1

1Journal: 1

2 ISSN: 2

3 País: 3

4 SJR2015: 4

5 FIN2015: 5 6

7

FILOGEOGRAFIA DE LA TAIRA Eira Barbara (Carnivora: Mustelidae) A TRAVÉS DE SU 8 RANGO DE DISTRIBUCIÓN, MEDIANTE MARCADORES MOLECULARES. 9

Yolanda Mejia1 Manuel Ruiz-García1, Nicolás Lichilín-Ortíz1, Juan Manuel Ortega1, Joseph Mark 10 Shostell2 11

1- Laboratorio de Genética de Poblaciones-Biología Evolutiva. Unidad de Genética. Departamento de 12 Biología. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá DC, Colombia 13

14

2- Department of Math Science and Technology, University of Minnesota Crookston, Crookston, MN, 15 US 16

17

Correspondencia: mruizgar@yahoo.es, mruiz@javeriana.edu.co 18

19 Prof. Manuel Ruiz-García. PhD 20 Full Professor (Profesor Titular-Catedrático) 21 Coordinador Unidad de Genética 22 Departamento de Biología 23 Facultad de Ciencias 24 Pontificia Universidad Javeriana 25 Cra 7A No 43-82 26 Bogotá DC., Colombia 27

28 Resumen: 29

Este estudio pretende aportar datos para dar a conocer la posible correspondencia filogenética de las subespecies 30 morfológicas descritas hasta el momento para Eira barbara (Mustelidae) en su rango de distribución a través 31 de Suramérica y parte de CentroAmérica con los resultados de un marcador mitocondrial (NADH5). Para este 32 estudio se trabajaron 100 muestras correspondientes a seis de las siete subespecies descritas para esta especie 33 en CentroAmérica y Suramérica (Brasil, Perú, Ecuador, Colombia, Guyana Francesa, Bolivia, Paraguay, 34 Argentina, Panamá y Trinidad): E. b. barbara, E. b. inserta, E. b. madeirensis, E. b. peruana, E. b. poliocephala 35 y E. b. sinuensis. A partir de los datos obtenidos no solo se estableció si la correspondencia de las subespecies 36 se ajusta con las descritas morfológicamente, si no también si se han dado cambios demográficos de la especie 37 a través del tiempo y su relación con eventos climáticos y geológicos. De igual manera se establecieron los 38 posibles tiempos de divergencia entre los diversos grupos moleculares encontrados en el seno de E. barbara. 39 Del estudio realizado se puede concluir lo siguiente: 1. La especie presenta una alta diversidad mitocondrial. 2. 40 Se pueden distinguir claramente dos subespecies, una que corresponde a Suramérica que puede agruparse dentro 41 de E. b. barbara y otra subespecie que corresponde a E. b. Inserta y que representa las poblaciones de 42 CentroAmérica. 3. Se observan dos pequeñas agrupaciones significativas en el interior de Sudamérica, una en 43 el Departamento del Cesar (Colombia) y otra en Argentina. 4. La especie presenta una expansión poblacional 44 pleistocénica importante a lo largo de su historia. 45

2

Abstract 46

We sequenced the mitochondrial (mt) ND5 gene of 100 specimens of Eira barbara (Mustelidae, Carnivora). 47 The samples represented six out of the seven putative morphological subspecies recognized for this Mustelidae 48 species (E. b. inserta, E. b. sinuensis, E. b. poliocephala, E. b. peruana, E. b. madeirensis, and E. b. barbara) 49 throughout Panama, Colombia, Venezuela, French Guiana, Brazil, Ecuador, Peru, Bolivia, Paraguay, and 50 Argentina. The main results show that the genetic diversity levels for the overall samples and within each one 51 of the aforementioned putative taxa were very high. The phylogenetic analyses showed that the ancestor of the 52 Central and South-American E. barbara originated during the Miocene or Pliocene (6.3-4 millions of years 53 ago, MYA). Furthermore, the ancestors of some geographical groups, (we detected at least four) originated 54 during the Pliocene (3.7-2.5 MYA). These four groups (or lineages) were placed in the Cesar-Antioquia 55 Departments (northern Colombia), Bolivia and northwestern Argentina, northern-central Peru, and in the trans-56 Andean area of Ecuador. However, during the Pleistocene, this species experienced a strong population 57 expansion and many haplotypes expanded their geographical distributions. They became superimposed on the 58 geographical areas of older geographical groups that originally differentiated during the Pliocene. Until new 59 molecular studies are completed, including those with nuclear markers, we proposed the existence of only two 60 subspecies of E. barbara (E. b. inserta in southern Central America, and E. b. barbara for all South America). 61 All of the demographic analyses showed a very strong population expansion for this species in the last 400,000 62 YA during the Pleistocene. 63

Key Words: Tayra, Eira barbara, mitochondrial ND5 gene, putative geographical subspecies, genetic 64 diversity, phylogeography, population expansion during the Pleistocene. 65

Introducción: 66

El orden Carnivora incluye 11 familias divididas en dos superfamilias: Caniformia y Feliformia. Dentro de la 67 Caniformia se encuentran las familias de Canidae, Ursidae, Procyonidae, Mustelidae, Otariidae, Odobenidae, 68 y Phocidae mientras que Feliformia fue dividida en las familias Viverridae, Felidae, Herpestidae y Hyaenidae 69 (Li Yua 2004). La familia Mustelidae que incluye las subfamilias Mustelinae, Lutrinae, Melinae, Taxidiinae, 70 Mephitinae y Mellinovorinae, corresponde a la familia más grande dentro del orden Carnívora y también a una 71 de las más diversas, con 24 géneros y 65 especies (Takahiro Yonezawa a 2006). Los Mustélidos presentan una 72 gran diversidad ecomorfológica, ya que se pueden encontrar especies que son desde cavadoras como los tejones 73 hasta algunas que son semiacuáticas o acuáticas como las nutrias, lo que ha conllevado que tradicionalmente se 74 utilizaran más caracteres físicos para la reconstrucción filogenética que análisis moleculares (Koepfli 2003). 75 Esta familia ha colonizado con gran éxito Centroamérica y Suramérica, encontrándose especies en casi todos 76 los países que corresponden a estas regiones. En este estudio se busca aportar datos para aclarar la situación 77 filogenética de la taira (Eira Barbara) en Centroamérica y Suramérica, cubriendo gran parte de Colombia, por 78 medio de un marcador mitocondrial (NADH5). La taira posee una extensa distribución geográfica por el 79 Neotrópico. Sin embargo, existe una carencia muy importante de estudios dirigidos a desentrañar si existe 80 algún tipo de filogeografía marcada al interior de esta especie y qué correspondencia puede existir entre las 81 subespecies morfológicas tradicionalmente admitidas por los mastozoólogos clásicos y los resultados de 82 naturaleza molecular. Esto es muy importante para poder determinar unidades evolutivas signigficativas 83 (ESUs) (Moritz 1994) que son de vital importancia en términos de aplicar políticas de conservación que sean 84 consistentes con la realidad evolutiva de los organismos. 85

Marco teórico: 86

Eira barbara es llamado comúnmente como: perro de monte en Belice, irara en Brasil, taira en Colombia, 87 tolomuco en Costa Rica, tejon, manco y perro de monte en Perú y Ecuador, lepasil en Honduras, gato eira en 88 Paraguay, comadreja grande, gato negro, y gato cutarra en Panamá, cabeza de viejo en México, y guacho y 89 guanico en Venezuela, dependiendo de los países donde se distribuye. Las subespecies descritas para esta 90 especie han sido (Presley 2000): E. b. barbara: Argentina, Brasil, Paraguay y Bolivia, E. b. inserta: Guatemala 91 y Costa Rica, Panamá, E. b. madeirensis: Amazonía de Brasil, Colombia, norte de Perú y Ecuador, E. b, 92 peruana: Perú y Bolivia, E. b. poliocephala: Venezuela, Guyanas y norte de Brasil, E. b. sinuensis: parte de 93 Colombia, Venezuela, Ecuador y Panamá, E. b. senex: México hasta Honduras. La taira (Eira barbara) es un 94

3

carnívoro pequeño con una larga cola y patas largas adaptadas a correr y a trepar, mas no a nadar; aunque 95 también se han encontrado nadando en algunos lugares (Cheida et al., 2006). Cuenta con unas mandíbulas 96 fuertes que le permiten obtener su alimento, y un desarrollado sentido del olfato, que les permite ubicar a sus 97 presas (Presley 2000). Las tairas son animales principalmente diurnos, aunque se han registrado algunas 98 actividades nocturnas, sobre todo en aquellos individuos que se encuentran cerca de los poblados (Presley 99 2000). Son agiles, de tamaño medio que puede estar entre los 3 a 7 kilogramos, son omnívoros, se pueden 100 encontrar explorando tanto el suelo del bosque como la parte alta de los árboles. La taira se puede alimentar de 101 frutos, vertebrados pequeños que generalmente son arbóreos, de carroña, insectos y hasta de miel (Ercoli & 102 Youlatos 2016) . Las Tairas habitan bosques tropicales y subtropicales, incluyendo bosques lluviosos, bosques 103 de galería, jardines, plantaciones, bosques nubosos y bosques de matorrales secos, aunque en algunas ocasiones 104 se han encontrado cerca a los humanos, donde aprovechan las fuentes de alimento como las plantaciones de 105 maíz (Presley 2000). Por lo tanto, es un carnívoro versátil y adaptable a muchos tipos de biomas diferentes. 106

