การปรบปรงพนธขาว กข6 ใหตานทานตอโรคขอบใบแหงโดยการเพมยน

ตานทาน Xa21 และใชเครองหมายโมเลกล ชวยในการคดเลอก

Introgression of Xa21 gene for bacterial blight resistance into the rice

cultivar RD 6 (Oryza sativa. L) using marker assisted selection

วชย สทธการ1, จรวฒน สนทชน1* และ พยอม โคเบลล2

Wichai Sittikarn1, Jirawat Sanitchon1* and Payorm Cobelli2

บทคดยอ: ขาวเหนยวพนธ กข6 นยมปลกและบรโภคในเขตภาคเหนอและภาคตะวนออกเฉยงเหนอของประเทศไทย แตมกประสบ

กบปญหาการระบาดของโรคขอบใบแหง (bacterial blight) ทเกดจากเชอแบคทเรย Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)

ท�าใหผลผลตขาวลดต�าลง การศกษาในครงนมวตถประสงคเพอ พฒนาขาวเหนยวพนธ กข6 ใหตานทานตอการเขาท�าลายของ

เชอสาเหตโรคขอบใบแหง โดยการใชเครองหมายโมเลกล Sequence Tagged Site (STS) STSBB21-11 ชวยในการคดเลอก

ในการปรบปรงพนธดวยวธผสมกลบ (backcrossing) จ�านวน 2 ครง ใชขาวพนธ IRBB21 เปนแหลงของยนตานทาน Xa21 (donor)

ไดประชากรชวรนท 3 ของการผสมกลบครงท 2 (BC2F2:3

) จ�านวน 9 สายพนธ น�าไปประเมนความตานทานตอเชอสาเหตโรคขอบ

ใบแหง จ�านวน 3 ไอโซเลท คอ CN1-1, MS1-2 และ NY1-1 พบวา สายพนธ BC2F

2:3 2-17-71-6 และ BC

2F

2:3 2-19-86-9 ตานทาน

ในระดบปานกลางตอเชอ 3 ไอโซเลท โดยมคาเฉลยความยาวแผลระหวาง 2.60-3.60 เซนตเมตร และ 2.43-3.50 เซนตเมตร

ซงนอยกวาพนธ IRBB21 ทมคาเฉลยความยาวแผลระหวาง 4.20-5.43 เซนตเมตร และพนธ กข6 มคาเฉลยความยาวแผลระหวาง

9.57-12.90 เซนตเมตร ตามล�าดบ สายพนธทผานการคดเลอก จะถกน�าไปประเมนลกษณะทางการเกษตรและผลผลตตอไป

การปรบปรงพนธในครงน แสดงใหเหนวาสามารถพฒนาขาวพนธ กข6 ใหตานทานตอการเขาท�าลายของเชอสาเหตโรคขอบใบแหง

และสามารถน�าไปใชเปนประชากรพนฐานในการปรบปรงพนธขาว กข6 ใหตานทานตอโรคขอบใบแหงไดดยงขนในอนาคต

ค�ำส�ำคญ: Xanthomonas oryzae, การปรบปรงพนธพชดวยวธผสมกลบ, STS

ABSTRACT: The rice cultivar RD 6 is the most famous variety planted and consumed in the North and North-East of Thailand. However this cultivar is susceptible to bacterial blight (BB) caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) The objective of this study was to increase resistance to bacterial blight resistance in RD6 for through backcrossing method and marker assisted selection. Resistance gene Xa21 from the resistant cultivar IRBB21 was introgressed into RD6 using sequence tagged sites (STS) marker STSBB21-11 that is tightly linked to Xa21 (0.1 cM) for foreground selection. Nine selected BC2F2:3 lines together with their parental lines and standard check varieties were evaluate for the resistance using artificial inoculation under greenhouse condition against three of Xoo isolates (CN2-1, MS1-2 and NY1-1). Two BC2F2:3 introgression lines showed higher resistance against the three bacteria isolates than RD6. The line BC2F2:3 2-17-71-6 was 2.60 – 3.60 cm. in average lesion length and BC2F2:3 2-19-86-9

1 สาขาวชาพชไร คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน จ.ขอนแกน 40002 Department of Agronomy, Faculty of Agriculture, Khon Kaen University, Khon Kaen 400022 กองวจยและพฒนาขาว กรมการขาว Rice Research and Development Division, Rice Department * Corresponding author: jirawat@kku.ac.th

แกนเกษตร 46 (2) : 267-276 (2561). KHONKAEN AG R.J. 46 (2) : 267-276 (2018).

