. ..................................... عادل ميساء د الخلية بايولوجية دراسة في العملي الكتابهادي

الرابع المختبرالخاليا لدراسة المجهرية التقانات

التقطيع Sectioning Methodطريقةوالغرض والخلوي النسجي مستواها على العينات لدراسة األهم وهي

الحصول منها , المقطع ويعرف جدا رقيق نسيجي مقطع رقيقة Sectionعلى شريحة بأنه

الخاليا ترتيب او تركيب دراسة لغرض حي كائن من مأخوذ جزء من تقطع . القطع طرق اما لها طريقتين :Method of sectioningالمكونة فتشمل

اليدوي أ- Hand sectioningالقطعشفرة او خاص سكين باستعمال الحرة باليد القطع يستخدمسميكة مقاطع الى وتقطع باليد تمسك مواد من مقاطع على للحصول

اآللي . بالقطع عليها الحصول يتم التى بالمقاطع مقارنة ما نوعااآللي ب- Mechanical sectioningالقطع

المقطاع او المشراح جهاز حيث Microtomeيستخدم النماذج لقطعمنها :- المشراح اجهزة من انواع عدة توجد

اليدوي -1 التقطيع .Hand microtomeجهازالهزاز -2 التقطيع .microtome Rockingجهازالدوار -3 التقطيع .Rotary microtomeجهازالمستدق -4 او الدقيق التقطيع .Ultramicrotomeجهاز

االلكتروني . بالمجهر للفحص السمك فائقة مقاطع لعمل يستخدم5-( الجليدي التقطيع .Cryostat )Freezing microtomeجهاز

شرائح على محملة نسجية مقاطع لعمل المتبعة الخطوات يلي فيما وزجاجية :

العينة 1- على )Sampling) Obtaining the specimenالحصولالعينة 2- Fixationتثبيتالعينة 3- Washingغسلالعينة 4- من الماء Dehydrationنزعالعينة 5- Clearingترويقالعينة 6 - تشرب أو Infiltrationتخليلالعينة 7- Embeddingطمر

. ..................................... عادل ميساء د الخلية بايولوجية دراسة في العملي الكتابهادي

Trimmingالتشذيب 8-Sectioningالقطع 9-

القطاعات - 10 Stainingصبغالشرائح- 11 مستديمة Mountingتغطية شريحة .Permanent slideلعملCleaning &Labelling- تنظيف ووسم)تعليم( الشرائح 12

: التفصيل من بشيء خطوة لكل نتطرق سوف و:Obtaining the specimen العينة على 1 - الحصول

خزعة بشكل اما العينة على خالل Biopsyنحصل المريض اإلنسان منإيقاف . بأنه القتل يعرف مباشرة قتله بعد الحيوان ومن الجراحية العملية

منها . وسائل بعدة القتل عملية تتم و الحيوية العمليات لجميع وسريع دائم. التخدير– – – الرأس مؤخرة ضرب التنخيع

بفصل Spinal dislocationالتنخيع : وذلك كامال شال الحيوان شل بها ويقصديحس ال وبذلك المخ أو المركزي العصبي الجهاز عن الشوكي الحبل

. الضفادع على يطبق ما وكثيرا التشريح عملية أثناء باأللم الحيوان : يصبح بحيث مفاجئ مخي ارتجاج إلى وتهدف الرأس مؤخرة ضرب

غيبوبة . حالة في بعدها الحيوانمخدرة: مادة بإستخدام الحيوية العمليات لجميع مؤقت إيقاف هو التخدير

الكلورفورم: مثل

:Fixation -2 التثبيت للفحوصات إخضاعها أجل من األنسجة تحضير في األولى الخطوة

النسيج على المحافظة إلى الخطوة هذه وتهدف والكيميانسجية النسجيةمن قريبة أو الحي الكائن جسم في عليها كان التي الحالة على ومحتوياته

والتداخالت الكيميائية التفاعالت خالل من التثبيت عملية وتتم ذلكللمواد الفعالة والمجاميع للمثبت الفعالة المجاميع بين الفيزيائيةإنزيمات ( – – – دهون بروتين كربوهيدرات النسيج في الموجودة الكيميائية