Fósiles: 107

Se han descrito dos especies de Eira correspondientes al post-pleistoceno, en unos depósitos en Maryland y 108 Virginia, USA (Galera macrodon y G. perdicida) (Ray et al., 1981). Otros géneros descritos posteriormente 109 son Mephitis y Trigonictis, encontrados específicamente en Washington, Idaho, Nebraska, Kansas, Texas, 110 Carolina del norte y Florida. Este último taxón es considerado como un intermedio entre Galictis y Eira y 111 ancestral a ambas. Se cree que los ancestros de Eira pudieron haber evolucionado en Suramérica y 112 posteriormente haberse movido hacia Norte américa. Sin embargo, estudios recientes sugieren que Eira podría 113 tener su origen en Norte América (Presley 2000). 114

Distribución: 115

Las tairas se encuentran localizadas desde México hasta Argentina, siendo muy común en los países centro-116 americanos, Ecuador, Perú, Colombia, Guyanas, Venezuela, Bolivia, Brasil, Paraguay y Argentina, tal como se 117 observa en la figura 1 (Presley 2000). 118

119

Figura 1. distribución geográfica de Eira barbara en norte y Suramérica (Presley 2000): 1, E. b. barbara; 2, 120 E. b. inserta; 3, E. b. madeirensis; 4, E. b. peruana; 5, E. b. poliocephala; 6 E. b. senex y 7, E. b. sinuensis. 121

4

Marcadores mitocondriales: 122

Los genes mitocondriales han sido usados ampliamente en filogenética, gracias a sus características, que les 123 permiten descifrar relaciones entre los niveles taxonómicos bajos, tales como familia, género y especie (Qiu-124 Hong Wan1 2004). Dentro de las características del ADN mitocondrial que permiten su enorme utilidad en 125 tareas filogenéticas y filogeográficas se encuentran: Una alta tasa de sustitución nucleotidica, carencia de 126 recombinación, herencia uniparental, un tiempo corto de coalescencia y una alta copia numérica, que permite 127 obtener una acumulación rápida de información (Qiu-Hong Wan1 2004). Por lo anterior este tipo de marcadores 128 son adecuados para el presente estudio en el que se trabaja a un nivel infra-específico. 129

130

Materiales y métodos: 131

Obtención de muestras y localidades: 132

Las muestras obtenidas para este estudio comprenden gran parte del rango de distribución de esta especie, y 133 corresponden a muestras de pelo con bulbo, piel, diente, hueso, uñas y garras obtenidas por el profesor Manuel 134 Ruiz-García en diferentes viajes a través del Neotrópico. Los orígenes geográficos de esas muestras pueden 135 verse en la Tabla 1. 136

En total se secuenciaron 100 muestras para el gen mitocondrial NADH5 de una longitud total de 280 pares de 137 bases, que cubren la mayor parte de distribución de la especie a lo largo de América Central y América del Sur, 138 tal como se observa en la tabla 1 y la figura 2. 139

Tabla 1. Origenes geográficos de las muestras analizadas de E. barbara para el gen NADH5. 140

Subespecie País Región Cantidad

E.b. barbara

Argentina

Misiones 2

Salta 2

Jujuy 2

San Pedro de Colalao, Tucuman 2

Bolivia

La Paz Provincia Fraz Tamamayo 1

Beni, Provincia Ballivian 3

Cochabamba 4

La Paz. Yungas, Lambata 1

Pando, Provincia Nicolás Suarez 2

El Alto, La Paz 1

Santa Cruz 2

San Jose de Chiquitos, Santa Cruz 1

Bolivia origen indeterminado 1

E.b. barbara

Brasil

Cataratas de Iguazu, Paraná 3

E. b. madeirensis

Paraná Rio Negro, Manaos, Amazonas 1

Rio Negro, Nova Airao, Amazonas 3

Paumarí, Rio Yavarí, Amazonas 1

E.b. barbara Parque Nacional Barra de Tijuca, Estado de

Rio de Janeiro 1

E. b. madeirensis

Colombia

Leticia, Amazonas 2

Playa blanca, Guainia 1

Zoológico Jaime Duque, Cundinamarca 1

Cesar 2

Antioquia 2

El Tapón, Vichada 2

PNN Los Katios Chocó 1

5

E. b. sinuensis PN Tamá, Norte de Santander 1

E. b. madeirensis

Ecuador

Pacto Pichincha 1

Pastaza 5

Tinigua 1

Baños 2

Guayaquil, Pantanal zoo 1

Tena, El Arca 2

Sucúa 2

Puyo, Yanacocha 5

Macas, Eden 1

La perla, Santo Domingo 2

Coca, Orellana 1

Zamora 2

Loja 1

E. b. poliocephala Guyana

Francesa Rio Carnopi 5

E. b. inserta Panama Valle de Anton 1

E.b. barbara

Paraguay

Chaco 2

Ciudad del Este 2

E.b. peruana

Perú

Huanuco 2

Lamas, San Martin 1

Chachapoyas, Amazonas 2

Nueva Cajamarca, San Martín 1

Moyobamba, San Martín 1

Pasco 1

Quistococha, Loreto 3

Caballo cocha, Loreto 1

Pucallpa, Ucayali 2

Cuzco 1

Madre de Dios 1

Yarinacocha, Ucayali 1

Piura, Selva Catacaos 1

E. b. poliocephala Trinidad Trinidad 1

Total 100

141

142

6

143

Figura 2. Ubicaciones de los individuos de Eira barbara de los cuales se obtuvieron muestras de pelo, piel, 144 diente, hueso, garra y uñas. 145

146

Extracción, amplificación y secuenciación de ADN: 147

El ADN usado se extrajo a partir de pelo con bulbo, piel, diente, hueso, uña y garras. En su mayoría 148 corresponden a pelo, por lo que se obtuvieron de especímenes vivos, mientras que los huesos, dientes, uñas y 149 garras fueron de animales muertos, que habían sido cazados por lugareños. 150

Piel: se cortó una muestra de 1cm² aproximadamente. Ésta fue cortada y macerada usando 300μl de buffer de 151 lisis de piel (solución de 2.5 ml de Tris-HCL, 0,1 ml de EDTA, 1 ml de NaCl y 2ml de SDS 10% en 44,4 ml de 152 H2O). A este macerado se le agregó 300 μl adicionales de buffer, 10 μl de proteinasa-k [20 mg/ml] y 20 μl de 153 ditiotreitol (DTT) y finalmente fue llevado a incubación en baño de maría (56°C) durante dos noches. 154

La extracción del ADN a partir de las muestras de piel se llevó a cabo siguiendo los protocolos descritos en 155 Sambrook et al. (1989). Una vez la muestra de piel se encontraba preparada y digerida, se realizó la extracción 156 utilizando fenol – cloroformo: la muestra se ubicó en un tubo eppendorf tratando de poner la mayor cantidad 157 de muestra digerida posible y se añadieron 500 μl de la solución fenol – cloroformo – alcohol - isoamílico 158 (25:24:1), en el mismo volumen de la muestra. Se realizó una mezcla batiendo con la mano por 20 segundos 159 mediante inversión, se centrifugó a 13000 rpm por 15 minutos, se extrajo la mayor cantidad de sobrenadante y 160 se añadió en un nuevo tubo descartando el precipitado. A ese sobrenadante se le adicionó el mismo volumen de 161 cloroformo – alcohol isoamilico (24:1) y se mezcló suavemente por inversión. Se centrifugó a 13000 rpm por 162 15 minutos, en el caso en el que algunas muestras después de este lavado presentaron en la interfase una capa 163 blanquecina se repitió el lavado con la solución cloroformo – alcohol isoamilico (24:1). Sobre el volumen final 164 obtenido se agregó dos veces el volumen de etanol al 100% y se dejó en nevera a - 20° C durante una noche. 165

7

Al día siguiente la muestra fue centrifugada por 15 minutos a 13000 rpm, posteriormente se descartó el 166 sobrenadante y se dejó secar el alcohol en el horno a una temperatura de 40° C. Finalmente el pellet se 167 resuspende en agua Mili – Q, estéril y se guarda en nevera. 168

Pulpa dentaria: Se tomó un diente de cada individuo dependiendo de la cantidad de pulpa dentaria que se 169 encontró. Los dientes se lavaron con hipoclorito y agua destilada y posteriormente se fragmentaron en varios 170 pedazos para extraer la pulpa. 171

Pelo: se tomaron pelos que tuvieran bulbo y se lavaron con detergente dodecilsulfato sódico (SDS) al 20% y 1 172 ml de agua destilada, de la siguiente manera: Se incluyeron los pelos en un tubo eppendorf de 1.5 μl con 1 ml 173 de agua destilada, se agregaron 40 μl de SDS al 20%, se dio vortex a la muestra, se retiró el sobrenadante y se 174 agregó nuevamente agua destilada haciendo vórtex. Finalmente, se realizó un lavado con 500 μl de Etanol 175 absoluto, se dio vórtex, se descartó el sobrenadante y se dejó secar en horno por 1 minuto a 50 °C. 176

Hueso: Se llevó a cabo una limpieza del hueso con hipoclorito y agua destilada, posteriormente, se rompieron 177 los huesos para extraer la medula, se tomó una cantidad de este tejido y se llevó a un tubo eppendorf. 178

