Viabilität und Charakterisierung von Stammzellen

R.G. Turan

Bone Marrow Nerve Cells Heart Muscle Cells

Pancreatic Islet Cells

Was sind Stammzellen ?

Wie kann man sie gewinnen ?

Wie kann man sie nutzen ?

STAMMZELLEN…

„Relatively undifferentiated cells of the same lineage that retain the ability to divide and cycle throughout postnatal life to provide cells that can become specialized and take the place of those that die or are lost.“ (NCBI MESH Definition, 1984)

Relativ undifferenzierte derselben Linie, welche auch nach der Geburt die Fähigkeit behalten haben, sich zu teilen und einen Zyklus zu durchlaufen. In diesem Zyklus entstehen Zellen, welche sich spezialisieren und verlorene Zellen ersetzen können.

Eigenschaften von Stammzellen

Können alle Zellarten formen

Können sich selbst erhalten

Können Gruppen von Zellarten formen

Von einer Zelle zum Organismus

Bone Marrow Nerve Cells Heart Muscle Cells

Pancreatic Islet Cells

„Um das Leben der Menschen zu verlängern“

(Individiuum/Spezies)

Organregeneration

Organreparatur

Organersatz

Klonen

Warum Stammzellen?

Embryonale Stammzellen

Fetale Stammzellen

Neonatale Stammzellen

Adulte Stammzellen

STAMMZELLEN

Zel

lzah

l

Fäh

igke

iten

Befruchtete Eizelle (Zygote)• bildet einen kompletten funktionsfähigen

Organismus• Vorkommen: nach der Befruchtung

Embryonale Stammzellen• können einen Verbund von Organsystemen

bilden• Vorkommen: Blastozyten, Keimblätter

Fetale Stammzellen• können Organsysteme bilden• Vorkommen: Organanlagen

Neonatale Stammzellen• Blutbildung und weitere Fähigkeiten• Vorkommen: : NabelschnurblutAdulte Stammzellen• Blutbildung und weitere Fähigkeiten• Vorkommen: : KM, PB, Haut, Gehirn, Leber, ...

Embryonale Stammzellen

Therapeutisches Klonen

Embryonale Stammzellen

Vorteile: Nachteile:

• Können beliebige Körperzellen formen

• Unsterblich als Zelllinie

• Gewinnung einfach, aus überflüssigen Embryos bei der in-vitro-Befruchtung

• Differenzierungsprozess ist schwer zu kontrollieren

• Eventuelle Abstoßung durch Empfänger (nicht autolog)

• Ethische Probleme bei Gewinnung

Neonatale Stammzellen

Neonatale Stammzellen

• Leukämie

• Diabetes ?

• Parkinson ?

• Hautersatz ?

• Rheuma ?

• Schlaganfall ?

• Myokardinfarkt

• Krebs ?

Vorteile: Nachteile:

• Einfach und risikolos zu gewinnen

• Keine ethischen Probleme

• Autolog und heterolog einsetzbar

• Nur bei der Geburt zu gewinnen

• Nur begrenzte Menge

• Weniger Plastizität als embryonale Stamm-zellen• Meist frei von Viren

• Frei von Tumorzellen

Neonatale Stammzellen

Adulte StammzellenDefinition

• Adulte Stammzellen sind undifferenzierte Zellen, die in differenzierten Geweben erwachsener Organismen vorkommen und dort gewebespezifische Zellen und neue adulte Stammzellen bilden.

• Quellen sind Knochenmark, Blut, Hornhaut und Netzhaut des Auges, Gehirn, Skelett-muskeln, Zahnmark, Leber, Haut, Darmwand und Bauchspeicheldrüse.

Adulte StammzellenPlastizität

…Fähigkeiten von

adulten Stamm-

zellen, die aus

einem Gewebe

gewonnen

wurden, Zellen

eines anderen

Gewebe zu bilden

Adulte StammzellenGewinnung

KM-Biopsie PB

Vorteile: Nachteile:

• Mehrfach zu gewinnen

• Große Zellzahl

• Ethisch unbedenklich

• Infektionsrisiko

• Allogene Abstoßung

• Können sich begrenzt vermehren

• Bessere Kontrolle als ES

Adulte Stammzellen

Detektion von Stammzellen

CD34

CD133

CD34+CD38-

CD34+Sca1+Lin-

Thy-1

Nestin

SSEA-3

SSEA-4

BMPR

…..