บทน�ำ

ขาว (Oryza sativa L.) เปนธญพชอาหารทส�าคญของประชากรโลก แตในระบบการปลกขาว มกประสบปญหาการระบาดของโรคขอบใบแหง (bacterial blight) ทเกดจากเชอแบคทเรย Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) เปนสาเหตหนงทท�าใหขาวมผลผลตลดลงไดมากถง 20-60 เปอรเซนต (Ou, 1985) โดยเฉพาะขาวพนธ กข6 ทออนแอตอโรคขอบใบแหง แตนยมปลกและบรโภคกนอยางแพรหลายในเขตภาคเหนอ และภาคตะวนออกเฉยงเหนอของประเทศไทย แนวทางหนงทใชในการควบคมโรคขอบใบแหง คอ การใชพนธตานทาน ซงเปนวธการทมประสทธภาพและปลอดภย (Khush et al., 1989) เนองจากสามารถลดการใชสารเคมก�าจดโรค ลดสารพษตกคางในขาวและสงแวดลอมได เปนวธการทชวยลดปญหาความเสยหายทเกดจากโรคขอบใบแหงไดอยางยงยน (Zhan et al., 2012)

ในปจจบนมรายงานการคนพบยนตานทานโรคขอบใบแหงแลวกวา 40 ยน (Khan et al., 2014; Kim et al., 2015) และ Wang et al. (1996) ไดรายงานวา ยน Xa21 มความตานทานตอเชอสาเหตโรคขอบใบแหงและสามารถใชเครองหมายโมเลกล STS ชวยใน การคดเลอกยนเปนวธทท�าไดงายสามารถวเคราะหผลไดบนแผนว น agarose ความเขมขน 2 เปอรเซนต (พะยอม และคณะ, 2557)

การศกษาและวจยในครงนจงไดท�าการปรบปรงพนธขาว กข6 ใหตานทานตอการเขาท�าลายของเชอสาเหตโรคขอบใบแหง โดยใชพนธ IRBB21 เปนพนธ ผใหยนตานทาน Xa21 โดยการปรบปรงพนธดวยวธผสมกลบ (backcrossing) รวมกบการใชเครองหมายโมเลกลชวยในการคดเลอก (marker-assisted selection : MAS) โดยน�าเครองหมายโมเลกล STS คอ STSBB21-11

ทอยใกลกน (linked) กบยนตานทานโรคขอบใบแหง Xa21 โดยมระยะหางจากยน 0.1 cM (Chunwongse et al., 1993) มาใชในการปรบปรงพนธในครงน เพอพฒนาขาว กข6 ใหตานทานตอการเขาท�าลายของเชอสาเหตโรคขอบใบแหงไดดยงขน

วธกำรศกษำ

1.กำรสรำงประชำกรใชขาวเหนยว กข6 เปนพนธรบ (recurrent parent)

และพนธ IRBB21 เปนพนธให (donor parent) ซงมยนตานทานโรคขอบใบแหง Xa21 ทเปนยนเดน (dominant) อยบนโครโมโซมท 11 (Khush et al., 1990) ไดท�าการผสมขามไดประชากรลกผสมชวรนท 1 (F

1) แลวผสม

กลบไปยงขาวพนธ กข6 ไดประชากรชวรนท 1 ของการผสมกลบครงท 1 (BC

1F

1) คดเลอกยน Xa21 ลกษณะ

ความเหนยวและลกษณะความหอมดวยเครองหมายโมเลกล glutinous-23 (Glu-23) (Wanchana et al., 2003) และ betaine-aldehyde dehydrogenase (BADH) (Jonliza et al., 2006) ผสมกลบไปยงพนธ กข6 อกครงจนกระทงไดประชากรชวรนท 1ของการผสมกลบครงท 2(BC

2F

1) คดเลอกยน Xa21 และคดเลอกลกษณะ

ความนมดวยเครองหมายโมเลกล RM587 (จรพงศ, 2556) แลวจงปลอยใหผสมตวเองจนไดเมลดประชากรชวรนท 2 ของการผสมกลบครงท 2 (BC

2F

2) คดเลอกเฉพาะตน

ทม genotype ในสภาพ homozygous dominant (RR) เหมอนกบพนธ IRBB21 แลวจงคดเลอกลกษณะการแตกกอและลกษณะเมลดเฉพาะตนทมความคลายกบขาวพนธ กข6 จงปลอยใหผสมตวเองอกครงจะไดเมลดประชากร BC

2F

2:3 ซงมปรมาณเมลดเพยงพอจงน�า

ไปประเมนความตานทานตอโรคขอบใบแหง

268 แกนเกษตร 46 (2) : 267-276 (2561).

was 2.43 – 3.50 cm. which were greater than IRBB21 (4.20 – 5.43 cm.) and RD6 (9.57 – 12.90). The two selected lines will be evaluated for agronomic traits and yield subsequently. This study was successful in breeding the rice cultivar RD6 for bacterial blight resistance. The introgression lines are promising lines and could be further utilized as material for gene pyramiding to achieve horizontal resistance.Keywords: Xanthomonas oryzae, backcrossing, STS