Para las muestras de pelo, medula de hueso y pulpa dentaria se añadieron 200 µl de una solución de resina 179 Chelex® al 20%, 20 µl de DTT y 10 µl de Proteinasa – K [20 mg/ml], a cada una de las muestras de los tejidos 180 antes mencionados. Posteriormente las muestras fueron dejadas por una noche en baño maría (56°C), el día 181 siguiente se llevaron a temperatura de ebullición durante 8 minutos. Finalmente fueron centrifugadas y el 182 sobrenadante fue utilizado para protocolo de PCR. 183

Para la amplificación del gen mitocondrial de interés se usó la Reacción en Cadena de la Polimerasa, PCR. Para 184 cada muestra se preparó un mix que contenía 2 μL de DNA (diluido o no según el caso), 13,5μL de agua Mili-185 Q, 1 μL de genTaq® polimerasa, 1 μL de DNTP’s, 3,0 μL de MgCl2, 1 μL de cada cebador [para NADH5 los 186 cebadores utilizados fueron L12673 y H12977, 5’ GGTGCAACTCCAAATAAAAGTA -3’ y 5´- 187 AGAATTCTATGATGGATCATGT 3’ propuestos por (Waits 1999)], 2,5 μL de buffer 10X; el producto siguió 188 un protocolo de PCR de 95 ° por 5 minutos, seguidos de 10 ciclos de 1 minuto a 95 °C, 1 minuto a 64 °C y 1.5 189 minutos a 72 °C, 25 ciclos de 1 minuto a 95 °C, 1 minuto a 60 °C y 1.5 minutos a 72 °C con una extensión final 190 de 15 minutos a 72 °C 191

Todas las amplificaciones incluyendo controles positivos y negativos fueron chequeados en gel de agarosa al 192 2%. Las muestras que presentaron una banda visible con la longitud esperada, fueron enviadas para 193 secuenciación automática a MACROGEN U.S.A. 194

Las muestras fueron alineadas manualmente y chequeadas con los cromatogramas enviados por MACROGEN 195 U.S.A. De esta manera se verifica una vez más la calidad de las secuencias, tomando para el análisis solo las 196 muestras que presentaran picos estables y una secuencia coherente. Las secuencias que no cumplieron con la 197 longitud o coherencia esperada fueron excluidas del análisis. 198

1.1. Alineamiento de secuencias de ADN mitocondrial: 199

Las secuencias fueron alineadas manualmente y con el Software DNA Alignment (Fluxus Technology Ltda.). 200

Diversidad genética: 201

Para medir la diversidad genética para la población total de tairas y para las subespecies morfológicas putativas, 202 se determinó el número de sitios polimórficos (S), el número de haplotipos (h), la diversidad Haplotípica (Hd), 203 la diversidad nucleotídica (π), el número promedio de diferencias nucleotídicas (k), y el coeficiente de 204 coancestralidad (θ) con los programas DNAsp 5.1 (Librado y Rozas, 2009) y Arlequin 3.5.1.2 (Excoffier y 205 Lischer 2010). 206

Análisis filogenéticos y estimación de tiempos de divergencia: 207

El software MrModeltest v2.3 (Nylander, 2004) y el software Mega 6.05 (Tamura et al., 2013) se aplicaron para 208 determinar el mejor modelo de mutación evolutiva para las secuencias analizadas del gen NADH5. Para 209

8

determinar el mejor modelo de evolución nucleotídica se utilizó el criterio de información de Akaike (AIC, 210 Akaike, 1974; Posada y Buckley, 2004) y el criterio de información bayesiano (BIC, Schwarz, 1978). 211

Los arboles filogenéticos se construyeron de dos maneras: Se utilizaron métodos de máxima verosimilitud 212 (Maximum Likelihood) y por métodos bayesianos. En el árbol de máxima verosimilitud se utilizó el modelo 213 HKY + G (Hasegawa-Kishino-Yano, 1985) y una distribución discreta gamma (+ G) con cinco tipos de 214 categorías, contando con Potos Flavus como grupo externo. El análisis Bayesiano se realizó utilizando el 215 modelo HYK + G con la tasa de distribución gamma, variando entre los sitios, ya que se buscaba determinar el 216 mejor modelo utilizado por el programa FindModel. Los análisis Bayesianos se completaron con el programa 217 BEAST v. 1.8.1 (Drummond et al., 2012). 218

Se realizaron cuatro iteraciones independientes utilizando tres particiones de datos (codón 1, codón 2, codón 3) 219 con seis cadenas MCMC muestreadas cada 10.000 generaciones durante 40 millones de generaciones después 220 de un período de quema de 4 millones de generaciones. Se comprobo la convergencia utilizando el programa 221 Tracer v1.6 (Rambaut et al., 2013). Posteriormente se trazó la probabilidad frente a la generación y se estimó 222 el tamaño de la muestra efectiva (ESS> 200) de todos los parámetros a través de los cuatro análisis 223 independientes. Los resultados de diferentes ejecuciones se combinaron utilizando el software LogCombiner 224 v1.8.0 (Rambaut y Drummond 2013a) y TreeAnnotator v1.8.0 (Rambaut y Drummond 2013b). Se utilizó un 225 modelo de especiación de Yule y un reloj molecular relajado con una tasa de distribución log-normal no 226 correlacionada (Drummond et al., 2006). Los valores de probabilidad posteriores proporcionan una evaluación 227 del grado de apoyo de cada nodo en el árbol. Valores superiores a 0,95 se consideraron un soporte fuerte para 228 los clados monofiléticos (Erixon et al., 2003, Huelsenbeck y Rannala 2004). Los árboles fueron visualizados 229 en el software FigTree v. 1.4 (Rambaut 2012). Este programa fue ejecutado para estimar el tiempo hasta el 230 ancestro común más reciente (TMRCA) para diferentes nodos de BI. Para la división del ancestro común de la 231 taira (Mustelidae) y de Potos flavus (Procionidae) siguiendo a Koepfli et al (2008) se utilizó un previo de 24 + 232 1 MYA (intervalo de confianza del 95%: 14,36-17,64 MYA). 233

Adicionalmente para realizar otra estimación de los tiempos de divergencia entre los haplotipos de taira 234 encontrados, se construyó una Red de Unión Mediana (MJN) (Bandelt et al., 1999) usando el software de la 235 Red 4.6.0.1 (Fluxus Technology Ltd). Además, se estimó y transformó en años el estadístico (Morral et al., 236 1994) y su desviación estándar (Saillard et al., 2004). El estadístico es imparcial y altamente independiente 237 de eventos demográficos pasados (Morral et al., 1994). Se empleó una mutación cada 309,310 años después de 238 una divergencia de nucleótidos de 1,22% por cada millón de años (Culver et al., 2000) para NADH5. Una 239 ventaja de los procedimientos MJN en comparación con los árboles tradicionales es que permiten 240 explícitamente la coexistencia de haplotipos ancestrales y descendientes, mientras que los árboles tradicionales 241 tratan todas las secuencias como taxones terminales (Posada y Crandall 2001). El uso de los procedimientos 242 MJN permite observar qué taxones actuales comenzaron a evolucionar primero y también a identificar los 243 taxones derivados más recientemente. 244

Distancias genéticas, heterogeneidad genética y flujo génico: 245

Se usaron diferentes pruebas para medir la heterogeneidad genética y para determinar el flujo génico entre de 246 las subespecies putativas de E. barbara. Entre ellos se encuentran los estadísticos HST, KST, KST*, Z and Z* 247 (Hudson et al., 1992a, b), Snn (Hudson, 2000), chi-cuadrado, GST (de las frecuencias haplotipicas) y ST, NST, 248 FST (de las secuencias nucleotidicas; Hudson et al., 1992a). Estos análisis fueron llevados a cabo con el software 249 DNAsp 5.10. También se utilizaron otros dos procedimientos para determinar el grado de diferenciación por 250 pares de subespecies putativas de taira. Se utilizó el porcentaje de la distancia de Kimura de 2 parámetros 251 (Kimura 1980) y probabilidades exactas con Cadenas de Markov Monte Carlo utilizando el procedimiento de 252 Raymond & Rousset (1995). A partir de los resultados de estos estaditicos, se obtuvieron valores de posible 253 flujo génico histórico (Nm) entre pares de subespecies putativas de taira utilizando el modelo isla n-dimensional 254 (Slatkin 1985; Ruiz-García & Álvarez 2000). 255

Detección de cambios demográficos: 256

Para determinar los posibles cambios demográficos que ha tenido la taira a lo largo de su historia evolutiva se 257 realizaron los siguientes procedimientos: 258

9

1. La distribución mismatch (diferencias en los pares de secuencias). Se obtuvo siguiendo el método de 259 Rogers y Harpending (1992) y Rogers et al., (1996). Se compararon las curvas obtenidas, asumiendo 260 tamaños constantes y no-constantes para la distribución empírica observada. De igual manera se usó 261 el estadístico de raggadeness rg, así como el estadístico R2 de Ramos-Onsins y Rozas (2002) para 262 determinar las diferencias entre las curvas teóricas y las observadas (Simonsen et al., 1995; Ramos-263 Onsins and Rozas, 2002). 264

2. Se llevaron a cabo análisis de los Tests Fu and Li D* and F* (Fu and Li, 1993), el estadístico Fu FS 265 (Fu, 1997), y el test D Tajima (Tajima, 1989) para detectar los posibles cambios poblacionales en Eira. 266

