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Clonación y secuenciación del DNA 2
Clonación y secuenciación del DNADeberán quedar bien claros los siguientes puntos:
•¿Cómo se manipula el DNA?•Las endonucleasas (enzimas) de restricción• Clonación del DNA: DNA foráneo, vector de clonación, organismo huésped, selección de vectores•Vectores eucarióticos•Organismos transgénicos•Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto •Mapas de restricción•Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción•La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)•La secuenciación del DNA
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Manipulación del DNA
Estudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse en un conjunto heterogéneo de secuencias.
Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un fragmento de DNA específico
Esta tecnología se denomina:Tecnología del DNA recombinante, clonación
génica o ingeniería genética
Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica
Propiedad básica del DNA que permite su manipulación:
El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases complementarias constituye un poderoso instrumento para la identificación, aislamiento, clonación,... De fragmentos de DNA complementarios a uno dado
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Herramienta básica
Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el esqueleto azúcar-fosfato.
•Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar)
•Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palíndromes
5´-GGATCC- 3´
3´-CCTAGG- 5´
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EcoRI: E. ColiBamHI: Bacillus amyloliquefaciens
Dos tipos de cortes:
•Corte plano: extremos romos
•Corte escalonado:extremos pegajosos o cohesivos
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Herramienta básica
Las enzimas de restricción tipo II:
Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en secuencias específicas, produciendo por tanto una población heterogénea de fragmentos de extremos idénticos
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Clonación del DNA
•DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)
•Vector de clonación (vehículo)
•Organismo huésped (E. Coli)
•Selección de vectores
Vector híbrido
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Vectores híbridos (quimera)Fragmentos de distintas procedencias que se unen in vitro tras cortarse con la misma enzima de restricción. Ligasa sella zona híbridaVectores
de clonación
•Plásmido (1 sitio de corte) 2-15 kb•Fago (Lambda)•Cósmido
Clonación del DNA
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Vectores de clonación
•Fago (2 sitios de corte) < 24 kb
•Cromosomas artificiales P1 (derivados del bacteriófago P1, pueden aceptar insertos de 80 y 100 kb
Clonación del DNA
Fago
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Vectores de clonación•Cósmido: extremos cos + DNA plásmido (origen replicación) + DNA foráneo + cápisde. ~50 kb
•BAC (cromosoma artificial bacteriano): derivado del plásmido F, insertos de 150-300 kb. Usados en la secuencia de genomas
Clonación del DNA
Cósmido
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Huésped: E. coli
Inserción del vector híbrido en el huésped:
•Plásmido: transformación (solución diluida cloruro de calcio) y replicación autónoma
•Fago (transducción, inserción en DNA huésped)
•Cósmido (transducción como fago y replicación como plásmido)
Clonación del DNA
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Selección de vectores híbridos
•Plásmido: resistencia a antibióticos
•Fago : Inserción en E. coli (sólo se puede empaquetar el DNA de si contiene el inserto foráneo)
Clonación del DNA
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Clonación del DNA
Obtención de la secuencia que se clona
•Un gen •Aislamiento a partir del mRNA (ya no tiene intrones): uso de la transcriptasa inversa que hace cDNA (por ejemplo, 1982 primera insulina humana recombinante en bacterias)
•Síntesis automatizada de DNA in vitro: a partir de la secuencia aminoacídica se puede hacer DNA con la ayuda del código (no región promotora ni controladora de la expresión) ~100bp
•Fragmentos del genoma por digestión con enzimas de restricción (aleotoria o perdigonada, Shotgun)
•Se obtiene genoteca, juego completo fragmentos clonados del genoma del organismo
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Permite obtener las máximas ventajas de genes eucariotas
•Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de levaduras (YACs):
Plásmidos + Secuencia replicadora + centrómero de levadura + (telómero levadura)Puede incorporar más de 500 kb de DNA
Vectores eucarióticos
Origen de replicación del DNA de levadura
(ARS)
Región centromérica (CEN)
Resistencia a antibiótico (p.e., ampr)
Origen de replicación bacteriano (ori)
CEN ARSampr ori TelómeroTelómero
Linealización (con endonucleasas) y
adición de extremos teloméricos
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Transfección: Introducción de DNA foráneo en eucariotasOrganismo transgénico: un eucariota con DNA
foráneo
•Células eucariotas toman DNA foráneo del ambiente con fosfato cálcico (poco eficiente)
•Inyección en el oocito: DNA incorporado en el cromosoma (ratones transgénicos 15% eficiencia)
Métodos transfección
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•Retrovirus: parte de su genoma se reemplaza con DNA foráneo (ejemplo: leucocitos humanos carecen enzima adenosina desaminasa (ADA) se repararon por infección viral)
Métodos transfección
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•Electroporación: se usa corriente eléctrica para introducir DNA
•Liposomas: DNA se encapsula en liposomas (vesículas de membrana artificial)
•Biolística (mitocondrias y cloroplastos): disparo de proyectiles de tungsteno recubiertos por DNA
•Plásmidos (Ti de Agrobacterium tumefaciens en plantas) y elementos móviles (Elemento P en Drosophila)
Métodos transfección
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Población de fragmentos
Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto heterogéneos de fragmentos
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Separación fragmentos
Reptación de los
fragmentos a través del gel de agarosa
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DNA teñido con
bromuro de etidio emite fluorescencia con luz UV
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Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto heterogéneos de fragmentos
Se precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes fluorescentes,...), cDNA suele usarse como sonda
•Transferencia en Southern (Southern blotting)•Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con RNA
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Transferencia en Southern
(esquema resumen)
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Mapas de restricciónmediante
enzimas de restricción
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Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)
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La reacción
en cadena de la
polimerasa (PCR)
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•Secuenciación
•DNA fósil (evolución,
arqueología, historia) DNA
traza
Fósiles
Mamut lanudo (40000
años)
Abraham Lincoln
(síndrome de Marfan,
afecta tejido conectivo,
fribrilina)
Hombre Neandertal ->
Hablaba como
nosotros? Color
cabello?
•Huellas dactilares del DNA (DNA
forense)
Usos de la PCR
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Secuenciación de DNA
La secuencia nucleotídica exacta de un fragmento de DNA permite un conocimiento más completo de la estructura y función de un gen.
Métodos:Secuenciación manual (inicial)
Químico (Maxam y Gilbert 1977)Didesoxi (Sanger 1977)
Secuenciación automatizada (1986,…) Didesoxi
Disoxi
•La base molecular de mutaciones específicas en un gen pueden investigarse•Las secuencias del DNA han revelado regiones reguladoras comunes a todos los genes•La comparación de secuencias de diferentes especies provee estimas de las tasas de evolución molecular•Secuenciación de genomas: estructura del genoma
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