สกดดเอนเอจากใบขาวซงเพาะในถาดเพาะและมอาย 21 วน ดวยวธ CTAB (Saghai-Maroof et al., 1984) แลวตรวจสอบปรมาณและคณภาพดเอนเอ ดวยเครองวเคราะห Nanodrop (Thermo scientific) เตรยมปฏกรยา Polymerase Chain reaction (PCR) ดวยไพรเมอร STSs คอ STSBB21-11 โดยมองคประกอบของปฏกรยาดงตอไปน DNA template (6.5-10 ng.) 10 μl. น�ากลน 0.5 μl. Primer (F) (5 pmol/μl) 1 μl. Primer (R) (5 pmol/μl.) 1 μlTaq master mix (Promega) 12.5 μl. ไดปรมาตรสดทาย 25 μl. น�าไปเขาเครองเพมปรมาณดเอนเอ Thermal cycler (iometra) ดวยปฏกรยาลกโซพอลเมอเรส ตงอณหภมและเวลาตาม ขนตอน ดงตอไปน 1) pre-denature อณหภม 95◦ซ 5 นาท 2) denaturation อณหภม 94◦ซ 30 วนาท 3) annealing อณหภม 55◦ซ 30 วนาท 4) extention อณหภม 72◦ซ 1 นาท (ท�าปฏกรยาจากขนตอนท 2 ถงขนตอนท 4 จ�านวน 30 รอบ) 5) final extention อณหภม 72◦ซ 5 นาท จากนนตรวจสอบผลผลต PCR ดวยเทคนค agarose gel electrophoresis ความเขมขน 2 เปอรเซนต เปนเวลา 1 ชวโมง 30 นาท และตรวจดแถบดเอนเอ ภายใตแสงอลตราไวโอเลตดวยเครอง gel document

สวนการเตรยมปฏกรยา Polymerase Chain reaction (PCR)ส�าหรบไพรเมอรSSR ชนด Glu-23, BADH และ RM587 มองคประกอบดงตอไปน DNA template 50 ng, 1X PCR buffer, 2mM MgCl

2, 0.2 mM

dNTP, 0.2μM reverse และforward primer, Taq DNA polymerase ปรมาณ 0.5μl.แลวปรบปรมาตรสดทายดวยน�ากลนนงฆาเชอใหครบ 10μl. ผสมองคประกอบตางๆ ใหเขากนดแลวจงน�าไปเขาเครองเพมปรมาณดเอนเอ Thermal cycler (Biometra) โดยตงอณหภมและเวลา ดงตอไปน 1) pre-denature อณหภม 95◦ซ 5 นาท 2) denaturation อณหภม 94◦ซ 30 วนาท 3) annealing อณหภม 55◦ซ 30 วนาท 4) extention อณหภม 72◦ซ 30 วนาท (ท�าปฏกรยาจากขนตอนท 2 ถงขนตอนท 4 จ�านวน 35 รอบ) 5) final extention อณหภม 72◦ซ 4 นาท จากนนตรวจสอบผลผลต PCR ดวยเทคนคเจลอเลกโตรโฟรซสโดยใชตวกลางชนด โพลอะครลาไมดเจล (polyacylamide gel) ทมความเขมขน 4.5 % เปนตวกลางในการแยก

KHONKAEN AG R.J. 46 (2) : 267-276 (2018). 269

Table 1 STS marker used for Xa21 gene selection.

marker sequence 5’-3’ PCR product (bp)

STSBB21-11F

STSBB21-11R

AGA CGC GGA AGG GTG GTT CCC GGA

AGA CGC GGT AAT CGA AAG ATG AAA

1,000

Source: Ronald et al. (1992)

2. กำรคดเลอกประชำกรโดยเครองหมำยโมเลกลคดเลอกยนตานทานโรคขอบใบแหง Xa21 ดวย

เค รองหมายโมเลกล STS โดยใช เค รองหมาย STSBB21-11 (Table 1) ในประชากรชวรน BC

1F

1,

BC2F

1 และ BC

2F

2 รวมกบเครองหมายโมเลกล

microsatellite (SSR) ชนด Glu-23, BADH และ RM587 เพอใชคดเลอกลกษณะ ความเหนยว ความหอม และความนมคลายกบขาวพนธ กข6

3. กำรประเมนควำมตำนทำนโรคขอบใบแหงเพาะเมลดขาวประชากร BC

2F

2:3 เปรยบเทยบ

กบพนธตานทานทดสอบ (resistant-check cultivar) ไดแก IR62266, IRBB5 และพนธออนแอทดสอบ (susceptible-check cultivar) ไดแก พนธขาวดอกมะล 105 (KDML 105) รวมกบขาวพนธ กข6, IRBB21 และขาวสายพนธ BC

2F

2:3 2-8-2-36 ทมยนตานทานโรคขอบ

ใบแหง xa5 ในถาดพลาสตกขนาด 105 หลม ซงมดนเหนยวบรรจอย วางแผนการทดลองแบบสมสมบรณ (completely randomized design; CRD) โดยจดสง ทดลองแบบแฟคทอเรยล (factorial) จ�านวน 3 ซ�า (ปลกขาวจ�านวน 3 ตน/1 ซ�า) ในสภาพเรอนทดลอง (greenhouse) เมอขาวมอาย 18 วน ใสป ยยเรย (46-0-0) อตรา 30 กก./ไร และเมอขาวมอาย 21วน หรอระยะทขาวมใบ 4-5 ใบ แลวจงน�าไปทดสอบความตานทานตอ

เชอสาเหตโรคขอบใบแหงในเดอนตลาคม 2559

ท�าการเลยงเชอแบคทเรย X. oryzae จ�านวน 3

ไอโซเลท (isolate) ไดแก CN2-1, MS1-2 และ NY1-1

ทไดรบความอนเคราะหจากมหาวทยาลยเกษตรศาสตร

วทยาเขตก�าแพงแสน ในอาหาร Nutrient Agar (NA)

เปนเวลา 72 ชวโมงเจอจางโคโลน (colony) ของเชอ

แตละไอโซเลตดวยน�ากลนนงฆาเชอ แลวน�าไปวดคา

การดดกลนแสง ดวยเครอง spectrophotometer

ทความยาวคลนแสง (OD) 600 nm ค�านวณหาคา

colony forming unit (CFU) ตอสารละลายเชอ

1 มลลลตรใหไดระดบความเขมขนของสารแขวนลอย

แบคทเรย (bacterial suspension) ทเหมาะสมตอการ

เกดเชอคอ 108cfu/ml (OD600

= 0.3) ท�าการปลกเชอดวย

วธตดใบ (clipping method) ตามวธของ Kauffman

et al. (1973) บนทกผลความตานทานตอโรคขอบใบแหง

14 วนหลงการปลกเชอ โดยพจารณาจากความยาวแผล

ทปรากฏบนใบขาวแลวประเมนเปนระดบความตานทาน

โรคโดยใชวธดดแปลงจากมาตรฐานของ (standard

evaluation system : SES) ของสถาบนวจยขาว

นานาชาต (International Rice Research Institute :

IRRI) (IRRI, 1996) ดงตอไปน (Table 2)

Table 2 Reaction of bacterial blight parameter.

Parameter reaction lesion length

(cm.)HR highly resistant < 1R resistant 1-3

MR moderately resistant 3-6MS moderately susceptible 6-10S susceptible >10

Source: modified from IRRI (1996)

4. กำรวเครำะหขอมล

น�าขอมลการประเมนความตานทานจากปฏกรยา

การเกดโรคมาวเคราะหความแปรปรวนทางสถต

(Analysis of variance; ANOVA) แลวเปรยบเทยบคา

เฉลยโดยวธ Least Significant Difference (LSD)

ทระดบความเชอมน 99เปอรเซนต (P < 0.01)

ผลกำรศกษำและวจำรณ

1. กำรสรำงและคดเลอกประชำกรโดยใชเครองหมำย

โมเลกล

การสรางประชากรในชวรน F1, BC

1F

1, BC

2F

1 และ

BC2F

2 ท�าการคดเลอกยนเปาหมายจากแถบดเอนเอท

ไดจากปฏกรยา PCR ดงตอไปน

ชวรน F1

ทมลกษณะเปน heterozygous (มแถบ

ดเอนเอ จ�านวน 2 แถบ ดานลางมขนาดเทากบ 700

คเบส เทากบขนาดแถบดเอนเอของพนธ กข6 และดาน

บนมขนาดเทากบ 1,000 คเบส เทากบขนาดแถบดเอนเอ

ของพนธ IRBB21 ทเปนพนธผใหยนตานทาน) ไดจ�านวน

6 ตน (Figure 1) แลวจงน�าไปผสมกลบไปยงขาวพนธ

กข6 เพอสรางประชากร BC1F

1

270 แกนเกษตร 46 (2) : 267-276 (2561).

KHONKAEN AG R.J. 46 (2) : 267-276 (2018). 271

ชวรน BC1F

1 คดเลอกประชากรดวยเครองหมาย

โมเลกล STSs เฉพาะตนทมลกษณะเปน heterozygous

เหมอนกบประชากรชว รน F1

ไดจ�านวน 28 ตน

คดลกษณะขาวเหนยวดวยเครองหมายโมเลกล Glu-23

คดเลอกประชากรทเปนขาวเหนยวไดจ�านวน 19 ตน

จากนนน�าไปคดเลอกลกษณะความหอม โดยใช

เครองหมายโมเลกลชนด BADH ไดขาวเหนยวทม

ความหอม จ�านวน 10 ตน ในการคดเลอกประชากรจาก

ลกษณะทปรากฏบนแถบดเอนเอของเครองหมาย

โมเลกล Glu-23 และ BADH จะคดเลอกเฉพาะแถบ

ดเอนเอทเหมอนขาว กข6 และม genotype อยในสภาพ

homozygous (rr) จ�านวน 10 ตน ใชผสมขามกลบไปยง

ขาวพนธ กข6 อกครงเพอสรางประชากร BC2F

1

ชวรน BC2F

1 คดเลอกประชากรดวยเครองหมาย

โมเลกล STSs เฉพาะตนทมลกษณะเปน heterozygous

เหมอนกบประชากรชวรน F1

จากนนเกบเมลดและน�า

ไปปลกแลวปลอยใหผสมตวเองเพอสรางประชากร

BC2F

2 คดเลอกดวยเครองหมายโมเลกล STS แตในชวรน

นไดคดเลอกเฉพาะตนทมลกษณะเปน homozygous

dominant ซงจะปรากฏลกษณะของแถบดเอนเอ จ�านวน

1 แถบ มขนาดเทากบ 1,000 คเบส ซงเทากบขนาดแถบ

ดเอนเอของพนธ IRBB21 (Figure 2) และคดเลอก

ลกษณะความนมดวยเครองหมายโมเลกล RM587

รวมกบการคดเลอกลกษณะทาง phenotype เฉพาะตน

ทคลายขาวพนธ กข6 มากทสดไดจ�านวน 9 ตน ปลอย

ใหผสมตวเองอกครงแลวจงเกบเมลดประชากร BC2F

2:3

ไวท�าการประเมนโรคขอบใบแหงโดยวธการปลก

เชอในล�าดบตอไป

Figure 1 Banding patterns amplified by STSs marker on 2% agarose gel, showing segregation of Xa21 gene in the F

1populations, RD 6 (recurrent parent), IRBB21 (donor parent), Lane 1-8= F

1 populations.

Figure 2 Banding patterns amplified by STSs marker on 2% agarose gel, showing segregation of Xa21 gene in the BC

2F

2 populations, RD 6 (recurrent parent), IRBB21 (donor parent), Lane 1-14= BC

2F

2

populations.

272 แกนเกษตร 46 (2) : 267-276 (2561).

2. กำรประเมนควำมตำนทำนโรคขอบใบแหง

จากการประเมนความตานทานตอเชอสาเหตโรค

ขอบใบแหง 3 ไอโซเลท พบวาเชอทง 3 ไอโซเลทมระดบ

ความรนแรงไมแตกตางกนทางสถต พนธ/สายพนธทใช

ทดสอบมความแตกตางกนอยางมนยส�าคญยงทางสถต

และพบปฏกรยาสมพนธระหวางพนธ/สายพนธกบเชอ

สาเหตโรคขอบใบแหง (Table 3)

Table 3 Analysis of variance of BC2F

2:3selected line

and check varieties against 3 isolates of

X. oryzae.

SOV Df MSIsolate (I) 2 0.44Genotype (G) 14 87.38 **

G x I 28 3.67 **Error 90 0.78

C.V. (%) = 20.28

** Significant at P<0.01 by LSD

ผลการเปรยบเทยบคาเฉลยความยาวแผลบน

ใบขาว (Table 4) พบวา ขาวพนธ กข6 (พนธผ รบ)

แสดงอาการออนแอตอเชอสาเหตโรคขอบใบแหงทง

3 ไอโซเลท โดยมความยาวแผล 9.57-12.90 เซนตเมตร

เชนเดยวกบพนธขาวดอกมะล105 (susceptible

check) ซงมความยาวแผล 11.20-14.53 เซนตเมตร

แตกตางทางสถตกบพนธตานทาน IRBB21 (พนธผ ให)

ทมความยาวแผล 4.20-5.43 เซนตเมตร และพนธ

ตานทาน IRBB21 มความยาวแผลแตกตางจากพนธ

ตานทานทดสอบ (resistance check) คอพนธ IRBB5

ทมความยาวแผล 0.73-1.07 เซนตเมตร (Figure 3,4,5)

เมอน�าคาเฉลยความยาวแผลไปแปลผลเปนปฏกรยา

ความตานทาน (Table 5) พบวาประชากรทผานการ

ปรบปรงพนธ 2 สายพนธคอ BC2F

2:3 2-17-71-6 และ

BC2F

2:3 2-19-86-9 นนแสดงปฏกรยาตานทานกบเชอ

ทง 3 ไอโซเลท โดยสายพนธ BC2F

2:3 2-17-71-6 แสดง

ปฏกรยาตานทาน (R) ตอไอโซเลท CN2-1 และ MS1-2

คอนขางตานทาน (MR) ตอไอโซเลท NY1-1 สวน

สายพนธ BC2F

2:3 2-19-86-9 แสดงปฏกรยาตานทาน

(R) ตอไอโซเลท MS1-2 และ NY1-1 คอนขางตานทาน

(MR) ตอไอโซเลท CN2-1 โดยทง 2 สายพนธแสดง

ปฏกรยาตานทานไดดกวาพนธ กข6 ทมปฏกรยาออนแอ

ตอเชอ ทง 3 ไอโซเลท แสดงใหเหนถงการปรบปรงพนธ

ขาว กข6 ในครงนสามารถเพมระดบความตานทานตอ

เชอสาเหตโรคขอบใบแหงไดดกวาขาว กข6 พนธเดม

แตไมถงกบมระดบความตานทานทสงมาก ดงนนวธการ

ทจะเพมความตานทานใหกบขาวสายพนธ BC2F

2:3

2-17-71-6 และ BC2F

2:3 2-19-86-9 ใหมความตานทาน

มากยงขน ควรมการรวมยนตานทานเขาดวยกนหลายๆ

ยน (gene pyramiding) โดยเฉพาะยน xa5 เปนยนหลก

ทนยมใชกนอยางแพรหลายในงานปรบปรงพนธขาวให

ตานทานตอโรคขอบใบแหง เนองจากสามารถตานทาน

การเขาท�าลายของเชอไดหลายไอโซเลท (Huang et.al.,

1997) ดงการศกษาของ Kottapalli et al. (2010) ทได

ท�าการ pyramiding ยน xa5, xa13 และ Xa21 เขาไวใน

ขาวพนธ Samba Muhsuri ใชเครองหมายโมเลกล STS

คดเลอกยนตานทาน ไดขาว Samba Muhsuri สายพนธ

ใหม ท มความตานทานตอเ ช อ ในระดบสงมาก

เมอเปรยบเทยบกบพนธออนแอ และพนธ Samba

Muhsuri สายพนธเดม สอดคลองกบ Huang et al.

(1997) ทสามารถรวมยนตานทานโรคขอบใบแหง

จ�านวน 4 ยนไดแก Xa4, xa5, xa13 และ Xa21 เขาไป

ในขาวและใชเครองหมายโมเลกลชนด RFLP และ PCR-

based marker ชวยในการคดเลอกเลอก ท�าใหสายพนธ

ทมการรวมยนตานทานโรคขอบใบแหงแสดงระดบ

ความตานทานทสงมากเมอเปรยบเทยบกบสายพนธทม

ยนตานทานเพยงยนเดยวทงนระดบความตานทาน

ตอเชอสาเหตโรคขอบใบแหงทแตกตางกนนน เปนไป

ตามกฎของ gene for gene interaction ทความ

ตานทานนนขนอยกบยนทมอยในขาว (host) และชนด

ของเชอสาเหตโรค (pathogen) (Kosack and Jones,

1997)

KHONKAEN AG R.J. 46 (2) : 267-276 (2018). 273

Figure 3 Reaction of lesion length to X. oryze isolate CN2-1

Figure 4 Reaction of lesion length to X. oryze isolate MS1-2

274 แกนเกษตร 46 (2) : 267-276 (2561).

Table 4 Means of lesion length of 9BC2F

2:3 population recurrent parent (RD 6) donor parent (IRBB21) and

1 susceptible check,2 resistant checksand BC2F

2:3 3-8-2-36 to 3 Bacterial blight isolate.

BC2F

2:3 population/ Varieties

Lesion length (cm.) of isolate1/

CN2-1 MS1-2 NY1-1BC

2F

2:3 2-17-66-4 3.13 de 2.67 cd 3.57 bcd

BC2F

2:3 2-17-71-4 3.13 de 1.77 de 3.77 bcd

BC2F

2:3 2-17-71-6 2.60 ef 2.63 cd 3.60 bcd

BC2F

2:3 2-19-86-9 3.50 cde 2.57 cd 2.43 def

BC2F

2:35-24-110-1 3.67 cde 3.00 cd 2.87 de

BC2F

2:35-24-110-2 5.27 cd 2.63 cd 3.73 bcd

BC2F

2:35-24-110-8 3.03 e 2.83 cd 4.07 bcd

BC2F

2:35-24-110-10 2.90 e 3.77 c 3.40 d

BC2F

2:36-51-38-3 3.03 e 2.93 cd 3.50 cd

RD 6 (recurrent parent) 9.57 b 12.90 a 10.00 aIRBB21 (donor parent) 5.40 c 4.20 c 5.43 bcKDML105 (susceptible check) 14.53 a 11.33 a 11.20 aIRBB5 (resistance check) 0.73 f 0.73 e 1.07 efIR62266 (resistance check) 2.73 ef 4.17 c 0.53 fBC

2F

2:3 3-8-2-36 3.63 cde 6.37 b 5.53 b

F-test ** ** **C.V. (%) 21.43 18.75 20.48

** = significant at P< 0.01. by LSD.1/Means in the same column followed by the same letter(s) are not significantly different at P< 0.01 by LSD

Figure 5 Reaction of lesion length to X. oryze isolate NY2-1

KHONKAEN AG R.J. 46 (2) : 267-276 (2018). 275

Table 5 Reaction of 9 BC2F

2:3 population recurrent parent (RD 6) donor parent (IRBB21) and 1 susceptible

checks 2 resistant checksand BC2F

2:3 3-8-2-36 to 3 Bacterial blight isolates.

BC2F

2:3 population/ Varieties

Reaction in isolate1/

CN2-1 MS1-2 NY1-1BC

2F

2:3 2-17-66-4 MR R MR

BC2F

2:3 2-17-71-4 MR R MR

BC2F

2:3 2-17-71-6 R R MR

BC2F

2:3 2-19-86-9 MR R R

BC2F

2:35-24-110-1 MR MR R

BC2F

2:35-24-110-2 MR R MR

BC2F

2:35-24-110-8 MR R MR

BC2F

2:35-24-110-10 R MR MR

BC2F

2:36-51-38-3 MR R MR

RD 6 (recurrent parent) MS S SIRBB21 (donor parent) MR MR MR

KDML105 (susceptible check) S S SIRBB5 (resistance check) HR HR RIR62266 (resistance check) R MR HR

BC2F

2:3 3-8-2-36 MR MS MR

1/Reactions;HR: highly resistance, R: resistance, MR: moderate resistance, MS: moderate susceptible and S: susceptible

สรป

จากการศกษาในครงนไดพฒนาขาว กข6 ใหม

ความตานทานตอโรคขอบใบแหงดวยวธผสมกลบ รวม

กบการใชเครองหมายโมเลกลชวยในการคดเลอกพบวา

ไดประชากร BC2F

2:3 จ�านวน 2 สายพนธ ทมลกษณะ

คลายกบขาวเหนยวพนธ กข6 มยนตานทานโรคขอบใบ

แหง Xa21 ทแสดงปฏกรยาตานทานไดปานกลางกบเชอ

สาเหตโรคขอบใบแหงทง 3 ไอโซเลท คอ BC2F

2:3 2-17-

71-6 และ BC2F

2:3 2-19-86-9 สามารถบอกไดถงความ

ไดผลในการปรบปรงพนธขาว กข6 โดยใชเครองหมาย

โมเลกล STS ทใชในการคดเลอกยนเปาหมาย Xa21 ได

อยางแมนย�า ถงแมขาวทผานการคดเลอกทง 2 สายพนธ

จะแสดงการตานทานปานกลางตอเชอสาเหตโรคขอบ

ใบแหงแตกแสดงใหเหนถงปฏกรยาตานทานทมากกวา

ขาว กข6 พนธเดม แตตองน�าไปปลกทดสอบในสภาพ

แปลงในฤดท�านาปกต เพอทดสอบปฏกรยาตานทานตอ

เชอสาเหตโรคขอบใบแหงในสภาพแปลงทดสอบ

หากขาวทผานการปรบปรงพนธสามารถแสดงปฏกรยา

ตานทานได กสามารถใชเปนเมลดพนธในการเพาะปลก

อกทงยงสามารถเปนประชากรพนฐานในการปรบปรง

พนธขาว กข6 ใหตานทานตอโรคขอบใบแหงไดดยงขน

ในอนาคต

ค�ำขอบคณ

ขอขอบคณศน ย วจยป รบป รงพนธ พ ช เ พอ

การเกษตรทยงยน มหาวทยาลยขอนแกนและศนยวจย

เทคโนโลยชวภาพทางการเกษตรเพอเศรษฐกจทยงยน

มหาวทยาลยขอนแกน ทไดสนบสนนงบประมาณและ

เชอพนธกรรมขาวในการศกษาครงน

276 แกนเกษตร 46 (2) : 267-276 (2561).

เอกสำรอำงอง

พยอม โคเบลล, จตตมา วงศหนองหวา, วราพงษ ชมาฤกษ,

สมทรง โชตชน, รศม ฐตเกยรตพงศวชชดา, รตนากาญจน

นชกานต ศลปประสทธ และธรดา หวงสมบรณด. 2557.

การใชเครองหมายโมเลกลชนด STSs ส�ารวจแหลง

พนธกรรมยนตานทานตอโรคขอบใบแหงของขาวพนธพน

เมองไทยทเกบรวบรวมไวทศนยปฏบตการและเกบเมลด

เชอพนธขาวแหงชาต. น.213-226. ใน: การประชมวชาการ

ขาวและธญพชเมองหนาวครงท 31 พ.ศ.2557. ส�านกวจย

และพฒนาขาว กรมการขาว, กรงเทพฯ.

จรพงศ ใจรนทร. 2556. การปรบปรงพนธขาวโดยใชเครองหมาย

โมเลกล.สมมนาเชงปฏบตการ การใชเครองหมายโมเลกล

เพองานปรบปรงพนธขาว 9-12 เมษายน 2556. ศนยวจย

ขาวอบลราชธาน, อบลราชธาน.

Chuwongse, J., G.B. Martin, and S.D. Tanksley. 1993.

Pregermination genotypic screening using PCR

amplification of half seeds. Theor. Appl. Genet. 86:

694-698.

Huang, N., E.R. Angeles, J. Domingo, G. Magpantay,

S. Singh, G. Zhang, N. Kumaravadivel, J. Bennett,

and G.S. Khush. 1997. Pyramiding of bacterial blight

resistance genes in rice marker-assisted selection

using RFLP and PCR.Theor. Appl. Genet. 95:

313-320.

IRRI. 1996. Standard evaluation system for rice. INGER,

Genetic Resources Center, International Rice

Research Institute, P.O. Box 933, 1099 Manila,

Philippines.

Jonaliza, L. S., B. Jongdee, G. Pantuwanc, and T. Toojinda.

2006. Developing KDML105 backcross introgression

lines using marker-assisted selection for QTLs

associated with drought tolerance in rice. Sci. Asia.

33: 207-214.

Kauffman, H.E., A.P.K. Reddy, S.P.Y. Hsieh, and S.D.

Merca. 1973. An improved technique for evaluating

resistance of rice varieties to Xanthomonas oryzae.

Plant Dis. 357: 537-541.

Khan, M.A., M. Naeem, and M. Iqbal. 2014. Breeding

approaches for bacterial leaf blight resistance in rice

(Oryza sativa L.), current status and future directions.

Eur. J. Plant Pathol. 139: 27–37.

Khush, G.S., D.J. Mackill and G.S. Sidhu. 1989. Breeding

rice for resistance to bacterial blight. pp. 207-217. In:

bacterial blight of rice. International Rice Research

Institute, Los, Banos, Manila, Philippines.

Khush, G.S., E. Bacalangco, and T. Ogawa, 1990.A new

gene for resistance to bacterial blight fromO.

longistaminata. Rice Genet. Newsl. 7: 121-122.

Kim, S.M., J.P. Suh, Y. Qin, T.H. Noh, R.F Reinke, and K.K.

Jena. 2015. Identification and fine-mapping of a new

resistance gene, Xa40, conferring resistance to

bacterial blight races in rice (Oryza sativa L.). Theor.

Appl. Genet. 128: 1933-1943.

Kosack, K.E.H., and J.D.G. Jones. 1997. Plant disease

resistance genes. Plant Mol.Biol. 48: 575–607.

Kottapalli, K.R., N.M. Lakshmi, and K.K. Jena. 2010.

Effective strategy for pyramiding three bacterial blight

resistance genes into fine grain rice cultivar, Samba

Mahsuri, using sequence tagged site markers.

Department of Plant and Soil Science, Texas Tech

University, Lubbock, TX, 79409, USA. Biotechnol. Lett.

32: 989-96.

Ou, S.H. 1985. Rice diseases. 2ndEdition. Commonwealth

Mycological Institute, England.

Ronald, P.C., B. Albano, R. Tabien, L. Abenes, K. Wu, S.R.

McCouch, and S.D. Tanksley. 1992. Genetic and

physical analysis of the rice bacterial blight disease

resistance locus, Xa21. Mol. Gen. Genet. 236: 113–

120.

Wanchana S., T. Toojinda, S. Tragoonrung, and A.

Vanavichit. 2003. Duplicated coding sequence in the

waxy allele of tropical glutinous rice (Oryza sativa L.).

Plant Sci. 165: 1193-1199.

Wang, G.L., W.Y. Song, D.L. Ruan, S. Sideris, and P.C.

Ronald.1996. The cloned gene, Xa21, confers

resistance to multiple Xanthomonascampestrispv.

oryzae isolate in transgenic plant. Molecular Plant-

Microbe Interaction. 9: 850-885.

Zhan, X.D., H.P. Zhou, R.Y. Chai, J.Y. Zhuang, S.H. Cheng,

and L.Y. Cao. 2012. Breeding of R8012, a Rice

Restorer Line Resistant to Blast and Bacterial Blight

through Marker-Assisted Selection. Rice Sci. 19: 29-35.