3. “Bayesian skyline plot” (BSP) fue obtenido para las secuencias de NADH5 por medio de los softwares 267 BEAST v. 1.6.2 y Tracer v1.5. 268 269

Se selecciono La opción del Coalescent-Bayesian skyline en los priores de árbol con cuatro pasos y un modelo 270 de skyline constante de piezas con 40.000.000 de generaciones (se descartaron los primeros 4.000.000 ), kappa 271 con log Normal [1, 1.25] Uniforme [0, infinito; Valor inicial 80] (Drummond et al., 2005; Felsenstein, 1992). 272 En el Tracer v1.6, se analizaron las densidades marginales de divisiones temporales y se seleccionó la opción 273 de reconstrucción de ¨Bayesian Skyline¨ para el archivo de registro de árboles (Drummond et al., 2005; 274 Felsenstein, 1992). Se seleccionó una variante de la silueta bayesiana escalonada (constante) con el tiempo 275 máximo como la densidad posterior alta del 95% (HPD) superior y la huella de la altura de la raíz como the 276 treeModel.rootHeight. 277 278

Resultados 279

Resultados filogenéticos: 280

El BIC demostró que el mejor modelo de sustitución nucleotidica fue el T92 + G (7,649.51), mientras que AIC 281 detecto que el mejor modelo fue GTR + G + I (5,881.29). La diversidad genética de la taira es muy alta. Para 282 los 100 individuos analizados, se encontraron 70 haplotipos diferentes con Hd = 0.983 + 0.006, π= 0.0422 + 283 0.0048 y k = 11.175 + 5.117. 284

La diversidad genética para cuatro de las cinco subespecies putativas de Suramérica fue muy similar, todas ellas 285 con altos niveles de diversidad genética (Hd = 0.991-0.960 y π = 0.0562-0.0308). La diversidad genética de E. 286 b. poliocephala fue un poco baja (Hd = 0.600 and π = 0.0176), aunque el tamaño de la muestra para esta 287 subespecie fue la más baja (Tabla 2). 288

Tabla 2. Diversidad genética en la muestra global de Eira barbara y en las cinco subespecies morfológicas 289 putativas suramericanas en el gen mt Ndha5. Los estadísticos estimados fueron el número de haplotipos (NH), 290 la diversidad de haplotipos (Hd), la diversidad de nucleótidos (π) y el número promedio de diferencias de 291 nucleótidos (K). 292

Taxones de Eira

barbara

NH Hd π K

Muestra global 70 0.983 + 0.006 0.0422+0.0048 11.175 + 5.117

E. b. sinuensis 12 0.987 + 0.065 0.0562+0.0311 14.884 + 8.344

E. b. poliocephala 14 0.600 + 0.147 0.0176+0.0093 4.667 + 2.556

E. b. peruana 13 0.989 + 0.063 0.0517+0.0299 13.703 + 7.324

E. b. madeirensis 26 0.960 + 0.009 0.0308+0.0071 8.162 + 3.233

E. b. barbara 25 0.991 + 0.012 0.0412+0.0092 10.928 + 4.111

293

10

El MLT y el BI pueden verse en las figuras 3 y 4. Ambos arboles filogenéticos mostraron que la primera rama 294 que divergió fue aquella de la muestra del animal correspondiente al norte-centro de Panamá (putativamente E. 295 b. inserta) (MLT: bootstrap bajo de 28 %; BI: p = 1). En el agrupamiento que quedó se unieron todos los 296 especímenes analizados para Suramérica. Sin embargo, aunque cinco subespecies putativas diferentes fueron 297 incluidas, sólo se observaron unos pocos clados significativos, y, parcialmente, relacionados con las subespecies 298 morfológicas. 299

El primer clado que divergió en Suramérica, fue uno compuesto de tres individuos del norte de Colombia 300 (departamentos de Cesar y Antioquia 50 % y p = 0.97, respectivamente), los cuales corresponden a la subespecie 301 putativa E. b. sinuensis. Sin embargo, en el BI, dentro de este clado se encontró la presencia de un ejemplar 302 Boliviano y otros especímenes clasificados como E. b. sinuensis, que por sus orígenes geográficos no 303 pertenecen a este clado. De aquí en adelante, solo hubo una correspondencia parcial entre este clado y E. b. 304 sinuensis. Otros clados interesantes en ambos arboles filogenéticos son los siguientes: 1- uno compuesto por 305 tres individuos del área del pacifico del Ecuador transandino (61 % y p = 1, respectivamente), el cual tambien 306 parcialmente correspondió con E. b. sinuensis; 2- otro grupo con cierta relevancia fue el compuesto por 307 individuos de diferentes areas de Bolivia y principlamente por individuos del noroeste de Argentina (provincias 308 de Salta, Jujuy y Tucuman) con MLT (41 %). En el BI, este grupo se compuso de 5 individuos del noroeste de 309 Argentina (p = 0.96). Este cluster esta parcialmente correlacionado con E. b. barbara. En el BI aparecio otro 310 grupo con varios especimentes de Bolivia y Argentina (p = 0.84), pero separados del primer grupo de Argentina 311 que se mencionó anteriormente. Sin embargo, como se comentaba para E. b. sinuensis, esta correspondencia 312 fue parcial porque otros individuos clasificados “a priori” como E. b. barbara fueron ubicados en otros grupos. 313 3- Otro grupo de relevancia fue el detectado en el MLT y BI, compuesto por individuos del centro de Perú, que 314 también contenia a un individuo del norte de la Amazonía peruana (80% y p = 0,72, respectivamente). Este 315 grupo también coincide parcialmente con la subespecie morfológica E. b. Peruana 4 - finalmente algunos 316 pequeños grupos de animales en la amazonía ecuatoriana y colombiana estuvieron presentes. Uno de ellos 317 contenía dos animales de la amazonía ecuatoriana y colombiana (62% y p = 1, respectivamente) y tres de la 318 amazonía ecuatoriana (73% y p = 1; 89% y p = 1; 28% y p = 0,8; respectivamente). Estos grupos locales muy 319 restringidos estaban dentro de la subespecie morfológica putativa, E. b. madereinsis. Pero muchos otros 320 individuos de E. b. madereinsis se distribuyeron en otros grupos con otros individuos "a priori" de diferentes 321 subespecies morfológicas. 322

323

324

11

325

Figura 3. Arbol con el metodo Neighbor-Joining con parámetro-2 de Tamura; Árbol Maximum likehood para 326 las muestras de NADH5 de Eira Barbara.327

12

328

Figura 4. Arbol Bayesiano de probabilidad obtenido para las muestras de E. barbara con NADH5. 329

13

330

Figura 5. Árbol Bayesiano obtenido para NADH5, suponiendo una diversificación del linaje mitocondrial hace 331 24MA: Los valores en los nodos muestran los posibles tiempos de divergencia. 332

14

Figura 6. Árbol Bayesiano obtenido para NADH5, suponiendo una diversificación del linaje mitocondrial 333 hace 24MA: Los valores en los nodos muestran el rango de los tiempos de divergencia.334

15

La estimación temporal de divergencia del BI (figura 5 y 6), mostró una divergencia inicial de los ancestros del 335 individuo panameño (E.b. inserta) y del ancestro de los ejemplares suramericanos de alrededor de 6,26 MYA 336 (95%: 5,4-8,49 MYA, divergencia del Mioceno). El ancestro del clado del norte de Colombia se dividió hace 337 alrededor de 3,7 MYA (1,55-6,37 MYA). El ancestro de los animales del noroeste de la Argentina divergió 338 alrededor de 3,15 MYA (1,01-4,23 MYA), mientras que los antepasados de los animales del norte y centro de 339 Perú, de los animales del Ecuador transandino y de una de las agrupaciones del amazonas ecuatoriano fueron 340 2,88 MYA (1,23-4,2 MYA), 2,35 MYA (0,31 - 2,7 MYA) y 1,49 MYA (0,42 - 3,74 MYA), respectivamente. 341

El análisis MJN reveló una visión muy similar a la de los árboles filogenéticos (Figura 7). La mayor parte de 342 los haplotipos están distribuidos independientemente de la distribución geográfica de las subespecies 343 morfológicas. Por ejemplo, los haplotipos más frecuentes (H1, H30, H7, H49, H19 y H9) incluyeron individuos 344 de diferentes subespecies putativas: H1 contenía ejemplares clasificados ¨a priori¨ como E. b. madereinsis, E. 345 b. sinuensis y E. b. barbara; H30 y H7 estaban compuestos por individuos de E. b. madereinsis y E. b. peruana; 346 H49 agrupo individuos de E. b. sinuensis; H19 fue constituido por especímenes de E. b. sinuensis, E. b. peruana, 347 E. b. madereinsis y E. b. barbara, mientras que H9 incluyó E. b. poliocephala y E. b. peruana. Esto pone en 348 evidencia que algunos haplotipos están ampliamente distribuidos, lo que concuerda bastante bien con el flujo 349 genético extenso de esta especie por toda América del Sur. Muchos de estos haplotipos principales presentaron 350 otros pequeños haplotipos en forma de estrella, lo cual está altamente relacionado con las posibles expansiones 351 de la población en todo el rango geográfico de distribución de la taira en Sudamérica. Sin embargo, como 352 detectaron los árboles filogenéticos, hubo algunos grupos de haplotipos bien delimitados geográficamente. Este 353 fue el caso del individuo Centroaméricano (H66), el agrupamiento de César-Antioquia (H65, H67 y H68), el 354 grupo ecuatoriano transandino (H45, H63 y H64) y el grupo central peruano (H11, H13, H18, y H20). Las 355 divisiones temporales de MJN fueron algo menores que las obtenidas con BI, pero relativamente similares. Las 356 divisiones temporales entre estos haplotipos y los principales grupos detectados se pueden ver en la Tabla 4. 357 Algunas de estas divisiones de tiempo son interesantes, la divergencia entre el individuo panameño y el H7 se 358 estimó alrededor de 4.02 + 0.31 MYA, mientras que la divergencia temporal entre los grupos del noreste de 359 Argentina, zona de Cesar-Antioquia (norte de Colombia), Ecuador trans-andino y norte-centro de Perú en 360 referencia al H7 fueron 3,73 + 0,65 MYA, 3,29 + 0,57 MYA, 1,04 + 0,31 MYA, y 2,89 + 0,47 MYA, 361 respectivamente. 362