Detektion von StammzellenFACS

Migrationsassay

Isolation of MNCs

3x106 Cells/ml

Boyden chamber

M em bran with porosities

Upper cham ber with cells

lower cham ber with chem okine(SDF or VEGF)

Migration

with SDF

Migration

with VEGF

Migration without

chemokine

blood orbone marrow

Mononucleare cells

blood orbone marrow

Isolation of MNCs

Mononucleare cells Methylcellulose

1x105 Cells/ml

Colony Forming Unit (CFU)

CFU (granulozyten

and macrophages)

CFU (erythrozytes)

after Incubation (14 days)

Mobilisierung von Stamm- und Progenitorzellen aus dem Knochenmark

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/utils/lofref.fcgi?PrId=3051&uid=12584367&db=pubmed&url=http://content.nejm.org/cgi/pmidlookup?view=short&pmid=12584367

0

100

200

300

400

500

600

20 40 60 80

Age (years)

CD

34/C

D45

+ B

M-E

PC

s (/

1x10

6

WB

Cs)

r = -0,58

p < 0,001

0

20

40

60

80

100

120

20 40 60 80

Age (years)

CD

133/

CD

45+

BM

-EP

Cs

(/1x

106

WB

Cs)

r = -0,43

p = 0,003

0

100

200

300

400

500

600

0 20 40 60 80 100

Infarct size (%)

CD

34/4

5+ B

M-E

PC

s (/

1x10

^6

WB

Cs)

r = -0,81

p < 0,001

0

20

40

60

80

100

120

0 50 100

infarct size (%)

CD

133/

45+

BM

-EP

Cs

(/1x

106

WB

Cs)

r = -0,54

p < 0,001

0

100

200

300

400

500

600

20 40 60 80

global EF(%)

CD

34/4

5+ B

M-E

PC

s (/

1x10

6

WB

Cs)

r = 0,71

p < 0,001

0

20

40

60

80

100

120

20 40 60 80

global EF (%)

CD

133/

45+

BM

-EP

Cs

(/1x

106

WB

Cs)

r = 0,40

p = 0,006

Die Anzahl von CD34 und CD133 im PB bei Patienten mit AMI vor, mitte sowie nach der REHA (n=17)

CD34

CD34

CD34

CD133CD133

CD133

0

50

100

150

200

250

300

350

400

CD

34

/CD

13

3+

(1

0^

6 W

BC

)

CD34 245 298 369

CD133 46 68 100

vor REHA mitte REHA nach REHA

Die Anzahl der CD34 und CD133 bei Pat.mit AMI ohne REHA (n=5)

CD34

CD34

CD133 CD133

0

50

100

150

200

250

CD

34

+/C

D1

33

+ (

10

^6

WB

C)

CD34 220 200

CD133 60 65

10 Tage nach AMI nach 3 Wochen

Migrationsassay bei Pat.mit AMI vor und nach REHA (n=17)

0

50

100

150

200

250

300

350

Mig

rie

rte

Ze

lle

n i

n %

SDF (100ng/ml) 136 232

VEGF (100ng/ml) 151 302

vor REHA nach REHA

Migrationsassay bei Pat.mit AMI ohne REHA (n=5)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Mig

rie

rte Z

ell

en

%

SDF (100ng/ml) 132 112

VEGF (100ng/ml) 142 118

vor REHA nach REHA

Mobilisation of BM-cEPCs in PB

Bone marrow (BM)

Myocardial regeneration

Acute Myocardial Infarction (AMI)

• Mobilisation nach AMI von KM ins PB

• Altersabhängig

• Positiver Einfluss auf die Mobilisation der Stammzellen durch regelmäßige körperliche Aktivität

• Mehrere Faktoren wie CVRF, Infarktgröße, Entzündungs-parameter (CRP, Leuk.)

