinese hamster ovary)culture de masse en bioracteurs, protines complexes
MAIS cher et rendement plus faible
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Levures et bactries utilises comme usines:production d'antibiotiques -pnicilline, ttracycline-,d'enzymes comme lipases -lessives-...
Vaccins : fraction de protines viralesncessaire la production dAC
Bioractifs Enzymes de restrictiondiminution du cot
Autres exemples
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Cration de plantes transgniques
An Introduction to Genetic Analysis
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Cration danimaux transgniques
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