Tabla 3. Haplotipos correspondientes a las muestras de Eira barbara.363

364

numero de

haplotipo frecuencia

haplotipos y su

ubicación.

numero

de

haplotipo frecuencia haplotipos y su ubicación.

hap. 1 9

38 ciudaddelesteparag hap. 27 1 55 ecuador

21 quistocochaiquitos hap. 28 1 54 ecuador

7 quitoecuador hap. 29 1 22 ecuador

67 macasecuador

hap. 30 3

68 playablancaguainia

65 sucuaecuador 8 paumariyavaririverb

64 sucuaecuador 95 cuzcoperu]

62 tenaecuador hap. 31 1 53 ecuador

86 cocaecuador hap. 32 1 50 leticiacolombia

24

jaimeduquecolombia hap. 33 1 40 fozdeiguacubrazil

hap. 2 1 70 misionesargentina hap. 34 1 3 fozdeiguacubrazil

hap.3 1 33 pandobolivia hap. 35 1 39 fozdeiguacubrazil

16

hap. 4 1 97 camotebolivia hap. 36 1 23riodejaneirobrazil

hap. 5 1 98 yucabolivia hap. 37 1 20 novaairaorionegrob

hap. 6 1 74misionesargentina hap. 38 1 57 sanjosedechiquitos

hap. 7 5

49 asuncionparaguay hap. 39 1 10 cochabambabolivia

34 asuncionparaguay hap. 40 1 30 lapazyungasbolivia

15

nuevacajamarcaperu hap. 41 1 42 nicolassuarezpando

2 lapazfranztamayobol hap. 42 1 48 provballivianbenib

52 santacruzbolivia

hap. 43 2

44 provballivianbenib

hap. 8 1 37 ciudaddelesteparag 136 ptoararaleticiata

hap. 9 6

6 limaperu hap. 44 1 4 provballivianbenibo

28 frenchguyana hap. 45 1 5 quitoecuador

27 frenchguyana hap. 46 1 35 novaairaorionegrob

26 frenchguyana hap. 47 1 1 manausrionegrobrazi

25 frenchguyana hap. 48 1 19 novaairaorionegrob

46 elaltolapazbolivia

hap. 49 2

124 eltuparro469vicha

hap. 10 2

47 pucallpaperu 125 zaragozaantioquia

36 quistocochaiquitos hap. 50 1 128 eltuparro468vicha

hap. 11 1 45 catacaospiuraperu hap. 51 1 130 pnnkatios3937choc

hap. 12 1 43 yarinacochaperu hap. 52 1 133 pntamanortesantan

hap. 13 1 9 lamasperu hap. 53 1 79 tucumanargentina

hap. 14 1 41 iquitosamazonasper hap. 54 1 80 tucumanargentina

hap. 15 1 32 pucallpaperu hap. 55 1 77 jujuyargentina

hap. 16 2

31 caballocochaperu hap. 56 1 72 jujuyargentina

56 cochabambabolivia hap. 57 1 71 saltaargentina

hap. 17 1 18 pascoperu hap. 58 1 76saltaargentina

hap. 18 1 17 moyobambaperu

hap. 59 2

87 zamoraecuador

hap. 19 6

16 limaperu 88 zamoraecuador

69 puyoecuador

hap. 60 2

89 lojaecuador

61 guayaquilecuador 81 tarquipuyoecuador

60 banosecuador hap. 61 1 84 tarquipuyoecuador

59 banosecuador hap. 62 1 82 yarinacocha2ecuado

51 santacruzbolivia hap. 63 1 83 laperlastodomingoe

hap. 20 1 13 peru hap. 64 1 85 laperlastodomingoe

hap. 21 1 11 peru hap. 65 1 91 cesarcolombia

hap. 22 1 29 frenchguyana hap. 66 1 90 valledeantonpanama

hap. 23 1 93 trinidadtobago hap. 67 1 92 cesarcolombia

17

hap. 24 1

66

puyoyanacochaecuad hap. 68 1 94 antioquiacolombia

hap. 25 1 63 tenaecuador hap. 69 1 96 madredediosperu

hap. 26 1 58 tiniguaecuador hap. 70 1 73 bolivia

z365

366 Figura 7. Median -Joining networks con los 70 haplotipos para Eira barbara por medio del gen mitocondrial 367 NADH5. 368

369

370

18

Comparacion de linajes + SD Divergencia Temporal

Entre el haplotipo de Panama H 66 (inserta) y H49 (sinuensis) 13.000 + 1.000 4.021 + 0.309

Entre los haplotipos Bolivianos y del norte-oeste Argentino y

H7 (madereinsis, peruana)

12.077 + 2.097 3.735 + 0.648

Entre los haplotipos de Cesar-Antioquia (norte de Colombia) y

H7 (madereinsis, peruana)

10.625 + 1.829 3.286 + 0.565

Entre los haplotipos trans-Andinos Ecuatorianos y H7

(madereinsis, peruana)

3.375 + 1.008 1.043 + 0.311

Entre los haplotipos de Perú norte-central y H7 (madereinsis,

peruana)

9.333 + 1.523 2.886 + 0.471

Entre H9 (poliocephala, peruana) y H19 (sinuensis, peruana,

madeirensis, barbara)

1.000 + 0.500 0.309 + 0.154

Entre H9 (poliocephala, peruana) y H7 (madereinsis, peruana) 1.363 + 0.454 0.422 + 0.140

Entre H19 (sinuensis, peruana, madeirensis, barbara) y H7

(madereinsis, peruana)

0.454 + 0.454 0.141 + 0.141

Entre H49 (simuensis) y H7 (madereinsis, peruana) 1.429 + 0.714 0.441 + 0.220

Entre H30 (sinuensis) y H7 (madereinsis, peruana) 0.625 + 0.625 0.193 + 0.193

Entre H9 (poliocephala, peruana) y H1 (madeirensis, sinuensis) 2.400 + 0.600 0.742 + 0.185

Entre H19 (sinuensis, peruana, madeirensis, barbara) y H1

(madeirensis, sinuensis)

1.200 + 0.600 0.371 + 0.185

Entre H49 (simuensis) y H1 (madeirensis, sinuensis) 2.454 + 0.818 0.759 + 0.253

Entre H7 (madereinsis, peruana) y H1 (madeirensis, sinuensis) 0.643 + 0.643 0.198 + 0.198

Entre H30 (sinuensis) y H1 (madeirensis, sinuensis) 1.500 + 0.790 0.463 + 0.231

Tabla 4. Las divisiones temporales entre los haplotipos de Eira y los principales grupos detectados. 371

372

El árbol filogenético y los análisis MJN mostraron que el ancestro de las tairas centrales y suramericanas ocurrió 373 durante el Mioceno o Plioceno y que los antepasados de algunos grupos geográficos, al menos cuatro de cierta 374 relevancia, se originaron durante el Plioceno y la primera fracción del Pleistoceno. Sin embargo, durante el 375 Pleistoceno (como se demuestra más adelante), la taira experimentó una fuerte expansión poblaciónal y muchos 376 haplotipos ampliaron sus distribuciones geográficas y se superpusieron a las áreas geográficas de estos grupos 377 geográficos antiguos restringidos originalmente diferenciados básicamente durante el Plioceno. 378

379

Distancias genéticas y heterogeneidad genética entre subespecies morfológicas putativas de Eira barbara: 380

Las diferencias genéticas de Kimura 2P entre todas las comparaciónes de parejas de las seis subespecies 381 morfológicas putativas de la taira se muestran en la Tabla 5. La diferenciación entre la subespecie 382 Centroaméricana (E. b. Inserta) y las cinco subespecies suramericanas fue elevada (5,5% - 7,8%), lo que 383 confirmó que el taxón Centroaméricano es, al menos, una subespecie diferente. Es interesante notar que el taxón 384 suramericano menos diferenciado con respecto al Centroaméricano fue E. b. sinuensis (5,5%). Precisamente es 385 el taxón sudamericano más cercano geográficamente. Las distancias genéticas con los otros cuatro taxones 386 suramericanos oscilaron entre el 7,1% y el 7,8%. 387

Por el contrario, las distancias genéticas entre las cinco subespecies suramericanas fueron muy bajas. 388 Oscilaron entre 0,1% y 1,2%. La comparacion de pareja de subspecies con las mayores distancias genéticas 389 fueron E. b. poliocefala E. b. sinuensis (1,2%) y E. b. poliocefala - E. b. barbara (0,9%), teniendo en cuenta 390 que aun estos valores siguen siendo bajos comparados con otras especies. 391

392

19

Tabla 5. Distancia genética de Kimura 2P (Kimura, 1980) en porcentajes (%) entre seis subespecies 393 morfológicas diferentes de Eira barbara (Mustelidae) (debajo de la diagonal principal) y desviaciones estándar 394 en porcentajes (%) en el gen mt Nadh5. 1 = E. b. barbara; 2 = E. b. peruana; 3 = E. b. madeirensis; 4 = E. b. 395 poliocephala; 5 = E. b. sinuensis; 6 = E. b. inserta; 7 = Potos flavus (Procyonidae). 396

E. b.

barbara

E. b.

peruana

E. b.

madeirensis

E. b.

poliocephala

E. b.

sinuensis

E. b.

inserta

Potos

flavus

E. b.

barbara

0.1 0.1 0.4 0.1 1.4 3.5

E. b.

peruana

0.2 0.1 0.2 0.1 1.5 3.5

E. b.

madeirensis

0.2 0.1 0.4 0.1 1.5 3.7

E. b.

poliocephala

0.9 0.5 0.8 0.5 1.5 3.2

E. b.

sinuensis

0.3 0.5 0.4 1.2 1.2 3.5

E. b. inserta 7.1 7.7 7.4 7.8 5.5 3.5

Potos flavus 27.5 27.5 28.5 24.6 26.5 24.9

397

La heterogeneidad genética global para todas las cinco subespecies suramericanas de la taira tomadas en 398 conjunto fue claramente significativa (Tabla 6), pero esta heterogeneidad genética significativa es relativamente 399

pequeña. Por ejemplo, las estadísticas FST y ST mostraron valores de 0,095 y 0,109, respectivamente, con sus 400 respectivas estimaciones de flujo genético de 4,75 y 4,10, que es un flujo genético elevado entre las supuestas 401 subespecies suramericanas. 402

Tabla 6. Heterogeneidad genética general y los estadísticos de flujo génico (Nm) para las cinco subespecies 403 suramericanas putativas de Eira barbara en el gen mt Nadh5 * P < 0.05; ** P < 0.01. 404

Diferenciacion genética estimada P Flujo Genético

2 = 313.351 df = 272 0.0429* GST = 0.0336

HST = 0.0236 0.0001** γST = 0.0951

KST = 0.0559 0.0001** NST = 0.1108

KST* = 0.0362 0.0001** FST = 0.1086

ZS = 2279.890 0.0001**

ZS* = 7.360 0.0001**

Snn = 0.511 0.0001**

405

El análisis de comparaciones de pares de subespecies con pruebas de probabilidad exacta (Tabla 7) sólo mostró 406 dos resultados significativos: E. b. madereinsis-E. b. barbara (p = 0,0066 + 0,0017) y E. b. madereinsis-E. b. 407 poliocefala (p = 0,0135 + 0,0034). En este análisis, el taxón Centroaméricano fue eliminado porque sólo se 408 analizó una secuencia. 409

410

20

Tabla 7. Pruebas de probabilidad exacta (P) (debajo de la diagonal principal) y desviaciones estándar (por 411 encima de la diagonal principal) entre seis diferentes subespecies morfológicas putativas de Eira barbara 412 mediante el gen mt Nadh5, 1 = E. b. barbara; 2 = E. b. peruana; 3 = E. b. madeirensis; 4 = E. b. poliocephala; 413 5 = E. b. sinuensis; 6 = E. b. inserta. * Probabilidad significativa. 414

E. b.

barbara

E. b.

peruana

E. b.

madeirensis

E. b.

poliocephala

E. b.

sinuensis

E. b.

inserta

E. b.

barbara

0.0000 0.0017 0.0138 0.0197 --------

E. b.

peruana

1.0000 0.0071 0.0132 0.0088 ---------

E. b.

madeirensis

0.0066* 0.0679 0.0034 0.0201 ---------

E. b.

poliocephala

0.2307 0.3472 0.0135* 0.0036 ---------

E. b.

sinuensis

0.4044 0.4796 0.1032 0.0893 ---------

E. b. inserta --------- ---------- ---------- --------- -----------

415

Las estimaciones de Nm para comparaciones de pares de subespecies (Tabla 8) arrojaron claramente que los 416 valores inferiores a 1 (que se considera el límite para el flujo genético bajo, Wright, 1943) implicaban siempre 417 al taxón Centroaméricano: E. b. inserta-E. b. peruana (Nm = 0,584), E. b. inserta-E. b. barbara (Nm = 0,459), 418 E. b. inserta-E. b. madereinsis (Nm = 0,286), E. b. inserta-E. b. poliocefala (Nm = 0,137). El único taxón 419 suramericano, que mostró flujo génico considerable con E. b. inserta fue E. b. sinuensis (Nm = 1.202), lo cual 420 coincide bastante bien con lo determinado en los árboles filogenéticos y con el análisis de distancia genética. 421 Las estimaciones de flujo genético entre los taxones suramericanos fueron todos superiores a 1, variando de 422 2,469 a 11,847, lo cual está bien correlacionado con un elevado flujo genético histórico entre las poblaciones 423 de la taira a traves de América del Sur. 424

Tabla 8. Estimaciones de flujo génico (Nm) (debajo de la diagonal principal) entre seis diferentes subespecies 425 morfológicas putativas de Eira barbara mediante el gen mt Nadh5, 1 = E. b. barbara; 2 = E. b. peruana; 3 = 426 E. b. madeirensis; 4 = E. b. poliocephala; 5 = E. b. sinuensis; 6 = E. b. inserta. 427

E. b.

barbara

E. b.

peruana

E. b.

madeirensis

E. b.

poliocephala

E. b.

sinuensis

E. b.

inserta

E. b. barbara

E. b. peruana 9.8245

E. b.

madeirensis

9.2893 11.8471

E. b.

poliocephala

2.6879 5.3236 2.2686

E. b. sinuensis 7.1919 5.8729 4.8435 2.4691

E. b. inserta 0.4597 0.5843 0.2862 0.1373 1.2019

21

Cambios evolutivos demográficos en la taira: 428

Todas las estadísticas de cambios demográficos empleadas fueron significativas a favor de una expansión 429 poblacional en la taira (estadística S de Strobeck, P = 0,0001, Tajima D = -2,258, p = 0,0040, Fu & Li D * = -430 3,175, p = 0,0115; Fu & Li F* = -3.335, P = 0.0052; Fu’s Fs = -52.632, P = 0.00001; y R2 = 0.037, P = 0.0041). 431

Las distribuciones de desigualdad también fueron significativas para una expansión de la población (rg = 432 0,0040, P = 0,00280) (Figura 8). Suponiendo un año como una generación en la taira, la expansión de la 433 población comenzó hace 343.586 años, durante el Pleistoceno. 434

435

Figura 8. Gráfico de distribución de desigualdades entre pares de secuencias (Distribución Mismatch) para un 436 modelo de tamaño poblacional constante para E. barbara. 437

438

El análisis BSP también determinó una fuerte expansión de la población de hembras durante el Pleistoceno 439 para la taira (Figura 9). Los análisis mostraron el inicio de la expansión alrededor de 400.000 años, muy similar 440 a la estimación temporal previamente comentada. Por lo tanto, hay evidencia incontrovertible de que la taira 441 experimentó una fuerte expansión de la población durante el Pleistoceno, tal como lo sugirió previamente el 442 análisis del MJN. 443

22

444

Figura 9. “Bayesian skyline plot” (BSP) obtenido para las secuencias de NADH5 para E. barbara , teniendo 445 en cuenta los últimos 4 MY de diversificación mitocondrial. 446

447

Discusión / conclusiones 448

Diversidad genética: 449

Los niveles de diversidad nucleótidica encontrados en E. barbara (𝜋 = 0.0422) fueron considerablemente altos. 450 Estos niveles de diversidad de nucleótidos son más altos que los encontrados en muchos otros carnívoros 451 neotropicales. Algunos casos son los de tres especies de zorros (Lycalopex culpaeus: 𝜋 = 0.008, Ruiz-García et 452 al., 2013a; Lycalopex sechurae: 𝜋 = 0.015, Ruiz-García et al., 2013a; Cerdocyon thous: 𝜋 = 0.019, Tchaika et 453 al., 2006), tres especies de nutrias (Lontra felina: 𝜋 = 0.005, Vianna et al., 2010; Lontra longicaudis: 𝜋 = 454 0.011, Ruiz-García et al., 2017a; Pteronura brasiliensis: 𝜋 = 0.0086, Ruiz-García et al., 2017a), y dos gatos 455 neotropicales vulnerables (Leopardus jacobita: 𝜋 = 0.0047, Ruiz-García et al., 2012; Leopardus guigna: 𝜋 = 456 0.00461, Napolitano et al., 2012). Los valores de E.barbara fueron similares a los encontrados en ciertos gatos 457 neotropicales, que se caracterizan por niveles muy elevados de diversidad (Puma yaguaroundi: 𝜋 = 0.0661; 458 Ruiz-García y Pinedo-Castro, 2013; Ruiz-García et al., 2017b; Leopardus pajeros: 𝜋 = 0.0513, Ruiz-García et 459 al., 2013b; Leopardus pardalis: 𝜋 = 0.068, Eizirik et al., 1998; Leopardus wiedii: 𝜋 = 0.035-0.074, Ruiz-García 460 et al., 2017c). 461

Estos altos niveles de diversidad genética en los marcadores neutrales a priori podrían ser la base de otros genes 462 sometidos posteriormente a la acción de la selección natural (Kimura, 1986). Éste podría ser el origen de la gran 463 variación morfológica y de la plasticidad del comportamiento encontrada en la taira. Emmons y Freer (1990) 464 determinaron que las tairas podían vivir en una amplia variedad de hábitats como bosques tropicales y 465 subtropicales, bosques lluviosos primarios (como en el bosque amazónico en Brasil, Perú, Colombia y 466 Ecuador), bosques lluviosos secundarios y bosques de galería (como en los Llanos de Venezuela y Colombia), 467 jardines, plantaciones, bosques nublados, así como en bosques de arbustos secos y caducifolios (como en el 468 Pantanal de Brasil, Paraguay y Bolivia) y sabanas de hierba alta (como en Argentina, Bolivia y Paraguay). 469 Sunquist et al., (1989) demostraron que la extrema plasticidad de esta especie en cuanto a preferencias de 470 hábitat, períodos de actividad y preferencias de dieta puede reducir la competencia interespecífica entre E. 471 barbara y otros carnívoros. Esta podría ser también la explicación de por qué Konecny (1989) no encontró una 472 preferencia de hábitat significativa para este mustelido en Belice. La abundancia de la taira en gran parte de 473 América Central y del Sur puede ser una consecuencia de su flexibilidad ecológica en comparación con los 474

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carnívoros simpátricos. Asociado a esto, la taira es un depredador generalista que consume una variedad de 475 frutas, carroña, vertebrados pequeños y medianos, insectos y miel (Cabrera y Yepes, 1960, Galef et al., 1976, 476 Hall y Dalquest, 1963, Konecny, 1989, Sunquist et al., 1989). 477

478

Heterogeneidad genética, flujo genético y la sistemática de E. barbara: 479

Los resultados mostraron claramente que el espécimen muestreado en Centroamérica era altamente 480 divergente de todos los muestreados en América del Sur. Sin embargo, la heterogeneidad genética entre las 481 subespecies morfológicas putativas de tairas suramericanas, aunque significativas, es muy pequeña como lo 482 encontramos con el estadístico FST, las pruebas de probabilidad exacta y las distancias genéticas. Wright (1943) 483 afirmó que, en un modelo de isla, Nm> 1, el flujo de genes es lo suficientemente importante como para borrar 484 la heterogeneidad genética entre las poblaciones. En un modelo escalonado, esta cantidad debe ser mayor que 485 4 (Trexler, 1988). En ambos modelos, Nm <0,5 significa que las poblaciones están altamente desconectadas 486 entre ellas desde un punto de vista reproductivo. Por ejemplo, las estimaciones de flujo génico entre E. b. inserta 487 y E. b. poliocefala (Nm = 0,137), E. b. inserta y E. b. madereinsis (Nm = 0,286) e E. b. inserta y E. b. peruana 488 (Nm = 0,459) mostró que el taxón Centroaméricano está totalmente aislado de estos tres taxones suramericanos. 489 Sin embargo, recordemos que se detectó cierta relación genética entre el taxón Centroaméricano y el taxón 490 suramericano más al norte (E. b. sinuensis). Además, encontramos un gran flujo génico comparando pares de 491 taxones suramericanos como E. b. madereinsis-E. b. barbara (Nm = 9,289) y E. b. madereinsis-E. b. 492 poliocephala (Nm = 2.168), que fueron elevados, aunque estas comparaciones mostraron heterogeneidad 493 significativa. Esto podría explicarse según Alledorf y Phelps (1981), quienes argumentaron que la interpretación 494 más acertada de Nm> 1 es que las poblaciones comparten los mismos alelos, aunque no necesariamente con las 495 mismas frecuencias alélicas. Por medio de simulaciones, estos autores demostraron que una divergencia de 496 alelos significativa se produjo en el 50% de las generaciones con un flujo genético de Nm = 50 y que la 497 divergencia significativa de alelos ocurrió en la mayoría de las ocasiones cuando Nm = 10. 498

La taira parece tener una fuerte capacidad de dispersión, que podría estar relacionada con estas altas 499 estimaciones de flujo genico detectados para todas las subspecies putativas suramericanas. Por ejemplo, en los 500 llanos Venezolanos y Colombianos, las tairas suelen encontrarse a lo largo de los bosques de galería. Sin 501 embargo, cruzan extensos pastizales por la noche, presumiblemente moviéndose de un bosque a otro cubriendo 502 distancias elevadas (Defler, 1980). 503

Teniendo en cuenta todos estos hechos, que las seis se podría considerar que las subespecies morfológicas 504 putativas analizadas de E. barbara podrían reducirse a dos subespecies diferentes: E. b. inserta para el sur de 505 Centroamérica y E. b. barbara para toda Sudamérica. El nombre debe ser E. b. barbara porque ésta era la 506 asignación dada por Linneo en 1758 contra E. b. sinuensis dado por Humboldt en 1812, E. b. peruana dado por 507 Nehring en 1886, E. b. madeirenis dado por Lonnberg en 1913 y E. b. poliocephala dado por Traill en 1821. 508 En referencia a la supuesta subespecie septentrional de América Central (E. b. senex), no podemos añadir ningún 509 comentario sobre su sistemática porque no se analizó ningún individuo de esta subespecie putativa. Por lo tanto, 510 es esencial muestrear tairas de esta subespecie putativa para determinar sus relaciones con otros taxones de 511 taira. 512

Un punto de vista alternativo podría ser el siguiente. Como se mostró anteriormente, las divisiones de las 513 primeras tairas se originaron durante el Plioceno y el comienzo del Pleistoceno. Sin embargo, durante el 514 Pleistoceno, la taira experimentó una fuerte expansión poblacional y muchos haplotipos ampliaron sus 515 distribuciones geográficas y se superpusieron a las áreas geográficas de estos grupos geográficos antiguos y 516 originales, diferenciados básicamente durante el Plioceno. Sería muy interesante analizar genes nucleares para 517 determinar si hubo o no una hibridación entre esos primeros grupos geográficos altamente específicos y más 518 antiguos (norte de Colombia, parte de Bolivia y el noroeste de Argentina, el área transandina del Ecuador y el 519 norte-centro de Perú) y la población de tairas que apenas se expandió por toda Suramérica durante el 520 Pleistoceno. Si la respuesta fuera afirmativa, nuestra visión de la subespecie unica de la taira en América del 521 Sur debería ser totalmente válida. Por el contrario, si hubo poca, o ninguna hibridación, entre las poblaciones 522 geográficas originales y los colonizadores Pleistocénicos, entonces el número de subespecies en América del 523

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Sur podría ser mayor: 1) la población del norte de Colombia (Cesar, Antioquia y posiblemente áreas cercanas) 524 deberia denominarse E.b sinuensis; 2) la población del norte-centro del Perú debería ser denominada como E. 525 b. peruana; 3) la población boliviana y especialmente la población noroccidental Argentina debería ser definida 526 como una nueva subespecie (provisionalmente E. b. saltensis); y 4) la población ecuatoriana transandina podría 527 ser definida como una nueva subespecie (tentativamente E. b. aequatorialis). Las poblaciones restantes de tairas 528 en América del Sur deben ser nombradas como E. b. barbara. En caso de ser así, la distribución de E. b. 529 sinuensis y E. b. peruana debería ser mucho más restringida de lo aceptado tradicionalmente (Presley, 2000). 530

Sólo futuros estudios genéticos con marcadores nucleares podrían aclarar cuál de los dos puntos de vista es 531 más aceptable. 532

533

Tiempos de divergencia: 534

Nuestros resultados mostraron que la divergencia entre las tairas del centro y del sur de América fue alrededor 535 de 6,3 a 4 MA (en los periodos del final del Mioceno, comienzos del Plioceno, dependiendo de la estimación 536 temporal). Johnson y O'Brien (1997) y Johnson et al., (2006) mostraron que siete de los ocho linajes primarios 537 de felinos irradiaron en la primera parte del Mioceno Tardío (10.8-6.2 MA). Hubo un notable enfriamiento del 538 clima global cerca del final del Mioceno Medio. Este período de enfriamiento coincide con la formación de una 539 capa de hielo antártico permanente en el Mioceno Medio y Tardío y una capa de hielo Ártico en el Plioceno. 540 Un gran pico de diversificación en muchos taxones de vertebrados ocurrió durante la época del Plioceno. El 541 clima frío y seco durante el Plioceno coincide con el inicio de ciclos glaciales en zonas de elevada latitud, 542 causando una expansión explosiva de vegetación de baja biomasa, incluyendo pastizales y estepa a latitudes 543 medias y el desarrollo de la taiga en latitudes altas de Eurasia y Norteamérica. Estos cambios se correlacionaron 544 con la diversificación de especies de presas como los roedores muroides y aves paseriformes que explotaron 545 estos nuevos hábitats, lo que a su vez proporcionó nuevos nichos para carnívoros pequeños o medianos, como 546 la taira. Adicionalmente, este período del Plioceno coincide bastante bien con la última fase de ascenso de los 547 Andes como lo demuestran Dollfus (1974) y Clapperton (1993) (ver, por ejemplo, el levantamiento de los 548 tablazos de Piura, Perú) y actividad volcánica muy alta en los Andes, con sustitución de bosques lluviosos por 549 estepa y pastizales. 550

Esto podría significar que el proceso de diversificación al interior de Eira podría coincidir con el final del primer 551 pico de diversificación de los mustelidos, o al comienzo del segundo pico de diversificación de los mustelidos 552 detectado por Koepfli et al., (2008). En cualquier caso, este proceso de diversificación mitocondrial fue antes 553 del puente terrestre panameño (3-2.5 MA). Por lo tanto, la radiación de Eira podría ser primero en Norteamérica 554 que en América del Sur en concordancia con el registro fósil (Ray et al., 1981) y en contra la visión de 555 Hershkovitz, (1972). Si es así, las tairas llegaron a América del Sur antes de la formación completa del puente 556 terrestre panameño, coincidiendo con el puente de la isla Choco-Panamá (Galvis, 1980), que podría haber sido 557 utilizado por los antepasados de la actual E. barbara para colonizar el norte del Suramérica hasta América 558 Central. Durante la orogenia superior del Plioceno, las actuales cuencas de los ríos Tuira, Atrato y Sinú, así 559 como las tierras bajas cercanas, se elevaron sobre el nivel del mar. De esta manera, las montañas del sur de 560 América Central y del norte de los andes fueron elevadas hasta aproximadamente su elevación actual (Van der 561 Hammen, 1961). Aunque los portales nicaragüenses, panameños y colombianos permanecieron abiertos (Alto 562 Mioceno-Medio Plioceno), existía una gran isla volcánica desde el valle inferior del Atrato y la cuenca del río 563 Tuira, al este de Panamá hasta el portal nicaragüense, que podría haber sido utilizado por el antepasado de Eira 564 para migrar hacia el sur. El puente del Cuchillo de la región de Urabá, que conecta los Andes colombianos del 565 oeste terciario con las islas panameñas, estuvo probablemente por encima del nivel del mar durante este período. 566 Así pues, las tairas podrían constituir una especie adicional de "saltadores esperanzados de islas" utilizando la 567 terminología de Simpson (1950, 1965, 1980). 568

Los resultados podrían ser también una evidencia indirecta a favor de un origen en el Mioceno del Istmo de 569 Panamá (Montes et al., 2012, 2015). De hecho, la formación del istmo de Panamá comenzó antes y parece estar 570 asociada con el levantamiento andino del norte, alrededor de 24 MA (Farris et al., 2011). 571

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Por lo tanto, la taira podría haber llegado a América del Sur antes que otros Mustelidae. Koepfli et al. (2008) 572 afirmaron que los géneros y especies de mustelidos encontrados en América del Sur hoy en día son en gran 573 parte descendientes de los inmigrantes norteamericanos que llegaron como parte del GABI después del 574 levantamiento del istmo panameño, 3.0-2.5 MA. Varias pruebas a favor de las afirmaciones de Koepfli et al. 575 (2008) son las siguientes: 1- El clado de nutrias del Nuevo Mundo en el que Lutra canadensis es hermana de 576 Lontra felina + L. longicaudis, con las dos últimas especies encontradas en América del Sur con una división 577 de tiempo estimada de 2.8-3.4 MA (95% HPD: 1.6-5.2 MYA) que se superponen bien con el momento de la 578 supuesta formación del puente terrestre panameño. 2 - La comadreja de cola larga, Mustela frenata, se extiende 579 desde América del Norte hasta el norte de América del Sur y las dos especies de comadrejas (M. africana y M. 580 felipei), endémicas de América del Sur, son otro ejemplo de este hecho. La evidencia fósil indica claramente 581 que Mustela colonizó América del Sur desde el norte, aparentemente después de que el istmo panameño se 582 formara hace unos 3 MA. 3- Los fósiles del actual Lyncodon patagonica (y una forma fósil muy relacionada 583 como Lycodon bosei) y Stipanicicia sp (muy relacionados con la existente Galictis cuja) han sido registrados 584 en los períodos Ensenadense y Bonaerense del Pleistoceno Argentino (Forasiepi et al. , 2007). 585

Los resultados mostrarían que el proceso de diversificación al interior de Eira es más antiguo que el de los casos 586 citados. Sin embargo, nuestros resultados podrían ser ratificados por otros resultados obtenidos por los mismos 587 autores (Koepfli et al., 2008). Encontraron que Pteronura, Galictis y Eira podrían tener un origen eurosiático 588 para cada género con posterior diversificación en América del Norte. Por ejemplo, Pteronura puede estar 589 relacionado con el extinto género Satherium del Plioceno de Norteamérica y Eira con Trigonictis y 590 Legionarictis, también fósiles norteamericanos (Tseng et al., 2009). Teniendo en cuenta que la evidencia fósil 591 sugiere que los mustelidos colonizaron el Nuevo Mundo a través de Beringia durante diferentes intervalos 592 cuando el puente terrestre entre Eurasia y Norteamérica estaba abierto, varios géneros de mustelidos emigraron 593 en Norteamérica durante el Mioceno Tardío (alrededor de 11.2-5.3 MA) previo a la primera apertura del 594 estrecho de Bering 5.4-5.5 MA, que cortó la ruta a través de Beringia. Muchos géneros que colonizaron América 595 del Norte durante el Mioceno Tardío o el Plioceno temprano se extinguierón, pero Eira podría ser uno de los 596 géneros supervivientes que comenzaron a diversificarse en Norteamérica y también hacia América del Sur si 597 aceptamos que llegaron a América del Sur antes de la formación completa del puente terrestre panameño. 598

La diversificación mitocondrial de los grupos de taira suramericanos más antiguos se detectó alrededor de 3,7-599 2,3 MA. En primer lugar, esto coincidió con los cambios climáticos que se originaron a partir de formación 600 completa del puente terrestre panameño (3.1-2.8 MA, Marshall et al., 1979, 1982, Marshall, 1985, 1988, Webb, 601 1985, 1997, Coates y Obando, 1996) en el Plioceno tardío. En segundo lugar, esta diversificación en la taira se 602 acerca al período gelasiano (2,5-1,8 MA), un período caracterizado por las últimas etapas de una tendencia de 603 enfriamiento global que condujo a las edades de hielo cuaternario (International Commission on Stratigraphy 604 2007). Alrededor de 2,5 MA, los bosques andinos se transformaron en una sábana seca y fría ('páramo'), que 605 podría tener poblaciones potencialmente aisladas de diferentes especies, que podrían cruzar los Andes del Norte 606 provenientes de Centroamérica. Van der Hammen (1992) demostró que la temperatura media en los Andes 607 colombianos era 4 ° C menor que la de hoy. También indicó que el nivel de lluvia descendió por debajo del 608 nivel reportado para hoy (500-1.000 mm). A 2.500 metros sobre el nivel del mar (m.s.n.m), la temperatura era 609 10 ° C más baja de lo que es hoy. En tercer lugar, la diversificación de la taira podría verse afectada por el 610 rápido levantamiento que dio lugar a una elevación significativa de los Andes del norte, que culminó hace 611 aproximadamente 2,7 MA cuando los Andes del norte de Colombia alcanzaron su elevación actual (Gregory-612 Wodzicki, 2000). Esto también coincide con la última fase de formación de los Andes Centrales. Toda la cadena 613 andina entre Cajamarca y Huancavelica en Perú apareció por volcanismo en este período. 614

Muchos de los procesos de diversificación mitocondrial en los típicos haplotipos colonizadores del Pleistoceno 615 ocurrieron alrededor de 1,5-0,8 MA. Esta divergencia podría haber sido iniciada por el período glaciar pre-616 pastoniano (1,3-0,8 MA), que fue el pico glacial más alto del primer período glacial cuaternario (Günz). Este 617 período glacial fue extremadamente seco, y hubo un gran grado de fragmentación del bosque. Este período fue 618 un tiempo para la diversificación y separación de haplotipos de muchos carnívoros, como se encontró 619 anteriormente para el gato de las Pampas (Cossíos et al., 2009) y para los zorros del género Lycalopex (Ruiz-620 García et al., 2013a). Alrededor de 1,3 MA, la fauna de Buenos Aires se transformó en una típica fauna semi-621 árida patagónica, representada por el género guanaco, Lestodelphys y Lyncodon. Por lo tanto, el clima era 622

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considerablemente más frío y más seco que hoy y podría haber influido en la fragmentación mitocondrial dentro 623 de la taira. La fuerte expansión de la población detectada alrededor de 0,4 MA para la taira coincide con un 624 período interglacial con temperaturas y humedad mucho más elevada que en épocas anteriores y con 625 expansiones forestales (Hoxniense en las Islas Británicas, Yarmouth en Norteamérica, Holstein en Europa del 626 norte e Interglacial Mindel-Riss en el centro de Europa) y la fecha se encuentra alrededor de 0.39-0.20 MA 627 (West, 1967). 628

Análisis futuros con marcadores nucleares y con la adición de muestras provenientes de Centroamérica 629 (especialmente del sur de México, Guatemala, Belice y Honduras), así como de las áreas del Pacífico de 630 Colombia y Ecuador, más áreas del Perú central y de la Zona del escudo de Guyana, son necesarios para 631 determinar con exactitud cuántas subespecies o ESU (Moritz, 1994) existen, lo cual es esencial para fines de 632 conservación biológica. 633

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