Applikationsformen bei der Zelltherapie der

koronaren Herzerkrankung

Koronare Zelltherapie bei AMI

Referenz

Strauer et al.(Circ 2000)

(AHA 2003)*

Assmus et al.(Circ 2000)

(JACC 2004)*

Wollert et al.

Zelltyp

BMC (40 ml) vs Kontrolle

BMC (50 ml) vs EPC (250 ml) vs Kontrolle

BMC vs Kontrolle

Pat.(n)

10

40

20

59

60

Effekte

• Hypokinetisches Areal • Kontraktilität Infarktregion (LVA)

• Endsystol. Volumen (LVA)• Perfusion (TI-Szintigraphie)

• Globale + regionale EF (LVA, MRT, Echo)

• Endsystol. Volumen • Vitalität (PET, MRT)• Koronare Flussreserve (i.c. Doppler)

• Globale EF (MRT)

*aktualisierte Anzahl an Patienten, Scientific Sessions, AHA, 2003

Zelltherapie: Patienten mit ischämischer Kardiomyopathie

Referenz

Interventionell

(AHA 2004)*

Perkutan-interventionell

Tse et al.

Fuchs et al.

Perin et a.

Zelltyp

BMC (40 ml) vs Kontrolle

BMC (40 ml)

BMC

BMC vs Kontrolle

Pat. (n)

Intrakoronare Injektion

20

Intramyokardiale Injektion (NOGA)

8

10

14

Effekte

• Endsystol. Volumen (LVA)• Perfusion (TI-Szintigraphie)

• Regionale Wandbewegung undDickenzunahme (LVA)

• Stress-induzierte Ischämie (MRT)

• Globale EF (LVA, Echo)• Endsystol. Volumen

A. femoralis communis

M. quadriceps femoris

M. gastrocnemius

Zelltherapie: Patienten mit pAVK

Zelltherapie: Patienten mit pAVKKnöchel-Arm-Index

0,7

0,6

0,8 0,8

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

in Ruhe nach Belastung

p=0,012 p=0,008

vor Transplantation 2,2 ± 0,4 Monate nach Transplantation

Totale Gehstrecke(Laufband, 12% Steigung, 2 km/h)

122

424

050

100150200250300350400450

Gehstrecke

Me

ter

p=0,005

O2-Sättigung in 12 mm Tiefe

5753

6764

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Oberschenkel Unterschenkel

p=0,008 p=0,012

Venenverschlußplethysmographie

2

5

2,7

6,7

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Arterielle Ruhedurchblutung Reaktive Hyperämie

ml/1

00m

l Gew

ebe/

min

p=0,008

p=0,011

vor Transplantation 2,2 ± 0,4 Monate nach Transplantation

Schwere AutoimmunerkrankungenAussicht auf Heilung durch Stammzellen

Diabetes Typ IH. Zulewski, Ther Umschau 2002

Multiple SkleroseA. Fassas, J Neurol 2002

Morbus Crohnwww.pr.uni-freiburg.de

Rheumatoide ArthritisR. Verburg, Arthritis Rheum 2001

Lupus erythematosusN.M. Wulffrath, Arthritis Rheum 2001

Mögliche Einsatzgebiete der Zelltherapie

Nervenzellen:• Schlaganfall, multiple Sklerose, Alzheimer, Parkinson, etc.

Endothelzellen:• Arteriosklerose, ischämische Bereiche des Gehirns,

Schlaganfall, etc.

Kardiomyozyten:• Herzinfarkt, chronische Herzerkrankung

Fibrolasten und Keratinozyten:• Wundkrankheiten, Hautverbrennungen

Chondrozyten:• Osteoarthritis oder rheumatischer Arthritis

Time Line

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009

Heart Infarct

Stroke/ParkinsonDiabetes

Artificial Liver

Heart FailureLiver Replacement

AlzheimerHuntington

Spinal Cord Injury

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit