Validation des méthodes alternatives d’analyse Détection ... · 18/12/2007 Validation initiale...
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AdGène laboratoire 1 rue des conquérants – 14220 Thury-Harcourt – www.adgene.fr
Email : [email protected] / tel : 02 31 15 62 80 / fax : 02 31 15 62 85
BIO-RAD 3 boulevard Raymond Poincaré 92430 MARNES LA COQUETTE
Marque NF Validation
Validation des méthodes alternatives d’analyse Détection et
quantification des Legionella spp
Renouvellement des kits iQ-Check® Legionella spp. pour la recherche et le
dénombrement des légionelles dans les eaux de réseau chaudes et les tours
aéroréfrigérantes
N° d’attestation BRD 07/15 – 12/07
Rapport de synthèse
Ce rapport comprend 15 pages dont 0 annexe. La reproduction de ce rapport n’est autorisée que sous sa forme
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Version 1.1
7 juillet 2016 Annule et remplace la version précédente L’ancienne version doit être détruite.
2 AdGène laboratoire iQ-Check® Legionella spp. Rapport de synthèse V1.1
Table des matières
Rappel sur la méthode commerciale d’analyse ...................................................................................... 3
Date de première attribution de la marque NF Validation ................................................................. 3
Principe de la méthode ....................................................................................................................... 3
Références du protocole : ................................................................................................................... 4
Domaine d’application ........................................................................................................................ 4
Restrictions .......................................................................................................................................... 4
Méthode de référence ........................................................................................................................ 4
Historique de la validation ...................................................................................................................... 5
Synthèse des résultats obtenus .............................................................................................................. 7
Raccordement de la solution calibrante et du matériau de référence à l’étalon primaire. ............... 7
Fonction de calibrage .......................................................................................................................... 8
Validation de la limite de détection .................................................................................................... 9
Validation de la limite de quantification ........................................................................................... 10
Etude du rendement et de la robustesse de l’extraction.................................................................. 11
Sélectivité : inclusivité et exclusivité ................................................................................................. 12
Inclusivité ....................................................................................................................................... 12
Exclusivité ...................................................................................................................................... 12
Praticabilité........................................................................................................................................ 12
Facilité d’utilisation : ..................................................................................................................... 12
Rendu de résultats rapide : ........................................................................................................... 12
Sécurisation des résultats : ............................................................................................................ 12
Etude interlaboratoire ....................................................................................................................... 13
Etude bibliographique ........................................................................................................................... 14
Bilan des réclamations utilisateurs ........................................................................................................ 14
Conclusions ............................................................................................................................................ 15
3 AdGène laboratoire iQ-Check® Legionella spp. Rapport de synthèse V1.1
Rappel sur la méthode commerciale d’analyse
Date de première attribution de la marque NF Validation Les kits iQ Check® Legionella spp. et iQ Check® Legionella pneumophila ont été validés
pour permettre l’utilisation de la marque NF VALIDATION en 2007. Une première
reconduction a été accordée en 2011 puis deux extensions ont eu lieu en 2012 (voir chapitre
historique de la validation).
Principe de la méthode Le kit iQ Check® Legionella spp. est un kits destiné à la détection ou la quantification des
bactéries du genre Legionella dans les échantillons d’eau, à l’aide de la PCR (Réaction de
Polymérisation en Chaine) qui permet grâce à des séquences spécifiques du genre
Legionella d’être amplifiées et détectées grâce à des sondes fluorescentes.
Le principe repose sur trois étapes (voir annexe 1) :
- Filtration de l’échantillon
- Extraction de l’ADN via le kit Aquadien™ (et protocole W2 pour les échantillons
colmatant)
- Amplification des séquences cibles Legionella spp.
L’extraction de l’ADN via le kit Aquadien™ repose sur une lyse alcaline et un choc thermique
suivi d’une purification par ultrafiltration. Une fraction de cet ADN est ensuite utilisée pour
être amplifiée par PCR en temps réel.
Au cours de la réaction de PCR, les amorces s’hybrident à la région cible. La Taq
polymérase utilise alors ces amorces et les desoxynucléotides triphosphates (dNTPs) pour
élonger l’ADN créant des copies de l’ADN cible de Legionella spp. Durant la PCR, la sonde
oligonucléotidique spécifique s’hybride aux amplicons. Cette sonde est marquée par un
fluorophore qui émet une fluorescence uniquement après hybridation aux amplicons. En
présence d’ADN cible dans l’échantillon, l’intensité de la fluorescence croit
proportionnellement à l’augmentation de la quantité de produits amplifiés.
La fluorescence est mesurée directement par le module optique du thermocycleur pendant
l’étape d’hybridation. Le logiciel associé à l’appareil affiche en temps réel l’intensité de la
fluorescence mesurée en fonction du nombre de cycle d’amplification. Pour chaque réaction,
le logiciel détermine un Ct (cycle à partir duquel la fluorescence est supérieure au bruit de
fond). La lecture des valeurs de Ct permet de détecter la présence des séquences d’ADN
cibles de Legionella spp., qui signale la présence de la bactérie dans l’échantillon d’eau
analysée.
La quantification est possible en utilisant des solutions d’ADN calibré iQ Check® Legionella
Quantification Standards, raccordées à l’étalon primaire du Centre National de Référence
des Légionelle.
Pour chaque échantillon, un ADN synthétique servant de contrôle interne (IPC) est inclus
dans la solution d’amplification pour détecter d’éventuels phénomènes d’inhibition de la
4 AdGène laboratoire iQ-Check® Legionella spp. Rapport de synthèse V1.1
PCR. L’IPC est amplifié en même temps que les séquences cibles de legionella spp., avec
les mêmes amorces, mais détecter avec un autre fluorophore.
Les kits iQ Check® Legionella spp. sont validés avec les matériels suivants :
Logiciel Opticon Monitor 3.4
CFX manager Software Industrial Diagnostic Edition v2.2
CFX manager Software Industrial Diagnostic Edition V2.2
Chassis PTC-200 C1000 C1000 touch Tête optique / bloc chauffant Chromo4 CFX96 CFX96 Deep
well touch
Références du protocole :
Aquadien™ (Réf. 3578121) : 10/2013 – Code : 881116
iQ-Check® Legionella spp (Réf. 3578102) : 10/2013 – Code : 881117
Domaine d’application
Prélèvements tous types d’eaux.
Restrictions
La certification du kit porte sur l’utilisation avec les thermocycleurs Bio-Rad Chromo™4 et
CFX96 Deep well Touch.
Méthode de référence
NF T90-471 (juin 2015) : Qualité de l’eau - Détection et quantification des Legionella et/ou
Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de
polymérisation en chaîne en temps réel (RT-PCR).
ISO/TS 12869 (Novembre 2012) : Qualité de l'eau - Détection et quantification de Legionella
spp. et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de
polymérisation en chaîne quantitative (qPCR).
Protocole de validation PCR :
Protocole de validation pour les méthodes commerciales de détection et de dénombrement
de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par
réaction de polymérisation en chaîne (PCR) V3.0
5 AdGène laboratoire iQ-Check® Legionella spp. Rapport de synthèse V1.1
Historique de la validation
Méthode certifiée Certificat Date
approbation Objet commentaires
Labo expert
Protocole de
validation PCR
iQ-check Legionella spp.
BRD 07/15-12/07
18/12/2007 Validation initiale IPL SED Nord
Rev. 0 (2006)
10/06/2011 Reconduction 1
Evolution du mix PCR
2 modalités d’extraction
(protocole W2) Mise à jour selon
protocole version 1
IPL SED Nord
Rev. 1 (2011)
04/04/2012 Extension 1 Nouveau thermocycleur
(Deep Well touch)
Eurofins IPL Nord
Rev. 1 (2011)
27/05/2013 Extension 2 Protocole de validation V.2
NA Rev. 2 (2013)
05/11/2013 Modification Logiciel V2.1 NA Rev. 2 (2013)
09/03/2015 Modification Logiciel V2.2 NA Rev. 2 (2013)
18/12/2015 Reconduction 2
AdGene avec
extension sur test
qualitatif
Rev 3 (2015)
2007 :
La méthode a été initialement validée en 2007.
2011 :
L’étude réalisée en 2010/2011 en vue de la reconduction de validation, a tenu compte
des modifications apportées à la fois au kit validé et au protocole de validation (révision
n°1 prenant en compte la norme NF T90-471 publiée en avril 2010).
Une étude tierce partie a porté sur les 2 premières phases du protocole de validation,
afin de vérifier les performances annoncées par le fournisseur pour la nouvelle
formulation du kit iQ-Check™ L. spp :
Phase 1 : étude des limites de détection et de quantification de l’étape PCR, de la
fonction de calibrage, du raccordement à l’étalon primaire, du rendement et de la
robustesse de l’extraction en utilisant le kit Aquadien™. Le nouveau thermocycleur
CFX 96 a été mis en œuvre.
Phase 2 : étude de l’inclusivité et de l’exclusivité, de la praticabilité et de la qualité des
réactifs.
L’étude inter laboratoire réalisée en 2007, n’a pas été refaite.
Les modifications intervenues depuis la validation initiale étaient les suivantes :
Dans le kit iQ-Check® L. spp : origine différente de la Taq polymerase et évolution de
la chimie des sondes du contrôle interne (fluorophore TEXAS RED remplacé par le
fluorophore HEX).
6 AdGène laboratoire iQ-Check® Legionella spp. Rapport de synthèse V1.1
Dans le kit Aquadien™ : 2 modalités d’utilisation selon la filtrabilité des échantillons (un
protocole W2 pour échantillons colmatants s’ajoute au protocole classique) et la
microfiltration double-tangentielle remplace la microfiltration horizontale pour l’étape de
purification de l’ADN. Les membranes et matériaux restent de même composition.
Un nouveau thermocycleur peut être utilisé : le CFX96 avec le logiciel CFX Manager
Sofware Industrial Diagnostic Edition en version V1.1.
2012 :
Une extension de validation a été prononcée en 2012 suite à l’évolution des
caractéristiques du thermocycleur CFX96, qui devient le CFX96 Deep Well Touch. Les
modifications portent sur le volume réactionnel du bloc chauffant, sur l’interface
utilisateur (clavier et écran), et sur le logiciel CFX Manager qui passe en version V1.2.
Le Bureau Technique d’AFNOR Certification a qualifié ces évolutions comme mineures
et sans impact sur les performances du kit, aucun essai supplémentaire n’a donc été
réalisé.
2013 :
Fin mai 2013, la validation de la méthode iQ-Check® L. spp a été étendue à la norme
ISO/TS 12869. Aucun complément d’étude de validation n’a été nécessaire : les essais
précédemment réalisés selon la norme NF T90-471 répondent aux exigences de la
norme ISO/TS 12869 et font suite au passage à la révision 2 du protocole de
validation.
Novembre 2013 : Evolution de la version du logiciel CFX manager IDE v2.1. Aucun
complément d’étude de validation n’a été nécessaire
2015 :
Mars 2015 : Evolution de la version du logiciel CFX manager IDE v2.2. Aucun
complément d’étude de validation n’a été nécessaire
Octobre 2015 : reconduction de la méthode iQ-Check® L. spp avec extension sur la
détection (recherche qualitative) Legionella spp sans test supplémentaire. Le Bureau
Technique d’AFNOR Certification a qualifié cette évolution comme sans impact sur les
performances du kit, aucun essai supplémentaire n’a donc été réalisé.
7 AdGène laboratoire iQ-Check® Legionella spp. Rapport de synthèse V1.1
Synthèse des résultats obtenus Les résultats présentés ci-dessous ont été obtenus avec la révision V1.0 du protocole de
validation pour les méthodes commerciales de détection et de dénombrement de Legionella
et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de
polymérisation en chaîne (PCR). Ils sont également conformes avec la version V2.0 car elle
ne contient aucune modification majeure engendrant d’étude complémentaire.
Raccordement de la solution calibrante et du matériau de référence à l’étalon
primaire.
Méthodologie
Le raccordement de la solution calibrante de travail à l’étalon primaire est effectué pour
couvrir le domaine de quantification avec 3 gammes de solutions d’ADN calibré iQ-Check®
Legionella spp. et comprenant 4 niveau de concentration d’unités génome de Legionella
pneumophila sérogroupe (QS1, QS2, QS3, QS4) et 3 gammes indépendantes d’étalon
primaire préparées en ciblant les 4 niveaux de concentration de la gamme d’ADN calibré iQ-
Check® Legionella Quantification Standards.
Le raccordement du matériau de référence à l’étalon primaire a été évalué en analysant les
résultats de deux dépôts du matériau de référence fourni avec le kit iQ-Check® Legionella
spp..
Les 6 gammes indépendantes obtenues et le matériau de référence ont été analysées avec
le kit iQ-Check® Legionella spp. au cours de la même série d’amplification sur le
thermocycleur CFX96.
Résultats
Les paramètres analysés pour évaluer le raccordement des solutions calibrantes et du
matériau de référence à l’étalon primaire sur le thermocycleur CFX96 et chromo 4sont repris
dans le tableau suivant :
Droite de régression Corrélation Efficacité (%)
Gamme de référence (CFX96) C(t) moyen = -3,198.log(x) + 39,076 0,998 105,5
Gamme de référence (Chromo 4) C(t) moyen = -2,891.log(x) + 38,674 0,995 121,75
Solution calibrante Erreur de calibrage
QS1 QS2 QS3 QS4
Par niveau (CFX96) 0,07 0,20 0,14 0,07
Par niveau (Chromo 4) 0,03 0,30 0,23 0,16
Moyenne (CFX96) 0,12
Moyenne (Chromo 4) 0,18*
Equivalence des pentes (CFX96) 0,00
Equivalence des pentes (Chromo 4) 0,13
Matériau de référence Erreur de calibrage
CFX96 0,19
Chromo 4 0,19
* Avec le thermocycleur Chromo 4, l’erreur de calibrage de la solution calibrante est de 0,18 log.
8 AdGène laboratoire iQ-Check® Legionella spp. Rapport de synthèse V1.1
Néanmoins, l’équivalence des pentes de la gamme de référence et de la solution calibrante est vérifiée. L’erreur de calibrage de la solution calibrante est inférieure à 0,15log. Les pentes de la
gamme de référence et de la solution calibrante sont équivalentes.
Conclusion
Sur le thermocycleur CFX96, la solution calibrante et le matériau de référence du kit iQ-
Check® Legionella spp satisfont les conditions de raccordement à l’étalon primaire.
Sur le thermocycleur Chromo 4, la solution calibrante satisfait globalement les conditions de
raccordement à l’étalon primaire. Le matériau de référence du kit iQ-Check® Legionella spp
satisfait les conditions de raccordement à l’étalon primaire.
Fonction de calibrage
Méthodologie
L’étude de la fonction de calibrage est réalisée en déposant 5 gammes différentes de
solutions d’ADN calibré iQ-Check® Legionella Quantification Standards (comprenant 4
niveaux de concentration d’unités génomes de Legionella pneumophila), fournie avec le kit
iQ-Check® Legionella spp..
Les 5 mesures ont été effectuées avec le kit iQ-Check® Legionella spp. pour chaque niveau
de concentration dans les conditions de reproductibilité.
Résultats
Dans ces conditions, l’équation de la droite de régression et l’efficacité de la réaction de PCR
ont été définis. Les résultats ont été obtenus sur CFX96.
Droite de régression -3,197.log(x) + 41,347
Efficacité 105,5%
Performances de la régression linéaire :
QS1 QS2 QS3 QS4
Biais 0,06 -0,10 0,00 0,04
Ecart type 0,12 0,06 0,08 0,05
Exactitude de linéarité
0,13 0,12 0,08 0,07
Incertitude de linéarité
0,42 0,37 0,27 0,22
Conclusion
Pour chaque niveau de la gamme, la régression linéaire satisfait l’exigence d’exactitude
inférieure à 0,15. La linéarité est donc vérifiée sur tout le domaine couvert par la gamme de
solutions d’ADN calibré iQ-Check® Legionella Quantification Standards fournie avec le kit
iQ-Check® Legionella spp..
9 AdGène laboratoire iQ-Check® Legionella spp. Rapport de synthèse V1.1
Validation de la limite de détection
Méthodologie
L’évaluation de la limite de détection a été réalisée à partir de 30 dilutions indépendantes
d’ADN de Legionella pneumophila à 5 UG par PCR. Les amplifications en duplicat ont été
faites dans des conditions de répétabilité. Les résultats ont été obtenus sur CFX96.
Résultats
Conclusion
Les 30 duplicats sont positifs, la limite de détection est donc validée pour 5 UG/puits de
PCR.
L’ensemble des Ct présentés dans le tableau ci-dessus est inférieur à la l’intercept. La
détection qualitative est conforme.
10 AdGène laboratoire iQ-Check® Legionella spp. Rapport de synthèse V1.1
Validation de la limite de quantification
Méthodologie
L’évaluation de la limite de quantification est réalisée en analysant 30 dilutions
indépendantes de Legionella pneumophila à 15 UG par puit de PCR. Les 30 solutions ont
été amplifiées simultanément en duplicat. Les résultats ont été obtenus sur CFX96.
Résultats
Résultats Valeurs théoriques ou critères de validation
Moyenne x’ (Log UG/puits) 1,309 1,279 Ecart-type (Log UG/puits) 0,097 Biais 0,030 Exactitude de LQ 0,101 0,15 Incertitude de la LQ 0,207
Conclusion
La valeur de l’exactitude de la limite de quantification estimée à 0,101. Cette valeur est
inférieure à 0,15. La limite de quantification à 0,15 UG/puits PCR du kit iQ-Check®
Legionella spp. est validée.
Seuil de positivité
Le manuel utilisateur prévoit un Cq de 43 au-delà duquel les échantillons sont considérés
comme étant inférieure à la limite de détection.
L’ensemble des valeurs obtenues pour caractériser la limite de détection a un Cq plus faible
que celui de 43. Cette valeur correspond donc bien à un seuil de positivité comme étant
inférieure à la limite de détection.
11 AdGène laboratoire iQ-Check® Legionella spp. Rapport de synthèse V1.1
Etude du rendement et de la robustesse de l’extraction
Méthodologie
Les études de rendement ont été réalisées avec le kit d’extraction Aquadien™ (pour les eaux
propres), et Aquadien W2 (pour les eaux colmatantes). Le rendement a été évalué sur 10
échantillons indépendants, artificiellement contaminés à deux niveaux de concentration
(1000 et 100 000 UG/puit PCR) de Legionella pneumophila ATCC 33152 et pour 3 matrices
différentes : eau stérile, eau chaude sanitaire, eau de tour aéro-réfrigérante.
Les échantillons ont été artificiellement contaminés par la suspension mère dont la
concentration a été déterminée par 3 quantifications après une étape d’extraction de l’ADN
par le protocole de lyse directe sur 3 aliquots. Les résultats ont été obtenus sur CFX96.
Résultats
Rendement
Protocole Aquadien Protocole Aquadien W2
Log Moyenne Log Moyenne
Eau chaude sanitaire 1000 UG/L 100 000 UG/L
-0,29 -0,39
-0,34 -0,16 -0,45
- 0,30
Eau de tour aéroréfrigérante
1000 UG/L 100 000 UG/L
-0,09 -0,31
-0,20 -0,45 -0,47
- 0,46
Eau minérale 1000 UG/L 100 000 UG/L
-0,25 -0,42
-0,33 -0,55 -0,46
- 0,50
Rendement moyen (log) -0,29 -0,41 Variance (log) 0,04 0,03 Incertitude globale élargie (log) 0,71 0,89
Conclusion
L’étude du rendement et de la robustesse de la méthode permet d’évaluer le rendement
moyen de :
- la méthode Aquadien à -0,29 log
- la méthode Aquadien W2 à -0,41 log
Les rendements avec les deux méthodes d’extraction sont conformes aux critères -0,6 log / +0,3 log (ce qui correspond à un rendement compris entre 25 % et 199 %).
12 AdGène laboratoire iQ-Check® Legionella spp. Rapport de synthèse V1.1
Sélectivité : inclusivité et exclusivité Pour chacune des souches testées, l’ADN a été extrait à partir d’une suspension bactérienne
pure.
Inclusivité
Les essais d’inclusivité ont été réalisés sur des extraits d’ADN à une concentration d’environ
100 UG/puits PCR, estimée à partir de la suspension bactérienne par une mesure de la DO
à 600 nm.
Les ADN des 35 souches Legionella testées (15 Legionella pneumophila et 20 Legionella
spp) ont montré une amplification.
Exclusivité
Les essais d’exclusivité ont été réalisés sur des extraits d’ADN à une concentration d’environ
10 000 UG/puits PCR estimée à partir de la suspension bactérienne par une mesure de la
DO à 600 nm.
Les ADN des 16 souches testées montrent l’absence d’amplification sauf pour 5 d’entre elles
où une très faible amplification a été observée.
Conclusion
La sélectivité du kit iQ-Check® Legionella spp. est satisfaisante.
Praticabilité
Facilité d’utilisation : les réactifs sont tous fournis dans les kits, et sont prêts à l’emploi. Les
séries d’analyse de 1 à 30 échantillons, dans le cadre d’une quantification, sont faciles à
gérer. Un technicien connaissant les techniques de microbiologie, biologie moléculaire ainsi
que le thermocycleur et son logiciel peut être formé en 1 jour.
Rendu de résultats rapide : la durée des différentes phases est compatible avec un délai de
rendu des résultats court (5 heures).
Sécurisation des résultats : elle est garantie par l’utilisation d’un contrôle interne d’inhibition
(dans le même puits que l’échantillon), et par un logiciel d’analyse des résultats. L’utilisation
du logiciel assure en outre la traçabilité complète des informations.
13 AdGène laboratoire iQ-Check® Legionella spp. Rapport de synthèse V1.1
Etude interlaboratoire
Méthodologie
Une étude inter-laboratoire a été réalisée en 2007, avec 14 laboratoires collaborateurs. Les
résultats d'un laboratoire n'ont pas été pris en compte en raison d’un problème technique
ayant conduit à l’invalidation de l’étalonnage. Au final, 13 laboratoires ont été retenus pour
l’exploitation statistique.
La finalité de cette étude est d’évaluer la fidélité (répétabilité et reproductibilité) de la
méthode iQ-Check® Legionella spp. :
- pour l’étape d’amplification génique seule (envoi de deux solutions d’ADN de L.
anisa et L. pneumophila sg1 à deux niveaux de concentration différents);
- pour l’ensemble de l’analyse (concentration, lyse, extraction, purification et
amplification génique) sur des suspensions bactériennes caractérisées de L.
pneumophila et Escherichia coli (CIP 54.8) à 2 niveaux de concentration
différents;
- pour l’ensemble de l’analyse en situation réelle (eau chaude sanitaire
naturellement contaminée en L. pneumophila et Legionella non pneumophila).
- Egalement, une eau garantie sans ADN de Legionella a été envoyée.
Résultats
Type d’échantillons
Solution
d’ADNs
calibrés
Eau de distribution
dopée
Echantillon
naturel
Niveaux de
dopage
(UG/L)
L. pneumophila
ATCC 33152
2000
UG/µl
20000
UG/µl
4000
UG/200
ml
40000
UG/200
ml
Eau chaude
sanitaire
naturellement
contaminée
L. anisa 500
UG/µl
5000
UG/µl
1000
UG/200
ml
10000
UG/200
ml
E. coli
5000
UG/200
ml
50000
UG/200
ml
Nombre de
laboratoires
participant 14 14 14 14 14
retenus 13 13 13 13 13
14 AdGène laboratoire iQ-Check® Legionella spp. Rapport de synthèse V1.1
Test
d’homogénéité
Nbre d’analyses 20 20 9 9 9
Moyenne (Log) 2.91 3.97 3.42 4.41 3.76
Résultats
Moyenne (Log) 3.02 4.11 3.52 4.47 3.69
r (Log) 0.18 0.15 0.28 0.34 0.46
R (Log) 0.43 0.32 0.72 0.66 0.8
Sr (Log) 0.06 0.06 0.10 0.12 0.16
SR (Log) 0.14 0.10 0.24 0.20 0.23
Conclusion
Les valeurs de répétabilité en r (Log), se situent autour de 0,15 pour les solutions d’ADN
(étape de PCR uniquement), et autour de 0,3 pour les suspensions bactériennes (méthode
globale), ce qui est acceptable. Cela signifie qu’au sein d’un même laboratoire, on s’attend à
des écarts de mesure, sur un même échantillon, de l’ordre d’un facteur 2. La répétabilité
n’apparaît donc pas comme une source majeure d’erreur.
Les valeurs de reproductibilité en R (Log) se situent autour de 0,4 pour les solutions d’ADN
(étape de PCR uniquement), et autour de 0,7 pour les suspensions bactériennes (méthode
globale). Par rapport à la répétabilité, cet ordre de grandeur reste conforme à ce que l’on a
l’habitude de rencontrer en analyse microbiologique de l’environnement. Ce qui signifie
qu’entre deux laboratoires, on s’attend à des écarts de mesure, sur un même échantillon, de
l’ordre d’un facteur 5. La reproductibilité ne participe donc pas de manière démesurée à la
dispersion des résultats.
Etude bibliographique
- Pas de publications recensées depuis la dernière parution de la méthode
- Pas de validations externes réalisées par un autre organisme de certification
Bilan des réclamations utilisateurs
Pas de réclamation client utilisateur.
15 AdGène laboratoire iQ-Check® Legionella spp. Rapport de synthèse V1.1
Conclusions
Les performances de la méthode iQ-Check® Legionella spp. sont conformes aux exigences des normes NF T90-471 et ISO/TS 12869 ainsi qu’au protocole de validation AFNOR : Protocole de validation pour les méthodes commerciales de détection et de dénombrement de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) V3.0. Les modifications entre la version 2.0 et 3.0 protocole de validation AFNOR concerne le seuil de positivité (détection qualitatif) et n’engendre pas d’étude complémentaire.
Le kit iQ-Check® Legionella spp est un kit validé pour la détection et la Détection et Quantification des Legionella et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (qPCR)
IPL santé, environnement durables Nord – 1 rue du Professeur Calmette – 59046 LILLE cedex
iQ-Check™ Quanti Legionella spp. - Ext 2011 - v01
ANNEXE C
RACCORDEMENT A L’ETALON PRIMAIRE
Rac
cord
emen
t
Rac
cord
emen
t sur
CFX
Rac
cord
emen
t sur
Chr
omo
4
Gam
me
de ré
fére
nce
Gam
me
de ré
fére
nce
Niv
eaux
test
és(U
G/p
uits
)15
420
4200
4200
0N
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ux te
stés
(UG
/pui
ts)
1542
042
0042
000
log
(UG
/Pui
ts)
1,17
609
2,62
325
3,62
325
4,62
325
log
(UG
/Pui
ts)
1,17
609
2,62
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74
IPL santé, environnement durables Nord – 1 rue du Professeur Calmette – 59046 LILLE cedex
iQ-Check™ Quanti Legionella spp. - Ext 2011 - v01
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ANNEXE D
FONCTION DE CALIBRAGE
Fonction de calibrage
Niveau (UG/puits) x i 19 390 3900 39000 19 390 3900 39000x' i =Log(x i ) 1,28 2,59 3,59 4,59 1,28 2,59 3,59 4,59
gamme gamme 1 37,08 33,33 29,60 26,49yij 36,49 33,27 29,84 26,72
gamme 2 37,02 33,18 29,44 26,36k=5 répétitions 36,77 33,33 29,71 26,24
gamme 3 37,78 33,30 29,69 26,5436,69 33,31 29,99 26,46
gamme 4 37,32 33,81 30,14 26,6537,16 33,32 30,32 26,84
gamme 5 37,40 33,57 30,01 26,5236,90 33,41 30,05 26,50
Moyenne mi 37,06 33,38 29,88 26,53 37,06 33,38 29,88 26,53
Estimation de la droite de régression
Pente a = -3,197Ordonnée à l'origine b = 41,347
Estimation de l'efficacité
Efficacité e = 105,5%
Vérification des performances de la régression linéaire
Niveau x i 19 390 3900 39000 19 390 3900 39000x' i =Log(x i ) 1,28 2,59 3,59 4,59 1,28 2,59 3,59 4,59
gamme gamme 1 1,33 2,51 3,67 4,65yij 1,52 2,53 3,60 4,57
gamme 2 1,35 2,55 3,72 4,69k=5 répétitions 1,43 2,51 3,64 4,73
gamme 3 1,12 2,52 3,65 4,631,46 2,51 3,55 4,66
gamme 4 1,26 2,36 3,51 4,601,31 2,51 3,45 4,54
gamme 5 1,23 2,43 3,55 4,641,39 2,48 3,53 4,64
Moyenne mi 1,34 2,49 3,59 4,63 1,34 2,49 3,59 4,63
Biais 0,06 -0,10 0,00 0,04
Ecart type S = 0,12 0,06 0,08 0,05
Exactitude de linéarité ELIN = 0,13 0,12 0,08 0,07
Incertitude de linéarité ULIN = 0,42 0,37 0,27 0,22
1,31 2,46 3,54 4,64
1,28 2,43 3,48 4,57
1,29 2,52 3,60 4,64
1,39 2,53 3,68 4,71
1,43 2,52 3,64 4,61
37,15 33,49 30,03 26,51
37,24 33,57 30,23 26,75
37,24 33,31 29,84 26,50
36,90 33,26 29,58 26,30
36,79 33,30 29,72 26,61
Droite de calibrage
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00x'i
C(t)
gamme 1
gamme 2
gamme 3
gamme 4
gamme 5
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ANNEXE E
LIMITE DE DETECTION
Limite de détection à 5UG
Echantillons à la concentration 5UG
Well Sample C(t) I.C. C(t) SQe1 37,88 33,12 6,445
A02 e1 37,73 33,12 7,232B02 e2 39,38 36,36 1,982C02 e2 38,41 34,8 4,257D02 e3 37,65 34,56 7,690E02 e3 38,19 34,14 5,046F02 e4 37,92 34,09 6,237G02 e4 38,12 34,01 5,328H02 e5 38,25 32,97 4,826A03 e5 37,77 33,71 7,028B03 e6 38,99 35,71 2,685C03 e6 38,34 34,12 4,496D03 e7 38,1 34,39 5,432E03 e7 38,02 34,24 5,775F03 e8 39,21 34,53 2,268G03 e8 37,86 34,21 6,526H03 e9 37,39 32,78 9,424A04 e9 37,82 33,79 6,734B04 e10 41,57 39,12 0,356C04 e10 37,97 34,42 5,989D04 e11 38,9 34,49 2,887E04 e11 38,13 34,04 5,271F04 e12 38,93 34,35 2,816G04 e12 37,85 34,08 6,557H04 e13 37,15 32,87 11,400A05 e13 38,08 34,53 5,489B05 e14 38,19 34,68 5,041C05 e14 38,56 34,31 3,786D05 e15 37,91 34,44 6,301E05 e15 38,43 34,93 4,193F05 e16 38,04 34,35 5,667G05 e16 37,42 34,07 9,195 Contrôle Gamme StandardH05 e17 37,32 32,73 9,950A06 e17 38,47 35,11 4,058 Well Content C(t) I.C. C(t) SQB06 e18 40,81 37,79 0,645 A01 QS1 36,02 33,04 19,00C06 e18 38,08 34,36 5,515 B01 QS1 36,06 33,22 19,00D06 e19 37,78 34,27 6,964 C01 QS2 34,01 35,6 390,00E06 e19 37,9 34,15 6,307 D01 QS2 42,26 N/A 390,00F06 e20 38,16 34,63 5,147 E01 QS3 29,99 34,11 3900,00G06 e20 39,2 34,48 2,280 F01 QS3 29,72 33,4 3900,00H06 e21 37,28 33,31 10,260 G01 QS4 26,4 33,75 39000,00A07 e21 41,82 35,38 0,293 H01 QS4 26,37 33,98 39000,00B07 e22 39,31 35,69 2,096C07 e22 37,61 33,71 7,956D07 e23 37,95 34,28 6,091 Contrôle négatifE07 e23 38,17 34,39 5,128F07 e24 38,14 34,38 5,261 Content C(t) I.C. C(t) SQG07 e24 37,92 34,65 6,214 G09 Neg Ctrl N/A 34,62 N/AH07 e25 37,33 33,41 9,875 H09 Neg Ctrl N/A 34,39 N/AA08 e25 37,47 33,94 8,870B08 e26 37,84 34,55 6,629C08 e26 37,97 34,48 5,997D08 e27 38,04 34,37 5,654E08 e27 37,53 34,6 8,487F08 e28 38,98 34,64 2,712G08 e28 38,15 34,36 5,218H08 e29 37,74 33,16 7,195A09 e29 41,52 39 0,372B09 e30 38,16 34,32 5,146C09 e30 38,22 34,72 4,908D09
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ANNEXE F
LIMITE DE QUANTIFICATION
Limite de quantification LQ à 15UG
Gamme de calibrage QS
UG/puits Moy Log (UG/puits) C(t)
QS1 1,278753601 36,87
1,278753601 37,23
QS2 2,591064607 33,65
2,591064607 33,71
QS3 3,591064607 29,73 Pente -3,241
3,591064607 29,87 Ordonnée origine 41,514
QS4 4,591064607 26,41 Corrélation (r2) 0,992
4,591064607 26,51 Efficacité (%) 103,474
LQPCR à 15UG : 30 mesures en réplicat
Réplicat Moyenne UG/puits Moy UG/puits x' (Log) Moyenne x'LQ-1 37,55 16,7 1,223
37,87 13,4 1,124LQ-2 37,57 16,5 1,217
37,27 20,4 1,309LQ-3 37,17 22,0 1,340
37,08 23,3 1,368LQ-4 37,21 21,4 1,328
37,49 17,5 1,241LQ-5 37,53 17,0 1,229
37,63 15,8 1,198LQ-6 37,73 14,7 1,167
37,21 21,3 1,328LQ-7 36,83 27,9 1,445
37,00 24,8 1,393LQ-8 37,07 23,5 1,371
37,21 21,3 1,328LQ-9 37,73 14,8 1,167
37,68 15,2 1,183LQ-10 37,82 13,8 1,140
38,15 11,0 1,038LQ-11 37,25 20,7 1,315
37,09 23,1 1,365LQ-12 36,54 34,4 1,534
37,06 23,7 1,374LQ-13 37,35 19,3 1,285
37,26 20,5 1,312LQ-14 37,56 16,7 1,220
37,57 16,4 1,217LQ-15 37,50 17,3 1,238
37,04 24,0 1,380LQ-16 36,48 35,7 1,553
37,37 19,0 1,278LQ-17 37,13 22,5 1,352
37,43 18,3 1,260LQ-18 37,39 18,7 1,272
37,65 15,6 1,192LQ-19 36,69 30,8 1,488
37,00 24,7 1,393LQ-20 36,57 33,5 1,525
37,13 22,5 1,352LQ-21 37,70 15,0 1,177
37,18 21,8 1,337LQ-22 37,75 14,5 1,161
37,68 15,2 1,183LQ-23 37,29 20,2 1,303
37,25 20,7 1,315LQ-24 37,00 24,7 1,393
36,94 25,8 1,411LQ-25 37,29 20,1 1,303
37,62 15,9 1,201LQ-26 37,55 16,7 1,223
36,63 32,1 1,507LQ-27 36,54 34,3 1,534
37,02 24,4 1,386LQ-28 36,83 28,0 1,445
36,99 24,9 1,396LQ-29 37,58 16,4 1,214
37,15 22,3 1,346LQ-30 37,12 22,8 1,356
37,34 19,5 1,288
1,309
0,097
0,030
0,101
0,207
37,37
37,23
37,46
37,09
36,78
36,91
37,44
37,72
37,27
36,97
37,28
37,52
36,85
36,85
37,31
37,57
37,27
36,93
37,7
37,99
37,17
36,8
37,58
37,47
36,91
37,14
37,71
37,42
37,13
37,35
C(t) UG/puits
Biais
Incertitude ULQ
Ecart-type s
Moyenne x'
Exactitude de LQ ELQ
1,50E+01
1,84E+01
2,26E+01
2,63E+01
1,94E+01
1,64E+01
2,19E+01
1,50E+01
1,24E+01
1,80E+01
1,99E+01
2,80E+01
2,77E+01
1,72E+01
2,04E+01
2,73E+01
2,07E+01
1,66E+01
1,49E+01
2,44E+01
2,04E+01
2,52E+01
2,11E+01
2,94E+01
2,64E+01
1,285
1,214
1,248
1,93E+01
1,80E+01
1,84E+01
2,91E+01
1,173
1,263
1,354
1,419
1,349
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IPL santé, environnement durables Nord – 1 rue du Professeur Calmette – 59046 LILLE cedex
iQ-Check™ Quanti Legionella spp. - Ext 2011 - v01
IPL santé, environnement durables Nord – 1 rue du Professeur Calmette – 59046 LILLE cedex
iQ-Check™ Quanti Legionella spp. - Ext 2011 - v01
ANNEXE G
RENDEMENT ET ROBUSTESSE
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