( - عملية- بإيقاف الناتجة التثبيت عملية تقوم و صبغات معدنية أمالحوالتفسخ نشاط Putrefactionوالتعفن Disintegrationالتفتت عن الناتجة

. ..................................... عادل ميساء د الخلية بايولوجية دراسة في العملي الكتابهادي

بفعل للنسيج الذاتي التحلل عملية إيقاف وكذلك والفطريات البكتيرياابرزها. :- اخرى فوائد الى باالضافة هذا اإلنزيمات

قدر -1 بأقل القطع وخاصة التالية العمليات امام لتصمد االنسجة تقسيةالتشوه . من

لعمليات -2 تعرضها عند االنكماش او االنتفاخ من النسيج خاليا حفظبالشمع . والتشرب الماء ازالة مثل مثل تالية

أفضل .-3 بشكل الصبغ تقبل على النسيج اجزاء قدرة تحسينالتمييز -4 يسهل بحيث النسيج مكونات لبعض االنكسار معامل تعديل

بينها .الساخن .-5 للشمع تعرضه اثناء للحرارة مقاومة اكثر النسيج جعل

: التالية النقاط مراعاة من البد التثبيت من المرجوة األهداف تتحقق وحتى-1. الدراسة من الغرض حسب للعمل المناسب المثبت اختيارعملية 2- لمنع الجسم من أخذها بعد مباشرة المثبت في العينة وضع

. والتفسخ التحللفي 3- العينة خالل بالنفاذ للمثبت يسمح بحيث صغير العينة حجم يكون إن

- على ( يزيد ال العينة سمك قصير (5-2وقت ملم العينة- )4 حجم أضعاف عدة المثبت حجم يكون (.20-10إن ضعف المستخدم- 5 المثبت حسب للتثبيت الالزمة الزمنية بالفترة التقيد ضرورةالنسيج- 6 مكونات على المثبت سيتركها التي اآلثار االعتبار في األخذ

. التثبيت بعد الخاليا وتركيبفي- 7 العينة وضع يجب طارئة حاله في المناسب المثبت يتوفر لم إذا

. المناسب المثبت توفر حين إلى النيتروجيني السائلبعد- 8 مرات عدة المثبت برج وذلك المثبت في بأكملها العينة غمر يجب

. بالمثبت العينة أسطح جميع تتبلل حتى فيه العينة وضع

Fixative المثبت

على يعمل بعضها كيميائية مواد على يحتوي سائل وسط عن عبارة هوالتخثير طريق عن الخلوية بين والمواد للخاليا الكيميائي المحتوى تثبيت

. المثبتات من التشوه من النسيج خاليا على والمحافظة والترسيب% : الفورمالين الضوئي بالمجهر للفحص محلول Formalin 10الشائعة ،

. ..................................... عادل ميساء د الخلية بايولوجية دراسة في العملي الكتابهادي

بوين Zinker Solutionزنكر او بوان محلول ،Bouin Solution محلول ، :Carnoyكارنوي بالمجهرااللكتروني للفحص الشائعة المثبتات ومن ،

الكلوترالديهايد االزميوم Gluteraldehydeمحلول اوكسيد Osmiumورابعtetraoxide.

: الجيد المثبت شروط- 1. وبسرعة بسهولة األنسجة يتخلل 2. العادية- الحرارة درجة في يعمل

3. بالنسيج- ضرر يحدث ال4. التقطيع- سهل قوامه يصبح بحيث ما نوعا النسيج تيبس على يعمل5. العينة- صبغ عند المختلفة الصبغات مع يتعارض ال6. طويلة- لمدة مفعولة يستمر7. األنسجة- تحلل على تساعد التي والفطريات الجراثيم يقتل8. النسيج- على أصباغ أو سيئة جانبيه آثار أي المثبت يترك ال أن9. باستمرار- ومتوفرا مناسبا سعره يكون أن

: التثبيت عملية على المؤثرة العوامل-1 : بين ما يكون أن يجب للمثبت الهيدروجيني األس 8-6األس زيادة ألن

درجة على الحصول ويمكن األنسجة يتلف النقصان أو الهيدروجينيمنظم . محلول باستخدام Bufferالحموضة

-2 : المكان حرارة درجة بزيادة النفاذ سرعة تزداد المكان حرارة درجةأال صحيح والعكس

( الحرارة درجة تكون أن يفضل لذا األنسجة تتلف العالية الحرارة (25أن. مئوية درجة

-3 ( : طرديا العينة حجم مع يتناسب وكميته المثبت ضعفا (.20-10تركيز-4. : المثبت نوع مراعاة ويجب طرديا العينة حجم مع تتناسب التثبيت مدة

الغسل- 3 Washing عمليةعلى المثبت أثر من تبقى ما إلزالة ذلك و التثبيت بعد العينة غسل يجب

. بالكحول يغسل بوان مثبت في المثبتة العينات مثال % 70العينة حتى

. ..................................... عادل ميساء د الخلية بايولوجية دراسة في العملي الكتابهادي

. بالكحول زنكر في المثبتة العينات تغسل األصفر اللون مشبع % 96يزولمن تترواح الغسيل ومدة . 8- 5باليود مثبت في المثبتة العينات ساعات

بالكحول تغسل بماء% . 96روسمان تغسل الفورمالين في المثبتة العيناتلمدة الجاري ساعة .24الصنبور

4-) ( االنكاز الماء نزع Dehydration : عمليةفي الموجود الماء محل مادة إحالل بواسطتها يتم التي الطريقة وهي

الخطوات في المستعملة والمواد المحاليل فيها تذوب المادة هذه النسيجسلسلة في العينة بتمرير العملية هذه وتتم النسيج تشويه عدم مع القادمة

اإلثيلي الكحول من التركيز في االرتفاع )ethanol)ethyl alchoholمتدرجةمباشرة مطلق كحول في وضعت لو حالة في األنسجة انكماش لمنع( الزايلين الزايلول مادة ومع الماء مع بسهوله يمتزج ألنه الكحول ويفضل

xylene. البرافينية( الطمر مادة مع جيدا تمتزج بدورها والتي المروقةالموجود الماء من التخلص يجب لذلك البرافين شمع مع الماء يمتزج ال

داخل إلى المصهور البرافين نفاذ عملية تسهل حتى الخلوي النسيج فياالرتفاع متدرجة سلسلة على العينة بتمرير الماء نزع عملية وتتم األنسجة

( االيثيلي الكحول محاليل من التركيز (100،}% 90،}% 70،% 50في % الماء نزع خطوات من خطوة كل في العينة لترك الالزمة المدة وتترواح

من التركيز المختلفة الكحول محاليل ساعات .30في ثالث إلى دقيقة

5-: الترويق Clearin g عمليةحيث الماء نزع مادة محل ماده إحالل يتم بواسطتها التي العملية هي

في األنسجة إلى بالدخول البرافين شمع لمادة بالسماح العملية هذه تقومشمع مع يمتزج ال الماء نزع في المستخدم الكحول ألن الالحقة الخطوة

البرافين وشمع الكحول في تذوب مروقه ماده تستخدم لذا البرافين– ( . الزايلول المروقه المواد أمثلة من شفافا النسيج تجعل وكذلك

) – الزايلول – – استخدام وعند األرز خشب زيت بنزين تولوين الكلورفورمعلى دليل وهذا الترويق مادة محلول لون يتعكر أن أحيانا يحدث والتولوينالعينة إرجاع يجب الحالة هذه في العينة نسيج من الماء نزع اكتمال عدمالمدة أما تام بشكل الماء نزع عملية من للتأكد الكحوالت سلسلة إلى

. ..................................... عادل ميساء د الخلية بايولوجية دراسة في العملي الكتابهادي

وحجم نوع على يعتمد فهذا المروق المحلول في العينة لترك الكافية. الترويق مدة زادت كلما العينة حجم زاد فكلما العينة

أنسب من الزيلول محلول يعتبر لذا البرافين شمع مع الكحول يمتزج المواد وهناك والكحول البرافين مع امتزاجه لسهولة المروقة المحاليل

ولكنها والكلوروفورم والبنزين التولوين مثل كمروقات استخدامها يمكنالتطاير . سريعة

6 . التخلل- أو التشرب Impregnation or Infiltration عمليةالمادة مكان الطمر في المستخدمة للمادة كامل إحالل عن عبارةتشريب في المستخدمة المواد أشهر من البرافين شمع ويعتبر المروقة،

النسيجي، بتركيبها ضرر إحداث دون بسرعة العينة يتخلل أنه حيث النسيجعلى ويساعد بالميكروتوم، للقطع لتهيئتها قوية دعامة يكسبها أنه كما

. العملية وتتم أذى أي دون طويلة لفترة العادية الظروف في حفظها ( المروقة والمادة الشمع من متساوي مزيج في العينة ( 1:1بتمرير ثم

هذه وتكرر الفرن داخل المنصهر المطلق البرافين شمع إلى العينة تنقل( مرات لعدة ( 3-2العملية تعتمد كما ساعة، نصف لمدة مرة وكل مرات

العينة كانت كلما تقل بحيث العينة نوع حسب الشمع تغيير مرات عدد . التشرب اوساط على االمثلة من صلبة العينة كانت كلما وتزداد رخوة

البرافين Paraffinشمع wax مثل البالستيكية اللدائن تستعمل بينماAraldite = بالمجهر حص للفص المحضرة للنماذج التشرب عملية في

االلكتروني .

:Embedding7- الطمر عمليةالمادة بها تحيط بحيث العينة من قالب عمل منها الغرض عملية وهيجاهزة لتكون كليهما من متماسكة طبقة لتتكون وتدعمها الطامرة

المواد تكون الغالب وفي التقطيع سكينة على مرورها اثناء بثبات للتقطيع. التشرب عملية في المستخدمة المادة نفس هي للطمر المستخدمة

بعدها به، المرغوب باالتجاه العينة توضع و ملقط باستخدام العينة توضع

. ..................................... عادل ميساء د الخلية بايولوجية دراسة في العملي الكتابهادي

استعدادا سطحه ليبرد قصيرة فترة ثلجي سطح على القالب يتركللتقطيع .

التشذيب- 8 Trimming عمليةحتى حادة بشفرة تشذيبها يستحسن الشمعية القوالب تحضير بعد

وضع في العينة تصبحعلى تنطبق أن يمكن و متوازية أطرافها تصبح بحيث للتقطيع مناسب

. الميكروتوم سكين حافة

العينة- 9 Sectioning تقطيعspecimen تثبت العينة على حامل العين}}ة holderفي الميكروت}}وم

كما يجب أن يزود جهاز القطع بسكين ح}}ادة ج}}دا ويح}}دد س}}مك القط}}اع ميك}}رون(15-10 ميك}}رون ( للب}}ارافين وبس}}مك )7-3المرغ}}وب في}}ه)

لقطع مقاطع المجهرglass knivesللسللويدين( تستعمل سكاكين زجاجية ، القطاع}}ات الجي}}دة ع}}ادة gridااللكتروني وتحمل على مشبك نحاس}}ي

أو سلس}}له من القطاع}}ات ويفض}}لRibbonsتكون على شكل أش}}رطة أن توضع هذه األشرطة على صفيحه سوداء حتى يسهل تمييز القطاعات

وأخذ المناسب منها لوضعه على الشريحة الزجاجية .

Hand microtome Cryostat

. ..................................... عادل ميساء د الخلية بايولوجية دراسة في العملي الكتابهادي

الصبغ- 10 Staining عمليةالنه ذلك المجهري التحضير في جدا حاسمة مرحلة التصبيغ عملية

تفقد وبالتالي مكوناتها تمييز يصعب فانه لالنسجة مناسب صبغ بدونمعامل في الفروق من تزيد التصبيغ عملية الن اهميتها التحضير عملية

نتيجة هذا ويحدث تمايزها الى يؤدي مما والخلية النسيج مكونات انكسار. توجد الصبغات لمعظم النسيج او الخلية مكونات بعض ميل في الفرق

هي : االنسجة صبغ لتفسير نظريتانكيمياوي : " -1 تفاعل عن عبارة الصبغ ان على تنص الكيمياوية النظرية

الموجب الشق بين ملحية مادة تكوين على الشق cationيعتمد أواو anionالسالب الخلية في معينة كيمياوية مجموعات وبين للصبغة

للحامض" محبات اما االنسجة تكون االساس هذا وعلى النسيجacidphilic مع تتفاعل الحالة هذه وفي قاعدية مجموعات وتحتوي

