MARIANA UCZAY
ANÁLISES DE QUALIDADE DA ÁGUA DO SISTEMA DO AQUÍFERO GUARANI E
BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDADE E ESTRESSE OXIDATIVO EM
Danio rerio
Dissertação apresentada ao Programa Multicêntrico
de Pós Graduação em Bioquímica e Biologia
Molecular, da Universidade do Estado de Santa
Catarina como requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Bioquímica e Biologia
Molecular.
Orientadora: Carla Ivane Ganz Vogel
LAGES
2018
‘
MARIANA UCZAY
ANÁLISES DE QUALIDADE DA ÁGUA DO SISTEMA DO AQUÍFERO GUARANI E
BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDADE E ESTRESSE OXIDATIVO EM
Danio rerio
Dissertação apresentada ao Programa Multicêntrico de Pós Graduação em Bioquímica e
Biologia Molecular, da Universidade do Estado de Santa Catarina como requisito parcial para
obtenção do grau de Mestre em Bioquímica e Biologia Molecular.
Banca examinadora:
________________________________________
Professora Doutora Carla Ivane Ganz Vogel
Universidade do Estado de Santa Catarina
_______________________________________
Professora Doutora Dinara Jaqueline Moura
Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre
_______________________________________
Professora Doutora Karim Hanh Luckmann
Universidade do Estado de Santa Catarina
______________________________________
Suplente: Professor Doutor Luiz Cláudio Miletti
Universidade do Estado de Santa Catarina
LAGES, 09/08/2018.
AGRADECIMENTOS
À minha querida orientadora professora Dra. Carla Ivane Ganz Vogel que sempre se
mostrou prestativa, desde a primeira vez que conversamos! Obrigada por acreditar em mim,
por todos os ensinamentos, por ter paciência comigo durante os experimentos e no processo
de escrita da dissertação, e por sempre se preocupar comigo em todos os aspectos da minha
vida.
Ao meu pai Sérgio e mãe Diolisete que sempre me apoiaram durante a minha
caminhada acadêmica!
Ao meu irmão Juliano e cunhada Charlene, pela infinita paciência pra ler tudo o que
eu escrevi desde o início do meu mestrado, pela ajuda com as análises e por estarem sempre
do meu lado.
Ao meu namorado Rômulo cuja ajuda e apoio foram imprescindíveis para a realização
deste trabalho, obrigada por ficar do meu lado até (principalmente) nos piores momentos, pela
compreensão, carinho e amizade.
A todos os meus colegas de laboratório, embora trabalhássemos em áreas totalmente
diferentes sempre me deram apoio durante os experimentos e me ajudaram, muito obrigada
pelo convívio, amizade e parceria, levo no coração todos vocês.
Aos meus queridos amigos: Lina, Mari, Carol, Leo, Anderson, Gabi, Fran e Rê, que
foram minha família nos dois anos que passei em Lages.
Ao querido estagiário Lucas, que nunca mediu esforços para me ajudar durante a
realização dos experimentos, muito obrigada.
Aos professores do PMBqBM Luiz Cláudio Miletti, Gustavo Felippe da Silva, Maria
de Lourdes Magalhães e Karim Hahn Lüchmann por todos os ensinamentos passados.
Ao laboratório de Psicultura da UDESC, principalmente ao professor Thiago El Hadi
Fabregat pelo espaço cedido no laboratório para a realização dos experimentos.
Ao pessoal do Laboratório de Genética Toxicológica da Universidade de Ciências da
Saúde de Porto Alegre (UFCSPA) pela ajuda com as análises das enzimas;
À Universidade do Estado de Santa Catarina por abrir suas portas para meus estudos e
a todo pessoal da pela boa disposição e ajuda em cada momento.
À CAPES, FAPESC, ANA e Caixa Econômica Federal que proporcionaram recursos
que financiaram minha bolsa e as análises presentes neste trabalho.
Aos peixes que deram a sua vida pelo pequeno progresso científico que este trabalho
proporcionou!
A todas as mulheres da ciência, que dentro de seus laboratórios e salas de aula mesmo
sem recursos, sem equipamentos, sem incentivo e sem reconhecimento, ainda lutam para que
a pesquisa prospere e possa trazer um pouco de avanço técnico-cientifico em nosso país!
“Cada pessoa deve trabalhar para o seu aperfeiçoamento e,
ao mesmo tempo, participar da responsabilidade coletiva
por toda a humanidade.”
― Marie Curie
RESUMO
Atividades antrópicas geram uma quantidade significativa de poluentes que são lançados
diariamente ao ambiente. Entre os xenobiontes presentes nos ecossistemas aquáticos,
inúmeros compostos químicos e orgânicos possuem um potencial oxidativo e genotóxico. As
quantificações de danos celulares e defesas antioxidantes podem ser usadas como
biomarcadores de contaminação aquática. Neste trabalho utilizou-se uma abordagem ampla de
biomonitoramento da qualidade da água em dois locais da região serrana de Santa Catarina
pertencentes ao Sistema do Aquífero Guarani. Um local de água subterrânea localizado no
interior do município de Ponte Alta, SC; e outro de água superficial coletada no Rio Caveiras,
em Lages, SC. Foram realizadas análises físico-químicas de qualidade da água e bioensaios
com Danio rerio para avaliação de genotoxicidade e estresse oxidativo. Realizaram-se quatro
experimentos de 28 dias cada, dois realizados com água subterrânea coletada em agosto e
dezembro de 2017; e dois com água superficial coletada em outubro de 2017 e fevereiro de
2018. O grupo controle foi mantido em água proveniente do laboratório de psicultura. As
análises de água foram realizadas no início de cada experimento. A cada sete dias do período
experimental 18 peixes, nove por tratamento (exposto e controle), foram eutanasiados para
coleta de sangue e músculo lateral. O sangue foi utilizado para realizaçãos do ensaio cometa
padrão e modificado com as enzimas Foraminopirimidina glicosilase (FPG) e Endonuclease
III (ENDO III) e teste do micronúcleo; enquanto o músculo lateral foi utilizado para
quantificar as enzimas catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), e analisar níveis de
Peroxidação lipídica (LPO). Em todos os experimentos observou-se baixa qualidade da água
coletada, Ponte Alta apresentou níveis acima dos permitidos de manganês e fósforo. Já a água
do Rio Caveiras apresentou ferro e manganês em concentrações aumentadas em relação ao
prevista na regulamentação. Nos bioensaios, observou-se um aumento na indução de danos ao
DNA nos animais expostos a essas amostras de água, apontando para um potencial efeito
genotóxico da água. O ensaio cometa modificado com as enzimas de restrição indicou baixo
dano oxidativo ao DNA, induzido pela água coletada. Não se observaram diferença entre os
grupos com relação à enzima SOD, porém CAT apresentou diferenças em relação ao grupo
controle. Os níveis de Peroxidação lipídica dos animais expostos não diferiram em relação ao
grupo contole em nenhum dos bioensaios realizados. A baixa qualidade hidrológica observada
pode ter levado a alterações na atividade da CAT, e potenciais danos ao DNA, observados nos
bioensaios com zebrafish.
Palavras chave: Zebrafish. Qualidade da Água. Sistema do Aquífero Guarani. Ensaio
Cometa. Estresse Oxidativo.
ABSTRACT
Antropic activities generate a significant amount of pollutants that are released daily into the
environment. Among the xenobionts present in aquatic ecosystems, numerous chemical and
organic compounds have an oxidative and genotoxic potential. Quantifications of cell damage
and antioxidant defenses can be used as biomarkers of aquatic contamination. In this work a
wide approach of water quality biomonitoring was used in two sites of the Santa Catarina
region belonging to the Guarani Aquifer System. A groundwater site located in Ponte Alta,
SC; and another of surface water collected in Caveiras River, in Lages, SC. Physico-chemical
analyzes of water quality and bioassays were carried out with Danio rerio for evaluation of
genotoxicity and oxidative stress. Four experiments of 28 days each were performed, two with
groundwater collected in August and December 2017; and two with surface water collected in
October 2017 and February 2018. The control group was kept in water from the pisciculture
laboratory. Water analysis was performed at the beginning of each experiment. Every seven
days of the experimental period, 18 fish, nine per treatment (exposed and control), were
euthanized for blood and lateral muscle collection. The blood was used to perform the
standard and modified comet assay with the enzymes Foraminopyrimidine glycosylase (FPG)
and Endonuclease III (ENDO III) and micronucleus test; while the lateral muscle was used to
quantify the catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) enzymes, and to analyze lipid
peroxidation (LPO) levels. In all the experiments, it was observed low quality of the water
collected, Ponte Alta presented levels above those of manganese and phosphorus. Water from
Caveiras River presented iron and manganese in concentrations increased in relation to the
one foreseen in the regulation. In the bioassays, an increase in the induction of DNA damage
was observed in the animals exposed to these water samples, pointing to a potential genotoxic
effect of the water. The comet assay modified with the restriction enzymes indicated low
oxidative DNA damage, induced by the collected water. No difference was observed between
the groups with respect to the SOD enzyme, but CAT presented differences in relation to the
control group. The levels of lipid peroxidation in exposed animals did not differ in relation to
the contole group in any of the bioassays performed. The observed low hydrological quality
may have led to changes in CAT activity, and potential DNA damage, observed in zebrafish
bioassays.
Key words: Zebrafish. Water Quality. Guarani Aquifer System. Comet Assay. Oxidative
Stress.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Abrangência do Sistema do Aquífero Guarani (SAG) .......................................... 23
Figura 2 - Esquema representativo da Bacia hidrográfica do Rio Caveiras. .......................... 25
Figura 3 - O teleósteo zebrafish (Danio rerio). ...................................................................... 27
Figura 4 - Representação dos danos às principais biomoléculas causados, ou não por
xenobiontes. ........................................................................................................... 32
Figura 5 - Esquema do processo de lipoperoxidação ............................................................. 33
Figura 6 - Caracterização do ponto de coleta de água subterrânea proveniente do Aquífero
Guarani, localizado no interior do município de Ponte Alta, SC, Brasil. .............. 40
Figura 7 - Caracterização do ponto de coleta de água superficial no ponto BR-2, localizado
no Rio Caveiras, em Lages, SC, Brasil. ................................................................. 41
Figura 8 - Esquema da forma de coleta de músculo lateral em zebrafish. ............................. 43
Figura 9 - Atividade de SOD/mg de proteína encontrados em músculos de zebrafish
expostos à água de Ponte Alta coletada em agosto de 2017. ................................. 51
Figura 10 - Atividade de CAT/mg de proteína encontrados em músculos de zebrafish
expostos à água de Ponte Alta. .............................................................................. 52
Figura 11 - Níveis de dano ao DNA encontrados em eritrócitos de zebrafish expostos à água
proveniente do Aquífero Guarani, dado pelo Software Comet Imager 2.2 da
Metasystem ®. ....................................................................................................... 53
Figura 12 - Efeito genotóxico em eritrócitos de zebrafish expostos à água de Ponte Alta,
medido por ensaio cometa padrão. ........................................................................ 54
Figura 13 - Níveis de oxidação de purinas encontrados em eritrócitos de zebrafish expostos à
água de Ponte Alta ................................................................................................. 55
Figura 14 - Níveis de oxidação de pirimidinas encontrados em eritrócitos de zebrafish
expostos à água Ponte Alta coletada em dezembro de 2017. ................................ 55
Figura 15 - Frequência de micronúcleos encontrados em eritrócitos de zebrafish expostos á
água coletada em Ponte Alta, SC, Brasil. .............................................................. 56
Figura 16 - Nmol de MDA/mg de proteína em músculos de zebrafish exposto a água coletada
em Ponte Alta em agosto e dezembro de 2017. ..................................................... 57
Figura 17 - Atividade de SOD/mg de proteína encontrados em zebrafish expostos à água do
Rio Caveiras coletada em fevereiro de 2018. ....................................................... 60
Figura 18 - Atividade de CAT/mg de proteína encontrados em zebrafish expostos à água do
Rio Caveiras........................................................................................................ 61
Figura 19 - Efeito genotóxico da exposição de zebrafish à água do Rio Caveiras medido por
ensaio cometa padrão. ............................................................................................ 62
Figura 20 - Níveis de purinas oxidadas encontrados em eritrócitos de zebrafish expostos à
água do Rio Caveiras. ............................................................................................ 63
Figura 21 - Níveis de oxidação de pirimidinas encontrados em eritrócitos de zebrafish
expostos à água do Rio Caveiras. .......................................................................... 64
Figura 22 - Frequência de micronúcleos encontradas em eritrócitos de zebrafish expostos á
água coletada no Ponto Br-2 do Rio Caveiras em Lages, SC, Brasil. ................... 65
Figura 23 - Lâmina de eritrócitos de Danio rerio, a seta indicando célula com micronúcleo.
............................................................................................................................... 65
Figura 24 - Nmol de MDA/mg de proteína em músculos de zebrafish expostos a água
coletada em Ponte Alta em outubro de 2017 e fevereiro de 2018. ........................ 66
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Delineamento dos experimentos realizados........................................................... 42
Tabela 2 - Resultados das análises de água referentes à água subterrânea coletada no ponto
localizado no interior do município de Ponte Alta, SC, Brasil. ............................. 50
Tabela 3 - Correlação de Pearson. Experimento realizado com água coletada em Ponte Alta,
SC, Brasil em agosto de 2017. ............................................................................... 57
Tabela 4 - Correlação de Pearson Experimento realizado com água coletada em Ponte Alta,
SC, Brasil em dezembro de 2017. ......................................................................... 58
Tabela 5.- Resultados das análises de água referentes ao ponto de coleta Ponto BR - 2,
localizado no Rio Caveiras, em Lages, SC, Brasil. ............................................... 59
Tabela 6 - Correlação de Pearson. Experimento realizado com água coletada no Rio
Caveiras, em Lages, SC, Brasil em outubro de 2017. ........................................... 67
Tabela 7 - Correlação de Pearson. Experimento realizado com água coletada no Rio
Caveiras, em Lages, SC, Brasil em fevereiro de 2018. ......................................... 67
LISTA DE ABREVIATURAS
8-oxoG 8-oxo-7,8-diidro-2'-deoxiguanosina
AG Aquífero Guarani
BER Reparo por excisão de bases
BSA Soroalbumina bovina
CAT Catalase
CT Coliformes termotolerantes
DNA Ácido desoxirribonucleico
DTT Dithiothreitol
EC Ensaio cometa
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
ENDO III Endonuclease III
EROs Espécies reativas de oxigênio
FPG Foramino pirimidina glicosilase
G6PDH Glicose 6-fosfato desidrogenase
GR Glutationa reduzida
LMP Baixo ponto de fusão
LPO Lipoperoxidação
KCl Cloreto de Potássio
MDA Malondialdeído
MN Micronúcleo
NaCl Cloreto de Sódio
NaOH Hidróxido de Potássio
NER Reparo por Excisão de nucleotídeo
NMP Ponto de fusão normal
SAG Sistema do Aquífero Guarani
SOD Superóxido Dismutase
SST Sólidos Suspensos totais
STD Sólidos dissolvidos totais
SFB Soro fetal bovino
pH Potencial hidrogeniônico
PMSF Phenilmetilsulfonil fluoride
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 21
2 REFERENCIAL TEÓRICO ..................................................................................... 23
2.1 O AQUÍFERO GUARANI ........................................................................................... 23
2.2 O RIO CAVEIRAS ....................................................................................................... 25
2.3 ZEBRAFISH (Danio rerio) ........................................................................................... 26
2.4 BIOMARCADORES DE CONTAMINAÇÃO AQUÁTICA ..................................... 28
2.5 DANOS OXIDATIVOS ............................................................................................... 29
2.6 SISTEMAS ANTIOXIDANTES EM PEIXES ............................................................ 30
2.7 PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA ....................................................................................... 32
2.8 DANOS AO DNA ........................................................................................................ 34
3 OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 37
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................... 37
4 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 38
4.1 ANÁLISES DE ÁGUA ................................................................................................ 39
4.2 PONTOS DE COLETA DE ÁGUA PARA OS BIOENSAIOS COM ZEBRAFISH .. 39
4.3 MANUTENÇÃO DOS PEIXES UTILIZADOS NOS EXPERIMENTOS ................. 41
4.4 CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS E DELINEAMENTO ........................................... 42
4.5 COLETAS DE AMOSTRAS PARA ANÁLISES LABORATORIAIS ...................... 43
4.6.1 Catalase ........................................................................................................................ 44
4.6.2 Superóxido Dismutase ................................................................................................ 44
4.6.3 Determinação de proteínas ........................................................................................ 45
4.7 BIOMARCADOR DE DANO LIPÍDICO ................................................................... 45
4.7.1 TBARS ......................................................................................................................... 45
4.8 BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDADE ........................................................ 46
4.8.1 Ensaio cometa .............................................................................................................. 46
4.8.2 Teste do micronúcleo .................................................................................................. 47
4.9 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ...................................................................................... 47
5 RESULTADOS ........................................................................................................... 48
5.1 PONTE ALTA – ÁGUA SUBTERRÂNEA ................................................................ 49
5.1.1 Análises de água .......................................................................................................... 49
5.1.2 Superóxido dismutase ................................................................................................. 51
5.1.3 Catalase ........................................................................................................................ 51
5.1.4 Ensaio cometa .............................................................................................................. 52
5.1.5 Teste do micronúcleo .................................................................................................. 56
5.1.6 TBARS ......................................................................................................................... 56
5.1.7 Análises de correlação ................................................................................................ 57
5.2 RIO CAVEIRAS – ÁGUA SUPERFICIAL ................................................................. 58
5.2.1 Análises de água – Rio Caveiras ................................................................................ 58
5.2.2 Superóxido dismutase ................................................................................................. 60
5.2.3 Catalase ........................................................................................................................ 60
5.2.4 Ensaio cometa .............................................................................................................. 61
5.2.5 Teste do micronúcleo .................................................................................................. 64
5.2.6 TBARS ......................................................................................................................... 66
5.2.7 Análises de correlação ................................................................................................ 66
6 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 69
6.1 PONTE ALTA – ÁGUA SUBTERRÂNEA ............................................................... 69
5.2 RIO CAVEIRAS – ÁGUA SUPERFICIAL ................................................................ 71
5.3 ANÁLISES DE CORRELAÇÃO ................................................................................. 75
7 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 77
REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 79
ANEXO A – Certificado da Comissão de Ética no Uso de Animais .................................. 93
ANEXO B – Concentrações de metais encontrados em três pontos de coleta pertencentes
ao estudo .................................................................................................................. 94
ANEXO C – Artigo com as análises prévias de qualidade de água ................................... 95
21
1 INTRODUÇÃO
Os ecossistemas de água doce estão sob intensa pressão antropogênica e, como
consequência, a disponibilidade de água potável está diminuindo e o equilíbrio do ecossistema
também está se deteriorando (JOVANOVIĆ et al., 2018). Unindo o rápido crescimento
populacional, com as falhas na construção de grandes cidades, observam-se muitos problemas
de poluição, em destaque estão os ambientes aquáticos próximos aos grandes centros urbanos
(OSÓRIO et al., 2013), dos quais provêm os recursos hídricos distribuídos para a população.
Na água, a interação entre contaminantes pode ocorrer e o impacto de tais sistemas
complexos sobre os organismos pode ter efeito diferente de um único contaminante. Muitos
poluentes químicos estão presentes no meio aquático em baixas concentrações, no entanto,
isso não significa que esses compostos não poderão interagir com os outros (JOVANOVIĆ et
al., 2018), causando aumento em sua toxicidade. Alguns desses poluentes podem alterar os
níveis de defesas antioxidantes e/ou interagir com a molécula de DNA, levando a danos no
DNA que podem levar a mutações (MACCUBIN; ERSING; FRANK, 1991). Efeitos
genotóxicos podem ocorrer frente à exposição de concentrações muito baixas de diferentes
substâncias, podendo afetar a reprodução, a vida embrionária, desenvolvimento, crescimento
e sobrevivência de organismos, ter relação com a carcinogênese, defeitos hereditários,
mutações e patologias de fundo genético (AL-SABTI; METCALFE, 1995).
Considerando a contaminação das águas superficiais, e em consequência das águas
subterrâneas, torna-se necessário um maior conhecimento das características físico-químicas
das águas, bem como seu potencial genotóxico e de indução de estresse oxidativo, visando à
certificação da segurança em seu consumo, e possibilitar, num segundo momento,
intervenções diretas no sentido de recuperação dessas áreas.
22
23
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 O AQUÍFERO GUARANI
O Sistema do Aquífero Guarani (SAG) (Figura 1) é um dos principais sistemas
aquíferos do mundo e a maior reserva subterrânea de água doce da América do Sul
(SCHEIBE; HIRATA, 2008). Ocupa uma área de 1,2 milhões de km² na Bacia do Paraná e
parte da Bacia do Chaco-Paraná. Estende-se por quatro países: Brasil (840.000 km²), Paraguai
(58.500 km²), Uruguai (58.500 km²) e Argentina (255.000 km²) (QUEIROZ et al., 2009). Sua
maior ocorrência se dá em território brasileiro (2/3 da área total) abrangendo os estados de
Goiás, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do
Sul (OLIVEIRA; VIEIRA, 2010).
Figura 1- Abrangência do Sistema do Aquífero Guarani (SAG)
Fonte: Síntese Hidrogeológica do Sistema Aquífero Guarani (2009).
24
As formações geológicas que constituem o SAG datam de cerca de 130 milhões de
anos e no Brasil compreendem a Formação Piramboia, correspondendo à porção basal, e a
Formação Botucatu, o topo (GOMES, 2008). A característica de confinamento do SAG se dá
devido à presença de camadas constituídas por rochas basálticas, da Formação Serra Geral,
que ocorrem superpondo as camadas que compõem o Sistema e, também, de rochas
sedimentares de baixa permeabilidade (BARBOSA et al., 2011).
A utilização de águas subterrâneas tem sido uma alternativa viável e crescente,
principalmente em regiões onde as águas superficiais têm sofrido com poluição ou escassez
(BARBOSA et al., 2011). A viabilidade da utilização desse recurso é decorrente de algumas
de suas características, tais como a abundância das águas subterrâneas, sendo cerca de 100
vezes mais abundantes que águas superficiais, além de que as águas subterrâneas apresentam
a vantagem de não necessitarem de graus elevados de tratamento prévio para o consumo
(GOMES, 2008).
As áreas de afloramento (ou de recarga) do aquífero no Brasil compreendem mais de
100.000 km2 e são áreas onde a água das chuvas infiltra para as camadas profundas do solo,
atingindo a zona saturada (QUEIROZ et al., 2009), segundo Sheibe e Hirata (2008) a zona de
recarga, apresenta maior vulnerabilidade a contaminações antrópicas que sua porção
subterrânea. Os principais fatores de risco, que podem comprometer a qualidade das águas
subterrâneas são a ocupação antrópica desordenada das áreas de afloramento, por meio da
utilização indiscriminada de defensivos agrícolas e efluentes industriais (MAZZOLLI;
EHRHARDT-BROCARDO, 2013).
Uma vez que as áreas de afloramento do SAG constituem-se de terrenos naturalmente
vulneráveis à eventual infiltração de contaminantes e que existe uma crescente utilização
dessas áreas para as atividades agrícolas, faz-se necessário uma avaliação regional do perigo
de contaminação do SAG relacionado ao desenvolvimento dessas atividades.
No Estado de Santa Catarina o SAG surge como uma importante alternativa de
abastecimento público. Nesse Estado o Aquífero encontra-se recoberto, em quase toda sua
extensão, por rochas da Formação Serra Geral e pequenas faixas aflorantes, na borda da Serra
Geral, que constituem áreas de alta vulnerabilidade à contaminação, necessitando de
monitoramento e controle (ZANATA; COITINHO, 2002).
O município de Lages tem seu território inteiramente inserido na Região Hidrográfica
4 - Planalto de Lages, que é a maior Região Hidrográfica em extensão do Estado de Santa
Catarina com 22.787 km², constituída pelas bacias hidrográficas do Rio Canoas, que
25
corresponde à maior bacia hidrográfica estadual (15.510 km²) e do Rio Pelotas (7.277 km²).
Os corpos d´água que cortam o seu território são o Rio Carahá, Rio Caveiras, Rio Lava Tudo,
Rio Pelotinhas, Rio Pelotas e Rio Canoas (SDS, 2006).
2.2 O RIO CAVEIRAS
Com uma área aproximada de 2400 km2 e 130 km de extensão a Bacia Hidrográfica
do Rio Caveiras (Figura 2) está situada na região serrana de Santa Catarina, sendo a segunda
maior sub-bacia da Bacia Hidrográfica do Rio Canoas. O rio recebe os efluentes industriais de
uma cervejaria e efluentes urbanos da cidade Lages, principalmente através dos rios Ponte
Grande (24km2) e Carahá (30 km
2) (RAFAELI NETO, 1994).
Figura 2 - Esquema representativo da Bacia hidrográfica do Rio Caveiras.
Fonte: Rafaeli Neto et al (2013).
Segundo Rafaeli Neto et al. (2013), a qualidade das águas na bacia hidrográfica do Rio
Caveiras está mais comprometida em um trecho de 70 km, o qual se inicia com o ponto de
captação de água que abastece a cidade de Lages. Poluentes, como os despejados pelos Rios
26
Carahá e Ponte Grande no Rio Caveiras, se estiverem presentes na água de superfície podem
atingir o Aquífero Guarani, visto que são áreas de afloramento e recarga do SAG, onde, dado
as reduzidas velocidades de reação e deslocamento, podem permanecer por longos períodos
(MARTINS, 2004).
A água dos rios pode conter misturas de poluentes de várias fontes e segundo Nunes et
al. (2011) a ação tóxica de cada amostra pode variar de acordo com a sensibilidade do ensaio
realizado, portanto, o uso de diferentes bioensaios permite a detecção de um espectro mais
amplo de substâncias que podem ter efeitos negativos sobre a biota. Tendo em vista que o Rio
Caveiras faz parte do SAG, e a intensa vulnerabilidade das áreas de recarga do Aquífero,
percebe-se a importância do monitoramento da qualidade da água desse local, e da
necessidade de se intensificar os estudos ecotoxicológicos da área.
2.3 ZEBRAFISH (Danio rerio)
Grande parte da bibliografia encontrada coloca os peixes como excelentes
bioindicadores de genotoxicidade ambiental, pois respondem aos agentes xenobióticos de
forma similar aos mamíferos e podem ser usados para avaliar a presença de substâncias que
são prejudiciais aos seres humanos (PARLAK, 2018). Além disso, podem ser utilizados em
testes a campo, ou em experimentos conduzidos em laboratório, dessa forma, uma infinidade
de compostos pode ser testada quanto ao potencial teratogênico ou carcinogênico (BRITO;
DA LUZ, 2015).
Peixes são organismos bioconcentradores, pois diversos contaminantes mesmo em
baixas concentrações podem afetar sua fisiologia e capacidade de sobrevivência (GRISOLIA
et al., 2009). Os peixes também podem ser utilizados para indicar o potencial de exposição
das populações humanas a genotóxicos químicos, sendo considerado um dos maiores vetores
de transferência de contaminantes para humanos (AL-SABTI; METCALFE, 1995). Recentes
estudos demonstram a importância da utilização de peixes como bioindicadores (BÜCKER;
CONCEIÇÃO, 2012; HUSSAIN et al., 2017), muitos deles utilizando zebrafish
(FAßBENDER; BRAUNBECK, 2013; GÜLSOY; YAVAŞ; MUTLU, 2015; SATHYA et al.,
2015), consequentemente, esses são organismos de grande confiabilidade para testes de
ecotoxicidade.
O zebrafish (Danio rerio) (Figura 3) é um pequeno peixe de água doce tropical
vertebrado, que pertence à família Cyprinidae e é originalmente do continente asiático
27
(SPENCE et al., 2008). O surgimento deste novo modelo animal e seu crescente uso em
pesquisa é devido às várias características vantajosas do zebrafish em relação a outros
modelos de vertebrados (WILSON; BUNTE; CARTY, 2009). São várias as vantagens
atribuídas à espécie, entre elas, a alta fecundidade, o rápido desenvolvimento, transparência
óptica durante a embriogênese, baixo custo, facilidade de manutenção no laboratório, sua
capacidade de absorver compostos dissolvidos em água. Além disso, possui extensa
homologia de seu genoma com de outras espécies de vertebrados, como os humanos, que
apresentam cerca de 70% dos genes em comum com o zebrafish (HOWE et al., 2013). A
utilização do zebrafish é justificada em função de recentes descobertas que o tornaram modelo
para estudos em biossegurança (GOLDSMITH; JOBIN, 2012).
O zebrafish vem sendo o modelo utilizado em pesquisas com vários compostos, testes
de segurança com fármacos, avaliação de riscos ambientais e toxicidade durante o
desenvolvimento (ALI; AALDERS; RICHARDSON, 2014). Desta maneira, as características
do zebrafish tornam a espécie em um modelo experimental interessante para a avaliação da
toxidade de ambientes aquáticos, podendo ser utilizado na avaliação da qualidade de água do
presente estudo.
Figura 3 - O teleósteo zebrafish (Danio rerio).
Fonte: Elaborado pela autora, 2017.
28
2.4 BIOMARCADORES DE CONTAMINAÇÃO AQUÁTICA
É praticamente impossível o monitoramento de todos os contaminantes aquáticos
sejam eles de origem humana ou natural. No entanto, é possível submeter de diferentes
formas plantas, animais e outros seres vivos a xenobióticos tóxicos e analisar suas respostas
metabólicas com o uso de diferentes tipos de biomarcadores. Segundo Peakall (1994)
biomarcadores podem ser definidos como uma resposta biológica a um, ou vários produtos
químicos, que dá uma medida de exposição e, às vezes, também, de efeito tóxico. Forbes;
Palmqvist; Bach (2006) consideram biomarcadores como indicadores bioquímicos,
fisiológicos ou histológicos de exposição ou efeitos de produtos químicos xenobióticos.
Os objetivos da utilização de biomarcadores são de utilizá-los para indicar que os
organismos foram ou estão sendo expostos a certos produtos químicos ou que os organismos
estão sofrendo ou provavelmente sofrerão futuros danos de relevância ecológica. No contexto
da avaliação de risco ecológico, um papel para os biomarcadores foi identificado tanto em
avaliações específicas do local quanto em programas regionais de biomonitoramento
(RODRIGUES, 2015).
São conhecidos dois tipos de biomarcadores: de efeito e de exposição. Os
biomarcadores de exposição são aqueles que indicam que ocorreu a exposição e que o
poluente está biodisponível (AMORIM, 2003). A resposta pode ser devida aos poluentes ou
aos metabolitos resultantes da interação dos poluentes com compostos endógenos nos órgãos
do organismo. Por outro lado, os biomarcadores de efeitos indicam alterações em níveis
bioquímicos, fisiológicos ou genéticos e dependendo da magnitude podem provocar danos ou
enfermidades, estes biomarcadores podem revelar o sitio alvo dos poluentes. Portanto, os
biomarcadores de exposição e efeito são uma parte fundamental nas análises das relações
entre os poluentes no meio ambiente, na incorporação pelos organismos e na ação tóxica ou
efeito sobre eles mesmos. Biomarcadores de exposição, e efeito são necessários para ligar a
presença de poluentes no ambiente com a sua ação em um organismo (JHA, 2008).
A contaminação por metais, e agrotóxicos é comum em ambientes aquáticos. Os níveis
desses agentes tóxicos nos ecossistemas aquáticos geralmente são monitorados por métodos
químicos, como espectrometria de massa, por exemplo. Embora essas técnicas permitam
medições diretas e precisas de concentrações de substâncias tóxicas no meio ambiente, elas
não podem revelar muito sobre a toxicidade dos contaminantes em organismos vivos
(REDEKER; BERVOETS; BLUST, 2004), especialmente em relação aos efeitos combinados
29
quando organismos aquáticos são expostos a múltiplos agentes tóxicos simultaneamente
(ZHU et al., 2006).
Efluentes podem possuir uma vasta variedade de poluentes, como hidrocarbonetos
aromáticos policíclicos, bifenis policlorados, pesticidas organoclorados e organofosforados,
metais entre outros (MARTINEZ-ALVAREZ; MORALES; SANZ, 2005). A maioria desses
compostos possuem potencial oxidante, tornando as células suscetíveis a danos por espécies
reativas de oxigênio (EROs) (WINSTON; DI GIULIO, 1991), logo, a quantificação de danos
oxidativos e os níveis de defesas contra danos celulares, têm o potencial de serem usados
como biomarcadores de contaminação aquática (AHMAD; PACHECO; SANTOS, 2006;
FUNES et al., 2006).
2.5 DANOS OXIDATIVOS
O oxigênio é uma molécula utilizada tanto na produção de energia através da cadeia
transportadora de elétrons na mitocôndria e em inúmeras vias metabólicas fundamentais. Ao
mesmo tempo, o consumo de oxigênio é capaz de gerar substâncias tóxicas a nível intracelular e
extracelular, criando então o chamado “paradigma do oxigênio”, devido ao balanço existente entre
suas vantagens e desvantagens (PRUCHNIAK; ARAZNA; DEMKOW, 2015).
O oxigênio pode levar à formação de espécies altamente reativas, as quais são
chamadas de espécies reativas de oxigênio (EROs) (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007),
são exemplos o ânion superóxido e o radical hidroxil. A produção de EROs é estimulada pelo
organismo, em condições de estresse, sendo a poluição aquática o maior contribuinte ao
estresse oxidativo em peixes (AHMAD; PACHECO; SANTOS, 2006). O estresse oxidativo é
definido como um desbalanço entre a produção de EROs e os níveis das defesas antioxidantes
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). O desequilíbrio entre essas duas frações pode
potencialmente levar a danos celulares no nível molecular, uma vez que os oxidantes são
formados em uma taxa diferente como um produto normal do metabolismo aeróbico,
mecanismos bioquímicos complexos são necessários para regular todo esse processo
fundamental (PRUCHNIAK; ARAZNA; DEMKOW, 2015).
A maioria das EROs são espécies radicalares, ou seja, átomos, moléculas ou íons que
possuem um ou mais elétrons não pareados em seus orbitais externos, o que as torna reativas,
sendo capazes de se combinar inespecificamente com diversas moléculas integrantes das
estruturas celulares e derivadas de cada uma delas (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). As
EROs em geral são formadas por reações redox ou por processos de catálise enzimática
30
(SLATER, 1984). ERO é um termo frequentemente usado para incluir também espécies que
não são radicalares como, por exemplo, o peróxido de hidrogênio (H2O2) (HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 2007).
As EROs podem reagir com macromoléculas biológicas (Figura 4) como lipídios e
produzir a peroxidação lipídica (LPO), danos ao DNA e oxidação de proteínas, resultando no
estresse oxidativo (MONTEIRO et al., 2006). A exposição a substâncias tóxicas ambientais,
como poluição, radiação e pesticidas, também pode contribuir para o estabelecimento dessa
condição em sistemas biológicos (XU et al., 2017; ZEPEDA-ARCE et al., 2017). O dano ao
DNA também é um efeito importante, resultante da exposição à xenobiontes, e pode estar
relacionado à sua capacidade de desregular as defesas antioxidantes e induzir estresse
oxidativo (CHAUFAN; COALOVA; RIOS DE MOLINA, 2014; DE CASTILHOS; GHISI;
CESTARI 2013).
2.6 SISTEMAS ANTIOXIDANTES EM PEIXES
A convivência harmoniosa dos seres aeróbicos com os efeitos deletérios do oxigênio
deve-se principalmente ao desenvolvimento de mecanismos de defesa antioxidantes altamente
especializados. Halliwell e Gutteridge (2007) definiram os antioxidantes como substâncias
capazes de, em concentrações relativamente baixas, competirem com outros substratos
oxidativos e assim evitar ou inibir a sua oxidação. Devido aos efeitos danosos das espécies
reativas de oxigênio (EROs), todas as células mantêm sistemas de defesas antioxidantes. As
EROs atuam como moléculas sinalizadoras, estimulando respostas de defesa nas células e
podendo desempenhar um papel fundamental no combate a uma ampla gama de doenças
(KRAVCUKOVA et al., 2009).
Enzimas em organismos vivos são as principais substâncias envolvidas no
metabolismo e na desintoxicação de compostos xenobióticos, sendo sensíveis a substâncias
estranhas. Uma vez que os agentes tóxicos entram em um organismo, eles frequentemente
aumentam ou diminuem imediatamente as atividades enzimáticas correspondentes. Portanto,
as enzimas têm sido utilizadas como um dos importantes biomarcadores da poluição
ambiental em estudos de toxicologia ecológica (MOORE et al., 2004).
Os peixes possuem os dois sistemas de defesa endógena: enzimático e não enzimático
(GUERRIERO; DI FINIZIO; GARCIA, 2002). O sistema enzimático é composto por
enzimas, como por exemplo, a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa
31
peroxidase (GPx), e por enzimas auxiliadoras, como a glutationa redutase (GR), a glicose-6-
fosfato desidrogenase (G6PDH) e a glutationa S-transferase (GsT).
Como uma metaloenzima presente em uma ampla gama de seres vivos (uma enzima
antioxidante de primeira ordem), a SOD reduz o dano oxidativo no tecido convertendo o O2−
(ânion superóxido) em H2O2 (peróxido de hidrogênio) (CHAKRABORTY et al., 2007). A
atividade da SOD nas células está diretamente envolvida na resposta a fatores estressores, e
também pode estar envolvida na adesão celular e sinalização molecular em plantas (PRICE et
al., 1994).
Como uma enzima tetramérica contendo um grupo heme (uma enzima antioxidante de
segunda ordem), a CAT realiza a decomposição de H2O2 em O2
(oxigênio molecular) e H2O
(água). Essas duas enzimas desempenham um papel central na proteção do tecido contra as
EROs (RAJESWARI; PALIWAL, 2008). A enzima CAT é amplamente distribuída em
tecidos biológicos e uma das enzimas mais importantes envolvidas na defesa contra o estresse
oxidativo em vertebrados e invertebrados (GOYAL; BASAK, 2010).
SOD e CAT são amplamente utilizadas como biomarcadores de poluição aquática. Os
programas de monitoramento aquático frequentemente empregam esses biomarcadores
bioquímicos como uma útil ferramenta para avaliação ecotoxicológica. As enzimas
antioxidantes são úteis na avaliação da resposta de um organismo à contaminação ambiental
devido à sua rápida taxa de resposta e sensibilidade na detecção de uma ampla gama de
contaminantes (FITZPATRICK et al., 1997)
32
Figura 4 - Representação dos danos às principais biomoléculas causados ou não por
xenobiontes.
Fonte: Adaptado de Nordberg; Arner (2001).
Os xenobiontes que estão presentes no ambiente aquático, podem induzir a formação de EROs, como por
exemplo o ânion superóxido. As enzimas antioxidantes, como a SOD, por sua vez tem função de neutralizar os
danos causados pelas EROs. Caso as enzimas sofram alterações em sua produção, e o aumento das espécies
reativas seja exacerbado, essas EROs podem vir a danificar as principais biomoléculas (lipídios, proteínas e
DNA).
2.7 PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA
O processo de oxidação de lipídios é denominado peroxidação lipídica ou
lipoperoxidação (LPO), constitui o maior evento decorrente do estresse oxidativo de lipídios
poliinsaturados em membranas celulares. A peroxidação lipídica é um processo complexo que
envolve a formação e propagação de radicais lipídicos, a captação de oxigênio, um rearranjo
das ligações duplas em lipídios insaturados e a eventual destruição de lipídios de membrana,
produzindo uma variedade de produtos de degradação, incluindo álcoois, cetonas, aldeídos e
éteres (BUEGE; AUST, 1975). O processo geral da peroxidação lipídica consiste em três
estágios: iniciação, propagação e terminação (ESTERBAUER; SCHAUR; ZOLLNER, 1991)
(Figura 5).
33
Figura 5 - Esquema do processo de lipoperoxidação
Fonte: Halliwell; Gutteridge (2007).
A abstração de átomos de hidrogênio de um ácido graxo poliinsaturado (neste esquema representado por três
ligações duplas) leva à formação de um dieno conjugado (ligações simples intercaladas por ligações duplas) por
rearranjo molecular. Esta molécula pode sofrer o ataque de oxigênio, formando um radical peroxil. Este radical
pode continuar o ciclo de lipoperoxidação através da abstração de átomos de hidrogênio de cadeias
poliinsaturadas próximas, transformando-se em um peróxido lipídico.
O começo desta reação geralmente ocorre através da abstração de átomo hidrogênio de
um grupo metileno pelo ataque de uma molécula reativa, como ERO, metais, ou outros
radicais livres, formando um radical de carbono. Este, por sua vez, realizará um rearranjo
molecular, formando um dieno conjugado, o qual pode reagir com moléculas de oxigênio,
formando um radical peroxil (BUEGE; AUST, 1975).
A partir da formação deste radical ocorre a fase de propagação, devido à sua capacidade
de abstrair átomos de hidrogênio de outros grupos metilenos de cadeias adjacentes
(transformando-se em um peróxido lipídico). Estes sofrerão processos de rearranjo molecular,
formação de dienos conjugados e, posteriormente, ataque de moléculas de oxigênio, formando
um novo ROO•. Este novo ROO• reinicia o processo, gerando uma reação oxidativa em
cadeia (CATALÁ, 2006). A formação de endoperóxidos lipídicos, em ácidos graxos
insaturados, contendo pelo menos 3 ligações duplas interrompidas por metileno pode levar à
formação de malondialdeído (MDA) como um produto de decomposição (BUEGE; AUST,
1975).
O malondialdeído (MDA) é um dos vários produtos finais de baixo peso molecular
formado através da decomposição de produtos primários e secundários de peroxidação
lipídica. Em pH baixo e temperatura elavada, o MDA participa prontamente da reação de
34
adição nucleofílica com o ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), gerando uma coloração vermelha.
Esses fatos, juntamente com a disponibilidade de métodos fáceis e sensíveis para quantificar o
MDA levaram ao uso rotineiro da determinação de MDA e, particularmente, o teste TBARS
(teste das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico) para detectar e quantificar a
peroxidação lipídica em uma ampla variedade de tipos de amostra (JANERO, 1990).
2.8 DANOS AO DNA
O ácido desoxirribonucleico (DNA) é um importante alvo do dano causado pelo
aumento de EROs nas células. Os efeitos causados pelo dano ao DNA afetam o sinal da
transdução, a proliferação celular, apoptose e a comunicação intercelular. O DNA é uma
molécula muito estável, mas pode sofrer decomposição espontânea durante seu tempo de
vida, sendo que o estresse oxidativo pode acelerar o dano ao DNA, levando a quebra da fita
do DNA.
As EROs estão envolvidas com processos de envelhecimento, desenvolvimento de
câncer, mutações e morte celular, através de alterações químicas, tanto nas bases
nitrogenadas, na ribose do DNA e na quebra de suas ligações. A espécie reativa de oxigênio
com maior capacidade de causar danos ao DNA é o radical hidroxila (PRUCHNIAK;
ARAZNA; DEMKOW, 2015). Ele tem a capacidade de adicionar ligações duplas nas bases
heterocíclicas de DNA, assim como, de abstrair hidrogênio da base nitrogenada timina e de
cada um dos carbonos da desoxirribose.
São usadas diversas técnicas para medir os níveis de danos oxidativos no DNA,
desenvolvido inicialmente por Singh et al. (1988) o Ensaio Cometa (EC), “Single Cell Gel
Electrophoresis”, é uma técnica rápida e eficiente quando usada para quantificar as lesões e
detectar os efeitos do reparo no DNA em células individualizadas de mamíferos. Essa
metodologia apresenta algumas vantagens sobre os testes bioquímicos e citogenéticos, entre
as quais a utilização de um pequeno número de células que não necessariamente estejam em
divisão. Essa técnica permite também analisar o nível de dano no DNA de diferentes células
de um mesmo indivíduo, determinando quais órgãos/tecidos são mais afetados pelo agente
agressor (MUTHUSAMY et al., 2017).
O princípio da técnica é simples: as células são inclusas em gel sobre uma lâmina de
microscopia, faz-se passar uma corrente elétrica e, como o DNA tem carga negativa, se
estiver rompido, migra para fora do núcleo, ficando com a aparência de um cometa ou cauda.
35
O DNA que não estiver rompido ou quebrado fica armazenado no núcleo, sendo muito grande
para migrar. Quanto mais fragmentado estiver o DNA, maior será a cauda.
O ensaio de cometa em condições neutras permite a detecção de quebras de fita dupla
de DNA, o que é mais relevante para a exposição à radiação ionizante (WANG et al., 2013).
Na variante neutra, a molécula de DNA é preservada como uma estrutura de cadeia dupla que
leva à detecção de quebras de fita dupla no DNA (ZHAO et al., 2013). Na variante alcalina do
método, a etapa de desnaturação em pH 13 permite revelar, simultaneamente, quebras de
DNA de dupla e de fita única, bem como locais abásicos, o que leva à suposição de que o
ensaio alcalino é muito mais sensível em comparação com sua variante neutra na detecção de
danos no DNA (MUTHUSAMY et al., 2017).
Estudos mais recentes dizem respeito à adoção do ensaio cometa enzimático, com um
passo a mais após a lise de digestão com endonucleases reparadoras específicas. Modificações
no ensaio cometa alcalino usando endonucleases específicas podem detectar bases de DNA
com danos oxidativos (MUTHUSAMY et al., 2017). Quando associado à glicosilases de
reparo de DNA, como a Formamidopirimidina-DNA glicosilase (FPG) de Escherichia coli e a
endonuclease III de E. coli (ENDO III) que reconhecem purinas e pirimidinas modificadas,
respectivamente, o método permite a detecção de danos oxidativos nas bases (COLLINS et
al., 1996), e é possível usar o ensaio cometa modificado para medir níveis muito baixos de
danos no DNA.
Dentre os métodos para investigação de toxicidade genética in vivo, além do ensaio
cometa, o teste de micronúcleo (MN) tem sido amplamente empregado e aceito pelas agências
reguladoras e comunidade científica (MATEUCA et al., 2006). O teste do micronúcleo
detecta alterações genômicas ou/e dano ao aparato mitótico, sendo os micronúcleos
indicativos de perdas irreversíveis de DNA (VALADARES; CASTRO; CUNHA, 2007). Os
micronúcleos se formam pela extrusão de cromossomos inteiros ou seus fragmentos durante a
divisão celular, sendo uma porção de cromatina resultante de mitoses aberrantes.
Hooftman e De Raat (1982), tomando por base o teste do micronúcleo desenvolvido
por Schmid (1975) para células da medula óssea de camundongos, introduziram-no nos
estudos de células sanguíneas de peixes mantidos em laboratório. Esta modificação do teste
original passou a ser conhecida como Piscine Micronucleus Test (CARRASCO; TILBURY;
MYERS, 1990).
Hoje, tanto o teste do micronúcleo quanto o do cometa estão sendo extensivamente
usados em conjunto no monitoramento do ambiente aquático e com peixes como
bioindicadores (BÜCKER; CONCEIÇÃO, 2012; FAβBENDER; BRAUNBECK, 2013;
36
GÜLSOY; YAVAŞ; MUTLU, 2015; SATHYA et al., 2015). Enquanto o teste MN detecta
danos não reparáveis, como lesões clastogênicas e aneugênicas, o ensaio cometa detecta
lesões recentes que podem ser reparadas, como quebras e locais álcali-lábeis (MATSUMOTO
et al., 2006)
37
3 OBJETIVO GERAL
Realizar análises-físico químicas de qualidade da água subterrânea e superficial de
dois pontos de coleta pertencentes ao Sistema do Aquífero Guarani, verificando sua influência
sobre os biomarcadores de genotoxicidade e estresse oxidativo em zebrafish (Danio rerio).
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Os objetivos específicos do presente trabalho são:
a) verificar parâmetros físico-químicos e biológicos da qualidade da água nos dois
pontos de coleta;
b) verificar a fragmentação do DNA de Danio rerio submetidos a águas oriundas do
Aquífero Guarani pelo Ensaio Cometa;
b) quantificar oxidação de purinas e pirimidinas pelo ensaio cometa enzimático,
modificado com as enzimas ENDO III e FPG;
c) avaliar a taxa de micronúcleos em eritrócitos de Danio rerio submetidos à água
proveniente do Aquífero Guarani;
d) avaliar biomarcadores de estresse oxidativo em Danio rerio submetido à água
coletada, como CAT, SOD;
e) quantificar níveis de peroxidação lipídica em Danio rerio.
38
39
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ANÁLISES DE ÁGUA
As análises de água foram realizadas no Laboratório de Tratamento de Água e
Resíduos (LABTRAT) da Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC). A
Universidade com o apoio do CISAMA (Consórcio Intermunicipal Serra Catarinense) elencou
seis propriedades rurais, que apresentam dificuldades com relação ao abastecimento de água,
situadas na região serrana de Santa Catarina: Pátria Livre, Rio Rufino, Cerro Baio, Anita
Garibaldi, Ponte Alta (Caravággio) e Urubici. Foram realizadas duas coletas de água prévias,
nessas propriedades, a fim de elencar as que apresentavam maiores inconformidades com a
Portaria MS nº 2.914/2011 que dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da
qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade. As análises de
qualidade de água do Rio Caveiras começaram após essas análises preliminares.
As amostras foram coletadas seguindo as recomendações do guia nacional de coleta e
preservação de amostras da Agência Nacional de Águas (ANA, 2011). Os parâmetros físico-
químicos e biológicos utilizados para a avaliação da água foram selecionados em função do
uso e ocupação do solo no entorno da bacia, sendo estes: pH, cor, turbidez, sólidos suspensos
totais (SST), sólidos totais dissolvidos (STD), nitrato, nitrito, amônia, condutividade, sulfato,
cloro residual livre, ferro, alumínio, cloreto, dureza, alcalinidade, manganês, fósforo total, e
coliformes termotolerantes (CT).
Todos os parâmetros em questão foram mensurados em duplicatas, seguindo as
normas propostas pelo Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater
(RICE et al., 2005) e utilizando-se os espectrofotômetros Nova 60 Merck e Pharo 300 Merck.
Coliformes termotolerantes foram identificados e medidos utilizando a técnica de filtragem
por membrana e posterior incubação a 44,5ºC em meio mFC (ágar coliformes fecais) água e
ácido rosólico como indicador. As análises de pH, sólidos totais dissolvidos e condutividade
foram realizadas em um pHmêtro da marca HOMIS.
4.2 PONTOS DE COLETA DE ÁGUA PARA OS BIOENSAIOS COM ZEBRAFISH
Para os experimentos com zebrafish, foram escolhidos dois pontos, o primeiro na
localidade de Caravaggio, localidade que apresentou grande desconformidade com a portaria
MS nº 2.914/2011, na cidade de Ponte Alta-SC (Latitute 27°24'22.5"S Longitude
40
50°22'52.7"W) onde foi coletada água subterrânea (Figura 6). O segundo local escolhido foi
no Rio Caveiras em um ponto denominado Ponte BR-2 (Latitude 27°52'48.40"S e Longitude
50°22'56.59"O), local onde há uma área de afloramento do Aquífero Guarani e que está a
jusante dos Rios Ponte Grande e Carahá, que despejam, no Rio Caveiras, esgotos e dejetos
oriundos da cidade de Lages-SC, onde coletou-se água superficial (Figura 7).
Figura 6 - Caracterização do ponto de coleta de água subterrânea proveniente do Aquífero
Guarani, localizado no interior do município de Ponte Alta, SC, Brasil.
Fonte: Google maps. https://www.google.com.br/maps/place/Pte.+Alta+-+SC/@-27.4163499,-50.5644484,10z
/data=!3m1!4b1!4m5!3m4!1s0x94e068be4378ce1f:0xb158e7e9161f33cc!8m2!3d-27.4844293!4d-50.3779495
41
Figura 7 - Caracterização do ponto de coleta de água superficial no ponto BR-2, localizado
no Rio Caveiras, em Lages, SC, Brasil.
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
4.3 MANUTENÇÃO DOS PEIXES UTILIZADOS NOS EXPERIMENTOS
Os experimentos com zebrafish foram desenvolvidos no laboratório de piscicultura nas
instalações do Centro de Ciências Agroveterinárias da Universidade do Estado de Santa
Catarina, em Lages, Santa Catarina, Brasil. O presente trabalho foi aprovado pela Comissão
de Ética no Uso de Animais da Universidade do Estado de Santa Catarina (CEUA/UDESC),
sob nº 8337300816 (ANEXO 1).
Os exemplares de zebrafish (Danio rerio) utilizados na pesquisa foram adquiridos de
empresa local especializada, sendo de sexo misto, com idade de seis a doze meses. Os peixes
foram mantidos no laboratório de piscicultura em uma densidade de dois peixes por litro de
água, em um fotoperíodo de 12 horas luz e 12 horas escuro, em aquários de vidro, contendo
aeração constante e termostato para controle de temperatura. Os animais foram alimentados
duas vezes ao dia, com ração comercial, marca Alcon. Foi realizada a limpeza e remoção de
sujidades (fezes e resto de ração) por meio de sifonagem diariamente, com renovação de água
de aproximadamente 5-10% do volume total do aquário, para manutenção dos parâmetros de
qualidade de água.
42
4.4 CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS E DELINEAMENTO
Ao todo foram realizados quatro experimentos, utilizando noventa peixes (Tabela 1),
que foram divididos em dois aquários, sendo um de água controle, e outro de água coletada
nos pontos pré-estabelecidos, onde coletou-se aproximadamente 100 litros de água em
bombonas de polipropileno que foram levadas até o laboratório de pisicultura para realizar a
exposição dos peixes. No Rio Caveiras, a água superficial foi coletada com ajuda de baldes,
cerca de dois metros da margem do Rio. A água de Ponte Alta foi coletada em bombonas de
prolipropileno, direto da caixa d’água onde é armazenada para distribuição. Os experimentos
foram realizados em quatro períodos distintos (Agosto de 2017; Setembro de 2017; Dezembro
de 2017 e Março de 2018).
Os peixes inicialmente foram mantidos por quinze dias em período de aclimatação e
em seguida por vinte e oito dias em período experimental. Os peixes tanto do grupo controle
quanto do grupo teste, foram mantidos em temperatura de 27,10 º C (±1,4º), com aeração
mecânica constante. Os níveis de amônia (0 ppm) e pH (7,8 ± 0,3) mantiveram-se
semelhantes nos dois grupos. Os animais do grupo controle foram mantidos em água
proveniente do laboratório de piscicultura, que têm seus parâmetros de qualidade da água
avaliados mensalmente. Os animais do tratamento exposto foram mantidos por vinte e um
dias na água coletada nos diferentes pontos analisados e em seguida, no vigésimo segundo
dia, colocados na água controle, para avaliação de sua recuperação após os efeitos da água.
Tabela 1- Delineamento dos experimentos realizados.
AGO/2017 SET/2017 DEZ/2017 MAR/2018
Dias
Controle
(n)
AG (n)
Controle
(n)
Rio
Caveiras
(n)
Controle
(n) AG (n)
Controle
(n)
Rio
Caveiras (n)
0 9 9 9 9 9 9 9 9
7 9 9 9 9 9 9 9 9
14 9 9 9 9 9 9 9 9
21 9 9 9 9 9 9 9 9
28 9 9 9 9 9 9 9 9
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
43
4.5 COLETAS DE AMOSTRAS PARA ANÁLISES LABORATORIAIS
Os procedimentos de coleta ocorreram a cada sete dias (0, 7, 14, 21, 28), onde nove
peixes por tratamento foram anestesiados em solução tamponada com tricaína (168 mg/L; pH
7,0) e eutanasiados em dose letal de tricaína metano sulfato (0,6 mg/mL; 27°C ±0,5; pH 7,0 a
7,4) (MATTHEWS; VARGA, 2012), para posterior coleta de amostras de sangue e do
músculo dorso-lateral. O sangue foi coletado através de uma incisão entre a nadadeira caudal
e anal, e aspirado com uma micropipeta com ponteira contendo EDTA. Foram realizados três
pools de sangue por tratamento, cada pool foi composto pelo sangue de três peixes, 5 μL de
cada pool foram diluídos em 495 μL de soro fetal bovino (SFB) em microtubos, totalizando
três pools analisados por tratamento.
Após a coleta de sangue foi realizado um teste de viabilidade celular com azul de
trypan, esse método baseia-se na observação de que células viáveis são impermeáveis ao
referido corante, ao passo que as células não viáveis apresentam permeabilidade, devido à
formação de poros na membrana, o que permite a penetração do corante e assim as células
não viáveis exibem coloração azul após tratamento (STROBER, 2001), só foram utilizadas
amostras com mais de 80% de viabilidade celular contadas em câmara de Neubauer.
Imediatamente após a coleta foram realizados o ensaio cometa e teste do micronúcleo. Para
coleta de músculo inicialmente a pele foi retirada (Figura 8), em seguida com o auxílio de um
bisturi o músculo lateral foi removido. O ensaio cometa, teste do micronúcleo e teste de
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foram realizados no laboratório de
Bioquímica e Biologia Molecular (CAV-UDESC). Já os experimentos para medir os níveis
das enzimas CAT e SOD foram realizados no Laboratório de Genética Toxicológica da
Universidade Federal de Ciências da saúde de Porto Alegre.
Figura 8 - Esquema da forma de coleta de músculo lateral em zebrafish.
Fonte: Gupta & Mullins, 2010.
44
4.6 DEFESAS ANTIOXIDANTES ENZIMÁTICAS
As amostras de músculos foram pesadas e separou-se 100 mg de músculo para as
análises, homogeneizadas com 500 µL de tampão de homogeneização, contendo TRIS (50
mM), KCl (0,15 M), PMSF (1 M) e DTT (1mM). Em seguida as amostras foram
centrifugadas a 9000 g por trinta minutos a 4º C, o sobranadante foi pipetado e alicotado em
três microtubos, e armazenado em ultrafreezer até o momento da análise.
4.6.1 Catalase
A alta velocidade de reação desta enzima, associada a uma baixa afinidade, permite a
determinação de sua atividade com concentrações elevadas de H2O2 (10 mM). A atividade da
enzima catalase foi determinada pela velocidade de consumo da H2O2 no primeiro minuto da
reação, 240nm (AEBI, 1984). Foi descontado o desaparecimento do peróxido de hidrogênio
sem a presença da amostra. O ensaio enzimático de 60 segundos foi realizado em tampão
fosfato de potássio (KPi) 50 mM, EDTA 0,5 mM, pH 7,0 contendo 0,012% de Triton X-100.
Como substrato iniciador foi utilizado 10 mM de H2O2. A absorbância basal foi descontada a
partir da leitura da reação do ensaio na ausência da amostra.
4.6.2 Superóxido Dismutase
Para a quantificação da SOD por meio do método baseado na inibição da auto-
oxidação da adrenalina, as amostras foram diluídas em tampão de homogeneização, na
proporção 1:10 (v/v), e quantidades crescentes do diluído (10, 15, 20, 25 e 30 ul) acrescidas
de tampão glicina pH 10,2 a 32°C, solução de catalase e solução ácida de adrenalina; foram
lidas no comprimento de onda de 480 nm durante 180 segundos, com intervalo de leitura de
dez segundos, de acordo com a metodologia descrita por Misra e Fridovich (1972). A curva
resultante desta leitura foi comparada com a curva de oxidação da adrenalina obtida no
mesmo dia da análise, sob as mesmas condições da amostra através de uma planilha do
Microsoft Excel. O resultado final foi expresso em g SOD/g proteína.
45
4.6.3 Determinação de proteínas
A concentração de proteínas totais foi determinada através do método de Lowry
modificado (PETERSON, 1977), com soro albumina bovina como padrão.
4.7 BIOMARCADOR DE DANO LIPÍDICO
4.7.1 TBARS
O teste de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA) foi realizado com base
no protocolo de Buege e Aust (1975), com algumas modificações, esse teste leva em
consideração a reação de duas moléculas de TBA com uma de ácido tricloroacético (TCA)
que gera uma cor rosa que pode ser lida em espectrofotômetro em comprimento de onda de
495 nm. As amostras de músculos de peixe foram pesadas e em seguida homogeneizadas com
tampão de NaCl (150mM), centrifugadas por trinta minutos a 13500 rpm (4ºC). 400 µL da
amostra foram reagidos com 100 µL de TBA (0,67%) e 500 µL de TCA (10%), essa mistura
foi aquecida até 96º por trinta minutos, resfriada em gelo por cinco minutos, em seguida
centrifugada novamente por trinta minutos a 13500 rpm (4ºC), e lida em espectofotômetro em
595 nm. Os resultados são apresentados em nmol de malondialdeido (MDA) por grama de
tecido. Juntamente com as amostras foi realizada uma curva de calibração com concentrações
conhecidas de MDA (0,75, 1,5, 3, 6 e 12 nmol) para estimativa do fator de correção.
Para determinação de proteínas totais das amostras para o TBARS foi realizada a
dosagem de proteínas pelo método de Bradford. Este método baseia-se na ligação do corante
(Coomassie Brilliant Blue /G-250) com moléculas de proteínas da amostra, formando um
complexo de cor azul. A concentração de proteína nas amostras foi determinada com base em
curva de calibração obtida de concentrações conhecidas de BSA (soro albumina bovina) e em
leitura espectrofotométrica a 595nm.
46
4.8 BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDADE
4.8.1 Ensaio cometa
Para a técnica de ensaio cometa alcalino foi utilizado o método previamente descrito
por Singh et al. (1988) com algumas adaptações, já para o ensaio cometa modificado com
FPG foi utilizado o protocolo de Dunsiska e Collins, (1996) com modificações, e o ensaio
modificado com Endonuclease III foi baseado no protocolo de Collins; Duthie; Dobson,
(1993) com adaptações.
As amostras de sangue coletadas foram dividas em três tipos de tratamentos diferentes:
espontâneo: somente o sangue dos animais controle e expostos; Enzimático com FPG- sangue
dos animais exposto à enzima FPG; Enzimático ENDO - sangue dos animais com a enzima
ENDO III; Induzido - sangue dos animais mais peróxido de hidrogênio. Todas as lâminas
foram feitas em triplicatas.
Primeiramente, lâminas histológicas foram lavadas com detergente, secas em estufa e
limpas com etanol, em seguida recobertas com uma camada de agarose (1,5%) com ponto de
fusão normal (NMP). As células sanguíneas diluídas em soro fetal bovino (SFB) (5 µL) foram
misturadas com 110 µL de agarose com baixo ponto de fusão (LMP) e depositadas sobre as
lâminas pré-recobertas com agarose NMP. Após as lâminas foram deixadas em solução de
lise (NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM, TRIS 10 mM) over night. Para o controle positivo foi
utilizado 10μL de peróxido de hidrogênio (100 µM) em 190 µL da amostra de sangue,
incubado a 4ºC por 5 minutos.
As lâminas com tratamento enzimático passaram por tratamento em tampão de
reação, sendo realizadas três lavagens de cinco minutos cada, com tampão de HEPES (40
mM), KCl (0,1M), EDTA (0.5 mM) e BSA (0.2 mg/ml), pH 8,0. Em seguida passaram por
um período de trinta minutos de incubação com a enzima específica em câmera úmida à 37º
C.
Em seguida tanto as lâminas que não sofreram tratamento enzimático, quanto as
tratadas com enzimas passaram por uma etapa de vinte minutos de desenrolamento alcalino,
com solução de NaOH (0,3 M) e EDTA (1 mM), pH 10. Após essas lâminas foram
submetidas à eletroforese por vinte minutos, em 1V/cm e 300mA. Em seguida houve uma
etapa de neutralização das lâminas com TRIS (0,4 M), pH 7,5, e uma etapa de fixação das
lâminas com etanol 100%. Em seguida as lâminas foram armazenadas até o momento da
47
análise, onde foram coradas com solução de brometo de etídeo, e analisadas em microscópio
de epi-fluorescência Zeiss Axio Imager.A2 com filtro de 605 nm, com o software Comet
Imager 2.2 da Metasystem ®.
4.8.2 Teste do micronúcleo
Para o teste do micronúcleo realizaram-se esfregaços com o sangue total em
triplicatas. Após secagem do esfregaço, as lâminas foram fixadas em etanol absoluto por 20
minutos. O material foi corado com solução Giemsa 10% diluído em tampão fosfato (pH 6,8)
por 20 minutos. Decorrido este tempo as lâminas foram lavadas suavemente sob uma torneira
para retirada do excesso de Giemsa e deixadas à temperatura ambiente para secagem. As
lâminas foram analisadas em microscópio óptico em aumento de 1000 X, em teste cego
contando-se 1000 células/lâmina. Apenas foram consideradas para análise hemácias
nucleadas com membrana citoplasmática intacta (HOOFTMAN; DE RAAT, 1982).
4.9 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os dados obtidos nas variáveis de genotoxicidade e estresse oxidativo, foram
submetidos a teste de homogeneidade de Levene e de normalidade de Kolmogorov-Smirnov
para verificação dos pressupostos estatísticos. Posteriormente aplicou-se análise de variância
de duas vias (Two-way ANOVA), levando em consideração tempo, tratamento e a interação
entre eles. Quando observado diferenças significativas as médias foram comparadas por meio
do teste de Tukey e de Bonferroni. Avaliou-se a correlação entre as variáveis analisadas em
cada experimento por meio da análise de correlação de Pearson. Foi considerada uma
significância de % (P<0,05) para todas as análises. As análises estatísticas e a confecção dos
gráficos foram realizados com auxilio dos softwares estatísticos Statistical Analysis System
9.4 (SAS) e GraphPad Prism 7.0.
48
49
5 RESULTADOS
Para investigar a qualidade da água coletada no bairro Caravággio, localizado no
interior do município de Ponte Alta, SC, Brasil, e no Rio Caveiras, ponto Br-2 localizado em
Lages, SC, utilizamos uma abordagem ampla, com testes físico-químicos de qualidade de
água, durante aproximadamente dois anos, e utilização de biomarcadores de genotoxicidade
(ensaio cometa alcalino e teste do micronúcleo) e de estresse oxidativo (ensaio cometa
modificado, catalase e superóxido dismutase).
Nas análises prévias (Anexo C) observamos os resultados das análises de qualidade da
água realizadas em agosto e setembro de 2016. Onde observamos valores alterados de amônia
e fósforo na localidade de Caravágio, bem como a presença de coliformes fecais.
Foram realizados quatro bioensaios, de vinte e oito dias cada, utilizando o zebrafish
como modelo experimental, sendo dois com água subterrânea coletada no bairro Caravággio,
localizado no interior do município de Ponte Alta, SC, Brasil, desenvolvidos em agosto e
dezembro de 2017; e outros dois com água superficial coletada no Ponto Br-2 do Rio
Caveiras em Lages, SC, Brasil, realizados em outubro de 2017 e fevereiro/março de 2018.
5.1 PONTE ALTA – ÁGUA SUBTERRÂNEA
5.1.1 Análises de água
Os resultados de qualidade da água do interior de Ponte Alta (Tabela 2) foram
comparados com os índices propostos pela Portaria MS nº 2.914/2011 que dispõe sobre os
procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu
padrão de potabilidade, e mostraram um índice maior do que o permitido de manganês na
primeira coleta e de fósforo nas duas primeiras coletas.
50
Tabela 2 - Resultados das análises de água referentes à água subterrânea coletada no ponto
localizado no interior do município de Ponte Alta, SC, Brasil.
PARÂMETROS
Coleta
03/08/2017
Coleta
10/10/2017
Coleta
22/11/2017
Coleta
23/02/2018
MS
2914/11
pH
6,79
6,7
6,7
6,98
6 - 9,5
Temperatura da Água (°C) 15,2 22,1 22,4 29,2 -
Condutividade Elétrica (µS/cm) 87 78 70 91 -
Sólidos Totais Dissolvidos (mg/L) 41 37 34 43 ≤ 1000
Sólidos Totais (mg/L) 0,0082 0,01 - 0,0114 -
Dureza Total (mg/L de CaCO3) 46 148 100 60 ≤ 500
Alcalinidade Total (mg/L de
CaCO3)
70 26,86 23,7 30,6 -
DBO (DBO 5d, 20°C, mg/L de O2) 0 3 0 - -
Alumínio Total (mg/L de Al) 0 < 0,1 0,06 <0,1 ≤ 0,2
Cloreto Total (mg/L de Cl) 31,9 28,36 31,9 14,18 ≤ 250
Ferro Total (mg/L de Fe) 0,06 0,04 0,06 <0,05 ≤ 0,3
Fluoreto Total (mg/L de F) 0 0 0 <0,5 ≤ 1,4
Manganês Total (mg/L de Mn)
0,13 0,04 0,03 <0,05 ≤ 0,1
Nitrogênio Nitrato (mg/L de N) < 0,5 1,19 0 3,05 ≤ 10
Nitrogênio Nitrito (mg/L de N) 0 0 0 0 ≤ 1
Fósforo (mg/L de P) 0,2172 0,2364 - - 0,10
Sulfato Total (mg/L de SO4) 174 32 - 123 ≤ 250
Bactérias Heterotróficas (Contagem
Padrão)
0 0 - 0 Contagem
Coliformes Totais Ausência Ausência - Ausência Ausência
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
51
5.1.2 Superóxido dismutase
A atividade da enzima superóxido dismutase em músculos de zebrafish, não
demonstrou diferenças significativas entre os tratamentos e tempos avaliados no experimento
conduzido com água subterrânea coletada no interior do município de Ponte Alta em agosto
de 2017 (Figura 9). Os dados de dezembro não puderam ser analisados em função da pouca
amostra obtida.
Figura 9 - Atividade de SOD/mg de proteína encontrados em músculos de zebrafish expostos
à água de Ponte Alta coletada em agosto de 2017.
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
Na ANOVA de duas vias não houve efeito da interação “tratamento*tempo” (P = 0,2865), do tratamento (P =
0,1671), e efeito do tempo (P = 0,3743).
5.1.3 Catalase
Nos bioensaios realizados para quantificar a atividade da enzima catalase podemos
perceber que, no experimento conduzido em agosto de 2017 (Figura 10A), houveram
diferenças entre os grupos analisados nos dias sete e quatorze. A atividade de CAT no
tratamento controle diminuiu com o passar das semanas, apresentando o maior valor no dia
sete e o menor valor no dia vinte e oito, enquanto no grupo controle os valores aumentaram
durante o período experimental, apresentando o menor valor no dia sete e o maior valor no dia
vinte e oito. Os dados do dia 0 (basal) não puderam ser analisados em função da pouca
amostra obtida.
No experimento realizado em dezembro de 2017 (Figura 10B) não houveram
diferenças entre os tratamentos e entre os dias de avaliação para cada tratamento.
52
Figura 10 – Atividade de CAT/mg de proteína encontrados em músculos de zebrafish
expostos à água de Ponte Alta.
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
A: Água coletada em agosto de 2017 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada interação “tratamento*tempo”
(P < 0,0001), e também efeito isolado do tratamento (P = 0,0084), mas não houve efeito do tempo (P = 0,2414).
B: Água coletada em dezembro de 2017 = Pela ANOVA de duas vias não houve efeito da interação
“tratamento*tempo” (P = 0,4786), do tratamento (P = 0,4269), e efeito do tempo (P = 0,6278) Letras maiúsculas
diferentes indicam diferença entre os tratamentos no tempo específico pelo teste de Bonferroni. Letras
minúsculas diferentes indicam diferença entre os tempos no tratamento especifico pelo teste de Tukey.
5.1.4 Ensaio cometa
Para avaliação dos danos no material genético em eritrócitos de zebrafish expostos à
água coletada em Ponte Alta, SC, utilizou-se o parâmetro % de DNA na cauda dos cometas
(dado pelo software Comet Imager 2.2) (Figura 11). No experimento conduzido em agosto
(Figura 12A), o ensaio cometa padrão mostrou um aumento na frequência de danos nos
animais expostos em todas as semanas avaliadas, em relação ao grupo controle.
No experimento conduzido em dezembro de 2017 (Figura 12B) houve diferença
significativa entre os grupos em todos os dias avaliados. A volta dos animais para a água
controle no vigésimo segundo dia não teve efeito na diminuição de danos nos animais
expostos, em ambos os experimentos houve um aumento na frequência de danos no vigésimo
oitavo dia.
53
Figura 11 - Níveis de dano ao DNA encontrados em eritrócitos de zebrafish expostos à água
proveniente do Aquífero Guarani, dado pelo Software Comet Imager 2.2 da
Metasystem ®.
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
54
Figura 12 - Efeito genotóxico em eritrócitos de zebrafish expostos à água de Ponte Alta,
medido por ensaio cometa padrão.
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
A: Água coletada em agosto de 2017 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada interação “tratamento*tempo”
(P < 0,0001), e também efeito isolado do tratamento (P < 0,0001) e efeito do tempo (P < 0,0001). B: Água
coletada em dezembro de 2017 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada interação “tratamento*tempo” (P <
0,0001), e também efeito isolado do tratamento (P < 0,0001) e efeito do tempo (P < 0,0001). Letras maiúsculas
diferentes indicam diferença entre os tratamentos no tempo específico pelo teste de Tukey, letras minúsculas
diferentes indicam diferença entre os tempos no tratamento especifico pelo teste de Tukey.
Os níveis de purinas oxidadas nos eritrócitos de peixes expostos a água coletada em
agosto em Ponte Alta (Figura 13A), foram estatisticamente diferentes do controle a partir do
décimo quarto dia de experimento até o vigésimo oitavo dia. No experimento com água
coletada em dezembro de 2017 (Figura 13B) podemos observar o aumento significativo da
frequência de purinas oxidadas nos animais expostos no sétimo e décimo quarto dia de
experimentação.
55
Figura 13 - Níveis de oxidação de purinas encontrados em eritrócitos de zebrafish expostos à
água de Ponte Alta
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
A: Água coletada em agosto de 2017 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada interação “tratamento*tempo”
(P = 0,0159), e também efeito isolado do tratamento (P < 0,0001) e efeito do tempo (P < 0,0001). B: Água
coletada em dezembro de 2017 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada interação “tratamento*tempo” (P <
0,0001), e também efeito isolado do tratamento (P < 0,0001) e efeito do tempo (P = 0,0028). Letras maiúsculas
diferentes indicam diferença entre os tratamentos no tempo específico pelo teste de Tukey, letras minúsculas
diferentes indicam diferença entre os tempos no tratamento especifico pelo teste de Tukey.
Os níveis de pirimidinas oxidadas avaliadas pelo ensaio cometa modificado com a
enzima ENDO III, nos animais expostos a água coletada em dezembro (Figura 14), mostram
um aumento na frequência de danos oxidativos a pirimidinas nos dias sete e quatorze do
período experimental. No primeiro experimento, realizado em agosto de 2017 não realizamos
ensaios com a enzima endonluclease III.
Figura 14 - Níveis de oxidação de pirimidinas encontrados em eritrócitos de zebrafish
expostos à água Ponte Alta coletada em dezembro de 2017.
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
Pela ANOVA de duas vias Ffoi verificada interação “tratamento*tempo” (P < 0,0001), e também efeito isolado
do tratamento (P < 0,0001) e efeito do tempo (F4, 30 = 16,23; P < 0,0001). Letras maiúsculas diferentes indicam
diferença entre os tratamentos no tempo específico pelo teste de Tukey, letras minúsculas diferentes indicam
diferença entre os tempos no tratamento especifico pelo teste de Tukey.
56
5.1.5 Teste do micronúcleo
No teste do micronúcleo podemos perceber um aumento significativo na frequência
dos micronúcleos encontrados nos animais expostos a água coletada em Ponte Alta, nos dias
sete e quatorze no experimento com água coletada em agosto de 2017 (Figura 15A), e nos
dias sete a vinte e oito no experimento de dezembro de 2017 (Figura 15B).
Figura 15 - Frequência de micronúcleos encontrados em eritrócitos de zebrafish expostos á
água coletada em Ponte Alta, SC, Brasil.
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
A: Água coletada em agosto de 2017 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada interação “tratamento*tempo”
(P = 0,0130), e também efeito isolado do tratamento (P = 0,0001) e efeito do tempo (P = 0,0053). B: Água
coletada em dezembro de 2017 = Pela ANOVA de duas vias não foi verificada interação “tratamento*tempo” (P
= 0,1531), houve efeito isolado do tratamento (P = 0,0001) e não houve efeito isolado do tempo (P = 0,0704)..
Letras maiúsculas diferentes a indicam diferença entre os tratamentos no tempo específico pelo teste de
Bonferroni, letras minúsculas diferentes indicam diferença entre os tempos no tratamento especifico pelo teste de
Tukey.
5.1.6 TBARS
Nas análises realizadas para avaliar o índice de Peroxidação lipídica (Figura 16) em
músculos de zebrafish expostos a água de Ponte Alta, não foram observadas diferenças
significativas entre os grupos analisados.
57
Figura 16 - Nmol de MDA/mg de proteína em músculos de zebrafish exposto a água coletada
em Ponte Alta em agosto e dezembro de 2017.
Fonte: elaborado pela autora, 2018.
Pela ANOVA de duas vias não foi observado efeito da interação “tratamento*tempo” (P = 0,1542), e também
não houve efeito isolado do tratamento (P = 0,0854) e não houve efeito do tempo (P = 0,2436).
5.1.7 Análises de correlação
Realizamos análises de correlação para avaliar os dados obtidos nos experimentos
realizados com zebrafish. Na Tabela 3 podemos observar a correlação entre os dados do
primeiro experimento, conduzido com água subterrânea proveniente de Ponte Alta.
Observamos correlação positiva entre os dados do ensaio cometa alcalino e o teste do
micronúcleo, além de uma correlação negativa entre a enzima catalase e o teste do
micronúcleo.
Tabela 3- Correlação de Pearson. Experimento realizado com água coletada em Ponte Alta,
SC, Brasil em agosto de 2017.
Tratamentos EC FPG CAT Micro
EC -
FPG 0,14NS
-
CAT -0,13NS
-0,27NS
-
Micro 0,62* 0,26
NS -0,59
* -
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
EC: Ensaio cometa padrão; FPG: Ensaio cometa modificado com enzima FPG; CAT: catalase; Micro: teste do
micronúcleo. NS
Não significativo; *P<0,05;
**P<0,01;
***P<0,001
Na Tabela 4 observamos os resultados do experimento realizado com água subterrânea
coletada em Ponte Alta em dezembro de 2017, houve uma correlação positiva entre o ensaio
cometa padrão e o ensaio cometa modificado com as enzimas ENDO e FPG, além do teste do
58
micronúcleo, já a enzima catalase novamente mostrou uma correlação negativa com o ensaio
cometa alcalino e com a FPG. A enzima ENDO correlacionou-se positivamente com a FPG, e
com os resultados do micronúcleo. Os resultados do ensaio cometa modificado com a enzima
FPG também tiveram correlação positiva com os resultados do micronúcleo.
Tabela 4 - Correlação de Pearson Experimento realizado com água coletada em Ponte Alta,
SC, Brasil em dezembro de 2017.
Tratamentos EC Endo FPG CAT Micro
EC -
ENDO 0,45* -
FPG 0,65***
0,58**
-
CAT -0,34* -0,25
NS -0,44
* -
Micro 0,33* 0,41
* 0,41
* -0,06
NS -
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
EC: Ensaio cometa padrão; FPG: Ensaio cometa modificado com enzima FPG; CAT: catalase; Micro: teste do
micronúcleo. NS
Não significativo; *P<0,05;
**P<0,01;
***P<0,001
5.2 RIO CAVEIRAS – ÁGUA SUPERFICIAL
5.2.1 Análises de água – Rio Caveiras
Os resultados das análises físico-químicas de qualidade de água do Rio Caveiras
(Tabela 3) foram comparados com a resolução do CONAMA (2005), que dispõe sobre a
classificação dos corpos de água e diretrizes ambientais para o seu enquadramento, bem como
estabelece as condições e padrões de lançamento de efluentes, e dá outras providências.
Nossas análises evidenciaram uma concentração maior do que a permitida na portaria de ferro
e manganês nas duas coletas analisadas.
59
Tabela 5- Resultados das análises de água referentes ao ponto de coleta Ponto BR - 2,
localizado no Rio Caveiras, em Lages, SC, Brasil.
PARÂMETROS Coleta 1
(10/10/2017) Coleta 2
(23/02/2018) CONAMA
357/05
pH 7 7,34 6 - 9
Temperatura da Água (°C) 20,1 25 -
Temperatura do Ar (°C) 21,5 23,2 -
Condutividade Elétrica (µS/cm) 92 112 -
Sólidos Totais Dissolvidos (mg/L) 44 50 ≤ 500
Sólidos Totais (mg/L) 0,0116 0,0168 -
Dureza Total (mg/L de CaCO3) 0 45 -
Alcalinidade Total (mg/L de CaCO3) 17,38 24,04 -
DBO (DBO 5d, 20°C, mg/L de O2) 4 - ≤ 5
Alumínio Total (mg/L de Al) < 0,1 <0,1 ≤ 0,1
Cloreto Total (mg/L de Cl) 35,45 24,81 ≤ 250
Ferro Total (mg/L de Fe) 0,73 0,68 ≤ 0,3
Manganês Total (mg/L de Mn) 0,14 0,23
≤ 0,1
Fluoreto Total (mg/L de F) 0 0 ≤ 1,4
Nitrogênio Nitrato (mg/L de N) 5,62 3,15 ≤ 10
Nitrogênio Nitrito (mg/L de N) 0,37 <0,5 ≤ 1
Bactérias Heterotróficas (Contagem Padrão) 153 258 Contagem
Coliformes Totais Presença Presença Ausência
Fonte: elaborado pela autora, 2018.
60
5.2.2 Superóxido dismutase
A atividade da enzima superóxido dismutase, não demonstraram diferença
significativa entre os grupos estudados no experimento conduzido com água superficial
coletada no Rio Caveiras em fevereiro de 2017 (Figura 17). Os dados de outubro não puderam
ser analisados.
Figura 17 - Atividade de SOD/mg de proteína encontrados em zebrafish expostos à água do
Rio Caveiras coletada em fevereiro de 2018.
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
Pela ANOVA de duas vias não houve efeito da interação “tratamento*tempo” (P = 0,3937), do tratamento (P =
0,2343), e efeito do tempo (P = 0,4181).
5.2.3 Catalase
Nos experimentos em que medimos a atividade de catalase nos animais expostos à
água do rio Caveiras vimos que no experimento de outubro de 2017 (Figura 18A) não houve
diferença estatística entre os tratamentos nem entre os dias avaliados, mas observamos um
aumento gradual na atividade de CAT dos animais do grupo exposto a partir do sétimo dia até
o vigésimo primeiro dia. Os dados do vigésimo oitavo dia não são mostrados em função da
pouca amostra obtida.
No experimento conduzido em fevereiro de 2018 (Figura 18B) houve um aumento dos
níveis de CAT no sétimo dia de experimento, seguido de uma gradual diminuição nos dias
seguintes, porém não houve diferença estatística entre os tratamentos.
61
Figura 18 - Atividade de CAT/mg de proteína encontrados em zebrafish expostos à água do
Rio Caveiras.
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
A: Água coletada em Outubro de 2017 = Pela ANOVA de duas vias não foi verificada interação
“tratamento*tempo” (P = 0,3019), houve efeito isolado do tratamento (P = 0,0161), mas não houve efeito do
tempo (P = 0,5535). B: Água coletada em Fevereiro de 2018 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada
interação “tratamento*tempo” (P = 0,0405), não houve efeito isolado do tratamento (P = 0,6876), e houve efeito
isolado do tempo (P < 0,0001) Letras maiúsculas diferentes indicam diferença entre os tratamentos no tempo
específico pelo teste de Bonferroni. Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre os tempos no
tratamento especifico pelo teste de Tukey.
5.2.4 Ensaio cometa
No primeiro experimento realizado com água coletada no Ponto Br-2 no rio Caveiras
em outubro de 2017 podemos observar o dano genotóxico medido pelo ensaio cometa padrão.
Devido a falhas experimentais os dados do vigésimo oitavo dia não puderam ser avaliados.
Houve aumento significativo do percentual de DNA entre os animais e o controle apenas no
décimo quarto dia de avaliação (Figura 19A).
No experimento realizado em fevereiro de 2018 (Figura 19B) houve diferença
significativa entre os peixes mantidos na água do Rio Caveiras em relação aos peixes
mantidos na água do tratamento controle a partir do décimo quarto dia de avaliação. A troca
dos animais pra água controle no vigésimo segundo dia não tem efeito em diminuir os danos
causados ao material genético.
62
Figura 19 - Efeito genotóxico da exposição de zebrafish à água do Rio Caveiras medido por
ensaio cometa padrão.
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
A: Água coletada em Outubro de 2017 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada interação “tratamento*tempo”
(P = 0,0195), houve efeito isolado do tratamento (P < 0,0001), mas não houve efeito do tempo (P = 0,8286). B:
Água coletada em Fevereiro de 2018 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada interação “tratamento*tempo”
(P < 0,0001), houve efeito isolado do tratamento (P < 0,0001), e houve efeito isolado do tempo (P = 0,0002)
Letras maiúsculas diferentes indicam diferença entre os tratamentos no tempo específico pelo teste de Tukey.
Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre os tempos no tratamento especifico pelo teste de Tukey.
Os níveis de purinas oxidadas, medidos pelo ensaio cometa modificado com a enzima
FPG, nos peixes expostos a água do rio Caveiras coletada em outubro de 2017 (Figura 20A),
foram diferentes (P<0,05) do dos peixes do tratamento controle no vigésimo primeiro dia de
exposição. O percentual de DNA tanto no tratamento controle, quanto no tratamento do rio
Caveiras foi maior (P<0,05) dos sete aos 21 dias, em relação ao dia 0. No experimento com
água coletada em fevereiro de 2018 (Figura 20B) podemos observar diferença na frequência
de purinas oxidadas encontradas nos animais expostos no vigésimo oitavo dia, em relação ao
grupo controle. Os maiores % de DNA na cauda no tratamento controle foram observados do
dia sete ao 21, enquanto no tratamento do Rio Caveiras, do dia sete ao 28.
63
Figura 20 - Níveis de purinas oxidadas encontrados em eritrócitos de zebrafish expostos à
água do Rio Caveiras.
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
A: Água coletada em Outubro de 2017 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada interação “tratamento*tempo”
(P = 0,0011), houve efeito isolado do tratamento (P < 0,0001), e houve efeito isolado do tempo (P = 0,0023). B:
Água coletada em Fevereiro de 2018 = Pela ANOVA de duas vias não foi verificada interação
“tratamento*tempo” (P = 0,0544), houve efeito isolado do tratamento (P < 0,0001), e houve efeito isolado do
tempo (P = 0,0004) Letras maiúsculas diferentes indicam diferença entre os tratamentos no tempo específico
pelo teste de Tukey. Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre os tempos no tratamento especifico
pelo teste de Tukey.
Os níveis de pirimidinas oxidadas avaliados pelo ensaio cometa modificado com a
enzima ENDO III, nos animais expostos a água do rio Caveiras coletada em outubro de 2017
(Figura 21A), mostram um aumento na frequência de danos oxidativos a pirimidinas nos dias
sete e vinte e um do período experimental, no décimo quarto dia não há diferença entre
tratamentos, porém não houve diferença estatística. O percentual de DNA da cauda foi maior
dentro do tratamento controle apenas no dia 14 e 21, e no tratamento do Rio Caveiras do dia
sete ao dia vinte e um em relação ao dia zero.
No experimento conduzido em fevereiro de 2018 (Figura 21B), houve um aumento na
frequência de pirimidinas oxidadas no vigésimo primeiro dia do período experimental entre os
peixes do rio Caveiras e o tratamento controle.
64
Figura 21 - Níveis de oxidação de pirimidinas encontrados em eritrócitos de zebrafish
expostos à água do Rio Caveiras.
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
A: Água coletada em Outubro de 2017 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada interação “tratamento*tempo”
(P = 0,0018), houve efeito isolado do tratamento (P < 0,0001), e houve efeito isolado do tempo (P = 0,0171). B:
Água coletada em Fevereiro de 2018 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada interação “tratamento*tempo”
(P < 0,0001), houve efeito isolado do tratamento (P < 0,0001), e houve efeito isolado do tempo (P < 0,0001)
Letras maiúsculas diferentes indicam diferença entre os tratamentos no tempo específico pelo teste de Tukey.
Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre os tempos no tratamento especifico pelo teste de Tukey.
5.2.5 Teste do micronúcleo
Nas análises realizadas com a água do Rio Caveiras podemos observar um aumento
não significativo nas frequências de micronúcleos nos animais expostos nos dias sete,
quatorze e vinte e um, e uma diminuição a partir do vigésimo segundo dia no experimento
realizado em outubro de 2017 (Figura 22A). No experimento conduzido em fevereiro de 2018
(Figura 22B) observamos diferença significativa na frequência dos micronúcleos em animais
expostos nos dias sete e vinte e um, em relação ao tratamento controle. Não houve diferença
entre os dias dentro do tratamento controle, enquanto no tratamento do Rio Caveiras foi maior
no dia 21, não diferindo do dia sete e do dia 14.
65
Figura 22 - Frequência de micronúcleos encontradas em eritrócitos de zebrafish expostos á
água coletada no Ponto Br-2 do Rio Caveiras em Lages, SC, Brasil.
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
A: Água coletada em Outubro de 2017 = Pela ANOVA de duas vias não foi verificada interação
“tratamento*tempo” (P = 0,2258), houve efeito isolado do tratamento (P = 0,0043), e não houve efeito isolado
do tempo (P = 0,0929). B: Água coletada em Fevereiro de 2018 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada
interação “tratamento*tempo” (P = 0,0142), houve efeito isolado do tratamento (P = 0,0012), e não houve efeito
isolado do tempo (P = 0,0748) Letras maiúsculas diferentes indicam diferença entre os tratamentos no tempo
específico pelo teste de Bonferroni. Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre os tempos no
tratamento especifico pelo teste de Tukey.
Figura 23 - Lâmina de eritrócitos de Danio rerio, a seta indicando célula com micronúcleo.
Fonte: Elaborado pela autora. 2018.
66
5.2.6 TBARS
Nas análises realizadas para avaliar o índice de Peroxidação lipídica em músculos de
zebrafish (Figura 24), não foram observadas diferenças significativas entre os grupos
analisados.
Figura 24 - Nmol de MDA/mg de proteína em músculos de zebrafish expostos a água
coletada em Ponte Alta em outubro de 2017 e fevereiro de 2018.
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
Pela ANOVA de duas vias não foi observado efeito da interação “tratamento*tempo” (P = 0,5753), e também
não houve efeito isolado do tratamento (P = 0,3772) e não houve efeito do tempo (P = 0,3851).
5.2.7 Análises de correlação
Na Tabela 6 temos o resultado das correlações realizadas com os dados do
experimento realizado com água do Rio Caveiras, coletada em outubro de 2017, observamos
correlação entre os dados do ensaio cometa alcalino e o teste do micronúcleo. O ensaio
cometa modificado com a enzima endo correlacionou-se positivamente com o mesmo ensaio,
conduzido com a enzima FPG. O micronúcleo se correlacionou positivamente com todos os
ensaios.
67
Tabela 6 - Correlação de Pearson. Experimento realizado com água coletada no Rio
Caveiras, em Lages, SC, Brasil em outubro de 2017.
Tratamentos EC Endo FPG CAT Micro
EC -
ENDO 0,34NS
-
FPG 0,24NS
0,72***
-
CAT 0,18NS
0,11NS
0,15NS
-
Micro 0,39* 0,39
* 0,52
* 0,41
* -
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
EC: Ensaio cometa padrão; FPG: Ensaio cometa modificado com enzima FPG; CAT: catalase; Micro: teste do
micronúcleo . NS
Não significativo; *P<0,05;
**P<0,01;
***P<0,001
Na Tabela 7 observamos as análises de correlação do experimento conduzido com
água coletada no Rio Caveiras em fevereiro de 2018. Observamos correlação positiva entre o
ensaio cometa alcalino e o teste do micronúcleo. O EC modificado com a enzima ENDO
também correlacionou-se positivamente com o EC modificado com a enzima FPG, e com o
teste do micronúcleo.
Tabela 7 - Correlação de Pearson. Experimento realizado com água coletada no Rio
Caveiras, em Lages, SC, Brasil em fevereiro de 2018.
Tratamentos EC Endo FPG CAT Micro
EC -
ENDO 0,31* -
FPG 0,19NS
0,45* -
CAT 0,15NS
0,29NS
0,26NS
-
Micro 0,26NS
0,54**
0,22NS
0,02NS
-
Fonte: Elaborado pela autora, 2018. EC: Ensaio cometa padrão; FPG: Ensaio cometa modificado com enzima
FPG; CAT: catalase; Micro: teste do micronúcleo . NS
Não significativo; *P<0,05;
**P<0,01;
***P<0,001
68
69
6. DISCUSSÃO
6.1 PONTE ALTA – ÁGUA SUBTERRÂNEA
Nas coletas de água realizadas em Ponte Alta, podemos observar um valor maior do
que o permitido pela portaria MS 2914/11 de manganês na primeira coleta e de fósforo nas
duas primeiras coletas (Tabela 2). De acordo com Omar et al. (2012), metais, como o
manganês, são contaminantes ambientais estáveis e persistentes, causando um forte impacto
na estabilidade dos ecossistemas. O contato com metais, seja por meio da ingestão da água ou
de organismos aquáticos contaminados, pode causar danos permanentes ao ser humano,
disfunções no sistema nervoso e até mesmo câncer (LIU et al., 2008).
O aumento de fósforo possivelmente está relacionado com a falta de esgotamento
sanitário, uso de agrotóxicos e fertilizantes, que é intenso na região, geralmente o aumento de
fósforo nos recursos hídricos tem como principal causa à urbanização, seguida pelo uso
agrícola do solo.
Apesar de, na água analisada, a maioria dos metais estarem dentro do limite
estabelecido pela legislação (Anexo B), podem ocorrer interações entre os componentes
químicos e poluentes presentes na água tornando, por sinergismo, a mistura mais tóxica do
que cada um dos elementos avaliados separadamente. De fato, estudos comparando a
exposição a um único pesticida com mistura de pesticidas mostraram que misturas de
pesticidas causam efeitos sinérgicos ou efeitos de aditivos parciais (BRODEUR et al., 2014).
As enzimas superóxido dismutase e catalase são dois componentes importantes do
sistema de defesa antioxidante que eliminam ânions superóxido e o peróxido de hidrogênio
para proteger o organismo de danos oxidativos (KÖPRÜCÜ; YONAR; ŞEKER, 2010). No
ensaio para quantificar a enzima catalase (Figura10), observamos uma diminuição nos níveis
de CAT em relação ao grupo controle nos dias sete e quatorze do período experimental,
segundo Liu et al. (2015), a inibição da atividade da catalase confirma elevado grau de
contaminação da água. Além disso, vários outros estudos relatam a diminuição dos níveis de
CAT em peixes expostos a água contendo agrotóxicos ou metais (McRAE; GAW; GLOVER,
2018; NUNES et al., 2018). Após quinze dias a CAT permaneceu estável uma possível razão
é que o zebrafish tenha desenvolvido tolerância aos contaminantes, o que causou o
nivelamento da atividade enzimática após esse período.
O ensaio cometa é um método de quantificação de danos no DNA bem validado que
pode ser usado com confiabilidade elevada na avaliação de alguns organismos expostos a
70
efluentes (GRAZEFFE et al., 2008). Exposições a agentes genotóxicos, presentes no meio
aquático, podem levar a perda da integridade do DNA (ROJAS et al., 1999). Nos resultados
do ensaio cometa padrão dos experimentos realizados em agosto e dezembro (Figura 12),
podemos observar um aumento significativo no percentual de DNA na cauda dos cometas nos
peixes expostos á água de Ponte Alta ao longo do período experimental, o que indica que a
água coletada tem potencial de causar danos genotóxicos em zebrafish. Estudos relatam um
aumento na quebra de DNA em peixes expostos a diferentes concentrações de metais, como
por exemplo, cádmio e alumínio (PEREIRA et al., 2013), cobre e zinco (OMAR et al., 2012),
cromo, chumbo e níquel (MORAIS et al., 2016). Além disso, o manganês que foi encontrado
em níveis acima dos permitidos para água de consumo humano, já foi comprovado ter
potencial genotóxico e de alterações nos níveis de enzimas do estresse oxidativo em vários
estudos com peixes (LOUISE et al., 2017; OMAR et al., 2012).
A avaliação da recuperação de animais após exposição a efluentes é fundamental para
saber o grau de dano sofrido no organismo e suas consequências. Quando a recuperação é
mais rápida indica danos leves ocorridos e que o organismo foi capaz de se defender como
descrito por Amado et al. (2006). No entanto quando há lentidão na recuperação indica que
esse organismo foi seriamente afetado, podendo ter atingido não apenas os níveis mais baixos
da organização biológica (molecular e bioquímico), mas também os níveis fisiológicos e
morfológicos. Não houve diminuição dos danos com a volta dos animais pra água controle do
vigésimo segundo dia em nenhum dos experimentos (Figura 12), houve, inclusive, um
aumento significativo no % de DNA na cauda dos cometas do experimento de agosto, o que
pode ter relação com o estresse envolvido na troca dos animais de uma água para outra
(apesar de ter havido aclimatação dos peixes por duas horas antes da troca), e que os danos
causados pela exposição dos peixes a água testada, foram demasiados, afetando a capacidade
de reparo dos animais expostos.
As altas frequências de dano ao DNA observados são esperadas, tendo em vista a
baixa qualidade hidrológica observada. Muitos poluentes aumentam o dano ao DNA
formando espécies reativas de oxigênio, mais precisamente, pela oxidação de bases de DNA.
Usando o ensaio cometa modificado por FPG, o dano ao DNA causado pelo estresse
oxidativo pode ser detectado (COLLINS, 2004). Nos ensaio cometa modificado com a enzima
FPG (Figura 13), podemos observar uma diferença em relação ao grupo controle no décimo
quarto, e no vigésimo primeiro dia de exposição no experimento de agosto. No experimento
realizado em dezembro observamos um aumento significativo de 8-oxoG no sétimo e decimo
71
quarto dias de exposição. Sabe-se que as bases oxidadas, como a 8-oxoG, são potencialmente
mutagênicas, através de uma alteração nas propriedades de baseamento (8-oxoG tende a
emparelhar com a adenina). No que se refere ao ensaio cometa modificado com a enzima
ENDO III (Figura 14), observamos um aumento significativo nos dias sete e quatorze do
período experimental.
A frequência de micronúcleos vem sendo utilizada como indicação rápida e sensível
tanto de aberrações devido a quebras, como perdas que levam a anormalidades
cromossômicas numéricas (MOREIRA et al., 2010). As frequências basais de MN em
diferentes espécies de peixes variam de 0 a 1% (BOLOGNESI; HAYASHI, 2011). Segundo
Thellmann et al. (2017) uma frequência alta de MN pode ser um indicador de substâncias com
efeitos genotóxicos. Pois os danos causados as estruturas cromossômicas estão relacionadas à
exposição do DNA diretamente com o agente mutagênico, ou devido a defeitos intracelulares
durante a replicação, recombinação ou mecanismo de reparo do DNA. Entre as substâncias
capazes de induzir à formação de micronúcleos estão os agrotóxicos que compõem um grande
grupo de produtos químicos mutagênicos (GHISI, 2012). Nos bioensaios utilizando o teste do
micronúcleo (Figura 15), observamos um aumento significativo na frequência de
micronúcleos encontrados nas lâminas dos animais expostos nos dias sete e quatorze do
experimento realizado em agosto e no experimento de dezembro houve um amento em todos
os dias do período experimental (14, 21 e 28), exceto no basal (dia 0) e no dia sete, entretanto
em nenhum grupo analisado a frequência de MN encontrada foi maior que 1%.
Quanto à diminuição da frequência de células micronucleadas no grupo exposto a
partir do décimo quarto dia, acredita-se que esse fator esteja relacionado com a renovação dos
eritrócitos. As células sanguíneas são continuamente renovadas, e eritrócitos danificados
tendem a ser eliminados do organismo mais rapidamente do que aqueles que não estão
danificados (FLORA et al., 1993).
A peroxidação lipídica é o mecanismo mais importante envolvido em toxicidade
induzida por poluentes (NWANI et al., 2010). O aumento dos níveis de LPO (Figura 16) é
esperado, em função dos outros parâmetros analisados, porém em não houve diferenças
significativas ao longo do período experimental.
6.2 RIO CAVEIRAS – ÁGUA SUPERFICIAL
Observamos níveis alterados de ferro e manganês nas coletas realizadas no Rio
Caveiras (Tabela 6), a presença de metais nas águas devido a ações naturais ou antrópicas
72
(OLIVA et al., 2012) pode representar uma fonte significativa de contaminação ambiental e
humana, uma vez que os metais são potencialmente genotóxicos e carcinogênicos.
Concentrações de metais podem ser bioacumuláveis e biofragmentadas, levando a danos
oxidativos aos organismos expostos, resultando em mutagenicidade ambiental e ocorrência de
diversas doenças degenerativas, como o câncer (WASI; TABREZ; AHMAD, 2013; TABREZ
et al., 2014).
A citotoxicidade em sistemas animais e vegetais pode ser diretamente relacionada às
concentrações de ferro. Este metal pode ter origem em diferentes fontes, incluindo erosão
natural de rochas contendo minério de ferro, ações antrópicas como mineração, fundição,
soldagem, polimento de metais e mistura de combustíveis, ou por fertilizantes usados em
agricultura (SHARMA et al., 2000), bem como efluentes municipais e industriais de esgoto
(KLAUCK; RODRIGUES; SILVA, 2013). Os peixes absorvem ferro da água pelas brânquias
ou pela absorção de alimentos (BURY; WALKER; GLOVER, 2003), e esse metal é essencial
em muitos processos vitais. No entanto, devido à sua capacidade de sofrer redução e
oxidação, pode gerar espécies reativas de oxigênio (LUSHCHAK, 2011).
Normalmente, metais estão presentes em pequenas quantidades em ambientes
aquáticos, mas podem ser descartados em quantidades significativas por atividades humanas,
incluindo esgoto urbano, atividades industriais, agrícolas e de mineração (MARCON et al.,
2010; MANZANO et al., 2015). A alta incidência de metais está relacionada aos mecanismos
de formação de radical superóxido, radical hidroxila e, eventualmente, à produção de adutos
mutagênicos (JOMOVA; VALKO, 2011).
Oliveira, Rech e Klock (2012) caracterizaram a qualidade das águas no Rio Caveiras
em áreas de afloramento do Aquífero Guarani no município de Lages/SC, através de análises
físico-químicas e microbiológicas. Segundo os autores a área do ponto “Ponte BR-2”,
encontra-se em desacordo com a Resolução CONAMA 357/05 para águas doces, sendo
classificado como classe 4, segundo a mesma resolução, em uma escala de 0 a 4, onde 4 é o
mais deteriorado. Dentre outras evidências, o Rio apresentou neste mesmo ponto, baixa
oxigenação, nitrito acima dos valores toleráveis, valores alterados para demanda bioquímica
de oxigênio (DBO) e análises microbiológicas de coliformes totais e termotolerantes,
bastantes elevados. Nosso estudo não revelou valores alterados de nitrito nem baixa
oxigenação, mas pode-se observar nas análises microbiológicas valores alterados de
coliformes totais e contagem alta de coliformes. Os desacordos em relação às análises de água
realizadas em 2012 e 2017/2018 podem ter inúmeros fatores envolvidos, a forma e local de
73
coleta, os índices pluviométricos, a temperatura na hora da coleta, entre outros. Contudo,
apesar de ter sido observada uma diminuição do número de parâmetros que apresentaram
níveis acima do que a regulamentação permite, ainda assim, o ponto de coleta apresenta
valores acima do permitido em alguns parâmetros, demonstrando a baixa qualidade de água
do local.
Em um estudo realizado por Lopes et al. (2017) observou-se altos teores alumínio (Al)
em amostras de água do Rio Caveiras, e aponta que esse acréscimo pode estar associado ao
esgoto doméstico, uma vez que o Rio Caveiras recebe despejos químicos e orgânicos
provenientes da urbanização do município de Lages por meio do seu afluente, o Rio Carahá.
Durante as cheias do Rio Caveiras, pode haver o aumento de Al (SANTOS et al., 2013).
Segundo Mazzolli e Ehrhardt-Brocardo (2013) em seu estudo sobre a ocupação
irregular em áreas de recarga do aquífero Guarani e vegetação ripária em Lages-SC observou-
se que parte da Área de Preservação Permanente das nascentes do Rio Carahá encontra-se
ocupada por casas que lançam seus efluentes diretamente nos corpos d’água.
Observamos nas coletas realizadas no Rio Caveiras um aumento da condutividade
elétrica que é um sinal da presença de materiais dissolvidos. Segundo a Empresa de
Tecnologia de Saneamento Ambiental - CETESB (2005), valores de condutividade elétrica
superiores a 100 µS/cm têm impacto negativo nos ambientes.
Aguiar et al. (2016) revelaram em seu estudo que mesmo as concentrações de metais
apresentando-se abaixo dos limites permitidos pela legislação brasileira, elas podem ser a
causa do potencial mutagênico observado em vários estudos. Demostrando a importância de
analises toxicogenéticas para avaliar a qualidade de ambientes aquáticos, uma vez que nas
análises realizadas as amostras de água dos dois pontos coletados, mesmo a maioria dos
parâmetros apresentando níveis abaixo do preconizado pela legislação, resultaram em danos
significativos sobre o DNA.
Os níveis de SOD avaliados em fevereiro de 2018 (Figura 17) não diferiram no grupo
exposto, porém observamos um aumento nos níveis de SOD em relação ao grupo controle nos
dias sete e quatorze do período experimental. A superóxido dismutase já demonstrou em
vários estudos, ser excelente biomarcadora do estresse oxidativo. Company et al. (2004)
observaram, em brânquias de mexilhões Bathymodiolus azoricus expostos ao cádmio,
mercúrio e cobre inibição na atividade da superóxido dismutase. Letendre et al. (2008),
utilizaram a superóxido dismutase como medidor do estresse oxidativo causado pelo ciclo de
maré na espécie de molusco Mytilus edulis, os quais foram divididos em grupos e submetidos
74
a regiões marinhas profundas e superficiais. O resultado foi o aumento na atividade
enzimática naqueles grupos alocados em ambiente mais profundo.
Não houve diferença estatística entre os tratamentos nos ensaios avaliando a atividade
da catalase em zebrafish expostos a água do Rio Caveiras coletada em outubro e fevereiro de
2018 (Figura 18), porém observou-se uma tendência de aumento nos níveis de catalase no
grupo exposto nos dias sete, quatorze vinte e um do período experimental. Atli e Canli (2007)
utilizaram O. niloticus para exposição a concentrações de cádmio e chumbo, e o resultado foi
o aumento da atividade da catalase.
Observou-se um aumento no percentual de dano ao DNA alisado pelo ensaio cometa
padrão nos dois experimentos realizados (Figura 19). Sendo que no experimento realizado em
outubro o décimo quarto dia apresentou o maior percentual de dano, e no experimento
conduzido em fevereiro de 2017 o maior dano foi observado no vigésimo oitavo dia. Esse
aumento na frequência de danos é esperado, pois a água analisada apresenta baixa qualidade
hidrológica e contaminação por ferro e manganês.
Outra potencial causa para o aumento no percentual de dano ao DNA nos animais
expostos à água coletada são os agrotóxicos, que possivelmente estão presentes na água
analisada. De acordo com a Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extenção (EPAGRI), no ano
de 2005 foram utilizados 2.187.500.000 g/ha de fertilizantes na cidade de Lages, e cerca de 5
Kg/ha de agrotóxicos, no mesmo ano.
O ensaio cometa foi empregado para detectar o dano ao DNA ocorrido recentemente,
este método é o mais comumente usado para avaliar a genotoxicidade relacionada à poluição
em organismos aquáticos (DIXON et al., 2002). Introduzimos o teste de cometa modificado
com FPG que detecta adicionalmente o dano ao DNA causado pelo estresse oxidativo em
amostras, pois o estresse oxidativo é identificado como o principal fator que causa dano ao
DNA na maioria dos estudos que lidam com ambientes aquáticos. Geralmente, o modo de
ação das substâncias poluidoras no ambiente é baseado na geração de espécies reativas de
oxigênio (MITCHELMORE et al., 1998). Nos ensaios realizados para quantificar ídices de
purinas e pirimidinas oxidadas, (Figuras 20 e 21) observamos aumentos na frequência de
purinas oxidadas no dia 21 do período experimental e nas pirimidinas oxidadas no vigésimo
oitavo dia.
Enquanto o teste MN detecta danos não reparáveis, como lesões clastogênicas e
aneugênicas, o ensaio cometa detecta lesões recentes que podem ser reparadas, como quebras
e locais álcali-lábeis (SILVA et al., 2002; MATSUMOTO et al., 2006; VILLELA et al.,
75
2007). Segundo Al-Sabti e Metcalfe (1995) a máxima indução de micronúcleos normalmente
ocorre de um a cinco dias de exposição, concordando com os resultados de Grisolia e
Cordeiro (2000), que observaram que a maior indução de micronúcleos ocorreu entre dois e
sete dias pós-tratamento. Segundo resultados observados por estes mesmos autores, há uma
tendência à diminuição da frequência de micronúcleos a partir do décimo quarto dia de
exposição a substâncias tóxicas. Diante disso, apesar do teste do MN ser reportado como um
biomarcador de genotoxicidade em peixes, alguns estudos de exposição crônica ou sub-
crônica a poluentes, demonstraram que a frequência de eritrócitos micronucleados tende a
diminuir após 15º ou 21º dia de exposição (ÇAVAS; ERGENE-GÖZÜKARA, 2005;
VANZELLA; MARTINEZ; CÓLUS, 2007).
No presente trabalho, as maiores frequências de micronúcleos foram observadas nos
dias sete, quatorze e vinte e um do período experimental, em ambos experimentos realizados
com a água do Rio Caveiras (Figuras 22). Isso demonstra que este período, nas condições em
que ocorreu o experimento, foi o mais adequado para a avaliação de mutação em D. rerio,
provavelmente devido ao fato de que até este intervalo de tempo, as lesões celulares que
ocorreram no núcleo não foram reparadas acuradamente antes de se iniciar o processo de
divisão celular, e dessa forma foram perpetuados para as células filhas, os danos
(micronúcleo) induzidos nas células parentais. A análise de MN como um índice de dano
genético acumulado durante a vida útil das células é uma das técnicas mais apropriadas para
identificar a resposta integrada ou sinergética decorrente da complexa mistura de
componentes encontrada nos rios (BOLOGNESI; HAYASHI, 2011).
6.3 ANÁLISES DE CORRELAÇÃO
Para a comparação dos dados usou-se teste de correlação entre todos os ensaios
realizados, uma correlação significativa foi observada (Tabelas 4, 5, 7 e 8) em relação aos
dados do ensaio cometa alcalino, com os dados do teste do micronúcleo, fato que enfatiza a
força e a plausibilidade dos conjuntos de dados individuais. Em estudos anteriores,
correlações entre EC e MN (em diferentes níveis de organização biológica) foram
comprovadas (ROCHA et al., 2009; SEITZ et al. 2008; BOETTCHER et al., 2010).
No entanto, apesar da comparabilidade de ambos os ensaios, as diferenças observadas
podem indicar diferenças nos tipos de dano ao DNA, potencial diferente para o reparo do
DNA ou impacto de diferentes poluentes. Por exemplo, danos no DNA que podem ser
revelados pelo ensaio do cometa podem potencialmente ser reparados por mecanismos de
76
reparo intracelular do DNA. Por outro lado, os eritrócitos periféricos subjacentes à ausência
de divisão celular e danos permanentes ao DNA observados no MN - incluindo fragmentos de
quebras duplas não reparadas, quebras no nível das cromátides e danos no aparato do fuso
(efeitos aneugênicos) - não podem ser reparados após sua fixação em fragmentos
extracromossômicos (BÜCKER; CONCEIÇÃO, 2012).
Nas análises do Rio Caveiras não observamos correlação entre o ensaio cometa padrão
e a frequência da 8-oxoG, podemos especular que o estresse oxidativo não é o único ou
principal contribuinte do potencial genotóxico detectado, resultado semelhante ao encontrado
por Kolarević et al. (2016), que também utilizou ambos ensaios cometa padrão e modificado
com FPG para avaliar o potencial genotóxico de amostras de água coletadas no Rio Sara, no
sudoeste da Europa, e não encontrou correlação entre o ensaio cometa padrão e o ensaio
modificado com FPG.
Em todos os experimentos o ensaio cometa enzimático com a enzima FPG
correlacionou-se positivamente a enzima ENDO III, mostrando que as lesões ao material
genético causado por estresse oxidativo atingiram tanto purinas (AG) quanto pirimidinas (CT)
uniformemente. A catalase correlacionou-se negativamente a maioria dos parâmetros
analisados, reforçando a ideia de que a água coletada tem baixa qualidade e influenciou no
equilíbrio da produção de enzimas antioxidantes em zebrafish expostos à água coletada.
77
7 CONCLUSÕES
As águas coletadas possuem baixa qualidade, sendo contaminadas com metais, fósforo
e matéria orgânica. Possivelmente essa baixa qualidade hidrológica levou ao desequilíbrio
entre a produção dos antioxidantes e a geração de EROs em zebrafish, levando a alterações
nos níveis de enzimas antioxidantes.
A água possui contaminantes com potencial genotóxico, observado pelo ensaio
cometa, além disso, o ensaio cometa modificado com as enzimas ENDO III e FPG
demonstrou aumento do dano genético decorrente de estresse oxidativo.
Dentro da bateria de bioensaios realizados, em todos os experimentos realizados o
ensaio cometa mostrou a maior sensibilidade para os efeitos da água coletada. Os resultados
do presente estudo mostram a importância de integrar um conjunto de biomarcadores para
identificar os efeitos da contaminação antropogênica.
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93
ANEXO A – Certificado da Comissão de Ética no Uso de Animais
94
ANEXO B – Concentrações de metais encontrados em três pontos de coleta pertencentes
ao estudo
Valores de concentrações de metais presentes na água consumida nos bairros Anita Garibaldi
e Caravágio, em Ponte Alta e no SASB de Rio Rufino. Os valores são estabelecidos em mg/L.
Portaria 2.914 de 2011 do Ministério da Saúde do Brasil.
b Guidelines for Drinking-water Quality by World Health Organization, 2011.
c Resolução CONAMA 357 de 2005, para classificação de água em Classe I a qual exige
apenas tratamento simplificado para potabilidade.
d Não existem limites máximos estabelecidos por não apresentarem risco à saúde em função
das concentrações observadas em águas naturais
95
ANEXO C – Artigo com as análises prévias de qualidade de água
AVALIAÇÃO E CONTROLE DA POTABILIDADE DE ÁGUA CONSUMIDA EM
PROPRIEDADES RURAIS DA SERRA CATARINENSE.
Resumo – A descontinuidade no abastecimento de água é um problema em muitos
municípios brasileiros, e sua principal dificuldade se encontra na distribuição e
saneamento de regiões remotas e nas zonas rurais, que não contam com sistemas
convencionais de abastecimento de água e acabam buscando soluções alternativas,
como a utilização de águas subterrâneas e superficiais, muitas vezes desenvolvidas
pelos próprios moradores. Desta forma, o presente estudo objetiva a avaliação de
sistemas alternativos de abastecimento de água consumida em municípios
localizados na serra catarinense, incluindo Correia Pinto, Ponte Alta, Rio Rufino e
Urubici, observando e avaliando os parâmetros físico-químicos e microbiológicos da
água consumida. Experimentalmente foram analisados os seguintes parâmetros: pH,
cor, turbidez, sólidos suspensos totais (SST), sólidos totais dissolvidos (STD),
nitrato, nitrito, amônia, condutividade, sulfato, cloro residual livre, ferro, alumínio,
cloreto, dureza, alcalinidade, manganês, fósforo total, e coliformes termotolerantes
(C.T). Os resultados obtidos não apresentaram grandes variações dentre as coletas
e, apesar de as propriedades amostradas, excluindo-se o centro de Rio Rufino, não
possuírem um sistema eficaz de desinfecção da água, a maioria dos parâmetros
analisados encontra-se dentro dos limites estabelecidos pela Portaria nº 2.914/2011.
Deste modo, comparado às demais localidades, o centro do município de Rio Rufino
apresentou os melhores resultados com relação à potabilidade da água consumida
pela população.
Palavras-chave: Qualidade da água. Saneamento. Abastecimento.
Introdução
A preocupação com a quantidade, qualidade e preservação da água vem
crescendo dentro da sociedade contemporânea, sendo esta um recurso
indispensável para os seres vivos e para os ecossistemas. SANTOS (2008) destaca
que a agricultura, a industrialização, o crescimento da população e o
desenvolvimento social, são fatores que necessitam de maior uso e ocupação da
96
água, desta forma podendo ocasionar a contaminação desta, provocando danos ao
meio ambiente.
A crescente dificuldade de abastecimento de água com uma boa qualidade é
um fator preocupante e muito comentado na atualidade. No Brasil, existem muitos
casos de localidades que não usufruem de boas condições financeiras ou não
possuem informações suficientes sobre o assunto, o que acarreta tratamentos que
não são adequados para um determinado local (NASCIMENTO et al., 2012).
Como afirma d’Aguila et al. (2000), existem métodos que proporcionam esta
qualidade e fornecem uma base de desenvolvimento de ações, que devem ser
implementadas juntamente com a população, a fim de garantir segurança no
fornecimento de água com a eliminação dos constituintes presentes na água que
são perigosos a saúde.
Em diversos países, comunidades menores tendem a ter uma proporção
muito menor de população que são servidas por algum tipo de sistema de
distribuição de água potável e de saneamento. Para Magno (2000), as taxas de
serviços de redes de esgoto e coleta de resíduos domésticos são menores do que
em cidades grandes. Desta maneira, as populações que vivem em comunidades
menores não são servidas por serviços coletivos e tecnologias eficientes, sendo
forçadas a encontrar suas próprias soluções, como saneamento individual com
fossas e sumidouros, que são negativas para a saúde e para o meio ambiente.
A problemática de não conter soluções de abastecimento de água acarreta
mais danos ao meio ambiente do que a população local imagina, pois os esgotos e a
água servida são despejados diretamente nos recursos hídricos sem nenhum
tratamento, e isto afeta as comunidades que vivem à jusante destes. De acordo com
Magno (2000), muitas vezes a água poluída é utilizada para irrigação, incluindo
hortaliças e produtos comestíveis, os quais são comumente vistos em comunidades
rurais. Além disso, o aumento de doenças de veiculação hídrica está diretamente
associado à baixa qualidade da água utilizada para o consumo humano (MORAIS et
al., 2016).
Por todas estas condições, tem-se buscado alternativas com tecnologias que
possibilitem a garantia da qualidade da água produzida para abastecimento público.
Esta seleção de tecnologias de água tem possibilitado a criação de diversas
propostas de metodologias. Assim, o método de escolha para implantar obras
97
sanitárias eficientes depende de aspectos sociais, culturais, institucionais, técnicos,
econômicos, financeiros, ambientais e a disponibilidade de recursos locais. (DI
BERNARDO e PAZ, 2008).
Para Campos (2007), a análise de viabilidade econômica, além de possibilitar
a definição do tamanho mínimo do sistema, segundo o tamanho da comunidade,
estabelece critérios para eventuais políticas de tarifação.
No Brasil, aproximadamente 51% do abastecimento público e privados são
realizados por captação subterrânea, através de mais de 200.000 poços tubulares e
1 milhão de cacimbas escavadas (FOSTER, 2003). Em áreas rurais, as águas
subterrâneas também são amplamente exploradas e constituem o recurso mais
econômico; esses poços são perfurados sem controle, o que origina um
abastecimento não tratado e sem monitoramento ou proteção sanitária.
Desta forma, a descontinuidade na distribuição de água é um grande
problema em muitos municípios brasileiros, e a principal dificuldade se encontra na
distribuição e saneamento de regiões remotas e nas zonas rurais. Estas regiões,
além de possuírem uma população baixa, por sua vez encontram-se distantes dos
centros urbanos e não contam com sistemas convencionais de abastecimento de
água. Buscando assim, a utilização de águas subterrâneas e superficiais como
soluções alternativas para este problema, que normalmente são desenvolvidas pelos
próprios moradores dessas regiões.
Com isso o presente estudo visa a avaliação de sistemas alternativos de
abastecimento de água consumida em propriedades localizadas em municípios da
serra catarinense, incluindo Correia Pinto, Ponte Alta, Rio Rufino e Urubici,
observando e avaliando os parâmetros físico-químicos e microbiológicos da água
consumida.
Material e métodos
O estudo foi realizado na região serrana de Santa Catarina, em propriedades
rurais que apresentam dificuldades com relação ao abastecimento de água. Até o
momento foram realizadas duas coletas com um intervalo de tempo de
aproximadamente um mês. A universidade com o apoio do CISAMA (Consórcio
Intermunicipal Serra Catarinense), o consórcio de municípios da região de estudo,
elencou 06 propriedades rurais, situadas nas comunidades de Pátria Livre,
98
localizada no município Correia Pinto, com 14.785 habitantes; no centro de Rio
Rufino e em Cerro Baio, também pertencente a Rio Rufino, com 2.436 habitantes;
em Anita Garibaldi e Caravággio, situadas no município de Ponte Alta, com 4.894
habitantes; e no município de Urubici, com 10.699 habitantes (IBGE,2010).
As amostras foram coletadas de poços dentro das propriedades, seguindo as
recomendações do guia nacional de coleta e preservação de amostras da Agência
Nacional de Águas (ANA, 2011). Os parâmetros físico-químicos e biológicos
utilizados para a avaliação da potabilidade da água foram selecionados em função
do uso e ocupação do solo no entorno da bacia, sendo estes: pH, cor, turbidez,
sólidos suspensos totais (SST), sólidos totais dissolvidos (STD), nitrato, nitrito,
amônia, condutividade, sulfato, cloro residual livre, ferro, alumínio, cloreto, dureza,
alcalinidade, manganês, fósforo total, e coliformes termotolerantes (C.T) (AGUIAR et
al.,2015).
Todos os parâmetros em questão foram mensurados em duplicatas, seguindo
as normas propostas pelo Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater (APHA, 2005) e utilizando-se os espectrofotômetros Nova 60 Merck e
Pharo 300 Merck. Coliformes termotolerantes foram identificados e medidos
utilizando a técnica de filtragem por membrana e posterior incubação a 44,5ºC em
meio mFC (ágar coliformes fecais) água e ácido rosólico como indicador. As análises
de pH, sólidos totais dissolvidos e condutividade foram realizadas em um pHmêtro
da marca HOMIS (AGUIAR et al.,2015).
Resultados e discussão
A região serrana de Santa Catarina é formada por 18 municípios que
constituem a associação dos municípios da região serrana (AMURES). Esta região
apresenta como peculiaridade a presença de municípios com população abaixo de
10.000 habitantes. Dados do IBGE de 2010 apontam que o município mais populoso
da região é Lages, com aproximadamente 160.000 habitantes. Os outros 17 somam
uma população em torno de 120.000 habitantes. Além da baixa população, grande
parte dos habitantes encontra-se na zona rural, distante dos centros urbanos que
contam com sistemas convencionais de abastecimento de água.
99
Diante desta problemática, os habitantes da zona rural utilizam soluções
alternativas de abastecimento que se constituem basicamente em águas
subterrâneas e também águas superficiais. Estas soluções alternativas normalmente
são aplicadas pelos próprios moradores e constam não envolver parâmetros
técnicos de projeto e tampouco é realizado um monitoramento da qualidade da água
que assegure os padrões de potabilidade exigidos pelo ministério da saúde, que são
expressos na portaria n° 2914 de 12 de dezembro de 2011.
A falta de controle da qualidade da água ocasiona diversas doenças de
veiculação hídrica que afetam a qualidade de vida das pessoas que consomem esta
água. Além da potabilidade, outros usos múltiplos como o preparo de alimentos
artesanais como queijo ou mesmo a piscicultura são afetados pela qualidade da
água. Dentre possíveis causas que possam comprometer a qualidade da água
consumida nas propriedades rurais destacam-se a falta de esgotamento sanitário e
a prática da silvicultura. Neste sentido, a presente proposta é justificada pela
necessidade dos moradores rurais conhecerem a qualidade da água consumida e
também dos mesmos receberem orientações sobre o tratamento da água que
condicione a mesma aos usos múltiplos nas propriedades rurais.
Práticas como estas justificam o papel da universidade enquanto instituição
pública responsável pelo desenvolvimento do conhecimento e aplicação do mesmo
na resolução de problemas da comunidade, especialmente através da realização de
atividades de extensão.
Após a realização das análises laboratoriais dos parâmetros previamente
citados obteve-se os seguintes resultados amostrados na Tabela 1.
100
Parâmetro Anita
Garibaldi Rio Rufino
Caravággio
Cerro Baio
*Urubici
Pátria
Livre
VMP Portaria
2.914/2011
pH 7,43 ±0,01 7,61 ±0,11 7,23 ±0,33 7,56 ±0,04
7,12 7,19
±0,35 6,0-9,0
Cor (uC) <0,2 ±0 4,05 ±1,05 0,5 5,15 ±0,15
<1 14 ±10 15
Turbidez (uT)
<1 ±0 1 ±0,5 1,5 ±0 1 ±0,5 <1 3 ±2 5
Amônia (mg/L)
0,26 ±0,06 0,24 ±0,2 0,36 ±0,17 0,52 ±0,18
0,31 0,48
±0,17 1,5
Nitrito (mg/L) 0,06 ±0,06 0,05 ±0,05 0,08 ±0,04 0,03 ±0,02
<0,1 0,08
±0,04 1
Nitrato (mg/L)
<1 ±0 <1 ±0,36 <1 ±0,52 5,03 ±1,67
0 1,99
±0,31 10
Sólidos Suspensos
(mg/L) 4 ±2 3 ±0 5 ±1 4 ±1 3
15 ±10 -
STD (mg/L) 110,65 ±77,35
30,15 ±8,85 136,18 ±1,35 22,25 ±0,55
34,94 39,35
±9,5 1000
Condutividade
65,21 ±1,4 49,95 ±7,95 90,45 ±2,1 42,35 ±3,25
68,75 78,72
±19,1 -
Sulfato (mg/L)
28,53 ±9,5 62 ±38 32 ±5 105,5 ±81,5
41 35 ±9 250
Cloro R.L (mg/L)
0,0 ±0,0 0,18 ±0,01 0,0 ±0,0 0,0 ±0,0 0,0 0,0 ±0,0 0,2-5,0
Ferro (mg/L) 0,09 ±0,06 0,03 ±0 0,03 ±0,1 0,03 ±0 0,05 0,07
±0,03 0,3
Alumínio (mg/L)
<0,1 ±0 <0,1 ±0 <0,1 ±0 <0,1 ±0 <0,1 <0,1 ±0 0,2
Cloreto (mg/L)
21,38 ±7,05 24,71 ±10,74
21,12 ±7,42 22,95 ±8,95
14,43 24,47
±10,57 250
Dureza (mgCaCO3/L
) 0 ±0 0 ±0 0,03 ±0,25
0,01 ±0,15
0 0,2 ±0
500
Alcalinidade (mg/L)
63,75 ±31,75
24 ±12 83 ±48 14 ±7 * 61 ±40 -
Manganês (mg/L)
0 ±0 0 ±0 0 ±0 0 ±0 0 0 ±0 0,1
101
Tabela 1: Médias e desvio padrão das comunidades amostradas. Nota *: Na localidade de Urubici foi efetuada apenas uma coleta, por
problemas logísticos. Assim como, na amostragem realizada o ensaio de alcalinidade não doi desenvolvido por falta de amostra.
Com base nos dados da Tabela 1, pode-se observar a constância no valor de
pH das amostras, todas em torno de 7,0, sem haver mudanças significativas entre
as amostragens. Desta forma, todas as localidades se encontram dentro dos limites
de pH estabelecidos pelo Ministério Público (6,0-9,0), da Portaria n° 2.914/2011
(6,0-9,0), que dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da
qualidade da água para consumo humano.
A cor é um parâmetro físico-químico exigido pela legislação em vigor, sendo
seu limite máximo de 15uC. Segundo Lucas (2007), este parâmetro está relacionado
com a quantidade de partículas (em sua maioria orgânicas) presentes nos corpos
hídricos. Observou-se nos dados analisados que os valores obtidos de cor
apresentaram uma moderada variação de uma amostra para outra. O assentamento
de Anita Garibaldi apresentou resultados abaixo do limite de quantificação inferior do
espectrofotômetro utilizado para a análise (0,2uC) (NOVA 60 MERK).
Já a comunidade de Pátria Livre obteve os maiores valores de cor, com uma
alta variação entre as análises, fato que pode estar relacionado com a mudança
climática, ocasionando chuvas e carreamento de sedimentos (carga orgânica) para
os poços de onde a água é coletada.
Segundo a definição de Sperling (2005), a turbidez representa o grau de
interferência da passagem de luz através da água devido à existência de sólidos em
suspensão. De acordo com a Portaria Portaria nº 2914/2011, o valor máximo
permitido é de 5,0 uT. Pode-se observar que Anita Garibaldi e Urubici novamente
registraram valores abaixo do limite de quantificação inferior do espectrofotômetro
(1uT) (NOVA 60, MERK). Contudo, na comunidade de Pátria Livre observa-se um
valor mais elevado (3uT), também observou-se a maior variação nesse ponto,
Fósforo (mg/L)
0,26 ±0,24 0,02 ±0 0,34 ±0,25 0,21 ±0,1
<0,05 0,54
±0,54 0,15
Coliformes fecais A/P
A A P P P P
Ausênci
a
102
possivelmente devido à chuva, com o aumento dos sólidos em suspensão na água,
tornando-a mais turva.
Em relação aos nitrogenados, observa-se pequenas concentrações e
variações sutis na forma de nitrito e amônia, tal fato se dá à instabilidade dos
compostos em questão. Já na forma de nitrato observa-se valores elevados em
Cerro Baio (5,0mg/L) e Pátria Livre (2mg/L), quando comparados aos demais locais,
isto é relacionado com a aplicação de fertilizantes nitrogenados em plantações,
cultivo do solo, esterco animal, e ainda esgoto humano depositado em sistemas
sépticos e deposição atmosférica (BAIRD; CANN, 2011.)
Quando as concentrações de nitrato na água ultrapassam os limites
estipulados pela Portaria nº 2.914/2011 (10mgNO3/L) acarretam uma série de danos
ao organismo humano, incluindo dores de cabeça, hipotensão postural (devido à
vasodilatação), câncer de estômago, entre outros.
Pode-se relacionar o grau de turbidez de um corpo hídrico com a
concentração de sólidos suspensos, visto que são parâmetros diretamente
proporcionais, observa-se nas análises que os locais com maior índice de turbidez
foram aqueles que possuíam uma elevada concentração de sólidos em suspensão
na água. Sendo assim, os locais com as maiores concentrações desses sólidos
foram Pátria Livre e Caravággio, tal fato está relacionado principalmente às chuvas,
que por sua vez lixiviam sedimentos para o corpo hídrico
A condutividade e os sólidos totais dissolvidos (STD) também são parâmetros
proporcionais, analisando-se os dados da Tabela 1, observa-se que as amostras
com maiores concentrações de STD foram as mesmas com maior condutividade
elétrica. Tal fato se dá pois estes sólidos estão relacionados com íons, logo quanto
maior a quantidade de STD mais íons estarão presentes, e assim terão uma
capacidade elevada de condução elétrica. A condutividade é um parâmetro que
necessita de um acompanhamento periódico, pois o seu aumento pode significar
sérios problemas na qualidade da água.
Nas localidades analisadas verificou-se concentrações não preocupantes de
íons de sulfato, sendo estes íons encontrados principalmente em minerais rochosos,
tais como mirabilita, tenardita, barita entre outros, desta forma se situando dentro
dos limites configurados pela Portaria nº 2.914/2011 (250mgSO4²/L).
103
Devido à falta de estrutura adequada e à falta de informação da população
envolvida sobre o funcionamento do sistema de abastecimento de água, dentro do
quadro de localidades amostradas apenas a região central de Rio Rufino conta com
um sistema eficaz de desinfecção da água, como já mencionado anteriormente, os
demais locais carecem de uma descontaminação eficiente, não há técnicos
responsáveis pela cloração, que por sua vez é realizada por pessoas não
qualificadas, já que nenhum tipo de fiscalização é exercida dentro destas
comunidades.
Em todos os municípios observou-se concentrações abaixo do limite inferior
regulamentados pela Portaria nº 2.914/2011 (0,2mg/L) de cloro residual livre, e
apenas Rio Rufino beirou o valor mínimo aceito (0,18mg/L), o que evidencia a falta
de suporte para estas comunidades. O restante dos locais apresentaram valores
abaixo da curva de quantificação inferior do espectrofotômetro utilizado para o
ensaio (PHARO 300 MERCK).
De acordo com Siega et al. (2002), metais pesados são contaminantes
ambientais estáveis e persistentes, uma vez que não podem ser degradados ou
destruídos. Portanto, o contato com metais pesados, seja por meio da ingestão da
água ou de organismos aquáticos contaminados, pode causar danos permanentes
ao ser humano, disfunções no sistema nervoso e até mesmo câncer. Todas as
regiões onde foram realizadas as amostragens revelaram baixas concentrações e
variações reduzidas dos elementos alumínio, ferro e manganês, visto que não há
contribuição antrópica para elevar os teores destes elementos, com isso respeitando
os limites propostos pela Portaria nº 2.914/2011.
Sendo um dos principais ânions inorgânicos em águas naturais e residuárias,
o cloro na forma de íon cloreto (Cl-) gera um sabor que varia em função da sua
concentração, como também da composição química da água. Com base na Tabela
1, é visto que os locais analisados possuem pequenas concentrações de cloro na
forma de íon cloreto (Cl-), apresentando variações elevadas de uma amostragem
para outra, isto pode estar relacionado à diluição das amostras pela água da chuva
ou pelo possível aumento de poluição gerada por esgotos domésticos. Mesmo assim
todos os níveis do elemento Cl- encontraram-se dentro dos valores permitidos pela
Portaria nº 2.914/2011 (250mg/L).
104
Quando encontrado nos ecossistemas aquáticos, o grupo dos fosfatos pode
ter origem de fontes naturais como rochas, bacia de drenagem, material particulado
presente na atmosfera, decomposição de organismos de origem alóctone, ou de
fontes artificiais como despejo de esgotos domésticos ou industriais (ESTEVES,
1998).
A partir da análise dos dados gerados na Tabela 1, nota-se que de todas as
localidades apenas as localidades de Urubici e Rio Rufino apresentaram valores que
se enquadram dentro do permitido pela legislação em questão (0,15mgP-/l).
Houve um aumento da primeira coleta para a segunda, e isto possivelmente
está relacionado com a falta de esgotamento sanitário, uso de agrotóxicos e
fertilizantes. Vale ressaltar que níveis elevados de fósforo no organismo humano
podem acarretar uma série de danos, tais como hipertensão, confusão mental, e
sensação de peso nas pernas.
Como pode-se observar todas as amostras apresentaram valores de dureza
próximos ou iguais a zero (0), com variações nulas entre as coletas. Fato que não se
repetiu quanto aos teores de alcalinidade nas amostras, variando de 24mg/L até
83mg/L. A Portaria n°2.914/2011 não estipula limites para tal parâmetro. Como
salienta AZEVEDO (1987) águas relativamente alcalinas e de dureza baixa,
possuem características de águas primárias, ou seja, águas que estiveram em
contato com rochas primárias da crosta terrestre: granitos, basaltos e gneisses.
Almeida et al., (1993) afirma que os coliformes fecais são apenas uma fração
do grupo coliformes totais, mas possuem uma maior relevância na avaliação da
qualidade sanitária do ambiente, sendo assim, o índice de coliformes fecais é um
excelente indicador de qualidade da água.
É visto que apenas as localidades de Anita Garibaldi e Rio Rufino não
apresentaram coliformes fecais. Sabe-se que somente Rio Rufino possui um sistema
eficaz de desinfecção da água, com isso pode-se explicar que mesmo com a
presença de cloro residual livre nas amostras, foi revelado coliformes fecais nas
propriedades de Caravággio, Ponte Alta, Cerro Baio e Urubici. Este resultado pode
estar diretamente relacionado à ausência de esgotamento sanitário adequado nas
regiões adjacentes, o que pode contribuir diretamente para a proliferação de
microrganismos e parasitas que podem causar doenças (Ferreira et al., 2017). Além
disso, segundo Fabregat (2015) a grande quantidade de animais de sangue quente
105
em volta da propriedade, tendo seus excrementos lixiviados para os corpos hídricos
em questão é mais um fator para a presença dos coliformes fecais nas regiões
estudadas.
Conclusão
Em virtude dos resultados obtidos pode-se concluir que apesar das
adversidades, de um modo geral as propriedades rurais avaliadas permaneceram
dentro dos limites impostos pela Portaria n° 2.914/2011.
No cenário decorrente o município de Rio Rufino se destaca, na região do
centro da cidade, obtendo os melhores resultados no quesito de potabilidade da
água, resultado este alcançado com a ajuda do Laboratório de Tratamento de Águas
e Efluentes (LABTRAT) em parceria com o órgão CISAMA, que ofereceram apoio,
cursos de capacitação para utilizar alguns equipamentos, e continua a realizar as
coletas e análises dos parâmetros físico-químicos e biológicos de qualidade da água
periodicamente.
Estudos como este mostram-se de suma importância para instruir e auxiliar as
populações rurais, que sofrem com a falta de saneamento adequado e água de
qualidade, e de certa forma são esquecidas pelos governantes.
Portanto, sugere-se a continuidade deste estudo para que se possa atender
melhor a população de todas as comunidades, e obter uma gama maior de valores
para um estudo mais aprofundado, tanto por meio das análises laboratoriais da
qualidade da água que abastece os habitantes quanto por meio de cursos e oficinas
de educação ambiental, a fim de instruir melhor a população quanto à importância
dos recursos hídricos, bem como garantir a eficácia do sistema alternativo de
tratamento de água.
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