للقاعدة محبات او الحامضي مجموعات basophilicالصبغ وتحتويالقاعدية . الصبغة مع تتفاعل حامضية

2-" : على تنص افتراضات على النظرية هذه ترتكز الطبيعية النظريةواالدمصاص االمتصاص مثل طبيعية بوسائل يتم التصبيغ ان

. والتنافذ واالنتشار الشعرية والخاصيةعمليات عن ينتج الصبغ ان هو الحاضر الوقت في السائدة الفكرة ان

واحد . ان في وطبيعية كيمياويةالصبغات Classification of stains تصنيف

للصبغة :أ- الهايدروجيني االس لتركيز تبعا الصبغات تقسيمالقاعدية -1 حاوية basic stainsالصبغات الصبغة تكون عندما وذلك

الملونة غير الحامضية الجذور مع تتحد ملونة عضوية قاعدة علىامثلتها ومن الكبريتات او الكلوريدات او الخالت كجذر لالنسجة

السفرانين .Haematoxylinوالهيماتوكسلين Safraninصبغة

الحامضية -2 تكون acidic stainsالصبغات التي الصبغات تلك هيمعدنية قاعة مع تتحد ملونة عضوية حامضية جذور على حاوية

metallic base الباهتة الخضراء صبغة مثل لالنسجة غيرملونةLight green االيوسين .Eosinوصبغة

. ..................................... عادل ميساء د الخلية بايولوجية دراسة في العملي الكتابهادي

المتعادلة -3 neutralالصبغات stains صبغات من مركبة وتكونالمتعادل االحمر مثل وقاعدية .neutral redحامضية

بها :ب- لالصطباغ البروتوبالزم اجزاء ميل حسب الصبغات تقسيمالنووية -1 لصبغ nuclear stainsالصبغات تميل التي الصبغات تلك هي

لالصطباغ تميل لذا النووية بالحوامض غنية النواة ان وبما النواةصبغات هي النووية الصبغات جميع فان لذا القاعدية بالصبغات

قاعدية.السايتوبالزمية -2 cytoplasmicالصبغات stains الصبغات تلك هي

طبيعة ذو السايتوبالزم لكون ونظرا السايتوبالزم لصبغ تميل التيأي الحامضية بالصبغات لالصطباغ يميل يميل فانه لذا قاعدية اكثر

حامضية . صبغات هي السايتوبالزمية الصبغات ان

من البرافين شمع يزال أن يجب البرافين شمع استعمال عندهو الزيلول من التخلص يجب ثم ومن الزايلول باستخدام تماما القطاعات

للبيئة مشابهه بيئة إلى القطاعات نقل يجب بعدها المطلق، بالكحول اآلخر .) ( الصبغة نوع على تعتمد الصبغ ومدة كحولية أو مائية الصبغة فيها المذابة

يلجأ قد أو صبغه من بأكثر النسيج يصبغ وقد النسيج وطبيعة وتركيزهالصبغ الهيماتوكسلين صبغة كاستخدام المضاد الصبغ يسمى ما إلى الباحث( ) صبغة) السيتوبالزم لصبغ األيوسين وصبغة نووية صبغة األنوية

المجهر(. عينات صبغ في المستعملة الصبغات من سايتوبالزميةاليورانيل خالت صبغة الرصاص Uranyl acetateااللكتروني سترات وصبغة

Lead citrate.

القطاعات- :11 Mounting تحميلهذه تم و الزجاجية، الشريحة على النسيجي القطاع وضع بها يقصد

الشريحة إعداد عملية تبدأ اذ الصبغ عملية من االنتهاء بعد العمليةالمست}ديم للح}}فظ بالستيكيةالمجهرية أو مادة مادة شمعية باستخدام

( ثم يوضعD.P.X أو مادة ) Canada balsamحافظه مثل مادة بلسم كندا

. ..................................... عادل ميساء د الخلية بايولوجية دراسة في العملي الكتابهادي

درجة وبحذر شديد حتى45(( بزاوية حادة Cover slipغطاء الشريحة Airال تتك}}ون فقاع}}ات هوائي}}ة bubblesوهك}}ذا يتم عم}}ل م}}ا يع}}رف

permanentبالش}}ريحة المس}}تديمة slideبع}}د أن ت}}ترك لتج}}ف على . مجفف الش}}رائح يمكن فحص القطاع}}ات تحت المجه}}ر. ان الغ}}رض من تغطية الشرائح لتسهيل دراستها تحت المجهر ألن التحضيرات المصبوغة وغير المغطاة التظهر االقليال من التفاصيل لكون معامل انكسار ك}}ل من زجاج الشريحة ومكونات النس}}يج مختلف}}ة تمام}}ا وتتحس}}ن امكاني}}ة رؤي}ة مكونات النسيج اذا غطيت بمادة ش}}فافة يك}}ون معام}}ل انكس}}ارها قريب}}ا من معام}}ل انكس}}ار الزج}}اج . كم}}ا ان الغط}}اء يحمي التحض}}ير وخاص}}ة المق}}اطع من التهت}}ك واالزال}}ة من على الش}}ريحة كم}ا يقل}}ل الغط}}اء من اكسدة الصبغة وبالتالي يمنع فسادها. ويكمن ان تك}}ون وس}}ائط التغطي}}ة

الجليسرول دائمية مثل مادة بلسم كندا مثل مؤقتة .glycerolاو

Cleaning &Labelling- تنظيف ووسم)تعليم( الشرائح 12الغطاء جوانب حول من الزائد التحميل وسط ويزال الشرائح تنظف

يكتب الشريحة طرف على مناسبة ورقة توضع الشريحة لتعليم وبالنسبةالتحضير . وتاريخ والصبغة والمثبت النسيج نوع عن معلومات عليها

تتم الخطوات السابقة بشكل يدوي بينما في مختبرات األمراض التي يتم فيها أجراء فحوصات روتينية لعين}ات كث}}يرة تت}}}م باست}}}خدام أج}}}هزة

Tissueحديث}}}ة منه}}ا جه}}از معامل}}ة األنس}}جة األوتوم}}اتيكي Auto processor.

التجميد method freezing تقنية

منه ويعمل ويصلب يجمد المثبت أو الطري النسيج الطريقة هذه في(. بالكريوستات يسمى ما أو الثلجي بالميكروتوم (cryostatقطاعات

مميزاتها:التي -1 الجراحية العمليات خالل عادة تستخدم وبسيطة سريعة طريقة

. للسرطانات سريعا تشخيص تطلب

. ..................................... عادل ميساء د الخلية بايولوجية دراسة في العملي الكتابهادي

استخدام -2 عدم بسبب تتغير ال النسيج في الموجودة الكيميائية الموادالحرارة .

الخلوية -3 األنزيمات فعالية لدراسة األنسجة كيمياء في تستخدموتفاعل والزايلين الكحول في تذوب التي الدهون عن والكشف

. األنتيجينات مع المضادة األجسامعيوبها:

المقاطع . -1 من سلسله تعطي الالتصبيغ . -2 و القطع صعوبة بسب سميك قطاعات تعطي

العملي : الجزء: المستعملة واالجهزة المواد

فورمالين الحي، الكائن من مباشرة مأخوذة ،% 10انسجة ،ايثانولزجاجية ،شرائح ،مايكروتوم كهربائي برافين،فرن ،شمع زايلين

( ماير ،اح ،ايوسين ،هيماتوكسلين تسخين ،صفيحة 1البومين : 1واغطيتها. بلسم( ،كندا كليسرول

1-. نباتية أو حيوانية ألنسجة مقاطع على حاوية شريحة حضر2-. حدة على مرحلة كل دفترك في ارسم

الضوئي بالمجهر للفحص العينات لتحضير المختلفة العمليات بين مقارنةوااللكتروني

Table Light microscope Electron microscope

Sample Size 1 cm 1 mm

Fixative Formaldehyde Glutaradehyde

Post-Fixation None Osmium Tetroxide

Dehydration Graded Alcohol Alcohol or Acetone

Clearing Agent Xylol/Toluene Propylene Oxide

Embedding Material Praffin Various Plastics

. ..................................... عادل ميساء د الخلية بايولوجية دراسة في العملي الكتابهادي

Section Thickness 5-10µ 60-90 nm

Stains Colored dyes Heavy Metals